KR101699152B1 - 호로파 및 흑삼 복합추출물을 유효성분으로 포함하는 남성 갱년기 증상의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 호로파 및 흑삼의 복합추출물을 유효성분으로 포함하는 남성 갱년기 증상의 예방, 치료 또는 개선용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 혈중 테스토스테론의 함량을 증가시키고 산화적 스트레스를 억제하며 근지구력과 운동능력을 향상시킴으로써 남성 갱년기 증상을 개선하는데 매우 효과적이다. 본 발명의 조성물은 남성 갱년기 증상을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물 또는 건강기능식품으로 유용하게 이용할 수 있다.

Description

호로파 및 흑삼 복합추출물을 유효성분으로 포함하는 남성 갱년기 증상의 예방 또는 치료용 조성물{A composition comprising the complex extract of Trigonella foenum-graecum L. and Black Ginseng for preventing or treating Andropause Symptoms}

본 발명은 호로파 및 흑삼 복합추출물을 유효성분으로 포함하는 남성 갱년기 증상의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

최근 과학과 의료기술의 발달로 우리나라 남성의 평균수명이 증가하고 있어 점차 중년기 이후의 남성인구가 증가되고 있다. 현재 우리나라는 2000년에 노인인구의 비율이 10%에 도달하여 노령화 국가에 접어들었다. 중년은 신체적, 심리적, 사회적으로 많은 변화를 경험하고 신체적 노화가 시작되는 시기로 건강관리에 대한 사회, 경제적으로 관심이 증가되고 있다.

여성은 폐경기가 오면서 여성호르몬의 급격한 감소를 보이며 남성도 유사하게 내분비 변화가 일어나게 된다. 남성 갱년기는 “후기발현 남성 성선기능 저하증”(late onset hypogonadism, LOH), 남성 호르몬결핍 증후군, 남성갱년기 증후군(Male Climacteric Syndrome) 이라고도 하며 남성에서 연령의 증가와 관련되어 있고 더불어 혈청 테스토스테론의 결핍과 그에 따른 특징적인 임상적, 생화학적 증상을 나타내는 증후군이다. 대표적인 증상으로는 혈중 테스토스테론의 감소와 더불어, 발기력 감퇴, 성욕감퇴, 수동적인 태도, 우울, 근력저하, 골다공증 수면장애, 혈중 콜레스테롤 대사이상에 영향을 미쳐 삶의 질을 저하시키고 여러 신체기관의 기능에 부정적인 영향을 초래할 수 있다.

이러한 남성갱년기 증후군을 개선하기 위하여 남성호르몬 보충요법이 시도되고 있으며, 남성갱년기에 동반하는 제반 증상들과 테스토스테론과의 관계에 대한 많은 연구결과가 알려지면서 남성 갱년기장애는 테스토스테론을 이용한 호르몬 치료의 새로운 적응증으로 관심이 대두되고 있다.

테스토스테론 보충요법은 남성갱년기에 동반되는 당뇨, 골대사, 체지방 및 근력, 심혈관계, 성기능 및 기분에 대한 효과, 인지능력에 대한 효과에 적용되거나 연구가 되고 있지만 미비한 상태이며, 특히 테스토스테론 보충요법에 의한 전립선 비대증, 전립선암, 심장질환과 같은 부작용이 보고되는바 제한성을 지니고 있으므로 정신적 신체적으로 안전하게 사용할 수 있는 개선제 및 치료제의 개발이 요구된다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 남성 갱년기 증상을 효과적으로 개선할 수 있으며 인체에 안전한 물질, 특히 식물-유래 물질을 개발하고자 예의 연구 노력하였고, 그 결과 호로파 및 흑삼 혼합 추출물이 남성갱년기 증후군의 원인이 된다고 알려져 있는 테스토스테론의 감소를 완화하고 산화적 스트레스를 억제하며 근지구력과 운동능력을 향상시킴으로써 남성 갱년기 증상을 효과적으로 개선하는데 매우 유효하다는 것을 규명함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 호로파 및 흑삼의 복합추출물을 유효성분으로 포함하는 남성 갱년기 증상의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 호로파 및 흑삼의 복합추출물을 유효성분으로 포함하는 남성 갱년기 증상의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 호로파 및 흑삼의 복합추출물을 유효성분으로 포함하는 남성 갱년기 증상의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 호로파 및 흑삼의 복합추출물을 유효성분으로 포함하는 남성 갱년기 증상의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 남성 갱년기 증상을 효과적으로 개선할 수 있으며 인체에 안전한 물질, 특히 식물-유래 물질을 개발하고자 예의 연구 노력하였고, 그 결과 호로파 및 흑삼 혼합 추출물이 남성갱년기 증후군의 원인이 된다고 알려져 있는 테스토스테론의 감소를 완화하고 산화적 스트레스를 억제하며 근지구력과 운동능력을 향상시킴으로써 남성 갱년기 증상을 효과적으로 개선하는데 매우 유효하다는 것을 규명하였다.

본 발명에서 사용된 호로파(Trigonella foenum - graecum L.)는 큰노랑꽃자리풀, 페누그리크(Fenugreek)로도 불리우며, 콩과(Fabaceae)의 한해살이풀로 높이는 0.7-1미터이며 열매는 꼬투리 모양이다. 잎은 견과류향이 나며 카로틴이 풍부하며 채소로 먹는다. 씨는 약재, 카레의 향신료로 쓰이며, 맛이 쓰고 성질이 더워 양기를 보한다고 알려져 있다.

본 발명에서 사용된 흑삼은 선별된 삼을 수증기 또는 그 밖의 방법으로 쪄서 익히고 건조하는 방법을 통해 제조한 것을 말한다.

인삼을 여러 번 증숙과정과 건조과정을 통하면 적색의 홍삼이 제조되며, 홍삼보다 더 많은 건조과정과 증숙과정을 통하면 적색의 홍삼에서 검은색의 흑삼이 된다. 증숙과정과 건조과정을 통하면 인삼에 없던 성분인 사포닌과 조사포닌 및 진세노이드 Rh2이 생성되며 홍삼보다 증숙과정과 건조과정이 많은 흑삼에 보다 많이 함유되어 있다. 흑삼이란 수회 증숙 및 건조과정을 거쳐 인삼이 검은 색으로 변한 삼을 의미하는 것으로서 증숙 및 건조 과정을 거치면서 인삼의 유용 활성성분인 인삼사포닌(Ginsenoside)의 함량이 증대된 것이다.

본 발명의 조성물에서 이용되는 호로파 추출물 및 흑삼 추출물을 호로파 또는 흑삼에 추출용매를 처리하여 수득하는 경우에 다양한 추출용매가 이용될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 극성 용매 또는 비극성 용매를 이용할 수 있다. 극성 용매로서 적합한 것은, (i) 물, (ii) 알코올(바람직하게는, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올, 노말-부탄올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올 또는 에틸렌글리콜), (iii) 아세트산, (iv) DMFO(dimethyl-formamide) 및 (v) DMSO(dimethyl sulfoxide)를 포함한다. 비극성 용매로서 적합한 것은, 아세톤, 아세토나이트릴, 에틸 아세테이트, 메틸 아세테이트, 플루오로알칸, 펜탄, 헥산, 2,2,4-트리메틸펜탄, 데칸, 사이클로헥산, 사이클로펜탄, 디이소부틸렌, 1-펜텐, 1-클로로부탄, 1-클로로펜탄, o-자일렌, 디이소프로필 에테르, 2-클로로프로판, 톨루엔, 1-클로로프로판, 클로로벤젠, 벤젠, 디에틸에테르, 디에틸 설파이드, 클로로포름, 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 어닐린,디에틸아민, 에테르, 사염화탄소 및 THF를 포함한다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 추출용매는 (a) 물, (b) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), (c) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d) 아세톤, (e) 에틸 아세테이트, (f) 클로로포름, (g) 부틸아세테이트, (h) 1,3-부틸렌글리콜, (i) 헥산 및 (j) 디에틸에테르를 포함한다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 추출물은 주정을 호로파 또는 흑삼에 처리하여 수득한 것이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 ‘추출물’은 상술한 바와 같이 당업계에서 조추출물(crude extract)로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함한다. 즉, 호로파 추출물 또는 흑삼 추출물은 상술한 추출용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라, 여기에 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다. 예컨대, 상기 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 호로파 추출물 또는 흑삼 추출물에 포함되는 것이다.

본 발명에서 이용되는 호로파 추출물 및 흑삼 추출물은 감압증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.

본 명세서에서 용어 ‘유효성분으로 포함하는’이란 하기의 호로파 추출물 및 흑삼 추출물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명은 천연식물재료인 호로파 및 흑삼으로부터 추출한 조성물로서 과량 투여하여도 인체에 부작용이 없으므로 호로파 추출물 및 흑삼 추출물이 본 발명의 조성물에 포함된 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.

본 발명에서 남성 갱년기 증상은 관절 또는 근육의 통증, 골다공증, 다한증, 수면장애, 흥분, 신경과민, 정서불안, 무기력증, 피로, 근력 저하, 우울증, 정력 저하, 성욕 저하, 발기력 저하, 노화 또는 비뇨생식기 기능 저하이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 복합추출물은 Erk 분자의 활성화를 유도하여 항산화 효과를 나타내며, 이로 인해 산화적 스트레스에 의한 세포 사멸을 억제한다.

본 발명의 조성물은 혈중 남성 호르몬의 함량을 증가시킨다.

바람직하게는, 본 발명의 조성물은 혈중 테스토스테론의 함량을 증가시킨다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 호로파 및 흑삼 복합추출물을 투여한 경우, 대조군과 비교하여 혈중 테스토스테론의 함량을 1.7배 증가시킨다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 성선을 자극하여 정자 생성을 촉진시키는 황체형성 호르몬 및 여포자극호르몬의 혈중 함량을 증가시킨다.

본 발명의 호로파 및 흑삼 추출물의 혼합물은 1:9 내지 5:5의 중량비로 혼합된다.

바람직하게는, 상기 혼합물의 구성비는 1:9 내지 5:5이고, 보다 바람직하게는, 상기 혼합물의 구성비는 1:9 내지 4:6이고, 가장 바람직하게는, 상기 혼합물의 구성비는 3:7이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 근지구력 및 운동 능력을 향상시킴으로써 남성 갱년기 증상을 효과적으로 개선하는데 매우 유효하다.

본 발명의 조성물은 약제학적 조성물로 제조될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 호로파 추출물 및 흑삼 추출물의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다. 본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 상술한 호로파 추출물 및 흑삼 추출물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여 방식으로 적용된다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 일반적인 투여량은 성인 기준으로 0.001-1000 ㎎/kg 범위 내이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 식품 조성물로 제공될 수 있다. 본 발명의 호로파 및 흑삼의 복합추출물을 유효성분으로 포함하는 남성 갱년기 증상의 예방 또는 개선용 조성물이 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로서 호로파 및 흑삼 추출물뿐 만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 백미 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 호로파 및 흑삼의 복합추출물을 유효성분으로 포함하는 남성 갱년기 증상의 예방, 치료 또는 개선용 조성물을 제공한다.

(b) 본 발명의 조성물은 혈중 테스토스테론의 함량을 증가시키고 산화적 스트레스를 억제하며 근지구력과 운동능력을 향상시킴으로써 남성 갱년기 증상을 개선하는데 매우 효과적이다.

(c) 본 발명의 조성물은 남성 갱년기 증상을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물 또는 건강기능식품으로 유용하게 이용할 수 있다.

도 1은 호로파 및 흑삼 단일 추출물의 농도별 세포 독성을 측정한 결과이다. BG, 흑삼추출물 ; FG, 호로파 추출물.
도 2는 호로파 및 흑삼 단일 추출물의 산화적 스트레스에 대한 세포 사멸 억제 효과를 측정한 결과이다. A, 각 단일 추출물의 농도별 항산화 효과; B, 각 추출물의 비율별 항산화 효과. BG, 흑삼추출물 ; FG, 호로파 추출물. 각 실험은 3번 반복 하였으며 * P> 0.05 유의성을 나타냄.
도 3은 호로파 및 흑삼 복합 추출물에 의한 p-ERK 키나아제의 활성 증가를 측정한 결과이다. 복합추출물 투여 후 30분 후 단백질을 추출하여 웨스턴 블롯 실험법으로 발현량을 측정함. 각 실험은 3번 반복 하였으며 * P> 0.05 유의성을 나타냄.
도 4는 LOH(late onset hypogonadism) 동물모델 확립을 위한 실험 디자인 모식도이다.
도 5는 테스토스테론 호르몬의 생합성 및 대사 경로를 나타낸 모식도이다.
도 6은 호로파 및 흑삼 복합추출물의 총 테스토스테론 및 유리형 테스토스테론 증가 효과를 측정한 결과이다.
도 7은 호로파 및 흑삼 복합 추출물 투여 후 각 조직 및 간독성에 미치는 영향을 평가한 결과이다.
도 8은 호로파 및 흑삼 복합 추출물의 지질대사에 미치는 영향을 측정한 결과이다.
도 9는 호로파 및 흑삼 복합 추출물에 의한 황체형성호르몬(LH) 및 여포자극호르몬(FSH)의 증가 효과를 측정한 결과이다.
도 10은 동물모델에 호로파 및 흑삼 복합 추출물의 투여한 후 강제유영 실험을 실시한 사진이다.
도 11은 호로파 및 흑삼 복합추출물의 지구력 향상 효과를 측정한 결과이다.
도 12는 호로파 및 흑삼 복합추출물 투여 후 강제유영실험에서 무활동(immobility) 시간 감소를 확인한 결과이다.
도 13은 호로파 및 흑삼 복합 추출물에 의한 근지구력 및 운동능력 향상 효과를 확인한 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

재료 및 방법

호로파 복합물 소재 선정

본 연구에서 사용한 호로파 복합 추출물은 (주) 광동제약으로부터 제공받아 사용하였다. 호로파와 흑삼 추출물에 대한 효능을 스크리닝 한 후 최적 비율을 조합하여 연구에 사용하였다.

본 연구에 사용된 흑삼은 주정 70%를 첨가하고 온도 70℃에서 12시간동안 1차 추출하고 주정 30%를 이용하여 같은 방법으로 2차 추출한 다음 마지막으로 정제수 100%를 이용하여 온도 100℃에서 추출하여 스프레이 건조 방법으로 건조하여 사용하였다.

호로파 종자는 70% 주정을 이용하여 온도 75℃에서 4시간동안 추출하여 스프레이 건조법으로 건조한 후 사용하였다. 각 건조된 추출물을 흑삼: 호로파 3:7의 비율로 사용하였다.

TM3 세포의 세포 생존율 영향평가.

1) 세포배양

마우스 유래의 라이디히 세포(leydig cell)인 TM3 세포는 고환내 간질 조직에 있는 세포로서 한국 세포주 은행에서 분양받아 사용하였다. TM3 세포를 10% FBS(fetal bovine serum), 1% 페니실린-스트렙토마이신이 함유된 DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 96웰 플레이트에 1×10⁵ 세포/웰로 접종한 후 24 시간 배양 후 복합물 소재를 비율별, 농도별로 처리하고 배양하였다.

2) 세포 생존율 측정

복합 추출물의 세포독성을 확인하고자 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium) 어세이를 실시하였다. 96웰 플레이트에 세포를 접종하고 24시간 후에 복합추출물을 농도별로 처리하고 16시간 이상 추가 배양하고 배지를 회수한 후 MTT 5 mg/ml를 100 μl씩 처리하였다. 2시간 이상 배양한 후 MTT 결정을 DMSO(Dimethyl sulfoxide)로 용해하고, 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 570 nm의 흡광도를 측정하였다.

3) 산화적 스트레스에 대한 효능 검증

정조세포를 비롯한 생식세포들은 산화적 스트레스에 민감한 반응을 보이며, 또한 외부의 산화적 스트레스에 의하여 손상된 세포를 회복하고자 항산화 효소등과 같은 내재성 항산화 기전을 보인다. 산화적 스트레스를 보호하는 세포내 항산화 능력이 저하되면 세포사멸이 일어나게 된다. 본 실험에서는 TM3 세포에 산화적 스트레스를 유도한 후 복합추출물이 항산화 효능이 있는지 검증하고자 하였다. 96웰 플레이트에 1×10⁵ 세포/웰의 개수로 접종한 후 24 시간 배양 후 복합물 소재를 비율별, 농도별로 처리하고 배양하였다. 추가 배양 후, 세포내 세포생존율을 측정하기 위하여 MTT 어세이를 실시하였다.

4) 세포사멸억제에 대한 기전연구 검증

세포의 생존 및 증식에 관여하는 대표적인 신호전달 분자인 ERK(Extracellular signal-regulated kinases는 활성산소 및 외부자극에 의해 활성화 되어 세포의 생존 및 증식에 관여한다. 본 발명에서는 호로파 복합추출물이 TM3 세포에서의 ERK 활성화에 관여하는지 확인하고자 하였다. TM3 세포를 6웰 플레이트에 접종한 후, 24시간 후에 흑삼과 호로파 추출물(흑삼:호로파)이 1:9, 3:7로 혼합된 추출물을 처리한 후 30 분 후에 세포를 회수하여 단백질을 추출하였다. 추출된 단백질을 bradford 기법으로 정량하여 50 μg의 단백질을 SDS-PAGE에 로딩한 후 전기영동을 실시하여 전개하였고 니트로셀룰로오스 멤브레인에 트랜스퍼한 후 1차 항체 항-ERK(1:1000), 항-phospho ERK(1:1000)(Cell signaling, USA)를 이용하여 면역 블롯팅하고 2차 항체를 이용하여 반응시킨 후, ECL(enhanced chemiluminescence)을 이용하여 감광하여 단백질의 발현량을 확인하였다.

동물모델을 효능 검증

1) 동물모델 확립

남성 갱년기 모델은 남성 성기능 개선 모델과 유사하게 사용되기 때문에 특정 모델이 정해져 있지 않다. 본 발명에서는 인위적인 성 기능 장애모델보다는 자연적으로 성호르몬의 감소의 증상이 나타날 수 있는 모델을 선택하였다. 26주령 쥐를 중앙실험동물에서 구입하여 사용하였다. 26주령 쥐를 1주간 적응시킨 후, 복합추출물을 매일 오전 9시에 경구로 4주간 투여하였다. 대조군, 100 mg/kg 두 개의 그룹으로 나누어 투여하였고, 각 8마리씩 실험을 진행하였다. 3주째에 근지구력 및 운동향상 평가를 위한 강제유영실험을 실시하였고 4주째에 성호르몬 및 조직 무게, 간독성을 위한 장기적출 및 혈액을 채취하였다.

2) 복합추출물의 테스토스테론 증가 효능 검증

남성의 경우 40세가 넘으면 남성호르몬이 매년 2.5%씩 감소하는데 40-49세는 50%, 70세 이상의 70%가 남성호르몬 결핍현상을 보인다고 보고된 바 있다. 이러한 남성 호르몬의 감소는 다양한 질병 및 남성 성기능 장애의 원인이 된다. 본 발명에서는 노화 쥐를 이용하여 호로파 복합물 추출물이 이러한 감소된 남성 호르몬을 증가하는지 확인하고자 하였다. 호로파 복합추출물을 4주간 투여 후 희생시킨 후 혈액을 채취하여 혈장을 분리하였고 혈장에서 남성 호르몬 테스토스테론을 측정하였고, 알부민 및 SHBG를 측정하여 생물학적 활성이 있는 테스토스테론을 계산하였다.

3) 복합추출물의 간 기능 검사 및 지질대사 관련 지표 검증

간 기능검사는 간 효소 검사를 포함하며 ALT(alanin aminotrasferase, SGPT), AST(asparate aminotrasnferase, SGOT)는 간세포의 손상여부를 알아보는데 있어 가장 유용한 지표가 된다. 간세포가 완전히 파괴되기 이전단계에서 간세포에 에너지 공급이 줄어들게 되면, AST, ALT가 세포 밖으로 유출되는데 유출된 이들 효소는 혈류를 타고 빠르게 확산되어 측정하기 용이하게 된다. 본 발명에서는 호로파 복합추출물의 투여가 동물실험에서의 간 기능에 어떠한 영향을 미치는지 확인하고자 혈액 채취 후 혈장분리 후, ALT, AST 키트(Roche, Germany)를 이용하여 측정하였다.

또한, 노화와 관련된 테스토스테론의 저하는 지질대사와 관련된 마커 등을 조절하여 HDL을 감소시킨다고 보고되어 있다. 본 발명에서는 호로파 복합추출물이 LDL-콜레스테롤(Low density lipoprotein cholesterol)과 HDL-콜레스테롤(High density lipoprotein cholesterol), 트리글리세리드 증감에 미치는 영향을 각 측정 키트(Roche, Germany)를 사용하여 확인하였다.

4) 복합추출물의 황체형성호르몬과 여포자극 호르몬 증가 검증

테스토스테론 호르몬은 황체형성 호르몬(LH)과 여포자극 호르몬(FSH)에 의해 조절되며, 황체형성호르몬(LH)과 여포자극 호르몬은 라이디히 세포의 정자형성에 관여하여 기능을 조절한다. 본 발명에서는 복합 추출물이 테스토스테론 호르몬 외에 다른 성선자극 호르몬의 증감에 어떠한 영향이 있는지 확인하고자 혈청을 이용하여 FSH와 LH 호르몬을 측정하였다.

5) 강제 유영실험(Forced swimming test) 을 통한 근지구력 및 운동능력 평가

복합추출물 투여 후 3주째에 근지구력을 평가하기 위한 강제 유영 실험을 실시하였다. 투명한 플렉시글라스 실린더(50 cm × 20 cm) 에 25-27℃ 수온의 물을 채운 후(쥐의 꼬리가 바닥에 닿지 않을 정도의 부피) 각 그룹의 쥐를 동시에 3개의 실린더에서 12분 동안 강제 수영 시킨 후, 활발한 유영 후 움직임이 적거나 떠있는 시간인 무활동(immobility) 시간과 활발한 유영 시간을 보이는 고활동(high activity) 시간을 맹검으로 측정하였고 이는 smart v3.0 video tracking system 프로그램(Panlab Harvard Apparatus, Spain)을 사용하여 분석하였다.

6) 통계분석

데이터 통계는 GraphPad Prism statistics(GraphPad Software, USA)을 이용하여 ttest 및 ANOVA를 이용하여 유의성을 분석하였다.

실험결과

TM3 세포에서의 세포 생존율 증가

1) 흑삼, 호로파 추출물의 세포독성 검증

고환유래 TM3 세포에서의 각 추출물의 세포 독성을 확인하고자 흑삼 추출물과 호로파 추출물을 각 10 μg/ml, 50 μg/ml, 100 μg/ml을 TM3 세포에 투여 한 후 24시간 추가 배양 후에 MTT 어세이를 통하여 세포 생존율을 측정하였다. 그 결과, 각 추출물의 각 농도에서의 유의적인 세포 독성은 나타나지 않았다(도 1).

2) 각 추출물의 산화적 스트레스에 의한 방어효과

흑삼 및 호로파 각 추출물의 산화적 스트레스에 의한 방어효능을 확인하고자 TM3 세포를 배양한 후, 과산화수소 20 μg/ml 와 각 추출물의 2배의 농도에 해당하는 20, 100, 200 μg/ml 농도를 50 μl씩 처리하여 최종 농도가 과산화수소는 10 μg/ml, 각 추출물은 10, 50 , 100 μg/ml이 되게 처리 한 후 추가로 24시간 배양 하였다. 배양 후 상층액을 제거하고 5 mg/ml 농도로 PBS에 희석한 MTT 용액을 100 μl 처리한 다음 2시간 이상 배양하고 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 과산화수소에 의해 40% 정도 감소되었던 세포생존율이 흑삼에서 농도 의존적으로 증가되는 경향을 확인하였으며 특히 호로파 추출물 처리군에서는 100 μg/ml 처리시 90% 가량의 세포 생존율을 나타내어 호로파 추출물에 의한 산화적 스트레스 방어 효능을 검증하였다(도 2A).

또한, 각 추출물의 혼합 비율별 효능을 검증하기 위하여 흑삼: 호로파의 비율을 1:9. 3:7, 5:5로 혼합추출물을 효능을 검증하였다. 그 결과, 산화적 스트레스에 의해 60% 이하로 감소되었던 세포 생존율은 1:9 복합물과 3:7 복합물에서 80% 이상의 생존율로 회복되었다(도 2B). 이를 근거로 하여 이후 실험에서는 복합물의 비율을 3:7로 결정 하였고 각 실험을 3:7 비율 복합물로 진행하였다.

3) 복합 추출물의 세포생존 기전 활성 검증

세포의 생존 및 증식에 관여하는 대표적인 신호전달 분자인 ERK(Extracellular signal-regulated kinases)는 활성산소 및 외부자극에 의해 활성화 되어 세포의 생존 및 증식에 관여한다. 본 발명에서는 복합추출물이 TM3 세포에서의 ERK 활성화에 관여하는지 확인하고자 하였다. TM3 세포를 6웰 플레이트에 접종한 후, 24시간 후에 복합추출물이 흑삼:호로파=3:7로 혼합된 추출물을 처리한 후 30 분 후에 세포를 회수하여 단백질을 추출하여 웨스턴 블롯을 실시한 결과, 50 μg/ml 처리군이 대조군보다 1.3배 정도 유의적인 활성 증가를 보였으며 양성 대조군으로 쓰인 복합물보다 유의성 있는 결과를 확인하였다(도 3).

동물 모델에서의 효능 검증

1) 동물 모델 확립

전임상 실험을 위하여 26주령 된 수컷 쥐를 1주간 적응시킨 후, 복합추출물 100 μg/ml, 500 μg/ml을 4주간 구강 투여 하였다. 4주간 투여한 후, 3주째에 강제유영 실험을 통한 근지구력 운동 능력을 평가하였으며, 4주째에 각 조직 및 혈액을 채취하여 실험에 이용하였다. 동물모델실험에 대한 실험개요는 도 4와 같다.

2) 복합추출물의 동물모델에서의 테스토스테론 증가 효능 검증

남성에서 테스토스테론은 중요한 순환 스테로이드로 주로 고환에서 생성된다. 후기발현 남성 성선기능 저하증의 진단은 오전 7-11시 사이에 채혈한 혈액에서 측정된 총 테스토스테론(total testosterone)과 성호르몬 결합 글로블린(sex hormone binding globulin; SHBG)을 측정하고 이를 이용하여 계산한 유리형 테스토스테론(free testosterone, bioavailable testosterone)을 이용한다. 본 발명에서도 이와 같은 방법으로 혈액을 채취한 후 혈장을 분리하여 각각을 측정하였다.

복합 추출물이 노화쥐 남성 갱년기 모델에서의 호르몬 증가를 나타내는지 확인하기 위하여 26주령 수컷 쥐에 복합물 100 mg/kg을 4주 동안 구강 투여하였다. 매일 오전 9시에 투여하였으며 4주 후 조직적출과 혈액을 채취하였다. 혈액 채취 후, 혈장을 분리하여 테스토스테론, SHBG, 알부민을 측정하였다. 그 결과, 100 mg/kg로 투여한 군에서 총 테스토스테론은 대조군에 비해 1.2배 정도 증가하였고, 생물학적으로 사용되는 유리형 테스토스테론은 100 mg/kg로 투여한 군에서 유의적으로 1.7배 정도 증가되는 것을 확인하였다(도 6).

3) 복합추출물의 조직 및 간 기능 마커 확인

동물모델에서의 성 호르몬 증가 확인과 동시에 복합 추출물이 간기능에 이상영향이 있는지, 혹은 조직손상을 일으켰는지 확인하기 위하여 각 조직의 무게 및 변화를 확인하고 간기능 마커인 ALT와 AST를 확인하였다. 그 결과, 각 조직의 무게 및 성상은 그룹별로 변화를 나타내지 않았고, 간기능 이상일 때 나타나는 ALT와 AST의 변화도 나타나지 않아서 복합 추출물이 동물모델에서 독성을 나타나지 않음을 확인하였다(도 7).

4) 복합 추출물의 지질대사 마커에 미치는 영향 확인

남성 갱년기는 정신적 증상 뿐 아니라 다양한 신체적 증상도 나타나는데, 그중 하나가 복부비만과 여성형 유방이다. 노화가 진행되면 근육량의 감소와 더불어 지방축적에 의한 내장비만이 증가하게 되고 비만이 된다. 물론 비만에 의한 성기능 저하도 나타나지만 남성 호르몬의 감소로 인한 지질대사에 영향을 받아 남성갱년기의 증상이 나타날 수도 있다. 본 발명에서는 테스토스테론을 증가시킨 복합추출물이 지질대사에 미치는 영향을 확인하고자 혈액 중 혈장에서 지질대사 마커인 총 콜레스테롤, LDL, HDL, TG 등을 측정하였다. 그 결과, 각각의 마커에서 대조군 그룹과 큰 차이를 나타내지 않았다(도 8). 이는 복합 추출물이 지질대사에는 큰 변화를 나타나지 않음을 의미한다.

5) 복합 추출물의 호르몬 증가 확인

도 5에서 보는바와 같이 테스토스테론의 생합성 및 대사는 다양한 효소에 의해서 다양한 호르몬으로 변화되며 대사된다. 테스토스테론은 고환의 라이디히 세포에서 생성되어 혈류로 분비되며 신체의 여러 부위로 이동해 작용하는 스테로이드 계열 호르몬이다. 고환은 뇌에 위치한 시상하부-뇌하수체의 조절을 받는데 시상하부에서 황체형성호르몬문비호르몬이 분비되어 뇌하수체를 조절하고 뇌하수체는 황체형성 호르몬(LH)을 분비하여 고환에서 테스토스테론의 생성을 조절한다. 이러한 황체형성 호르몬(LH)와 여포자극호르몬(FSH)도 남성갱년기 진단에 사용되는 호르몬이다. FSH와 LH 모두 라이디히 세포의 기능에 영향을 주는 호르몬이므로 라이디히 세포 및 테스토스테론 합성에 관여한다고 할 수 있다. 본 발명에서 LH 호르몬과 FSH 호르몬을 측정한 결과 100 mg/kg의 복합추출물을 투여한 군에서 LH 호르몬이 1.5배, FSH 호르몬이 1.3배 증가하였고 이는 통계적으로 유의하게 증가됨을 확인하였다(도 9).

6) 복합추출물의 근지구력 및 운동능력 향상 검증

남성갱년기증후군의 신체적 증상 중 하나인 민첩성과 근지구력의 감소는 노화진행에 따라 이루어지기도 하지만 테스토스테론의 감소에 의해 근지구력이 감소되기도 한다. 본 발명에서는 노화쥐 모델에서의 복합추출물이 근지구력 향상에 어떠한 영향을 미치는지 확인하고자, 강제유영실험(Forced swimming test)을 실시하였다(도 10). 그 결과, 대조군에서 보다 100 mg/kg를 처리한 그룹에서 활동성에 의한 유영 시간이 증가되었으며(도 11), 또한 탈진상태 전의 움직이지 않은 행동과 물에 떠있는 시간을 측정하여 무활동 시간을 측정한 결과, 무활동 시간이 감소됨을 확인하였다(도 12). 이는 복합 추출물 투여가 근지구력 및 운동능력을 향상시킴을 나타낸다(도 13).

참고문헌

1. Alexander GM et al., Horm Behav. 1998, 33(2):85-94.

2. Burris AS et al., J Androl. 1992, 13(4):297-304.

3. Christiansen K, J Endocrinol. 2001, 170(1):39-48.

4. Feldman HA et al., J Clin Endocrinol Metab. 2002, 87(2):589-98.

5. Gooren LJ. Parthenon Publishing; 1997;340-51.

6. Gray A et al., J Clin Endocrinol Metab 1991;73:1016-25.

7. Haren M et al., Age Ageing. 2005, 34(2):125-30.

8. Lunenfeld B et al., Aging Male 2005;8:59-74.

9. Nieschlag E et al., Aging Male 2005;8:56-8.

10. Plymate SR et al., J Androl. 1989, 10(5):366-71.

11. Spetz AC et al., Menopause. 2007, 14(6):999-1005.

12. Seungwoo Kang et al., European Journal of Pharmacology, 2010, 110-116.

13. Vermeulen A et al., J Clin Endocrinol Metab. 2001, 86(6):2903.

14. 김문종 등, Kor J Androl, 2008, 26(1)8-10.

15. 김제종, 남성갱년기와 호르몬 보충요법, 대한남성과학회지, 2004, 22(2) 45-51.

16. 홍준혁, Non-androgenic hormone replacement therapy in aging male, 제 6회 카톨릭비뇨기과 심포지움, 22-26.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (10)

1. 호로파 (Trigonella foenum-graecum L.) 종자 에탄올 추출물 및 흑삼 에탄올 추출물의 복합추출물을 유효성분으로 포함하는 남성 갱년기 증상의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
   
2. 삭제
3. 제 1 항에 있어서, 상기 남성 갱년기 증상은 관절 또는 근육의 통증, 골다공증, 다한증, 수면장애, 흥분, 신경과민, 정서불안, 무기력증, 피로, 근력 저하, 우울증, 정력 저하, 성욕 저하, 발기력 저하, 노화 또는 비뇨생식기 기능 저하인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
4. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 혈중 테스토스테론의 함량을 증가시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
5. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 혈중 황체형성 호르몬 및 여포자극호르몬의 함량을 증가시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
6. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 산화 스트레스에 의한 세포 사멸을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
7. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 근지구력 및 운동 능력을 증가시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
8. 제 1 항에 있어서, 상기 복합추출물은 흑삼 에탄올 추출물 및 호로파 종자 에탄올 추출물을 1:9 내지 3:7 중량비로 혼합한 것을 특징으로 하는 조성물.
   
9. 호로파 (Trigonella foenum-graecum L.) 종자 에탄올 추출물 및 흑삼 에탄올 추출물의 복합추출물을 유효성분으로 포함하는 남성 갱년기 증상의 개선용 식품 조성물.
   
10. 제 9 항에 있어서, 상기 복합추출물은 흑삼 에탄올 추출물 및 호로파 종자 에탄올 추출물을 1:9 내지 3:7 중량비로 혼합한 것을 특징으로 하는 조성물.

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