KR101697614B1

KR101697614B1 - 백작약, 백출, 백지 및 백질려를 포함하는 항산화 활성 및 미백, 주름개선용 조성물 및 이를 포함한 기능성 화장품

Info

Publication number: KR101697614B1
Application number: KR1020140162334A
Authority: KR
Inventors: 조정희; 조현우; 최인영; 김지현; 정희정
Original assignee: 한약진흥재단; 재단법인 전남생물산업진흥원; 바이허브 주식회사
Priority date: 2014-11-20
Filing date: 2014-11-20
Publication date: 2017-01-18
Also published as: KR20160060813A

Abstract

본 발명은 백작약; 백출; 백지 및 백질려;를 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화 활성 및 미백, 주름개선용 조성물 및 이를 포함하는 기능성 화장품에 관한 것으로서, 항산화활성을 나타내었으며, melanin 합성 및 tyrosinase 활성 및 단백질 발현양이 억제되었고 세포증가율을 보였으며 배양액에 분비되는 procollagen 함량을 증가시키고, UVB에 의해 감소된 procollagen 분비 또한 농도의존적으로 증가되었다. 따라서, 본 발명에 따른 조성물 및 기능성화장품은 항산화 효능을 갖으며 미백 및 주름개선의 효과가 있다.

Description

백작약, 백출, 백지 및 백질려를 포함하는 항산화 활성 및 미백, 주름개선용 조성물 및 이를 포함한 기능성 화장품{Composition comprising having anti-oxidative for skin whitening and anti-wrinkle effects, and Functional Cosmetic comprising this}

본 발명은 항산화 활성 및 미백, 주름개선용 화장품 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 백작약, 백출, 백지 및 백질려를 일정비율로 조성함으로써, 항산화 활성효과 및 미백과 주름개선 효과를 갖는 조성물 및 이를 포함한 화장품에 관한 것이다.

전 세계적으로 화장품시장이 성장하면서 미용을 목적으로 하는 것 외에도 미백, 주름개선, 자외선 차단 등 기능성 화장품들이 급속이 개발되고 성장하고 있다. 특히 기능성 화장품개발을 위한 신소재 발굴은 피부과학의 발전과 함께 항산화, tyrosinase 억제, 멜라닌합성억제, 주름개선에 대한 연구를 바탕으로 특허 등록이 미국, 일본, 한국을 중심으로 활발하게 이루어지고 있다(Lee HB, Lee HB, Lee CY and Kim EK. (2007). Trend of depigmenting research based on patent analysis. J. Soc. Cosmet. Scientists Korea., 33(4), 209-217).

화장품과 밀접한 관련이 있는 것이 멜라닌세포인데, 멜라닌은 동물의 피부, 머리, 눈의 색을 결정하며 UV 손상으로부터 피부를 보호하는 역할을 한다. 그러나 과량의 멜라닌은 주근깨, 기미, 과색소침착(hyperpigmentation) 같은 피부손상을 일으킨다. 또한 멜라닌합성과정은 과산화수소 및 다른 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)을 발생시켜 멜라닌세포를 산화적스트레스 환경에 놓이게 한다. ROS가 멜라닌 합성 조절에 중요한 역할을 하며 또한 ROS 소거제 혹은 억제제가 UV에 의해 유도되는 멜라닌 합성을 억제하는 것은 잘 알려져 있다.

멜라닌 생성에 주요효소(key enzyme) 역할을 하는 티로시나제(tyrosinase)는 구리이온을 함유하는 metalloprotein으로, 아미노산의 하나인 L-tyrosine을 기질로 L-DOPA (3,4-dihydroxyphenylalanine)로 변환시키고 이것을 다시 산화시켜 L-DOPA-quinone으로 변환시키고, 이렇게 변환된 L-DOPA-quinone은 microphthalmia-associated transcriotion factor (MITF) 및 phospholipase C (PLC), tyrosinase related protein-1 (TRP-1), tyrosinase related protein-2 (TRP-2) 같은 다른 단백질들에 의해 멜라닌으로 합성된다.

또한 반복적인 자외선(ultraviolet radiation, UV) 노출은 광노화를 일으키며 이런 광노화에 의한 피부 손상은 콜라겐 섬유에 손상을 주고, 피부의 표피와 진피층에 깊숙하게 투과하며 여러 효소반응을 포함하는 다양한 과정을 거쳐 세포 및 조직 중에서 활성산소를 생성시키는데, 이렇게 생성된 과잉의 활성산소는 돌연변이, 염증, 발암, 피부노화를 일으키게 된다. 이중 피부노화의 대표적인 증상은 주름으로 자외선에 의한 피부내 활성산소의 세포내 작용과 콜라겐 분해효소의 증가로 주름이 유발되는 것이 알려져 있다.

피부결합조직에는 세포외기질 단백질 중 type I 콜라겐이 가장 많이 존재하며, 그 밖에 엘라스틴, fibronectin, integrin, fibrillin, 프로테오글리칸 등이 존재한다. 새롭게 합성된 프로콜라겐은 효소반응을 거쳐 피부세포의 세포외 공간으로 분비되어 콜라겐 섬유를 형성하는 원료가 되며 콜라겐은 피부의 결합력과 탄력성을 갖게 하는 중요한 요소이다. 그러므로 피부노화와 주름의 개선에 있어 ROS와 같은 활성산소를 제거하는 항산화 물질이나 콜라게네이즈 작용을 억제하고 콜라겐 합성을 촉진시키는 소재의 발굴이 중요하다.

이와 같은 연구를 바탕으로 항산화 효능이 있는 천연물을 이용한 미백화장품 및 콜라겐 합성 물질, UV 자극에 의한 보호 물질을 찾고자 하는 연구가 여전히 활발히 진행되고 있다. 이에 맞추어 본 발명에서도 항산화 활성효능을 포함하며 미백, 주름개선에 도움이 되는 새로운 조성물을 발명해 내게 된 것이다.

한국등록특허 제10-1258355호. 한국등록특허 제10-1456040호

본 발명의 목적은 항산화 활성효과 및 미백과 주름개선 효과를 갖는 백작약, 백출, 백지 및 백질려를 포함하는 항산화 활성 및 미백, 주름개선용 조성물 및 이를 포함한 기능성 화장품을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명에 따른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

백작약, 백출, 백지 및 백질려를 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화 활성 및 미백, 주름개선용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명에 따른 항산화 활성 및 미백, 주름개선용 조성물에서,

상기 백작약, 백출, 백지, 백질려의 조성물 비율은 2~8:2:2:1인 것을 특징으로 한다.

상기 백작약, 백출, 백지, 백질려의 조성물 비율은 6:2:2:1 인 것을 특징으로 한다.

상기 조성물은 상기 백작약, 백출, 백지, 백질려를 일정비율로 혼합한 다음, 혼합물에 그 양의 10배의 증류수를 가하여 85~110℃ 에서 2~5 시간동안 열탕추출 하고, 상층액을 필터하여 동결건조한 것으로 이루어지는 것을 특징으로 한다.

상기 조성물은 상기 백작약, 백출, 백지, 백질려를 일정비율로 혼합한 다음, 혼합물에 그 양의 10배의 증류수를 가하여 100℃ 에서 3 시간동안 열탕추출 하고, 상층액을 필터하여 동결건조한 것으로 이루어지는 것을 특징으로 한다.

제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 조성물은 항산화 활성효능, 미백효능, 및 주름개선효능을 갖는 것을 특징으로 한다.

제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 한다.

상기 기능성 화장품은 항산화 활성효능, 미백효능, 및 주름개선효능을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 백작약, 백출, 백지 및 백질려를 포함하는 조성물 및 이를 포함한 기능성 화장품은 항산화 활성효과 및 미백과 주름개선 효과가 있다.

도 1은 본 발명에 따른 조성물의 DPPH radical scavenger 활성도를 그래프로 나타낸 도면,
도 2는 본 발명에 따른 조성물의 Mushroom tyrosinase 활성 억제 효능을 그래프로 나타낸 도면,
도 3은 본 발명에 따른 조성물의 세포생존율을 그래프로 나타낸 도면,
도 4 및 도 5는 본 발명에 따른 조성물의 JT13-B3에 의한 멜라닌 합성 억제효과 및 tyrosinase 억제효과를 나타낸 도면,
도 6 및 도 7은 본 발명에 따른 조성물의 주름개선효능을 알아보기 위해 JK13-B3에 의한 세포증가효과를 세포생존율 증가 및 프로콜라겐 함량증가 그래프로 나타낸 도면,
도 8은 본 발명에 따른 조성물의 UVB 유도 세포사멸에 대한 JK13-B3의 보호효과를 그래프로 나타낸 도면,

본 발명에서는 항산화 활성효과 및 미백과 주름개선 효과가 있는 조성물로서, 백작약, 백출, 백지 및 백질려의 혼합조성물을 사용하였다.

백작약(Paeoniae Radixa)은 모란과(Paeoniaceae)에 속하는 다년생 식물 작약(Paeonia japonica)의 뿌리로 한방에서 수렴, 완화, 진경, 진통약으로 사용한다. 백작약의 주요 성분으로는 파에오니플로린(paeoniflorin), 옥시파에오니플로린(oxypaeoniflorin), 벤조일파에오니플로린(benzoylpaeoniflorin), 알비플로린(albiflorin), 파에오니올(paeoneol) 등이 있다. 백작약은 평활근 이완, 할혈전, 항염증, 항스트레스, 간독성 보호효과가 연구되었으며, 또한 그 분획물에 의한 항암, 면역기능 촉진 효과 등이 보고되었다. 또한, 미백과 관련하여 B16F10에서 단독처리에 의하여 멜라닌 함량이 억제되었으나 또한 세포 생존율을 감소시키는 결과 또한 관찰되었다.

백출(Atractylodis Rhizoma Alba)은 국화과(Asteraceae)에 속한 삽주(Atractylodes ovate, A. japonica)의 뿌리줄기로 방향성 건위제, 진정, 이뇨,지한, 자양, 안태(安胎)에 사용된다. 약리작용으로 위장관 손상억제 효과, 이뇨작용, 혈당강하작용, 항염증, 항산화효과, 면역조절 효과, 간보호 효과, 관절염 억제 효과 등이 보고되었다. 주요 성분으로는 아트락틸론(atractylone), 3-b-hydroxy-atractylon, 아트락틸레노라이드(atractylenolide) Ⅰ~Ⅲ, 아트락틸레노라이드(atractylenolide) A, B 등이 알려져 있다.

백출의 에탄올 및 메탄올 추출물에 의한 멜라닌 생성억제 및 티로시나제(tyrosinase) 활성 억제에 대한 보고가 있으며, 또한 생약학회지 36(1), 60-63에서는 메탄올 추출물에서 selina4(14),7(11)-dien-8-one을 유효성분으로 보고하기도 하였다.

백지(Angelicae Dahuricae Radix)는 미나리과(Umbelliferae)에 속하는 구릿대(Angelica dahurica) 또는 그 변종의 뿌리이다. 백지는 주로 해열, 진통약으로 치통, 두통에 사용되며 항미생물 작용으로 유방염, 여드름 치료 구강청열제로 이용된다. 백지는 간보호효과, 항염증 효과, 돌연변이 억제 활성, 에탄올 추출물에서 전자공여능 활성, 백지 분획물에서 콜라겐 생성촉진효과, 에탄올 추출물에 의한 미백활성이 연구되었다. 백지의 성분으로는 옥시포세다닌(oxypeucedanin), 임페라토린(imperatorin), 바이아칸겔리콜(byakangelicol), 바이아칸겔리신(byakangelicin) 등이 있다.

자질려(Tribulus fructus)는 백질려라고도 불리며, 납가새과(Zygophyllaceae)에 속하는 1년생 혹은 다녕생 초본인 납가새(Tribulus terrestris)의 성숙한 과실로 현운, 두통 및 흉협불서(胸脇不舒), 유폐불통(乳閉不通)의 증상과 목적다루(目赤多淚), 피부소양 등에 한약으로 사용되어왔다. 백질려에 대한 연구로 백질려 추출물이 혈압강하 효과, Streptococcus mutans에 대한 항치아우식에 미치는 영향, 항알레르기 반응에 미치는 영향 등이 연구되었다. 백질려의 성분으로는 켐페롤(kaemferol), 캠페롤-3-글리코시드(kaemferol-3-glycoside), kaemferol-3-rutinoside, 트리불로시드(tribuloside) 가 알려져 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세하게 설명한다. 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것이 아님은 물론이다.

<시료제조>

백작약, 백출, 백지, 백질려를 일정비율로 혼합한 다음, 혼합물에 그 양의 10배의 증류수를 가하여 대략 85~110℃ 에서 대략 2~5 시간동안 열탕추출 하였다. 그런 다음 상층액을 필터하고 동결건조한 것을 시료로 사용하였다. 바람직한 열탕추출조건은 대략 100℃ 에서 대략 3 시간동안 열탕추출 하는 것이다.

여기서, 백작약, 백출, 백지, 백질려의 조성물 비율은 2~8:2:2:1가 바람직하며, 더욱 바람직한 백작약, 백출, 백지, 백질려의 조성물 비율은 6:2:2:1 이다.

후술하는 실험결과에서 확인할 수 있듯이, 본 발명에 따른 조성비율을 갖는 백작약, 백출, 백지 및 백질려를 포함하는 조성물이 항산화활성을 나타내었으며, 특히 백작약, 백출, 백지, 백질려의 조성물 비율이 6:2:2:1일 때 세포독성을 나타내지 않으면서 항산화 활성을 보였다. 또한, 상기 조성비율에서 melanin 합성 및 tyrosinase 활성 및 단백질 발현양이 억제되었으며, 백작약, 백출, 백지, 백질려의 조성물 비율이 6:2:2:1일 때 24 시간 동안 유의미하게 세포증가율을 보였고 배양액에 분비되는 procollagen 함량을 증가시키는 결과를 나타냈고, UVB에 의해 감소된 procollagen 분비 또한 농도의존적으로 증가되었다.

따라서, 상기 조성비율을 갖는 조성물이 항산화 효능을 갖으며 미백 및 주름개선의 효과를 갖는다는 것을 알 수 있다.

[표1]은 백작약, 백출, 백지, 백질려의 조성물 비율을 달리하여 시료로 제조한 것을 나타낸 것이다.

<실시예1> 항산화 활성효과

1-1. DPPH 라디칼 소거능 측정

DPPH 라디칼 소거능은 한국식품영양과학회지(Kim MJ and Park EJ. (2011). Feature analysis of different in vitro antioxidant capacity assays and their application to fruit and vegetable samples. J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. 21, 746-752)에 소개된 방법을 변형하여 각 농도별 시료 40 uL와 1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl (DPPH) 용액 160 uL를 가하여 잘 혼합한 다음 암소에서 30분간 반응 시킨 후 518 nm에서 흡광도를 측정하여 농도에 따른 DPPH 라디칼 소거능을 확인하였다.

1-2. Mushroom tyrosinase 억제 측정

Tyrosinase 저해 활성은 L-tyrosine을 기질로 하여 spectrophotometry를 이용하여 측정하였다. 96 well plate에 0.1 M 인산염완충액(pH 6.8) 220 μl와 농도별 시료액 20 μl 그리고 tyrosinase(125 unit/ml)액 20 μl를 순서대로 넣었다. 이 용액에 1.5 mM L-tyrosin 액 40 μl를 넣고 37℃에서 10～15분 동안 반응시켰다. 그리고 이것을 microplate reader를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 공시료액으로 시료액 대신 0.1 M인산염완충액(pH 6.8)을 넣었다. 양성대조군은 코직산(Kojic acid)을 사용하였다.

<실시예2> 미백활성 측정

2-1. 세포배양

본 실험에 사용한 세포는 10% FBS와 1% penicillin/streptomycin (100u/ml)을 첨가한 DMEM 배지에서 37℃, 5% CO₂ 세포배양기를 이용하여 배양하였다.

2-2. 세포 생존율 측정(MTS assay)

B16F10 murine melanoma cells에 대한 세포생존율을 MTS[3-(4,5-dimethylthiaxol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, inner salt] 세포생존율 측정 Kit를 이용하여 확인하였다. B16F10을 5 x 10³ cells/well 농도로 10% FBS가 첨가된 DMEM에서 96-well plate에 24 시간 동안 5% CO₂ 37℃ 세포배양기에서 배양하였다. 배양액을 바꿔주고 각 well에 TKM13-BH3을 50, 100, 500, 1000ug/ml 농도로 처리하고 48 시간 배양하고, Cell Proliferation MTS Kit (Promega Corporation, Madison, USA)를 사용설명서의 방법으로 측정하였다. 요약하면, MTS시약을 10 μL씩 각 well에 첨가한 뒤, 3 시간 동안 37°C에서 배양하였다. 그 후 생성된 formazan을 microplate reader를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. TKM13-BH3을 처리하지 않은 군을 100%로 세포 생존율을 나타내었다.

2-3. 세포 내 멜라닌 함량 측정

미백 활성 분석을 위하여 B16F10 cells을 이용하여 멜라닌 함량을 기능성 화장품의 유효성평가를 위한 가이드라인 (2003) 및 Huang 등(31)의 방법을 이용하여 측정하였다. B16F10 cells을 5×10⁵cells로 6 well culture dish에 분주하여 세포를 안정화 시키고 TKM13-BH3을 50, 100, 500, 1000ug/ml 농도 처리하였다. 한 시간 후 α-MSH을 100 nM 농도로 처리하고 48시간 후 세포를 phosphate bufferd saline(PBS)로 씻어주고 세포에 10% DMSO가 포함된 1 N sodium hydroxide (NaOH) 용액을 처리하여 80℃에서 한 시간 동안 반응 시키고 microplate reader를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로 Kojic acid 1000 ug/ml를 세포에 처리하여 사용하였다.

2-4. 세포 내 tyrosinase 활성 측정

B16F10 cells을 5×10⁵ cells 로 6 well culture dish에 분주하여 세포를 안정화 시키고 TKM13-BH3을 50, 100, 500, 1000ug/ml 농도 처리하였다. 한 시간 후 α-MSH을 100 nM 농도로 처리하고 48시간 후 세포를 phosphate buffered saline(PBS)로 씻어주고 cell lysis buffer를 첨가하여 vortex로 잘 섞어주고 4℃에 보관하였다. 10분에 한번씩 vortex에 잘 섞어주고 3회 후 15,000rpm, 15분, 4℃에서 원심분리 하여 상층액을 실험에 사용하였다. BCA protein assay kit (Sigma)를 이용하여 단백질을 정량하고 같은 양의 단백질을 이용하여 1mg/ml L-DOPA 100ul 에 50ul 단백질 시료를 처리하여 30 분 동안 37℃에서 반응시키고 microplate reader를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.

2-5. Tyrosinase 단백질 발현양 측정

단백질 수준의 tyrosinase는 western blot방법을 이용하여 측정하였다. B16F10을 5×10⁵ cells로 6well 에 분주하여 24 시간 동안 배양기에서 안정화 시켰다. 새로운 배지로 바꿔주고 TKM13-BH3을 50, 100, 500, 1000ug/ml 농도 처리하였다. 한 시간 후 a-MSH를 처리하고 48 시간 후에 PBS로 세척하고 원심분리로 세포를 수거하였다. 세포는 1% proteinase inhibitor 가 포함된 cell lysis buffer (Enzo Life Sciences) 200 ul에서 용해되고 15,000 rpmⅹ 15 min, 4℃ 에서 원심분리하고 얻은 상층액을 BCA protein assay kit (Sigma)를 이용하여 단백질을 정량하고 30 ug을 10% SDS-PAGE를 이용하여 전기영동으로 단백질을 분리하였다. 분리된 단백질은 PVDF membrane에 옮겨기고 1시간 동안 5% skim milk in TBST 에서 blocking 하고 1차 항체로 tyrosinase, GAPDH를 처리하여 4℃ 에서 overnight으로 반응시켰다. 이후 10분 간격으로 TBST로 3회 washing 하고 2차 항체를 실온에서 1시간 반응시키고 다시 3회 TBST를 이용하여 washing 하였다. ECL solution에 1분 동안 반응시키고 imaging system (Li-Cor Inc., Lincoln, USA)을 이용하여 확인하였다.

<실시예3> 사람피부세포주를 이용한 주름개선 효과 측정

3-1. 세포배양

본 실험에 사용한 HDFn 세포는 HDFn 세포는 10% low serum growth supplement (LSGS, Invitrogen)이 포함된 Medium 106 (Gibco) 에서 37℃, 5% CO₂ 세포배양기를 이용하여 배양하였다.

3-2. 세포성장효과 (MTS assay)

시료를 HDFn에 농도별로 처리하고 24 시간 동안 증가된 세포성장율을 MTS[3-(4,5-dimethylthiaxol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, inner salt] 세포성장 측정 Kit를 이용하여 확인하였다. HDFn을 5 x 10³ cells/well을 96-well plate에 24 시간 동안 5% CO₂ 37℃ 세포배양기에서 배양하였다. 배양액을 바꿔주고 각 well에 각 시료를 100, 500ug/ml 농도로 처리하고 24 시간 배양하고, Cell Proliferation MTS Kit (Promega Corporation, Madison, USA)를 사용설명서의 방법으로 측정하였다. 요약하면, MTS시약을 10 μL씩 각 well에 첨가한 뒤, 3 시간 동안 37°C에서 배양하였다. 그 후 생성된 formazan을 microplate reader를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료를 처리하지 않은 군을 100%로 세포성장율을 나타내었다.

3-3. UVB 유도 세포사멸에 대한 보호 효과

세포를 5 x 10⁴ cells/well로 48 well에 접종한 후, 24 시간 배양하였다. 배양액을 제거하고 48 well plate에는 PBS를 50ul씩 넣고 UVB를 세포에 조사하고 각 well의 PBS를 제거하고 배양액을 넣어30분 안정화 시킨 후 각 시료를 농도별로 처리하였다. 24시간 후 , Cell Proliferation MTS Kit (Promega Corporation, Madison, USA)를 이용하여 세포 생존율을 확인하였다.

3-4. Procollagen type-1 생합성 효과

세포를 5 x 10⁴ cells/well로 48 well에 접종한 후, 24 시간 배양하였다. 이후 새로운 배양액으로 바꿔주고 각 시료를 농도별로 첨가하여 배양기에서 24 시간 더 배양하였다. 동시에 또 다른 48 well plate에는 PBS를 100ul씩 넣고 UVB를 세포에 조사하고 각 well의 PBS를 제거하고 배양액을 넣어주고 30분 안정화 시킨 후 각 시료를 농도별로 처리하였다. 24 시간 후 배양액을 모아 Procollagen type-1 C-Peptide (PIP) EIA Kit (Takara Bio, Japan)를 이용하여 배양액 내 procollagen을 측정하였다.

<실험결과>

4-1. DPPH radical scavenger 활성

DPPH는 안정한 free radical로 항산화 활성을 평가하는데 빠르고 간편하게 이용된다. JK13-B1,B2,B3, 그리고 B4를 농도별로 처리하고 DPPH radical 소거능을 측정한 결과는 도 1에 그래프로 나타내었다.

도 1에 도시된 바와 같이, 500ug/ml 농도를 기준으로 JK13-B4, JK13-B3, JK13-B2 순서로 DPPH radical 소거능이 관찰되었다.

4-2. Mushroom tyrosinase 활성 억제 효능

Tyrosinase 에 의해 L-DOPA가 DOPA quinone으로 산화되는 반응을 JK13-B1,B2,B3, 그리고 B4에의해 억제되는지 확인한 결과는 도 2에 그래프로 나타내었다.

도 2에 도시된 바와 같이, 각 물질에서 고르게 tyrosinase 활성이 억제되었으며 특히 JK13-B2, B3, B4, B1 순서로 활성이 높게 관찰되었다.

4-3. 세포생존율

B16F10을 이용한 세포생존율 측정을 통하여 세포 독성에 대한 관련성을 확인하였다. 각 샘플을10, 50, 100, 500, 1000 ug/ml 농도로 B16F10에 처리하고 48시간 동안 배양하였다. 이후 세포생존율을 관찰한 결과는 아래 [표2]와 도 3에 그래프로 나타내었다.

도 3에 도시된 바와 같이, JK13-B4의 경우 50 ug/ml, 100 ug/ml 88.83±3.99%, 87.59±4.16% 로 대조군(B)와 비교했을 때 유의한 차이가 (P<0.05) 관찰되었으나 JK13-B1, B2, B3의 경우 세포 생존율에서 유의한 차이가 관찰되지 않았다.

4-4. JT13-B3에 의한 멜라닌 합성 억제효과 및 tyrosinase 억제효과

JK13-B1,B2,B3, 그리고 B4를 이용한 DPPH, mushroom tyrosinase 활성 및 B16F10 cell viability 활성을 종합적으로 검토해 본 결과 JK13-B3에서 세포독성이 없으면서 DPPH, mushroom tyrosinase 활성이 높게 관찰되어 이후 실험은 JK13-B3에서 진행하였다. 결과는 도 4에 그래프로 나타내었다.

도 4에 도시된 바와 같이, JK13-B3을 B16F10에 처리하고 한 시간 후에 a-MSH를 가하여 48시간 배양하였다. A-MSH를 처리한 그룹에서 a-MSH를 처리하지 않은 그룹에 비하여 40% 정도의 멜라닌 합성을 유도하였다. 그러나 JK13-B3을 전처리한 그룹에서는 a-MSH에 의한 멜라닌 합성이 억제되었으며 특히 500 ug/ml, 1000 ug/ml 농도에서 유의미하게 a-MSH 그룹과 차이를 보였다. 특히 JK13-B3을 1000 ug/ml 농도로 처리했을 때 대조군으로 사용된 kojic acid와 비슷하게 멜라닌 합성 억제효과를 보였다.

또한 멜라닌합성에 주요 효소로 알려진 tyrosinase의 활성을 관찰하였다. A-MSH를 처리한 군에서 a-MSH를 처리하지 않은 군에 비하여 tyrosinase 활성이 20% 정도 높았으나 JK13-B3를 전처리 했을 경우 tyrosinase 활성이 억제되었다. 또한 멜라닌합성 억제 결과와 같이 JK13-B3 500ug/ml, 1000ug/ml로 처리했을 때 a-MSH 단독 처리한 그룹과 유의미한 차이를 보였으며 1000 ug/ml 농도에서 kojic acid 1000ug/ml농도와 비슷하게 tyrosianse 활성 억제 효과를 보였다.

또한, JK13-B3에 의한 B16F10에서 tyrosianse 발현을 조절 효과를 확인하기 위하여 western blot을 실시한 결과는 도 5에 나타내었다.

도 5에 도시된 바와 같이, a-MSH에 의해 tyrosinase가 과발현되었으나 JK13-B3 전처리에 의하여 농도의존적으로 tyrosinase 발현양이 감소하는 것을 관찰할 수 있었다.

4-5. 사람섬유아세포를 이용한 주름개선 효과

4-5-1. JK13-B3에 의한 세포증가효과

사람섬유아세포 (human dermal fibroblast neonatal, HDFn)를 1ⅹ10³ cells/well로 96 well plate에 처리하고 24시간 배양한다. 이후 새 배지로 바꿔주고 각 물질을 농도별로 처리하고 24시간 후 cell proliferation kit를 이용하여 세포증식률을 확인한 결과는 도 6에 그래프로 나타내었다.

도 6에 도시된 바와 같이, JK13-B1,B2,B4에서는 세포 생존율에 영향을 미치지 않았으나, JK13-B3에서 농도의존적으로 세포생존율 증가를 보였으며 500 ug/ml 농도에서 샘플을 처리하지 않은 군에 비하여 유의미한 차이를 보였다.

또한, 도 7에 도시된 바와 같이, 무처리군의 세포 생존율을 100%로 했을 때 JK13-B2의 500 ug/ml 농도에서 106.17 ± 1.15% (P<0.01)의 세포 증가율을 보였으며, 세포 배양액을 이용한 procollagen 함량을 확인했을 때 무처리군이 100% 일때 JK13-B2의 500 ug/ml 농도에서 139.37 ± 6.28% (P<0.01)로 증가됨을 확인할 수 있었다.

4-5-2. UVB 유도 세포사멸에 대한 JK13-B3의 보호효과

반복적인 자외선 노출은 피부노화의 중요한 원인이다. 본 발명에서 HDFn에 ultra violet B (UVB)를 조사하여 세포 사멸을 유도했으며 JK13-B3에 의한 보호 효과를 확인한 결과는 도 8에 그래프로 나타내었다.

도 8에 도시된 바와 같이, JK13-B3의 경우 100 ug/ml 과 500 ug/ml 농도에서 UVB만을 조사한 군과 비교하여 유의미하게 세포 보호효과가 관찰되었다. 또한 UVB에 의해 감소된 procollagen 분비에 대해서도 JK13-B3 처리에 의해 회복 되는 것을 확인할 수 있었다.

결과적으로, 본 발명에 따른 백작약, 백출, 백지 및 백질려를 포함하는 항산화 활성 및 미백, 주름개선용 조성물인 JK13-B1,B2,B3,B4 를 이용한 DPPH radical, mushroom tyrosinase 활성 시험에서 각 물질은 항산화활성을 나타내었으며, 특히 JK13-B3 물질의 경우 B16F10 세포에 독성을 나타내지 않으면서 항산화 활성을 보였다.

또한, B16F10을 이용한 in vitro 실험에서 각 농도에서 a-MSH에 의해 유도되는 melanin 합성 및 tyrosinase 활성 및 단백질 발현양이 억제되었으며 이것은 농도의존적으로 관찰되었다. 특히 1000ug/ml 농도에서는 양성 대조군으로 사용된 kojic acid와 비슷하게 효능을 보였다.

또한, HDFn 세포를 이용한 주름 개선 활성 연구에서 500 ug/ml JK13-B3은 24 시간 동안에 유의미하게 세포증가율을 보였으며 또한 배양액에 분비되는 procollagen 함량을 증가시키는 결과를 나타냈다.

또한, UVB에 유도되는 세포생존율 감소를 JK13-B3은 농도의존적으로 억제하였으며, UVB에 의해 감소된 procollagen 분비 또한 농도의존적으로 JK13-B3에 의해 증가됨을 확인하였다.

따라서, JK13-B3은 항산화 효능을 갖으며 미백 및 주름개선의 효과를 갖는 조성물로 사용될 수 있음을 확인하였다.

비록 본 발명이 상기에서 언급한 바람직한 실시예와 관련하여 설명되었지만, 본 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다른 다양한 수정이나 변형이 가능할 것이다. 따라서, 첨부된 청구범위는 본 발명의 진정한 범위 내에 속하는 그러한 수정 및 변형을 포함함은 물론이다.

Claims

백작약; 백출; 백지 및 백질려;를 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화 활성 및 미백, 주름개선용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 백작약, 백출, 백지, 백질려의 조성물 비율은 2~8:2:2:1인 것을 특징으로 하는 항산화 활성 및 미백, 주름개선용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 백작약, 백출, 백지, 백질려의 조성물 비율은 6:2:2:1 인 것을 특징으로 하는 항산화 활성 및 미백, 주름개선용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 상기 백작약, 백출, 백지, 백질려를 일정비율로 혼합한 다음, 혼합물에 그 양의 10배의 증류수를 가하여 85~110℃ 에서 2~5 시간동안 열탕추출 하고, 상층액을 필터하여 동결건조한 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 항산화 활성 및 미백, 주름개선용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 상기 백작약, 백출, 백지, 백질려를 일정비율로 혼합한 다음, 혼합물에 그 양의 10배의 증류수를 가하여 100℃ 에서 3 시간동안 열탕추출 하고, 상층액을 필터하여 동결건조한 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 항산화 활성 및 미백, 주름개선용 조성물.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 조성물은 항산화 활성효능, 미백효능, 및 주름개선효능을 갖는 것을 특징으로 하는 항산화 활성 및 미백, 주름개선용 조성물.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 항산화 활성 및 미백, 주름개선용 기능성 화장품.
제 7항에 있어서,
상기 기능성 화장품은 항산화 활성효능, 미백효능, 및 주름개선효능을 갖는 것을 특징으로 하는 항산화 활성 및 미백, 주름개선용 기능성 화장품.