KR101694945B1 - 톳 추출물을 유효성분으로 함유하는 자외선 차단용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 톳(S. fusiforme) 추출물 또는 상기 톳 추출물을 크로마토그래피로 분리한 플로로탄닌 함유 활성분획을 유효성분으로 함유하는, 자외선 차단용 조성물을 제공한다.
Description
본 발명은 자외선 차단용 조성물에 관한 것으로서, 더 상세하게는 톳 추출물을 유효성분으로 함유하는 자외선 차단용 조성물에 관한 것이다.
피부노화(skin aging)는 크게 내인성 노화(intrinsic aging)와 외인성 노화(exogenic aging)로 구분되는데 전자는 나이를 먹음에 따라 신체 기능이 저하되는 것을 의미하며, 후자는 지속적인 자외선(Ultraviolt, UV) 등과 같은 외부 자극에 노출되었을 때 야기된다. 광노화의 대표적인 원인 중 하나인 자외선은 파장의 길이에 따라 UV-A(320~400 nm), UV-B(280~320 nm) 및 UV-C(100~280 nm)로 분류된다. UV-C는 오존층에 의해 대부분 흡수되어 지표까지는 미미한 양만이 도달하지만 UV-A는 상대적으로 긴 파장으로 피부 면역 체계에 작용하여 장기적 피부 손상을 일으킬 수 있고, 노출시간이 길어지면 피부암 발생의 위험이 있는 것으로 보고된 바 있다. UV-B는 피부의 표피층까지만 도달함에도 불구하고 장시간 노출 시 홍반, 수포, 피부 갈라짐, 주름 및 피부암까지 유발하기도 한다. 이러한 자외선을 효과적으로 차단하기 위해 무기자외선 산란제 또는 유기자외선 흡수제가 많이 사용 되고 있으나 모공을 막아 여러 가지 부작용이 나타나기도 하고 자외선을 흡수하여 피부를 보호하지만 알레르기에 의한 접촉성 피부염의 원인이 되기도 한다.
대표적인 해조류 중 하나인 톳(Sargassum fusiforme)은 우리나라와 일본 등 동아시아에 분포하고 있으며, 국내에서는 식용으로 알려져 있고, 특히 일본에서는 많은 수요를 보이고 있는 갈조류이다. 톳에 대한선행 연구를 통해 높은 항산화 효능이 확인되었을 뿐만 아니라 항염증 반응을 통한 아토피 증상 완화 효과를 보이는 것으로 입증되어 피부 개선에 대한 잠재력이 인정되었다.
대한민국 등록특허 제1475505호는 톳 추출물을 유효성분으로 함유하는 미백용 화장료 조성물을 개시하고 있다.
그러나 상기 선행기술은 톳 추출물을 유효성분으로 함유하는 기능성 화장품 소재에 관한 것일 뿐 톳 추출물을 이용한 자외선 차단제에 관한 연구는 전무하다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 톳 추출물을 유효성분으로 함유하는 자외선 차단용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 톳(S. fusiforme) 추출물 또는 상기 톳 추출물을 크로마토그래피로 분리한 플로로탄닌 함유 활성분획을 유효성분으로 함유하는, 자외선 차단용 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 톳(S. fusiforme) 추출물 또는 상기 톳 추출물을 크로마토그래피로 분리한 플로로탄닌 함유 활성분획을 유효성분으로 함유하는, 피부노화 개선용 화장료 조성물이 제공된다.
상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 톳 추출물로부터 제조된 자외선 차단용 조성물을 이용하여 효율적인 자외선 차단효과를 구현할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 바다에서 채집한 톳(Sargassum fusiforme)으로부터 플로로탄닌 추출물(phlorotannins extract, PE) 추출공정을 나타내는 순서도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 건조된 톳 100 g으로부터 확보된 플로로탄닌의 총 함량을 측정한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 플로로탄닌 추출물 내에 함유된 플로로탄닌을 분리, 정제하기 위해 HPLC-MS 분석을 수행하여 디페닐 에테르(diphenyl ether)를 동정한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 플로로탄닌 추출물 내에 함유된 플로로탄닌을 분리, 정제하기 위해 HPLC-MS 분석을 수행하여 플로로퓨코퓨로엑콜 A(phlorofucofuroeckol A)를 동정한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 플로로탄닌 추출물(PE)의 항산화 효능을 확인하기 위해 DPPH 라디칼 소거효능 분석(DPPH radical scavenging assay)을 수행한 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 플로로탄닌 추출물(PE)의 항산화 효능을 확인하기 위해 히드록실라디칼(hydroxyl radical)에 의한 단백질 분해 억제효능을 분석한 겔 사진이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 인간 섬유아세포(human fibroblast) 유래 CCD-986sk 세포주를 대상으로 UV-B에 의한 일산화질소(NO) 발생 조건을 측정한 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 PE 처리에 의해 UV-B를 효과적으로 차단함으로써 NO의 발생을 조절할 수 있는가를 확인한 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 세포에 UV-B 조사 후 생성되는 LDH(lactate dehydrogenase)의 양을 측정함으로써 상대적인 독성 수준을 비교한 그래프이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 V-B에 의해 독성이 유발된 세포에 PE를 처리하여 세포 독성저하 효능을 관찰한 그래프이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따라 세포에 UV-B를 조사하여 직접적인 세포사(apoptosis)가 유도되는 시간을 측정한 사진이다.
도 12은 본 발명의 일 실시예에 따라 세포에 PE를 처리 하고 UV-B를 조사하여 세포사를 유도함으로써 PE에 의한 세포 보호효과를 검증한 사진이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따라 PE에 의한 UV-B 차단 및 세포 보호 효과를 측정한 그래프이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따라 PE에 의한 MMP-1 발현 기전의 조절 여부를 확인하기 위해 웨스턴 블랏을 수행한 겔 사진이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 건조된 톳 100 g으로부터 확보된 플로로탄닌의 총 함량을 측정한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 플로로탄닌 추출물 내에 함유된 플로로탄닌을 분리, 정제하기 위해 HPLC-MS 분석을 수행하여 디페닐 에테르(diphenyl ether)를 동정한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 플로로탄닌 추출물 내에 함유된 플로로탄닌을 분리, 정제하기 위해 HPLC-MS 분석을 수행하여 플로로퓨코퓨로엑콜 A(phlorofucofuroeckol A)를 동정한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 플로로탄닌 추출물(PE)의 항산화 효능을 확인하기 위해 DPPH 라디칼 소거효능 분석(DPPH radical scavenging assay)을 수행한 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 플로로탄닌 추출물(PE)의 항산화 효능을 확인하기 위해 히드록실라디칼(hydroxyl radical)에 의한 단백질 분해 억제효능을 분석한 겔 사진이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 인간 섬유아세포(human fibroblast) 유래 CCD-986sk 세포주를 대상으로 UV-B에 의한 일산화질소(NO) 발생 조건을 측정한 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 PE 처리에 의해 UV-B를 효과적으로 차단함으로써 NO의 발생을 조절할 수 있는가를 확인한 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 세포에 UV-B 조사 후 생성되는 LDH(lactate dehydrogenase)의 양을 측정함으로써 상대적인 독성 수준을 비교한 그래프이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 V-B에 의해 독성이 유발된 세포에 PE를 처리하여 세포 독성저하 효능을 관찰한 그래프이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따라 세포에 UV-B를 조사하여 직접적인 세포사(apoptosis)가 유도되는 시간을 측정한 사진이다.
도 12은 본 발명의 일 실시예에 따라 세포에 PE를 처리 하고 UV-B를 조사하여 세포사를 유도함으로써 PE에 의한 세포 보호효과를 검증한 사진이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따라 PE에 의한 UV-B 차단 및 세포 보호 효과를 측정한 그래프이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따라 PE에 의한 MMP-1 발현 기전의 조절 여부를 확인하기 위해 웨스턴 블랏을 수행한 겔 사진이다.
용어의 정의:
본 문서에서 사용되는 용어 "톳(Sargassum fusiforme)"은 갈조식물(phaeophyta)문 모자반과의 바닷말로 우리나라의 서해안, 남해안 및 제주도에 서식하는 천연자원 식물로 식이섬유가 풍부하고 혈액응고작용 및 면역증강작용 등의 기능을 갖는 중성다당류인 라미나란(laminaran)과 함황산성 다당류인 푸코이단(fucoidan)을 다량 함유하고 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "플로로탄닌(phlorotannins)"은 갈조류에서 생성되는 폴리페놀성 물질로 플로로글루시놀(phloroglucinol) 유도 물질이다. 갈조류의 감태, 대황, 모자반 및 패 등에서 많은 플로로탄닌 성분을 함유하고 있고 이 성분은 항산화 효과, 항염 효과, 미백 효과, 항고혈압 효과 및 항당뇨 효과 등 우수한 효과가 있다고 보고되었다.
본 문서에서 사용되는 용어 "DPPH(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl, Sigma-Aldrich, MO, USA)"는 화학적으로 안정화된 수용성 자유 라디칼(free radical)로서 517 nm에서 특징적인 광흡수를 나타내는 보라색 화합물이다. DPPH는 알코올 등의 유기용매에서 매우 안정하며, 항산화활성이 있는 물질과 만나면 전자를 내어주면서 라디칼(DPPH)이 소멸되어 최초 용액의 보라색빛깔에서 노란색으로 색깔이 변화되어 산화 활성을 육안으로도 쉽게 관찰할 수 있어 항산화 활성실험에 활용되고 있는 대표적인 물질이다.
본 문서에서 사용되는 용어 "NO(nitric oxide)"는 아르지닌(L-arginine)으로부터 산화질소 합성효소(nitric oxide synthase)에 의하여 생성되는 물질로 신체 내 다양한 생리 조절 인자로 작용하는데 피부에서는 UV에 노출되었을 때 증가하게 되며 과도하게 합성되었을 경우 홍반 등을 일으키게 된다.
본 문서에서 사용되는 용어 "LDH(lactate dehydrogenase)"는 NADH를 이용하고 젖산을 탈수소하여 피루브산으로 만드는 세포질효소로 일반적으로 강한 UV는 세포 독성을 야기하게 되는데 독성이 유발된 세포는 Lactate dehydrogenase(LDH)를 생성하게 되어 이를 측정함으로써 상대적인 독성 수준을 비교할 수 있어 세포독성분석(Lactate dehydrogenase(LDH) release assay)에 이용된다.
발명의 상세한 설명:
본 발명의 일 관점에 따르면, 톳(S. fusiforme) 추출물 또는 상기 톳 추출물을 크로마토그래피로 분리한 플로로탄닌 함유 활성분획을 유효성분으로 함유하는, 자외선 차단용 조성물이 제공된다.
상기 조성물에 있어서, 상기 톳 추출물은 C1 내지 C4의 저급 알콜, 주정 또는 이들의 혼합용매로 추출하여 제조될 수 있다.
상기 자외선은 UV-A, UV-B 또는 UV-C일 수 있고 상기 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 톳 추출물이 0.1 내지 50 중량부로 포함될 수 있다.
상기 톳 추출물은 ⅰ) 톳을 n-헥산에 침지하여 지질을 제거하고 아세톤으로 추출한 아세톤 추출물; ⅱ) 상기 아세톤 추출물을 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 그의 수용액으로 염을 제거한 알코올 추출물; 및 ⅲ) 상기 알코올 추출물로 추출하는 과정에서 남은 잔사를 톨루엔(toluene) 이용하여 색소를 제거하고 아세톤으로 재추출한 아세톤 추출물로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상의 혼합물일 수 있다.
상기 조성물에 있어서, 상기 플로로탄닌은 디페닐 에테르(diphenyl ether) 또는 플로로퓨코퓨로엑콜 A(phlorofucofuroeckol A)일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 톳(S. fusiforme) 추출물 또는 상기 톳 추출물을 크로마토그래피로 분리한 플로로탄닌 함유 활성분획을 유효성분으로 함유하는, 피부노화 개선용 화장료 조성물이 제공된다.
상기 톳 추출물은 ⅰ) 톳을 n-헥산에 침지하여 지질을 제거하고 아세톤으로 추출한 아세톤 추출물; ⅱ) 상기 아세톤 추출물을 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 그의 수용액으로 염을 제거한 알코올 추출물; 및 ⅲ) 상기 알코올 추출물로 추출하는 과정에서 남은 잔사를 톨루엔(toluene) 이용하여 색소를 제거하고 아세톤으로 재추출한 아세톤 추출물로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상의 혼합물일 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: 톳 유래 phlorotannins 추출
본 발명에 사용된 톳은 2012년 12월에서 2013년 1월까지 동해에서 채집하여 염분과 모래를 수돗물로 제거한 후 음지에 자연건조 하고 파쇄한 뒤 보관하였으며, 증거표본은 국립생물자원관에 보관하였고(표본 바우처: NIBRAL0000137941), 플로로탄닌 추출물(phlorotannins extract, PE) 추출은 종래의 방법(Fairhead et al., Polar Biol 28 : 680-686. 2005; Lopes et al., PLoS ONE 7 : e31145. 2012)을 응용하여 하기와 같이 추출하였다.
우선, 상기 파쇄한 톳 100 g을 300 mL의 n-헥산(n-hexane)에 2회 침지하여 상등액을 제거함으로써 지질을 제거하고 용매를 증발시킨 후 남은, 잔사를 70% 아세톤 수용액 500 ml에 다시 침지하여 실온에서 24시간동안 추출하였으며, 필터 페이퍼(Whatmann International Ltd., Maidstone, UK)로 여과한 뒤 용매를 증발시켜(Rotary evaporator, N-1110, Eyela, Tokyo, Japan) 아세톤 추출물을 확보하였다. 상기 아세톤 추출물을 100% 메탄올 500 ml에 침지하여 상등액을 제거함으로써 염을 제거하고, 용매를 증발시킨 후 남은 잔사를 톨루엔(toluene)으로 세척함으로써 색소를 완전히 제거한 뒤 70% 아세톤 수용액 500 ml을 이용하여 재추출하였다. 상기와 같이 아세톤으로 재추출된 상등액의 용매를 증발시켜 최종 플로로탄닌 함유 톳 추출물 6.28 g을 수득하였다(도 1).
실시예 2: DMBA 분석
본 발명의 일 실시예에 따라 추출한 플로로탄닌 추출물(PE)을 정량적으로 측정하기 위해 DMBA 분석을 수행하였다.
구체적으로, 상대적으로 비교하여 산출하기 위한 표준물질(standard substance)로는 플로로글루시놀(phloroglucinol, Sigma-Aldrich, MO, USA)을 사용하였고 PE 절대량 내에 함유되어 있는 플로로탄닌의 상대적인 용량을 확인하기 위해 PE를 62.5~1000 ㎍이 되도록 증류수에 용해시킨 후 모든 샘플의 최종 용량을 10 ㎕가 되도록 조정한 뒤 메탄올 10 ㎕ 첨가하고 N,N-디메틸포름아마이드(DMF) 10㎕ 및 아세트산(acetic acid)으로 희석한 16% 염산(hydrochloric acid) 200 ㎕를 첨가하였다. 상기 준비된 각 혼합액에 대해 아세트산에 녹인 DMBA(20 mg/mL) 200 ㎕ 첨가 한 후 60분간 30℃ 항온수조(water bath)에서 인큐베이션하고 510 nm에서 흡광도를 측정하여 표준물질 농도에 대한 상대적인 함량을 산출하였다.
PE의 절대량에 따른 플로로탄닌의 함량을 측정한 후 이를 바탕으로 회귀방정식을 작성한 뒤 추출물 총량을 대입한 결과 건조된 톳 100 g으로부터 확보된 플로로탄닌의 총 함량은 약 57.87 mg으로 확인되었으며, 최종 추출물(PE) 중에는 9.21 mg/g(0.9% 건조 중량)가 함유되어 있는 것으로 산출되었다(도 2).
실시예 3: HPLC-MS 분석
본 발명의 일 실시예에 따라 상기 최종 추출물(PE) 내에 함유된 플로로탄닌을 분리, 정제하기 위해 HPLC-MS 분석을 수행하였다.
구체적으로, 톳으로부터 추출한 PE는 HPLC(Thermo Accela UPLC, Waltham, MA, USA)-MS(Thermo LTQ- Orbitrap XL, Waltham, MA, USA)를 통해 분석하였고, 시료는 증류수에 녹여 사용하였으며, 1회 측정 시 2 ㎕를 주입하였다. 상기 분석에 사용한 컬럼은 ACQUITY BEH C18 column(150×2.1mm, 1.7 ㎛)을 사용하였고 이동상(mobile phase)은 증류수에 0.1% 포름산을 첨가한 용매 A와 아세토나이트릴(acetonitrile)에 0.1% 포름산을 첨가한 용매 B(HPLC grade, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하였고 용매구배는 최초 0% A, 100% B로 시작하여 20분 후 80% A가 되도록 용매 A의 농도를 직선적으로 증가시켰으며, 20~30분까지는 100% A, 0% B로 분석하였다. 유속은 400 ㎕/min으로 설정하였고, 200~500 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였으며, 컬럼의 온도는 35℃로 고정하였다. 질량 스펙트럼(mass spectra)의 수집 시 HESI 프로브 온도(probe temperature)는 300℃, 스프레이 전압(spray voltage)은 3.5 kV, 스프레이 유량(spray flow rate)은 50 arb, 질량범위(mass range)는 150~1600 m/z, 격리영역(isolation width)은 2.5 m/z 및 CID 에너지는 45로 설정하여 분석하였다.
그 결과, 230 nm에서 2종류의 플로로탄닌이 확인되었다. 먼저 머무름 시간(retention time) 0.9 분에서 디페닐 에테르(diphenyl ether, 이론적 분자량 = 170.21 g/mol)를 동정하였고(도 3), 25.2 분에서는 플로로퓨코퓨로엑콜 A(phlorofucofuroeckol A, 이론적 분자량 = 602.45 g/mol)로 예상되는 물질을 동정하였다(도 4).
실시예 4: 항산화 효능 분석
본 발명의 일 실시예에 따라 플로로탄닌 추출물(PE)의 항산화 효능을 확인하기 위해 DPPH 라디칼 소거효능 분석(DPPH radical scavenging assay) 및 히드록실라디칼(hydroxyl radical)에 의한 단백질 분해 억제효능 분석(protein degradation assay)을 수행하였다.
4-1: DPPH 라디칼 소거효능
본 발명의 일 실시예에 따라 DPPH 0.3 mM 함유한 메탄올용액을 제조하여 100 ㎍부터 1.5 ㎍까지 2배 비율로 순차희석(serial dilution)한 PE를 혼합한 후 실온에서 10분간 반응 후 517 nm에서 흡광도를 측정하여 라디칼 소거효능을 비교분석하였고 양성대조군으로서 항산화 효과가 우수한 아스코르브산(ascorbic acid, 50 μM)을 사용하였다.
그 결과, PE의 경우 농도의존적으로 라디칼을 제거하는 경향은 나타나지만 50 ㎍이상의 농도에서 통계적으로 유의한 차이를 나타내었다(도 5).
4-2: 단백질 분해 억제효능
본 발명의 일 실시예에 따라 활성산소(reactive oxygen species, ROS)에 의한 손상으로부터 단백질이나 효소를 보호하는 항산화 물질의 효과를 금속이온촉매반응을 이용해 확인하는 금속이온촉매 산화억제효과(protein degradation assay)분석을 수행하였다. 먼저, 표적 단백질(target protein)은 0.5 μg/mL의 BSA(bovine serum albumin)를 사용하였고, 1차 반응으로서 Cu2+(100 μM)와 H2O2(1 mM)를 첨가하여 히드록실라디칼(hydroxyl radical)을 생성한 뒤 BSA와 각 농도 별 실험물질을 혼합한 후 2차 반응을 수행하였다. 반응이 종료된 각 그룹은 10% SDS 폴리아크릴아마이드 겔에 전기 영동하여 각 시료에 의한 BSA 단백질 저해 수준(degradation)을 확인하였고 양성대조군으로서 항산화 효과가 우수한 아스코르브산(50 μM)을 사용하였다.
그 결과, 과산화수소(H2O2)와 Cu2+만을 첨가한 실험군의 경우 BSA의 완전한 분해가 일어났음이 확인된 반면 PE 처리 실험군에서는 25 ㎍/ml 이상의 농도에서 단백질 보호 효과가 나타났고 50 ㎍/ml 이상의 농도에서는 양성대조군인 아스코르브산 이상의 효능이 관찰되었다(도 6).
실시예 5: UV-B
in vitro
모델 실험
본 발명의 일 실시예에 따라 인간 섬유아세포(human fibroblast) 유래 CCD986sk 세포를 대상으로 UV-B의 조사 강도 및 시간 조건을 조정함으로써 UV-B에 의한 자극은 주어지지만 극단적인 독성은 유발하지 않는 조건을 확립한 뒤 PE에 의한 보호 효과를 확인하고자 in vitro 모델을 구축하였다. 모델 구축을 위해 UV-B를 조사하면서 배양한 세포에 대해 일산화질소(NO) 및 LDH(lactate dehydrogenase)를 측정하였으며, 핵 염색을 통해 세포의 직접적인 손상이 일어나는 시간을 설정하였고, mRNA 및 단백질 등 유전자 수준의 변화가 야기되는 조건 등을 관찰하였다. 세포에 인위적인 자외선 자극을 유발하기 위한 조사(irradiation)는 VILBER LOUMAT (BLX-E312)를 이용하여 UV-B(312 nm)를 일정 시간간격을 설정한 후 20 mJ/cm2의 세기로 조사하였다.
5-1: 일산화질소(nitric oxide) 발생조건 측정
본 발명의 일 실시예에 따라 인간 섬유아세포(human fibroblast) 유래 CCD-986sk 세포주를 대상으로 UV-B에 의한 일산화질소(NO) 발생 조건을 확인하기 위해 동수의 세포를 배양 후 30분, 1시간 및 2시간 간격으로 UV-B(20 mJ/cm2)를 조사하였다. UV-B 조사 후 50 ㎕의 배지를 채취한 뒤 그리스 시약(griess reagent)을 상기 배지와 15분간 반응하여 발색 반응을 유도하였으며, 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 540 nm 하에서 흡광도를 측정하여 대조군에 대한 상대적인 NO 발생 정도를 비교하였다.
그 결과, 세포에 UV-B를 30분부터 2시간까지 단계적으로 조사하였을 때 경시적으로 NO가 증가하는 것이 나타나 UV-B에 의한 자극이 일어나는 것을 확인하였다(도 7).
5-2: 일산화질소(nitric oxide) 발생조절
본 발명의 일 실시예에 따른 PE 처리에 의해 UV-B를 효과적으로 차단함으로써 NO의 발생을 조절할 수 있는가를 확인하기 위해 CCD986sk 세포를 대상으로 10~100 μg/mL의 PE를 6시간 동안 처리한 후 UV-B(20 mJ/cm2)를 1분 동안 조사하였으며, UV-B 조사 후 16시간 동안 추가적으로 배양하여 배지로 분비된 NO의 상대량을 발색 반응을 통해 비교하였다.
그 결과, UV-B 실험군의 경우 대조군에 비해 4배에 가까운 NO 발생을 보인 반면 PE를 처리한 뒤 UV-B를 조사하였을 때는 NO의 발생이 현저히 줄어드는 것을 확인하였다. 즉, PE처리 실험군의 경우 최저 농도인 10 μg/ml 이상부터 대조군과 거의 동등한 수준까지 NO 생성이 저해된 것을 확인하였다(도 8).
5-3: 세포독성 분석(LDH release assay)
본 발명의 일 실시예에 따라 세포에 UV-B 조사 후 생성되는 LDH(lactate dehydrogenase)의 양을 측정함으로써 상대적인 독성 수준을 비교하였다. 우선, 동수의 CCD-986sk 세포를 배양 후 30분, 1시간 및 2시간 간격으로 UV-B(20 mJ/cm2)를 조사한 뒤 배지 일부를 채취하여 동량의 LDH 반응액(CytoTox 96ⓡ Non-Radioactive Cytotoxicity Assay, Promega, WI, USA)에 넣고, 암조건에서 30분간 반응하였다. 반응 종료 후 정지액(stop solution)을 첨가한 뒤 490 nm에서 흡광도를 측정하여 대조군에 대한 상대적인 세포독성을 평가하였다.
그 결과, NO 측정결과와 동일하게 경시적으로 LDH의 양이 증가하여 UV-B에 의한 독성이 유발되는 것을 확인하였다(도 9).
5-4: 세포 독성저하 효능 검증
본 발명의 일 실시예에 따라 UV-B에 의해 독성이 유발된 세포에 PE를 처리하여 세포 독성저하 효능을 관찰하였다. 먼저, UV-B 차단 효과에 의한 세포 독성 저하 여부를 확인하기 위해 CCD986sk 세포를 대상으로 10~100 μg/mL의 PE를 6시간 동안 처리한 후 UV-B(20 mJ/cm2)를 1분 동안 조사하였으며, UV-B 조사 후 16시간 동안 추가적으로 배양하여 배지로 분비된 LDH의 상대량을 발색 반응을 통해 비교하였다.
그 결과, 모든 PE 처리 실험군에서 UV-B 조사 실험군에 비해 적은 양의 LDH가 검출되었으며, 대조군과 유사한 수준으로 측정된 것으로 볼 때 세포로 전해지는 대부분의 UV-B 광선을 차단한 것으로 판단된다(도 10).
5-5: 세포사(apoptosis) 유도
본 발명의 일 실시예에 따라 세포에 UV-B를 조사하여 세포로부터 분비 또는 생성되는 지표 외에도 직접적인 세포사(apoptosis)가 유도되는 시간을 확인하였다.
구체적으로, CCD-986sk 세포를 4-웰 슬라이드 챔버에서 배양 후 UV-B(20 mJ/cm2)를 10, 20, 30, 60 및 90분 간격으로 조사하였고 이 후 PBS로 세척한 뒤 4% 파라포름알데하이드로 고정하고 0.25% 트리톤 X-100으로 세포막을 용해시켰다. 상기 고정된 세포는 Hoechst 33342(Life Technologies, MA, USA)를 이용하여 10분간 염색한 후 세척한 뒤 형광현미경을 이용하여 관찰하였다.
그 결과, UV-B 조사 20분부터 핵 응축이 일어나기 시작하여 30분부터는 분명한 핵 응축이 일어나 세포사(apoptosis)가 진행되고 있음을 확인하였다(도 11).
5-6: 세포 보호효과 검증
본 발명의 일 실시예에 따라 세포에 PE를 처리 하고 UV-B를 조사하여 세포사를 유도함으로써 PE에 의한 세포 보호효과를 검증하였다.
구체적으로, CCD-986sk 세포를 4-웰 챔버 슬라이드에 파종한 후 100 및 250 μg/mL 농도의 PE를 6시간 동안 처리한 뒤 15분 동안 UV-B(20 mJ/cm2)를 조사하였다. 이 후 UV-B가 조사된 각 실험군의 세포핵(cell nucleus)을 형광염색한 후 형광현미경 하에서 핵의 형태변화를 관찰하였다.
그 결과, UV-B 처리 실험군은 분명한 핵 응축이 확인된 반면 PE 처리 실험군에서는 대조군과 유사한 핵의 형태를 유지하고 있어 PE에 의한 자외선 차단 및 세포 보호 효과가 입증되었다(도 12).
5-7: mRNA 발현 수준
본 발명의 일 실시예에 따라 UV-B 조사 후 세포 내 유전적 변화를 확인하기 위해 CCD-986sk 세포에 추출한 PE를 6시간동안 농도별(10~100 μg/mL) 전처리한 후 UV-B(20 mJ/cm2)를 1분간 조사하였으며, 새로운 배지에서 16시간 추가배양을 하였다. 배양 종료 후 상기 실험군과 대조군으로부터 트리졸 시약(trizol reagent, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 총 RNA를 추출하였다. 상기 추출한 RNA 1 ㎍을 대상으로 올리고 dT 프라이머 및 TOPscript™ 역전사 효소(Enzynomics, Seoul, Korea)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 상기 합성된 cDNA를 이용하여 콜라겐 분해 효소로 알려진 MMP-1 유전자를 real-time PCR을 통해 증폭하였고, 증폭된 MMP-1 발현 수준은 GAPDH 발현 수준과 비교하여 표준화하였다.
PE에 의한 UV-B 차단 및 세포 보호 효과를 검증한 결과, UV-B만을 처리한 실험군의 경우 대조군에 비해 4~5배 이상의 높은 MMP-1 발현 수준을 보인 반면 PE 처리 실험군에서는 UV-B 처리 실험군에 비해 유의한 MMP-1 억제 효과가 나타났으며, 특히 50 μg/mL 이상의 고농도 처리 실험군에서는 대조군과 유사한 수준으로 MMP-1이 조절되는 것으로 확인되어 PE에 의한 UV-B 높은 차단 효과가 검증되었다(도 13). 상기 유전자 증폭에 사용된 프라이머의 서열을 하기 표 1에 표시하였다.
유전자 | 프라이머 | 핵산 서열(5' -> 3') | 산물 크기(bp) |
GenBank
접근 번호 |
서열번호 |
GAPDH | 포워드 | ggagccaaaagggtcatcat | 202 | NM_002046 | 1 |
리버스 | accacagtccatgccatcac | 2 | |||
MMP1 | 포워드 | tagtggcccagtggttgaaa | 228 | NM_002421 | 3 |
리버스 | tctgctcttggcaaatctgg | 4 |
5-8: 웨스턴 블랏 분석
본 발명의 일 실시예에 따라 PE에 의한 MMP-1 발현 기전의 조절 여부를 확인하기 위해 CCD-986sk 세포에 PE를 6시간동안 농도별(10~100 μg/mL)로 처리한 후 UV-B(20 mJ/cm2)를 1분 동안 조사하였다. 이 후 UV-B가 조사된 CCD-986sk 세포를 PBS로 세척하고 1% 방사선 면역촉진분석(RIPA) 버퍼(Rhoche, Mannheim, Germany)를 이용하여 단백질을 추출하였다. 추출한 단백질은 Pierce BCA 단백질 분석 시약(Thermo scientific, Florida, USA)을 이용하여 발색 반응을 통해 정량하였으며, BSA를 표준물질로써 설정하였다.
웨스턴 블랏 분석을 위해 동량의 단백질을 SDS 폴리아크릴아마이드 겔에 전기영동을 하였고, PVDF(polyvinylidene difluoride) 멤브레인으로 트랜스퍼하였다.그 후 멤브레인을 5% 탈지유(skim milk)를 이용하여 블록(blocking)한 후 p38, p-p38, IκB, p-IκB 및 액틴(actin) 1차 항체를 1시간 30분 동안 반응시켰으며, HRP(horseradish peroxidase)가 중합된 2차 항체를 2시간 동안 반응시킨 다음 Amersgam ECL(enhanced chemiluminescence) 수용액(West Pico Maximum Sensitivity Substrate, Thermo scientific, Rockford, IL, USA)으로 반응 부위를 발광시켜 단백질 발현 수준을 측정하였다. 단백질 발현 수준의 정량적 비교는 액틴(actin)의 발현량을 기준으로 하였다.
그 결과, IkB 및 p38은 실험군 간 유사한 경향을 보이는 반면 p-IκB, p-p38의 경우 PE 처리군에서 분명한 억제 효과가 관찰되었다(도 14). 따라서, IκB 및 p38 단백질의 생성을 억제하기 보다는 두 단백질의 인산화를 억제함으로써 MMP-1의 발현을 저해하는 것으로 판단된다.
결론적으로 톳 유래 클로로타닌에 의한 피부 노화 개선 및 자외선 차단 효과를 비롯하여 강한 자외선에 대한 세포 보호 효과가 검증되었으며, 이를 바탕으로 천연 UV차단제에 적용 가능한 신소재로써 활용 가능하다.
본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
<110> GANGNEUNG-WONJU NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMY COOPERATION GROUP
<120> Composition for blocking ultraviolet rays comprising extract of
Sargassum fusiforme
<130> PD13-1017
<160> 4
<170> KoPatentIn
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH F
<400> 1
ggagccaaaa gggtcatcat 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH R
<400> 2
accacagtcc atgccatcac 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MMP1 F
<400> 3
tagtggccca gtggttgaaa 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MMP1 R
<400> 4
tctgctcttg gcaaatctgg 20
Claims (8)
- 톳(S. fusiforme) 추출물 또는 상기 톳 추출물을 크로마토그래피로 분리한 플로로탄닌 함유 활성분획을 유효성분으로 함유하는, UV-B 자외선 차단용 조성물에 있어서,
상기 톳 추출물은 ⅰ) 톳을 n-헥산에 침지하여 지질을 제거하고 아세톤으로 추출한 아세톤 추출물; ⅱ) 상기 아세톤 추출물을 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 그의 수용액으로 염을 제거한 알코올 추출 잔사; 및 ⅲ) 상기 알코올 추출 잔사를 톨루엔(toluene) 이용하여 색소를 제거하고 아세톤으로 재추출한 아세톤 재추출물로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상의 혼합물인, UV-B 자외선 차단용 조성물. - 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서,
조성물 총 중량 100 중량부에 대하여 상기 톳 추출물이 0.1 내지 50 중량부로 포함되는, UV-B 자외선 차단용 조성물. - 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 플로로탄닌 함유 활성분획은 디페닐 에테르(diphenyl ether) 또는 플로로퓨코퓨로엑콜 A(phlorofucofuroeckol A)을 포함하는, UV-B 자외선 차단용 조성물. - 삭제
- 삭제
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