KR101691536B1 - 신규 fak 저해제를 유효성분으로 포함하는 방사선 민감성 증진용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 FAK(Focal Adhesion tyrosine Kinase) 단백질을 표적으로 억제하는 신규 화합물을 유효성분으로 포함하는, 방사선 민감성 증진용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로, FAK 또는 Src의 인산화를 저해하여 그의 활성을 억제시키는 신규 FAK 저해제를 유효성분으로 포함하는 방사선 민감성 증진용 조성물 및 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 신규 FAK(Focal Adhesion tyrosine Kinase) 저해제 혹은 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 조성물은 FAK 또는 Src의 인산화를 감소시켜 그의 활성을 억제하고 암 세포의 사멸을 유도함으로써 암세포를 치료하고, 특히, 방사선에 대한 민감성을 증가시키는 효과가 있어 암의 치료시 방사선 조사와 병용으로 투여하여 그 효과를 극대화시킬 수 있다.

Description

신규 FAK 저해제를 유효성분으로 포함하는 방사선 민감성 증진용 조성물 {Composition for enhancing sensitivity to radiotherapy comprising Novel FAK inhibitor}

본 발명은 FAK(Focal Adhesion tyrosine Kinase) 단백질을 표적으로 억제하는 신규 화합물을 유효성분으로 포함하는, 방사선 민감성 증진용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로, FAK 또는 Src의 인산화를 감소시켜 그의 활성을 억제하는 신규 FAK 저해제를 유효성분으로 포함하는 방사선 민감성 증진용 조성물 및 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

암은 정상세포 유전자에 변화가 일어나 비정상적으로 세포가 변한 것으로, 불완전하게 성숙하고 과다하게 증식하는 것이 특징이다. 또한, 암은 주위 조직 및 장기에 침입하여 이들을 파괴할 뿐 아니라, 다른 장기로 퍼질 수 있는 특징을 가지며, 이와 같은 종양 세포의 빠른 증식으로 정상적인 세포 및 장기의 구조와 기능이 파괴되기 때문에 그 진단과 치료는 매우 중요하다.

국가암정보센터 통계에 따르면, 국내 암 발병자 수는 2010년 20만 6615명, 2011년 22만 265명, 2012년 22만 4177명으로 암 발생률이 해마다 증가하고 있으며, 평균수명까지 생존할 시의 암 발생 확률은 37.3%에 달하는 것으로 보고되고 있는바, 암에 대한 진단과 치료는 더욱 더 중요해지고 있다고 할 수 있다.

이러한 암을 치료하는 방법으로 가장 많이 이용되는 방법은 크게 수술, 항암제 치료법, 방사선 치료법이 있는데, 수술은 원발 부위를 직접 제거해야 한다는 한계가 있고, 항암제 치료법은 세포 증식이 정상세포보다 빠른 암의 특성을 이용하여 약제를 직접 투여하는 치료법으로 많이 사용되고 있는 방법이나, 전신 투여 및 약물의 특성에 의해 부작용이 빈번히 발생되는 한계가 있다는 문제점이 존재하여, 현재에는 통증완화치료를 포함하여 다양한 종류의 암에 필수적인 치료방법으로 방사선 치료법이 점차 증가되고 있는 추세이다. 실제로, 현재 암 환자 중 국내의 경우 약 35%, 미국의 경우는 약 50% 정도가 방사선 치료를 받고 있으며, 국내에서 방사선 치료를 받는 암환자의 수가 매년 증가하고 있는 추세여서 암 치료에 있어 방사선 치료의 중요성은 매우 증가되고 있다.

그러나 방사선 치료법은 다양한 종류의 암에 필수적인 치료 방법임에도 불구하고, 종양 사멸을 위해서는 고선량의 방사선 조사가 필요하여 이 과정에서 주변의 정상 조직에도 손상을 가할 수 있고, 암세포의 방사선 내성 획득, 종양 자체의 내재적 방사선 민감도 차이 등이 치료효과를 달리할 수 있다는 등의 여러 가지 문제점이 대두되어 왔으며, 현재 항암제로 알려진 탁솔(Taxol)과 시스플라틴(cisplatin)을 유방암, 자궁암, 폐암, 위암, 대장암 등의 여러 고형암 환자들을 대상으로 방사선과 함께 병용 투여해 본 결과, 방사선 치료 효율을 증진시킨다는 것은 입증되었으나, 여전히 이러한 항암제들은 그 부작용이 커서 사용에 제한적일 뿐 아니라, 다양한 암조직에서 고르게 효과를 나타내지도 못한다는 문제점이 계속 있어 왔다.

따라서, 방사선 치료에서 보다 효과적으로 방사선 민감성을 증진시키고, 안전하며, 동시에 암의 치료시 방사선 조사와 병용하여 투여시에도 그 항암 치료 효과를 향상시킬 수 있는 방사선 민감성 증진용 조성물에 대한 개발은 여전히 절실하게 요구되고 있는 실정이다.

한편 FAK(Focal Adhesion Kinase)는 PTK2 유전자에 의해 코딩되는 단백질로, 인테그린 및 성장 인자 수용체로부터의 신호를 통합하는 125 KDa의 비-수용체 티로신 키나아제(kinase)이다. 상기 단백질은 세포의 생존, 성장, 부착, 이동 및 침윤 등의 조절에 중요한 역할을 한다고 보고되고 있는데, 이러한 FAK는 여러 개의 티로신 잔기 상에서의 인산화에 의해 조절되고 활성화되며, 인테그린 베타 1 수용체 또는 티로신 키나아제 수용체 등에 의해 활성화되고 Src 단백질을 활성화시켜 전이 및 침윤을 촉진한다고 알려져 있다(Discovery of FAK Inhibitors Using Structure Based Drug Design. Bull. Korean Chem. Soc. 2014, Vol. 35, No. 11, 3516-3517 참조).

상기 FAK 단백질의 유전자 또는 단백질은 폐암, 유방암, 대장암, 난소암, 갑상선암 등의 고형암에서 과발현될 뿐만 아니라, 급성 골수양 백혈병 등의 혈액 암 종에서도 과발현됨이 확인되었다. 또한, 활성을 나타내는 인산화된 FAK가 정상 조직보다 악성 조직에서 증가되어 있는 것으로 보아 FAK의 활성이 인체 암의 진행이나 전이 과정에 중요하게 관여한다고 할 수 있다.

이와 관련하여, FAK의 활성을 저해하여 암을 치료할 수 있는 다양한 화합물이 계속 보고되고 있는데, 예를 들어, 한국등록특허 제1512217호에서는 FAK 억제제로서의 피라졸릴아미노피리딘 화합물에 대해, 한국공개특허 제2014-138247호에서는 비시클릭 2,4-디아미노피리미딘 유도체에 대해 개시하는 등 FAK 억제제로서의 여러 화합물에 대해 많이 보고되고 있다.

그러나, 본 발명의 신규 FAK 저해제가 항암에 영향을 미치는지 여부에 대해서는 지금까지 보고된 바 없으며, 특히, 상기 신규 FAK 저해제가 방사선 민감성을 증진시키고 방사선 치료와 병용 사용될 때 항암 효과를 향상시킨다는 것에 대해서는 전혀 보고된 바 없다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 본 발명의 신규 FAK 저해제가 FAK 또는 Src의 인산화를 감소시켜 그의 활성을 억제시키고 암 세포의 사멸을 유도하여 암세포를 치료하며, 특히, 방사선에 대한 민감성을 증가시켜 암의 치료시 방사선 조사와 병용으로 투여하여 그 항암 치료 효과를 극대화시킨다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 방사선 민감성 증진용 조성물을 제공하는 데 있다.

[화학식 1]

본 발명의 다른 목적은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.

[화학식 1]

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 방사선 민감성 증진용 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명의 유효성분인 화학식 1의 FAK 저해제는 화학 명칭으로 2-[2-(2-Methoxy-4-morpholin-4-yl-phenylamino)-5-trifluoromethyl-pyrimidin-4-ylamino]-N-methyl-benzamide(2-((2-메톡시-4-몰폴리노페닐)아미노)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-4-일)아미노)-N-메틸벤즈아마이드)를 가지는 화합물로서, 구체적으로는 하기 화학식 1의 구조를 가진다.

[화학식 1]

본 발명자들은 화학식 1로 표시되는 화합물이 다른 FAK 저해제인 화합물과 비교하여 예상치 못한 방사선 민감제로의 효과, 특히, 방사성 민감성을 증가시키는 용도를 보유하고 있음을 확인하였다.

본 발명의 상기 화학식 1로 표시하는 화합물은 하기 반응식에 의거한 반응을 통해서 직접 합성할 수 있으나, 하기 반응식에 제한된 것은 아니다.

[반응식 1] 4-클로로-N-(2-메톡시-4-몰폴리노페닐)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2-아민

[반응식 2] 2-((2-메톡시-4-몰폴리노페닐)아미노)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-4-일)아미노)-N-메틸벤즈아마이드

즉, 상기 저해제는 상기 반응식에 기재된 반응에 한정되지 않으며, 당해 분야의 기술범위 내에서 용이하게 제작되는 화합물은 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 상기 저해제를 제작하는데 필요한 통상의 기술은 본 발명에 적용 가능하다.

본 발명에서 용어, "FAK"는 Focal Adhesion Kinase의 약어로서, PTK2 유전자에 의해 코딩되는 단백질이며, 인테그린 및 성장 인자 수용체로부터의 신호를 통합하는 125 KDa의 비-수용체 티로신 키나아제이다.

본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 염"은 인간에게 투여하기에 적합한 안전성 및 효능 프로파일을 갖는 염을 의미한다. 구체적으로는, 화학식 1로 표시되는 화합물의 제약상 허용되는 염으로서, 구체적인 형태로는 무기 산, 예컨대 염산, 질산, 인산, 황산, 브로민화수소산, 아이오딘화수소산, 아인산 및 이들의 혼합물로부터 유도된 염 뿐만 아니라 유기 산, 예컨대 지방족 모노- 및 디카르복실산, 페닐-치환된 알칸산, 히드록시 알칸산, 알칸디오산, 방향족 산, 및 지방족 및 방향족 술폰산으로부터 유도된 염을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에서 용어, "방사선 민감성"은 방사선 용량에 기초한 생존하는 세포수를 의미한다. 본 발명에서는 방사선 민감성을 측정하기 위하여, 방사선을 용량별로 조사한 후 형성된 클로니의 수를 측정하는 방법을 사용하여 작성한 선형 모델의 기울기의 값으로 확인하였다. 이러한 분류 방법은 Jerry R. Williams 등이 논문(Acta Oncologica, 46, 628-638, 2007)을 통해 보고한 바 있다.

본 발명에서 용어, "증진"은 어떤 방사선 용량에서 생존하는 세포수의 감소, 치사량에 필요한 방사선 용량의 감소, 또는 이들의 조합을 의미하나, 다른 통상적으로 의미하는 증진도 포함한다. 구체적으로, 본 발명에서 상기 방사선의 민감성이 증진된다는 것은 방사선을 용량별로 조사한 후 형성된 클로니의 수를 측정하였을 때, 방사선 농도에 따라 그 콜로니의 수가 감소하거나, 상기 작성된 선형 모델의 기울기의 값이 증가하는 것을 의미한다.

본 발명의 방사선 민감성 증진용 조성물은 화학요법에서도 민감성을 증가시킬 수 있기 때문에, 암 세포에 대한 방사선 치료에서 뿐만 아니라, 화학요법에서 민감도를 증가시키는 용도로 사용하는 경우도 포함한다.

본 발명의 상기 화합물은 FAK 인산화 또는 Src의 인산화를 감소시킬 수 있다.

본 발명의 상기 화합물은 암의 방사선에 대한 민감성을 증진시킬 수 있다.

본 발명에서 용어, "암"은 조직 내에서 질서를 무시하고 무제한 증식하는 미분화 세포로 구성된 종괴, 또는 종양을 형성하는 질환을 의미하는 것으로, 구체적으로는 폐암, 유방암, 대장암, 난소암, 두경부암, 뇌암 등의 고형암을 의미할 수 있으나, 이에 한정된 것은 아니다. 보다 구체적으로, 상기 암은 폐암 또는 유방암일 수 있으며, 상기 폐암은 비소세포성 폐암일 수 있다.

본 발명의 구체적인 일실시예에서는, A549 및 H1299 비소세포성 폐암세포를 대상으로 하여, 상기 암 세포에 본 발명의 화합물을 농도별로 처리하고, 방사선을 용량별로 조사한 후 형성된 클로니 수를 측정한 결과, 농도 의존적으로 클로니의 수가 급격히 감소함을 확인하였는바, 상기 결과는 본 발명의 화합물이 방사선 민감성을 증진시키는 용도를 가지고 있음을 나타내는 것이다(도 7 및 8).

또한, 본 발명의 구체적인 일실시예에서는, FAK 저해제가 FAK의 인산화 및 Src의 인산화에 미치는 영향 및 관련 단백질들의 발현 변화 여부를 웨스턴 블럿 실험을 통해 분석하였다. 그 결과 도 10에서 확인할 수 있는 바와 같이, FAK 저해제에 의해 FAK의 인산화가 현저하게 감소되었고, 그에 대한 하위 단백질인 Src 단백질의 인산화 또한 현저히 감소됨을 확인할 수 있었다. 또한 방사선과 병용 처리한 실험군에서도 FAK과 Src의 인산화가 더욱 감소하였으며, 세포 사멸의 지표가 될 수 있는 PARP의 분해가 증가되었다(도 10). 아울러, 도 11에서 확인할 수 있는 바와 같이, MDA-MB231 및 BT549 유방암 세포주에서도 FAK 저해제 처리시 용량 의존적으로 FAK의 인산화가 현저히 감소함을 확인하였으며, 이와 더불어 종양세포의 전이나 침윤시 증가하는 피브로넥틴이 FAK 저해제 처리에 의해 감소됨을 확인하였다.

상기 본 발명의 조성물은 암의 치료시 방사선 조사와 병용하여 투여될 수 있다.

본 발명에서 용어, "방사선 조사"는 악성 세포의 DNA를 손상시키는 국소 치료 방법을 의미한다. 정상 세포는 종양 세포에 비해 이런 손상을 수선하는 능력이 더 크다. 방사선 조사는 이런 차이를 이용하는 치료를 의미하며, 통상적으로 의미하는 방사선을 이용하여 치료하는 방법을 포함한다.

방사선 조사는 국소 요법의 형태이므로, 일반적으로 부작용은 치료된 부위에 제한된다. 그러나 공통된 전신 증상으로서 피로감이 있다. 많은 유전적 요인들이 일부 환자에서 2차 암의 소인이 되는 것이 사실이지만, 방사선 또한 관련 위험의 증가에 기여한다. 본 발명에 따른 방사선 민감성 증가용 조성물은 방사선의 필요량을 감소시킴으로써 이러한 부작용을 줄일 수 있다. 또한, 방사선에 민감한 암세포뿐만 아니라, 방사선에 저항성이 있는 암세포에서도 방사선 민감도를 증가시킬 수 있다.

밀봉 선원 방사선요법 또는 근접방사선요법(endocurietherapy)이라고도 알려진 근접요법은 방사선 활성 선원을 치료가 필요한 영역 내부에 또는 그 옆에 배치하는 방사선요법의 형태이다. 반대로, 외부 빔 방사선요법, 또는 원격요법은 선형가속장치에 의해 외부에 생성된 방사선이 적용된다. 근접요법은 국소 전립선암 및두부와 경부 암의 치료에 일반적으로 사용된다.

근접요법은 몰드 근접요법, 스트론튬 판 요법, 간극내 근접요법, 공동내 근접요법, 및 혈관내 근접요법을 포함한다. 몰드 근접요법에서, 표피에 가까운 종양이 피부 가까이 배치된 밀봉된 선원을 사용하여 치료될 수 있다.

본 발명에서 용어, "병용하여 투여"는 다양한 종류의 암세포를 치료하는 항암 과정에서 방사선 조사를 함께 투여하는 것을 의미한다. 구체적으로는, 폐암, 유방암, 대장암, 난소암, 두경부암, 뇌암 등의 고형암과 같은 암세포를 치료하는 항암 과정에서 방사선 조사 치료법을 병용 처리되는 것이며, 보다 구체적으로는, 폐암 또는 유방암의 항암 치료 과정에서 병용으로 투여되는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는, FAK 저해제 처리가 방사선 단독 조사에 비해 세포 사멸을 보다 증가시키는지와, 방사선과 병용처리 군에서 G2-M기의 세포가 sub G1기로 전환되어 세포사멸이 증가되는지를 확인해 본 결과, 도 7 및 8에서 알 수 있는 바와 같이, 비소세포성 폐암세포 A549 세포와 H1299 세포에서, FAK 저해제 처리가 방사선 단독 조사에 비해 세포 사멸을 보다 증가시키는 것으로 확인되었는바, 상기 결과로부터 FAK 저해제가 방사선 치료 민감 효능을 지님으로써 방사선 치료시 병용 약물로 사용 가능함을 확인하였다(도 7 및 8). 또한, 방사선과 병용처리 군에서 G2-M기의 세포가 sub G1기로 전환되어 세포사멸이 증가함으로써, 결과적으로 FAK 저해제 처리는 세포의 G2-M arrest를 유발하며 방사선과 병용시 세포의 사멸을 증가시키는 것임을 확인하였다.

아울러, 본 발명의 FAK 저해제를 비소세포성 폐암세포 A549, H1299 및 유방암 세포 MDA-MB231를 대상으로, 방사선 치료와 병용 처리한 결과, 도 9, 10 및 12에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 FAK 저해제는 종양의 성장을 보다 효과적으로 감소시킴으로써 항암치료 병용 혹은 보조제로 사용할 수 있음을 확인하였다(도 9, 10 및 12).

상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"는 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균, 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 하나 이상의 성분을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정군제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 본 발명에서, 상기 담체는 비자연적 담체 (non-naturally occuring carrier)를 포함할 수 있다. 상기 약학 조성물을 제조함에 있어서, 제조하고자 하는 제형에 따라 담체는 선택되어 지고, 이를 활성 성분인 상기 화합물 1과 적절한 비율로 혼합함으로써 제형화할 수 있다.

상기 조성물은 FAK 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

상기 용어 "화학식 1", "약학적으로 허용 가능한 염" 및 "암"은 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명에서 용어, "예방"은 상기 FAK 저해제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용하여 암의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다.

본 발명에서 용어, "치료"는 상기 FAK 저해제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용하여 암의 증상 등을 다스리거나 낫게 하는 모든 행위를 말한다.

상기 약학적 조성물은 FAK 또는 Src의 인산화를 저해하는 것일 수 있다.

상기 암은 구체적으로는 폐암, 유방암, 대장암, 난소암, 두경부암, 뇌암 등의 고형암을 의미할 수 있으나, 이에 한정된 것은 아니다. 보다 구체적으로, 상기 암은 폐암 또는 유방암일 수 있으며, 상기 폐암은 비소세포 폐암일 수 있다.

또 다른 양태로, 상기 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 단일 또는 다중 투여될 수 있다.

본 발명에서 용어, "약학적으로 유효가능한 양"은 의학적 예방 또는 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 예방 또는 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

상기 본 발명의 약학적 조성물은 포유동물에 투여될 수 있다. 구체적으로, 인간, 가축과 사육 동물, 및 동물원용, 경기용 또는 애완용 동물, 예를 들면, 개, 고양이, 소, 말, 양, 돼지, 염소, 토끼 등을 포함하는 포유동물로서 분류되는 모든 동물을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로는, 인간을 의미한다.

상기 약학적 조성물은 치료적 처치를 위해 비경구적, 국소적, 경구적 또는 국부적으로 투여될 수 있다. 예를 들면, 물, 완충수, 0.04% 식염수, 0.3% 글라이콜 등의 다양한 수성 운반체가 사용될 수 있고, 알부민, 지질단백, 글로불린 등과 같은 안정성을 강화하는 다른 단백질들을 포함할 수 있다.

상기 조성물은 기존에 잘 알려진 멸균기법에 의해 멸균될 수 있다. 그 용액은 사용을 위해 포장될 수 있고, 무균 조건에서 여과되고 냉동 건조될 수 있으며, 상기 냉동 건조된 제조물은 투여 전에 멸균된 용액과 결합된다.

본 발명의 경구 조성물은 일반적으로 불활성 희석제 또는 식용 운반체를 포함할 수 있다. 그들은 젤라틴 캡슐에 봉해 넣어지거나 또는 정제에 압축될 수 있으며, 경구 치료적 투여의 목적을 위해, 상기 활성 화합물은 부형제와 함께 포함되어 정제, 트로키 또는 캡슐의 형태로 사용될 수 있다.

상기 경구 조성물을 제조하는 경우에는 통상의 약제학적 담체를 사용할 수 있다. 예를 들어, 현탁액, 시럽제, 엘릭시르 및 용액제와 같은 경구용 액체 제제의 경우에는 물, 글리콜, 오일, 알콜 등을 담체로 사용할 수 있고, 산제, 환제, 캅셀제 및 정제와 같은 고체 제제의 경우에는 전분, 설탕, 카올린, 윤활제, 결합제, 붕해제 등을 사용할 수 있다. 투여의 용이성을 고려할 때 정제 및 캅셀제가 가장 편리한 복용 형태이며, 정제 및 환제의 경우는 장피제로 제조될 수 있다.

비경구 제제의 경우, 담체로서 통상 멸균수를 사용하며, 용해 보조제와 같은 다른 성분도 포함시킬 수 있다.

주사용 제제, 예를 들어, 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액은 공지된 기술에 따라 적합한 분산제, 습윤제 또는 현탁제를 사용하여 제조할 수 있다. 여기에 사용될 수 있는 용매에는, 물, 링거액 및 등장성 NaCl 용액이 있으며, 멸균 고정오일도 통상적으로 용매 또는 현탁 매질로서 사용한다. 모노 또는 디-글리세라이드를 포함하는 임의의 무자극성 고정 오일이 이러한 목적으로 사용될 수 있으며, 그 밖에 올레산과 같은 지방산도 주사용 제제에 사용할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 치료 유효량은 치료를 요하는 병에 대한 공지된 생체내(in vivo) 및 시험관내(in vitro) 모델 시스템에서 해당 화합물을 실험함으로써 경험적으로 결정될 수 있다.

상기 치료 유효량(therapeutically effective amount)이란, 치료를 요하는 병의 증상을 경감 또는 줄이거나 예방을 요하는 병의 임상학적 마커 또는 증상의 개시를 줄이거나 지연시키는데 유효한 활성 성분의 양을 의미한다.

본 발명에 따른 약학 조성물의 활성 성분, 구체적으로 화학식 1 로 표시되는 화합물을 암 치료 또는 항암치료의 병용 보조제로 투여시, 이를 치료학적 유효량으로 투여할 수 있으며, 구체적으로, 단일 용량 또는 분리용량으로 환자에게 투여될 총 1일 용량은 체중 1㎏당 0.1 ~ 100㎎의 범위일 수 있으나, 특정 환자에 대한 특이 용량 수준은 사용될 특정 화합물, 환자의 체중, 성, 건강상태, 식이, 약제의 투여시간, 투여 방법, 배설률, 약제 혼합 및 질환의 중증도 등에 따라 투여량이 변화될 수 있다.

경우에 따라서는, 상기 화합물은 그것의 프로드럭(prodrug) 등의 형태로 유효한 제약 조성물을 제형화하는데 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 조성물에는 활성 성분의 작용을 저해하지 않거나 활성 성분의 작용을 보조하는 기타 성분들이 더 포함될 수 있으며, 기타 당업계에 공지된 다양한 형태로 제형화될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물에는 바람직하게 기존에 알려진 항암제를 추가로 함유할 수 있다.

본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 결정형 또는 무정형 생성물로서 투여될 수 있다. 또한, 이들은 침전, 결정화, 동결-건조, 분무건조, 또는 증발 건조와 같은 방법에 의해, 예를 들어, 고체 플러그(solid plug), 분말 또는 필름으로서 수득될 수 있다. 마이크로파 또는 고주파 건조도 본 목적을 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 신규 FAK(Focal Adhesion tyrosine Kinase) 저해제 혹은 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 조성물은 FAK 또는 Src의 인산화를 감소시켜 그의 활성을 억제하고 암 세포의 사멸을 유도함으로써 암세포를 치료하고, 특히, 방사선에 대한 민감성을 증가시키는 효과가 있어 암의 치료시 방사선 조사와 병용으로 투여하여 그 효과를 극대화시킬 수 있다.

도 1은 인체 비소세포성 폐암 세포주인 A549 세포를 대상으로 본 발명의 신규 FAK 저해제를 농도별로 처리하였을 때, 상기 폐암세포 생존율이 농도 의존적으로 감소하는 효과를 나타낸 것이다.
도 2는 인체 비소세포성 폐암 세포주인 H1299 세포를 대상으로 본 발명의 신규 FAK 저해제를 처리하였을 때 상기 폐암세포의 생존율이 농도 의존적으로 감소하는 효과를 나타낸 것이다.
도 3은 인체 유방암 세포주인 MBA-MB231 세포를 대상으로 본 발명의 FAK 저해제를 농도별로 처리하였을 때, 상기 유방암 세포 생존율이 농도 의존적으로 감소하는 효과를 나타낸 것이다.
도 4는 인체 유방암 세포주인 BT549 세포를 대상으로 본 발명의 FAK 저해제를 농도별로 처리하였을 때, 상기 유방암 세포 생존율이 농도 의존적으로 감소하는 효과를 나타낸 것이다.
도 5는 상처 치유 분석법(Wound healing assay)을 통해 A549 폐암세포에 본 발명의 신규 FAK 저해제를 처리하였을 때, 세포 이동성이 감소하는 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 상처 치유 분석법(Wound healing assay)을 통해 유방암 세포주인 MDA-MB 231 세포에 본 발명의 신규 FAK 저해제를 처리하였을 때, 세포 이동성이 감소하는 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 신규 FAK 저해제의 방사선 민감도 증가 효과를 확인하기 위하여, A549 폐암세포에 본 발명의 신규 FAK 저해제를 250 또는 500 nM 농도로 처리하고 방사선을 용량별로 조사하였을 때 형성된 콜로니 수를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 신규 FAK 저해제의 방사선 민감도 증가 효과를 확인하기 위하여, H1299 폐암세포에 본 발명의 신규 FAK 저해제를 100 또는 500 nM 농도로 처리하고 방사선을 용량별로 조사하였을 때 형성된 콜로니 수를 나타낸 것이다.
도 9는 폐암 세포주 A549 세포에 본 발명의 신규 FAK 저해제와 방사선을 병용 처리하였을 때의 세포주기 변화를 FACS로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 폐암 세포주 A549 세포에 본 발명의 신규 FAK 저해제 단독 또는 방사선 조사와 병용 처리하였을 때, 인산화 FAK, FAK에 의해 조절되는 Src, 및 세포 사멸을 나타내는 PARP-1의 발현을 나타낸 것이다.
도 11은 인체 유방암 세포주 MDA-MB231 및 BT549 세포에 본 발명의 신규 FAK 저해제를 처리하였을 때, 인산화된 FAK와 피브로넥틴(fibronectin)의 발현이 감소하는 것을 나타낸 것이다.
도 12는 인체 폐암 세포주 A549 세포를 이식하여 종양이 형성된 쥐에 본 발명의 신규 FAK 저해제 또는 방사선을 조사하여 나타난 항암 효과를 나타낸 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

제조예 : 화학식 1로 표시되는 화합물인 신규 FAK 화합물의 제조

[반응식 1] "4-클로로-N-(2-메톡시-4-몰폴리노페닐)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2-아민"의 제조

DCE / t-부탄올 = 1:1의 현탁액 200mL 속에 화합물 2(2,4-다이클로로-5-(트리플루오로메틸) 피리미딘) 2.61g(12.0mM)을 넣고, 0℃의 조건에서 염화아연(에테르 중의 1M 용액 14.4㎖(14.4mM))을 첨가하였다. 이 후, 0℃에서 1시간 동안 교반하였고, 화합물 1(2-메톡시-4-몰폴리노아닐린) 2.50g(12.0mM)과 DCE / t-부탄올의 현탁액에 50mL의 트리에틸아민 용액 1.84㎖(13.2mM)을 적가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 추가로 12시간 동안 교반한 다음, 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 MeOH / H2O = 4:1에서 재결정하여 정제하였다. 그 결과, 중간체 화합물로 황색의 고체인 화합물 3(4-클로로-N-(2-메톡시-4-몰폴리노페닐)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2-아민) 2.78g 60%의 수율로 수득하였다.

상기 수득된 화합물 3의 NMR 분석 결과는 다음과 같다.

1H NMR (CDCl3,400MHz):δ 8.55 (1H, brs), 8.19 (1H, d, J = 8.4 Hz), 7.86 (1H, brs), 6.53-6.58 (2H, m), 3.88-3.93 (8H, m), 3.17 (3H, t, J = 5.0 Hz).

[반응식 2] "2-((2-메톡시-4-몰폴리노페닐)아미노)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-4-일)아미노)-N-메틸벤즈아마이드"의 제조

상기 반응식 1에서 수득한 화합물 3(4-클로로-N-(2-메톡시-4-몰폴리노페닐)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2-아민) 3.00g(7.72mM)과 화합물 4(2-amino-N-methylbenzamide 2-아미노-N-메틸벤즈아마이드) 1.16g(7.72 mM)을 2- 메톡시에탄올 30mL에 혼합하여 24시간 동안 100℃에서 교반하여 냉각한 후, 상기 반응 혼합물을 진공에서 농축시켰다. 플래시 컬럼크로마토그래피 SiO₂(헥산: EtOAc = 2 : 1 ~ 1 : 2)상에서 정제하였고, CH₂Cl₂로부터 재결정화하였다. 그 결과, 목적하는 화합물로, 황색 고체인 화합물 5(2-((2-메톡시-4-몰폴리노페닐)아미노)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-4-일)아미노)-N-메틸벤즈아마이드) 1.1g을 28%의 수율로 수득하였다.

상기 수득된 화합물 5의 NMR 분석 결과는 다음과 같다.

1H NMR (CDCl3+DMSO-d6,400MHz): δ 8.19 (1H, d, J = 7.2 Hz), 8.04 (1H, s), 7.77 (1H, d, J = 8.4 Hz), 7.65 (1H, d, J = 4.4 Hz), 7.38 (1H, d, J = 7.6 Hz), 7.32 (1H, brs), 7.16 (1H, t, J = 7.4 Hz), 6.86 (1H, t, J = 7.4 Hz), 6.28 (1H, d, J = 2.4 Hz), 6.15 (1H, d, J = 7.6 Hz), 3.58-3.64 (8H, m), 2.87 (4H, t, J = 4.6 Hz), 2.67 (3H, d, J = 4.4 Hz).

실시예 1: 본 발명의 신규 FAK 저해제에 의한 폐암 세포주 사멸 효과

인체 폐암 세포주인 A549 및 H1299 세포를 각각 10% 우태혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/ml)이 첨가된 RPMI-1640(Rosewell Park Memorial Institute medium 1640) 배지에서 5% CO₂ 및 37℃의 조건 하에서 배양하였다. 96-웰 플레이트(96 well plate)에 상기 A549 및 H1299 세포를 1,000개씩 분주하고 24시간 배양한 후, 상기 FAK 저해제를 50, 100, 250, 500, 1,000, 5,000 또는 10,000 nM 농도로 처리하여 각각 24시간, 48시간, 72시간 추가 배양하였다. 0.5 mg/mL의 MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 용액을 각각의 웰에 첨가하고 37℃에서 3시간 동안 추가 배양한 후, 상등액을 제거하고 형성된 포름아잔 결정을 DMSO(Dimethyl sulfoxide)에 용해시켰다. 그리고 540nm에서의 흡광도를 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 측정하고, 상기의 과정을 독립적으로 3회 반복 수행하였다.

그 결과 도 1 및 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, A549 세포는 1,000nM 농도에서부터 현저하게 세포의 생존율이 감소하였고(도 1), H1299 세포는 500nM 농도에서부터 생존율이 감소하였다(도 2). 상기 A549 세포는 P53 야생형, KRAS 돌연변이형이고, H1299 세포는 P53 결실형, KEAP1 돌연변이형인 세포주로, 상기와 같은 결과는 두 가지 폐암 세포주에서 본 발명의 신규 FAK 저해제가 효과적으로 암세포의 사멸을 효과적으로 유도하는 것을 나타내는 것이다.

실시예 2: 본 발명의 신규 FAK 저해제에 의한 유방암 세포주 사멸 효과

인체 유방암 세포주인 MDA-MB231 및 BT549 세포를 각각 10% 우태혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/ml)이 첨가된 RPMI-1640(Rosewell Park Memorial Institute medium 1640) 배지에서 5% CO₂ 및 37℃의 조건 하에서 배양하였다. 96-웰 플레이트(96 well plate)에 상기 MDA-MB231 및 BT549 세포를 1,000개씩 분주하고 24시간 배양한 후, FAK 저해제를 0.2, 1 또는 5μM 농도로 처리하여 각각 48시간 추가 배양하였다. 0.5mg/mL의 MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5- diphenyltetrazolium bromide) 용액을 각각의 웰에 첨가하고 37℃에서 3시간 동안 추가 배양한 후, 상등액을 제거하고 형성된 포름아잔 결정을 DMSO(Dimethyl sulfoxide)에 용해시켰다. 이 후, 540nm에서의 흡광도를 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 측정하고, 상기 과정을 독립적으로 3회 반복 수행하였다.

그 결과 도 3 및 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 유방암 세포주 MDA-MB231 세포는 상기 1μM 농도의 FAK 저해제 처리시, 대략 30% 정도 세포 생존율이 감소하였으며, BT549 세포에서는 본 발명의 신규 FAK 저해제에 의해 세포사멸의 효과가 MDA-MB231 세포에서보다 더욱 현저하게 증가되었다. 상기와 같은 결과는 폐암 뿐만 아니라 유방함 세포주에서도 본 발명의 신규 FAK 저해제가 암세포의 사멸을 효과적으로 유도한다는 것을 나타내는 것이다.

실시예 3: 본 발명의 신규 FAK 저해제에 의한 폐암 및 유방암 세포 전이이동 억제효과

본 발명의 신규 FAK 저해제가 세포 전이이동에 미치는 효과를 확인하기 위하여, 상처 스크래치 분석법(wound scratch assay)을 실시하였다. 구체적으로, 6-웰 플레이트에 인체 폐암 A549 세포 혹은 인체 유방암 MDA-MB231 세포를 각각 1 × 106 개 접종하고, 2㎖의 세포배양 배지에서 80%의 컨플루언시(confluence)까지 성장시켰다. 그 다음, 세포 단일층의 중간부를 200㎕ 피펫 팁으로 긁어 상처를 만들고, 상기 FAK 저해제를 1μM 또는 5μM로 처리한 다음, 37℃에서 48시간 동안 추가 배양하였다. 세포배양이 끝난 후 메탄올로 고정시킨 후, 크리스탈 바이올렛 (crystal violet)으로 염색하고, 이동 패턴을 현미경(OLYMPUS IX73, 일본 동경)하에서 관찰하였다. 이 후, 40배 배율로 사진을 찍었다.

그 결과 도 5 및 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 신규 FAK 저해제를 처리하면 A549 인체 폐암세포와 MDA-MB231 인체 유방암 세포에서 농도 의존적으로 상처 회복율이 감소함을 확인할 수 있었으며, 이와 같은 결과는 FAK 저해제에 의해 암세포의 전이 이동성이 감소한다는 것을 나타내는 것이다.

실시예 4: 본 발명의 신규 FAK 저해제와 방사선 병용 처리에 따른 암세포 사멸 증진 효과

본 발명의 신규 FAK 저해제가 방사선 민감성 증진의 효과를 가지는지에 대해 확인하기 위하여, A549 폐암세포 및 H1299 폐암세포를 대상으로, 클로노제닉 분석법(Clonogenic assay)을 통해 세포 생존율을 평가하였다. 구체적으로, 60mm 플레이트에 각각의 세포주를 접종하고, 본 발명의 신규 FAK 저해제를 100nm 또는 500nm의 농도로 3시간 동안 처리한 후, 방사선을 용량별로 조사하였다. 이후 5% CO₂ 및 37℃의 조건 하에서 14일간 배양한 다음, 형성된 세포 집락(콜로니)을 인산완충용액(Phosphate Buffered Saline; PBS)로 세척하고 1% 메틸렌 블루가 포함된 100% 메탄올 혼합액으로 염색한 후 육안으로 계수하였으며 이후 동일한 과정을 3회 반복하여 수행하였다.

그 결과 도 7 및 8에서 확인할 수 있는 바와 같이, A549 폐암세포와 H1299 폐암세포에서, 본 발명의 신규 FAK 저해제를 처리한 경우, 방사선을 단독으로 조사한 경우에 비해 세포 사멸이 보다 증가되었다. 이와 같은 결과로부터 본 발명의 신규 FAK 저해제가 방사선 치료에 대한 민감성 효과를 가짐으로써 방사선 치료시 병용 약물로 사용할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 5: 본 발명의 신규 FAK 저해제에 의한 G2 -M arrest 유발 효과

본 발명의 신규 FAK 저해제에 의한 세포 사멸 원인을 규명하기 위하여 세포 주기의 변화를 확인하였다. 구체적으로, 2 x 105 개의 A549 세포를 6-웰 플레이트(6-well plate)에 분주하여 24시간 배양하고, 10μM 농도의 상기 FAK 저해제 또는 8 Gy 용량의 방사선을 각각 또는 병용 처리한 다음 24시간 추가 배양하였다. 세포를 획득하여 800㎕의 인산완충용액(PBS)과 400㎍/㎖ 농도의 Propidium iodide(PI) 100㎕를 처리하여 5% CO₂ 및 37℃의 조건 하에서 30분간 배양하였다. 이 후, 유세포 분석기(FACS)를 이용하여 세포 주기의 변화를 확인하였다.

그 결과, 도 9에서 확인할 수 있는 바와 같이, 방사선 조사 처리군에서는 이미 알려진 바와 같이 대조군과 비교할 때 G2-M기 세포가 증가되었으며, 본 발명의 FAK 저해제를 단독으로 처리한 군에서도 G2-M기 세포의 증가가 현저히 증가되었음을 확인할 수 있었다. 또한, 방사선과 본 발명의 신규 FAK 처리제를 병용으로 처리한 군에서도 G2-M기의 세포가 sub G1기로 전환되어 세포사멸이 증가함을 확인하였다. 이와 같은 결과로부터 본 발명의 신규 FAK 저해제 처리는 세포의 G2-M arrest를 유발하며 방사선과 병용으로 사용시 세포의 사멸을 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 6: 본 발명의 신규 FAK 저해제의 표적 및 관련 신호전달 물질 변화 측정

세포내 FAK의 활성은 FAK의 인산화에 의존하며 하위 단백질인 Src을 인산화시킴으로써 암세포의 전이 및 침윤을 증가시키는 것으로 보고되고 있으므로, 본 발명의 신규 FAK 저해제가 FAK의 인산화에 미치는 영향과 관련 단백질들의 발현 변화 여부를 웨스턴 블럿 실험을 통해 분석하였다.

구체적으로, A549 폐암세포에 1μM의 본 발명의 FAK 저해제를 3시간 동안 처리하고 10 Gy의 방사선을 조사하여, 5% CO₂ 및 37℃의 조건 하에서 24시간 동안 배양한 다음, 프로테아제 저해제(1 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드, 1μg/mL 아프로티닌, 1μg/mL 루펩틴(leupeptin) 및 1mM Na₃VO₄)가 첨가된 TNN 용해 완충액(1 M Tris-HCl, 5M NaCl 및 10% NP-40)으로 단백질을 추출하여, 세포 용출물(lysates)을 획득하였다. 단백질의 양은 브래드포드(Bradford) 방법을 사용하여 정량하였으며, 동일한 양의 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드 겔에 의해 분리하고, 나이트로셀룰로즈 막으로 이동시켰다. 그 다음으로, 나이트로셀룰로즈 막을 Tris-완충 염수에서 5% 탈지 분유로 블로킹하고, 4℃에서 일차 항체를 가하여 밤새 배양하였다. 이 후, 나이트로셀룰로즈 막을 퍼옥시다제가 결합된 이차 항체와 함께 반응시키고, 증강 화학발광 시약을 이용하여 면역반응 밴드를 검출했다. 이때, 단백질 발현 분석의 내부 대조군으로는 Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) 단백질을 사용하였다. 이에 대한 결과를 3회의 독립적인 실험의 대표값으로 표시하였다.

그 결과, 도 10에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 신규 FAK 저해제에 의해 FAK의 인산화가 현저하게 감소되었고, 하위 단백질인 Src 단백질의 인산화 또한 현저히 감소됨을 확인할 수 있었다. 특히, 방사선과 병용으로 처리한 실험군에서는 FAK와 Src의 인산화가 현저하게 감소하였으며, 세포 사멸의 지표가 될 수 있는 PARP의 분해가 특히 증가된 것을 확인할 수 있었다.

또한, 도 11에서 확인할 수 있는 바와 같이, MDA-MB231 및 BT549 유방암 세포주에서도 본 발명의 신규 FAK 저해제를 처리시, 용량 의존적으로 FAK의 인산화가 현저히 감소하였으며, 더불어 종양세포의 전이나 침윤시 증가하는 피브로넥틴이 본 발명의 FAK 저해제 처리에 의해 감소된다는 것을 확인하였다. 이와 같은 결과는 도 6에서 나타나는 결과와 일치하는 결과이다.

실시예 7: A549 폐암 세포주 이식 동물모델에서의 항암 효능 실험

6주령의 암컷 Balb-c/Nu 마우스를 오리엔트바이오에서 구입하여, 7일간의 순화기간을 거친 다음, 1 x 106 개의 A549 세포를 마우스 뒷다리에 피하주사를 통해 이식하고, 종양의 크기가 100mm³ 정도에 도달하였을 때 다음과 같이 5 마리씩 4개의 실험군으로 구분하였다: ① 정상대조군, ② 6 Gy 방사선 조사군, ③ 본 발명의 FAK 저해제 처리군 (1mg/kg, 복강주사), ④ 본 발명의 FAK 저해제 투여 후, 3시간째 6 Gy 방사선 조사군. 상기 각 실험군에서 2 또는 3일 간격으로 종양의 크기와 체중을 측정하였다.

그 결과, 도 12에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 신규 FAK 저해제를 투여한 군이 정상 대조군에 비해 종양 크기가 25.4% 감소하였고, 상기 FAK 저해제와 방사선을 병행 처리한 군에서는 43.7%의 감소로, 현저하게 감소되었음을 확인할 수 있었다.

또한, 각 실험군에서 종양의 크기가 500mm³에 도달하기까지의 시간을 계산해봤을 때, 대조군은 12.6일이 소요된 반면, 본 발명의 FAK 저해제를 단독으로 처리한 군은 17.5일로 1.39배 지연되었으며, 방사선 조사와 본 발명의 신규 FAK 저해제를 병용으로 처리한 군에서는 21.2일로 1.68배 현저하게 증가된 것을 확인할 수 있었다. 한편, 6 Gy 조사 용량의 방사선 단독 조사군도 대조군 대비 36.6%의 종양크기 감소를 나타냈다.

이와 같은 결과를 바탕으로, 본 발명의 신규 FAK 저해제를 단독으로 처리시에도 항암 효과를 나타내며, 특히, 방사선 치료와 병행으로 처리할 경우에는 항암치료의 효과를 극대화시킬 수 있다는 것을 알 수 있었다.

실시예 8: 본 발명의 신규 FAK 저해제의 실험관내 대사안정성

대사 안정성 평가는 약물의 제거, 반감기, 생체 이용율과 같은 약동력 지표 등에 영향을 미칠 수 있는 요인들을 미리 파악하는 실험이다. 약물 대사의 주요 장기인 간에 의한 약물의 대사 정도를 in vitro 실험을 통하여 예측하는 실험으로, liver microsome 또는 hepatocytes 등 대사 활성 시스템을 사용하여 약물의 대사 안정성을 평가한다. 약물 대사 반응의 과정은 크게 phase I 과 phase II 로 나누어지며 Phase I 반응은 약물이 산화, 환원, 가수분해 등을 받아서 극성기를 생성하며 주로 마이크로솜 분획에 존재하는 약물 대사 효소계에 의해서 이루어진다. Phase II 반응은 포합반응으로 글루쿠론산염(glucuronate), 황산염(sulfate), 글루타치온(glutathione) 등의 생체성분이 결합하는 것으로 주로 세포질에서 이루어지며 글루코닐화(glucuronidation) 반응은 마이크로솜(microsome)에서 이루어진다. 실험관내 약물대사 안정성 실험은 다양한 대사 효소들을 포함하고 있는 종-특이 (마우스, 랫트, 인간) 간 마이크로솜을 이용하여 NADPH와 반응시킨 후 LC/MS/MS로 정량하여 약물의 안정성을 판단한다.

구체적으로, 본 발명의 신규 FAK 저해제를 아세토나이트릴에 용해시켜 최종 1㎛ 농도로 조정한 다음, 0.5mg/ml의 간 마이크로솜과 0.1M 인산완충용액 160㎕을 가하고 37℃에서 5분간 정치시킨 다음, 1mM β-NADPH를 가하여 30분까지 배양하였다. 양성대조군으로는 부스피론(buspirone)을 사용하였. 배양이 끝난 다음, 910g에서 10분간 원심분리 후 상등액을 취하여 QTRAP LC/MS/MS (Applied Biosystems, Concord, Canada)를 시행하였다.

그 결과, 하기 표 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 신규 FAK 저해제는 NADPH 존재 하에서 마우스와 인간 간 마이크로솜을 이용한 phase I 대사과정에서, 30분 배양 후 각각 59.7%, 55.9%가 남아 있으므로, 반감기가 30~60분 정도에 해당하여 비교적 안정한 화합물임을 알 수 있었다. 양성대조군으로 사용한 부스피론(buspirone)은 굉장히 대사가 빠른 약물로 알려져 있으며, 대부분의 종에서 빠르게 고갈되는 화합물인데, 본 발명의 신규 FAK 저해제는 부스피론이 대부분 고갈되는 것과 달리, 훨씬 안정한 화합물임을 알 수 있었다.

* 양성대조군

실시예 9: ICR 마우스에서 본 발명의 신규 FAK 저해제 약동력 실험

9주령의 특정병원균 부재 수컷 ICR 마우스를 코아택 (평택)에서 구매한 다음 일주일간 순화기간을 거쳐 정맥주사군 (5mg/kg)과 경구투여군 (20mg/kg)으로 나누었으며 경구투여군은 투여 하루 전날 밤 금식을 시켰다. 본 발명의 신규 FAK 저해제는 디메칠아세트아마이드 : 트윈80 : 20% 2 하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린 수용액을 15 : 15 : 70 용량 대 용량으로 만든 용제에 녹인 다음, 5 혹은 10ml/kg 용량으로 투여하였다. 투여 후 24시간까지 시간별로 50㎕의 혈액을 복재정맥으로부터 채취하여 4℃, 12,000 g에서 5분간 원심분리한 후 상등액을 취하였다. 이 후, 상등액에서 15㎕의 혈장샘플을 취하여 4배 용량의 내부대조군으로 카바마제핀을 포함한 아세포나이트릴 용액과 5분간 혼합한 다음, 11,722g에서 10분간 원심 분리하고 상층액을 취해 3200 Q TRAP LC/MS/MS 시스템 (Applied Biosystems, Concord, Canada)으로 분석하였다.

그 결과, 표 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 신규 FAK 저해제를 정맥 투여시 혈장농도 - 시간 곡선은 다분획분포 특징을 나타내며, 24시간 후에도 혈장에서 검출되었다. 전신적 약물 제거속도는 0.7L/hr/kg으로 마우스의 간 혈류량의 13%에 해당하였다. 이와 같은 결과는 본 발명의 신규 FAK 저해제의 약물분포용적(Vss)은 1.1L/kg로 추정된다는 것을 의미하며, 이것은 혈액으로 빠르게 분포된다는 것을 의미한다. 정맥 투여시의 약물 최종 반감기는 1.6 시간으로 계산되었다. 또한, 경구 투여에서는 본 발명의 신규 FAK 저해제의 흡수가 빨리 이뤄져 혈중농도 최고치에 도달하는 시간 평균 tmax가 1시간으로 나타났으며, 상기 FAK 저해제의 경구 생체 이용율은 58.7%로 확인되었다(표 2).

참고적으로, 상기 약물동력학 지표들은 KineticaTM 4.4.1 (Thermo Fisher Scientific, Inc., Woburn, MA, USA)을 사용하여 혈장농도-시간곡선을 non-compartmental 분석을 통해 획득하였으며 생체이용율 F는 AUCinf을 사용하여 계산되었다. 하기 표 2의 NA는 해당사항 없음을 나타낸다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (9)

1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 방사선 민감성 증진용 조성물로,
   상기 화합물은 폐암의 방사선에 대한 민감성을 증진시키는 것인, 방사선 민감성 증진용 조성물.
   [화학식 1]
   

   

   
   
2. 제1항에 있어서, 상기 화합물은 FAK 인산화 또는 Src의 인산화를 감소시키는 것인, 방사선 민감성 증진용 조성물.
   
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6. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 폐암의 치료시 방사선 조사와 병용하여 투여되는 것인, 방사선 민감성 증진용 조성물.
   
7. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것인, 방사선 민감성 증진용 조성물.
   
8. 제1항에 있어서, 상기 화합물은 FAK 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 것인, 방사선 민감성 증진용 조성물.
   
9. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 폐암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   [화학식 1]
   

   

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