KR101672499B1 - 비생물적 스트레스에 대한 저항성을 갖는 감자 아쿠아포린 유전자 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 비생물적 스트레스에 대한 저항성을 갖는 감자 아쿠아포린 유전자 및 그의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 비생물적 스트레스에 대한 저항성을 갖는 감자 유래의 서열번호 1 내지 서열번호 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 아쿠아포린 단백질, 상기 단백질을 암호화하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터, 상기 재조합 식물 발현 벡터로 형질전환된 비생물적 스트레스에 대한 저항성을 갖는 식물 및 상기 재조합 식물 발현 벡터를 이용한 형질전환 식물체의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 감자 아쿠아포린 단백질 및 이를 암호화하는 유전자는 감자에서 스트레스 저항성 및 영양물질 섭취의 분자 메커니즘을 조사하거나, 비생물적 스트레스에 대한 저항성을 갖는 식물체를 제조하기 위한 중요한 유전자원으로 사용될 수 있고, 또한 식물체 내에서의 물 이용 특성과 영양물질 섭취를 조절하기 위한 잠재적인 표적을 제공할 수 있다.

Description

비생물적 스트레스에 대한 저항성을 갖는 감자 아쿠아포린 유전자 및 그의 용도{Aquaporin Genes of Potato Having Abiotic Stress Resistance and Use There of}

본 발명은 감자로부터 분리된 아쿠아포린(aquaporin) 유전자 및 상기 유전자의 용도에 관한 것이다.

식물에서 물의 전달은 아포플라스트(apoplast)(세포벽 및 세포외 공간)와 심플라스트(symplast)(세포-대-세포 및 막관통(transmembrane)) 경로를 통해 이루어진다. 세포에서의 물의 막관통 이동은 주된 고유 단백질(major intrinsic protein, MIP) 수퍼패밀리에 속하고 아쿠아포린으로 불리는 특별한 부류의 막관통 채널 단백질에 의해 조절된다(비특허문헌 1 및 비특허문헌 2). 아쿠아포린 단백질은 5 개의 나선간 루프(interhelical loop)(A-E)에 의해 연결되어 있는 6 개의 막-투과(membrane-spanning) α-나선(H1-H6)으로 이루어지며, 아미노 및 카르복실 말단 모두 막의 세포질 측에 위치한다. 아쿠아포린은 4량체의 복합체를 형성하며, 각각의 서브유닛은 기능적 물 채널로서 거동한다(비특허문헌 3). 상기 채널의 구멍은 루프 B 및 E에 위치하는 2 개의 매우 보존된 NPA(Asn-Pro-Ala) 모티프에 의해 특정되며, 분자의 통과 특이성에 대한 프로필을 한정한다. 지질 이중층의 중간에서 2 개의 NPA 모티프를 겹치면 양성자 배제 및 채널 통과 특이성에 관여하는 2 개의 잘 알려진 채널 협착(constriction) 부위 중 하나를 형성한다(비특허문헌 4). 2 번째 협착은 방향족/아르기닌(ar/R) 협착 또는 선택성 필터로 불려지며, 각각 나선 2(H2), 나선 5(H5) 및 루프 E(LE1 및 LE2) 유래의 4 개의 잔기에 의해 상기 구멍의 세포밖 측에서 형성된다. 상기 부위에서의 다양성이 식물 아쿠아포린에서 기질 전도성(conductance)의 넓은 스펙트럼에 대한 기초를 형성하는 것으로 생각된다(비특허문헌 5 내지 비특허문헌 7).

모든 살아있는 유기체 내에 존재하는 아쿠아포린 단백질 및 그 분포는 세포의 복잡성에 따라 매우 다양하다. 식물은 미생물 및 포유동물보다 그 게놈 내에 더 많은 수의 아쿠아포린을 갖고 있는 것으로 밝혀졌으며, 애기장대(Arabidopsis thaliana)에서는 35 개(비특허문헌 2), 옥수수(Zea mays)에서는 33 개(비특허문헌 8), 포플러(Populus trichocarpa)에서는 65 개(비특허문헌 5) 및 목화에서는 68 개(비특허문헌 9)의 아쿠아포린이 동정되어 있다. 식물에서 아쿠아포린은 많고 다양한 MIP 패밀리를 구성하며, 일반적으로 서열 상동성과 세포내 위치에 따라 세포막(plasma membrane) 고유 단백질(PIP), 액포막(tonoplast) 고유 단백질(TIP), 노둘린(nodulin)-유사 고유 단백질(NIP), 작은 염기성 고유 단백질(SIP) 및 X 고유 단백질(XIP)의 5 개의 서브패밀리로 분류된다.

식물에서 아쿠아포린은 물 균형을 유지하는데 주된 역할을 하는 것으로 알려져 있다(비특허문헌 3). 또한, 식물의 아쿠아포린은 이산화탄소, 암모니아, 글리세롤 및 요소와 같은 다양한 범위의 작은 중성 분자의 통과에 관여함으로써 식물의 미네랄 영양과 탄소 및 질소의 고정에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(비특허문헌 10; 비특허문헌 11; 비특허문헌 3; 비특허문헌 12; 비특허문헌 13).

그러나, 현재까지 감자에 대해서는 상기 아쿠아포린 단백질에 대응하는 상동성 단백질 또는 유전자가 동정되어 있지 않고, 또한 그 기능에 대해서도 전혀 알려져 있지 않다.

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본 발명은 비생물적 스트레스에 대한 저항성을 갖는 감자 아쿠아포린 단백질을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 비생물적 스트레스에 대한 저항성을 갖는 감자 아쿠아포린 단백질을 암호화하는 유전자를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 식물 발현 벡터로 형질전환된 비생물적 스트레스에 대한 저항성을 갖는 형질전환 식물체를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 식물 발현 벡터를 이용한 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 비생물적 스트레스에 대한 저항성을 갖는 감자 유래의 서열번호 1 내지 서열번호 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 아쿠아포린 단백질을 제공한다.

본 발명의 한 구현예에 따르면, 본 발명의 감자 유래의 아쿠아포린 단백질은 감자 내의 다양한 조직에서 발현되며, 특히 뿌리와 괴경의 발달과 비생물적 스트레스에 대한 저항성을 갖는데 중요한 역할을 한다.

본 발명에 있어서, 서열번호 1 내지 서열번호 5로 기재되는 아쿠아포린 단백질과 실질적으로 동일하거나 유사한 기능을 수행할 수 있는 임의의 변이체 단백질도 본 발명의 아쿠아포린 단백질에 포함된다. 상기 변이체 단백질로는 상기 서열번호 1 내지 서열번호 5로 기재되는 아쿠아포린 단백질의 아미노산 서열과 적어도 80% 이상, 바람직하게는 85%, 보다 바람직하게는 90%, 보다 바람직하게는 95%, 보다 바람직하게는 97%, 보다 바람직하게는 99%의 아미노산 상동성을 갖는 임의의 단백질을 제한없이 포함할 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.

다수의 연구 결과 식물 아쿠아포린 서브패밀리의 기질 통과 특이성이 매우 다양한 것으로 나타났다(비특허문헌 3). ar/R 협착 잔기들은 구멍 협착 부위의 크기와 소수성을 다양하게 함으로써 아쿠아포린의 통과 특이성을 핵심적으로 결정한다(비특허문헌 6). 아울러, 프로거 위치(P1-P5)에서의 아미노산 잔기는 아쿠아포린과 글리세로포린을 식별하는데 중요하다(비특허문헌 16). 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 감자 아쿠아포린의 기능적 특성을 이중 NPA 모티프, ar/R 선택성 필터 및 프로거 위치에 근거하여 확인한 결과, 감자 아쿠아포린은 ar/R 선택성 필터와 프로거 위치에서 구조적 다양성이 큰 것으로 관찰되었으며(표 1 참조), 특히 감자 XIP 단백질의 Ar/R 선택성 필터 및 프로거 위치는 종래 보고된 가지과 XIP의 경우와 동일하였다. 최근, 가지과 XIP는 요소, 글리세롤 및 준금속과 같은 큰 분자의 전달을 촉진하는 것으로 나타났지만, 물에 대한 투과성은 오히려 약하였다.

아쿠아포린은 모든 식물 조직에 존재하며, 발달 단계 및 환경 조건에 따라 시공간적으로 조절된다. 아쿠아포린 발현의 기관 특이성은 각 기관의 생리적 기능과 매우 연관이 있을 수 있으므로, 특수한 조직 및 기관에서의 아쿠아포린 유전자의 발현을 개시하고 있는 실험들은 중요하다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 일련의 아쿠아포린 유전자의 발현 레벨을 qPCR에 의해 확인한 결과, 감자 MIP의 전사체는 모든 조직에서 어디서나 발현되고 있으나, 발현 레벨은 조직 유형에 따라 매우 다양하게 나타난다. 많은 감자 TIP 동족체(TIP2-3, TIP3-1 및 TIP3-2)는 잎보다 뿌리에서 더 높게 발현되었고, 감자 XIP3-1 및 XIP4-1은 뿌리 조직에서 상대적으로 발현이 낮았다. 흥미롭게도, XIP3-1과 XIP4-1은 감자의 모든 조직에서 유사한 발현 패턴을 보였고, 동일한 서브패밀리에 속하는 감자 아쿠아포린은 싹 조직에서 어느정도 균일한 발현을 보였다(도 2 참조). 이로부터 아쿠아포린이 식물에서 물과 관련된 것뿐만 아니라 식물의 발달 단계에 있어서도 중요한 역할을 하고 있음을 확인할 수 있다.

한편, 비생물적 스트레스는 식물에 삼투적 스트레스를 유도하여 식물의 물 균형을 방해하기 때문에, 본 발명자들은 가뭄, 고염, 아브시스산(abscisic acid, ABA)과 같은 다양한 비생물적 스트레스 조건 하에서의 감자 아쿠아포린의 발현 패턴을 분석하였으며, 그 결과 감자 아쿠아포린은 상이한 스트레스 처리시 다양한 반응을 보였다. 본 발명의 한 구현예에 따르면, 감자에서 TIP 및 XIP는 다수의 스트레스에 의해 그 발현이 상당히 조절되었다. 일부 예외가 있지만, 많은 감자 TIP는 다양한 스트레스 도입시 상향조절되었다. 감자 TIP2-3, TIP3-1 및 TIP3-2는 도입된 모든 스트레스에서 매우 상향조절되었다. 또한, XIP3-1 및 XIP4-1은 고온 스트레스에서 상향조절되었다. 일부 감자 아쿠아포린 전사체는 축적이 증가되었는데, 이는 비생물적 스트레스 저항성에서 역할을 할 것임을 제시한다.

몇 가지 작물에서의 아쿠아포린 전사체의 축적은 유전자 및 식물 종의 유형에 따라 ABA-의존적 또는 ABA-비의존적 방식을 포함하는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 한 구현예에 따르면, 감자에서 ABA에 대한 각각의 아쿠아포린의 반응성은 매우 다양하였다. 그러나, 몇 가지 예외를 제외하고, 가뭄 및 염 스트레스 조건에서의 감자 아쿠아포린의 상향/하향 조절 방향성은 ABA 스트레스 처리의 경우와 유사하였는데, 이는 가뭄 및 염 스트레스는 ABA에 의해 매개되는 아쿠아포린의 발현을 조정할 수 있음을 시사한다. 이와 대조적으로, 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 저온 및 고온 스트레스에서의 감자 아쿠아포린의 발현은 ABA 비의존적임을 나타낸다(도 3 참조).

또한, 본 발명은 상기 비생물적 스트레스에 대한 저항성을 갖는 감자 아쿠아포린 단백질을 암호화하는 유전자를 제공한다.

상기 유전자는 본 발명은 비생물적 스트레스에 대한 저항성을 갖는 감자 유래의 서열번호 1 내지 서열번호 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 아쿠아포린 단백질을 코딩하는 임의의 유전자로서, 각각 서열번호 6 내지 서열번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기서열을 갖는 것이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 한 구현예에 따르면, 본 발명의 유전자는 상기 유전자가 암호화하는 아쿠아포린 단백질을 구성하는 임의의 아미노산에 있어서, 상기 아미노산을 동일하게 암호화할 수 있는 임의의 다른 염기서열로 치환될 수 있다. 특정 아미노산을 암호화하는 염기서열의 종류는 원핵생물 및 진핵생물에서 매우 보존되어 있으며, 해당 아미노산과 염기서열의 조합은 본 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 공지되어 있다. 본 기술분야의 통상의 기술자는 특정 아미노산의 서열을 변경시키지 않으면서 그 염기서열이 상이한 다양한 종류의 유전자 서열을 용이하게 도출할 수 있으며, 따라서 서열번호 1 내지 서열번호 5로 기재되는 아미노산을 암호화할 수 있는 임의의 염기서열들은 모두 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 감자의 게놈에 대한 BLAST 검색을 통하여 서열번호 6 내지 서열번호 10으로 기재되는 염기서열을 갖는 5개의 전장(full-length) 아쿠아포린 유전자를 분리하였다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터를 제공한다.

본 발명에 있어서, "재조합"이란 용어는 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나, 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 단백질을 발현하는 세포를 나타내는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한, 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으나, 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

본 발명에 있어서, "벡터"란 용어는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 나타내는 것이다. 벡터는 DNA를 복제시켜 숙주 세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다.

본 발명에 있어서, "전달체"란 용어는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 또한, "발현 벡터"란 용어는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다.

본 발명의 재조합 식물 발현 벡터의 제조에 사용될 수 있는 식물 발현 벡터의 한 예로는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터를 들 수 있다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP0116718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP0120516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

바람직하게는 상기 발현 벡터는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 진핵세포 배양에 대해 디히드로폴레이트 환원효소 또는 네오마이신 내성을 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 널리 이용되는 식물 형질전환 마커 중 하나는 Tn5로부터 분리된 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 Ⅱ(nptⅡ) 유전자이며, 또 다른 마커 유전자는 항생제 하이그로마이신에 내성을 부여하는 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 유전자이다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따른 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터가 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에 있어서, "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림(upstream)의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. 또한, "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이고, "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터를 나타낸다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터를 사용하는 것이 본 발명에 있어서 보다 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터의 선택 가능성은 제한되지 않으며, 임의의 구성적 프로모터, 예컨대 CaMV 35S 프로모터 등이 제한없이 사용될 수 있다.

터미네이터는 노팔린 신타아제(NOS) 또는 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터 등과 같은 임의의 터미네이터가 사용될 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 따라서, 터미네이터를 사용하는 것이 본 발명에 있어서 보다 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 식물 발현 벡터로 형질전환된 비생물적 스트레스에 대한 저항성을 갖는 형질전환 식물체를 제공한다.

본 발명의 형질전환 식물체의 제조에 사용할 수 있는 식물로는 단자엽 뿐만 아니라 쌍자엽 식물이 제한없이 사용될 수 있다. 이들은 바람직하게는 유용한 식물이며, 특히 감자, 곡식(밀, 보리, 귀리, 호밀 등), 벼, 옥수수 또는 콩과 같은 전분-저장 식물 또는 전분-합성 식물이 제한없이 사용될 수 있다. 상기 식물은 감자인 것이 가장 바람직하다.

상기 재조합 식물 발현 벡터를 포함하는 재조합 구조체는 감염, 형질도입, 트랜스펙션, 트랜스벡션, 전기천공 및 형질전환과 같은 공지된 기술을 이용하여 배양된 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 숙주 세포의 대표적인 예로는 박테리아 세포, 예를 들면, 대장균, 스트렙토마이세스 및 살모넬라 티피무리움 세포; 진균 세포, 예를 들면, 효모 세포; 곤충 세포, 예를 들면, 초파리 S2 및 스포돕테라 Sf9 세포; 동물 세포, 예를 들면, CHO, COS 및 Bowes 흑색종 세포; 및 식물 세포를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 숙주 세포에 대한 적당한 배양 배지 및 조건은 본 기술분야에 공지되어 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계; 및

상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 상기 재조합 식물 발현 벡터를 이용한 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전달하는 임의의 방법을 의미하며, 이러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및/또는 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 모두를 포함하는 식물 종에 대해 일반적으로 적용될 수 있다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법이 본 발명에 따른 감자 유래 아쿠아포린 유전자를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 이러한 방법으로는 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법, 원형질체의 전기천공법, 식물 요소로의 현미주사법, 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법, 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염법 등으로부터 적절히 선택될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 예컨대 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefiaciens)에 의해 매개될 수 있다. 식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어느 특정한 식물 세포로 한정되는 것은 아니며, 본 기술분야에서 이용가능한 어떤 식물 세포도 제한없이 이용될 수 있다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태로도 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 본 기술분야에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다. 본 발명의 한 구현예에 따른 방법에서, 상기 식물 세포는 감자 유래의 세포지만 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 감자 아쿠아포린 단백질 및 이를 암호화하는 유전자는 감자에서 스트레스 저항성 및 영양물질 섭취의 분자 메커니즘을 조사하거나, 비생물적 스트레스에 대한 저항성을 갖는 식물체를 제조하기 위한 중요한 유전자원으로 사용될 수 있고, 또한 식물체 내에서의 물 이용 특성과 영양물질 섭취를 조절하기 위한 잠재적인 표적을 제공할 수 있다.

도 1은 감자 아쿠아포린 유전자의 인트론 및 엑손 분포를 나타낸 것이다.
도 2는 감자 아쿠아포린의 조직 특이적 발현 프로필을 qPCR로 확인한 결과를 보여주는 그래프로서, Y 축은 대조군과 비교할 때의 배수 변화(fold change)를 나타낸다.
도 3은 감자 아쿠아포린의 비생물적 스트레스 하에서의 발현 프로필을 qPCR로 확인한 결과를 보여주는 그래프로서, Y 축은 대조군과 비교할 때의 배수 변화를 나타낸다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 감자에서 아쿠아포린 상동체의 확인

모든 감자 게놈 서열 및 예상되는 단백질 서열(S. tuberosum group phureja DM1-3 version 2.1.10)은 솔라나시애(Solanaceae) 게놈 소스로부터 다운로드하였다(http://solanaceae.plantbiology.msu.edu/pgsc_download.shtml). 잠재적인 아쿠아포린 유전자를 확인하기 위하여, 쿼리(query) 서열로 애기장대, 목화 및 벼 아쿠아포린 서열(비특허문헌 10; 비특허문헌 14; 비특허문헌 15)을 이용하여 1^e-10의 컷-오프(cut-off) E-값으로 Spud DB 감자 게놈 리소스(http://solanaceae.plantbiology.msu.edu/integrated_searches.shtml)에서 BLASTN, BLASTX, BLASTP 및 TBLASTN을 포함하는 복수의 블라스트 검색을 수행하였다. 각각의 상동성 검색으로부터, 상위 3-5개의 전사체 서열을 후보 아쿠아포린 유전자로 선별하였다.

그 결과, 서열 상동성 분석에 기초하여 배수의 단일반수체(doubled monohaploid)인 감자 게놈에서 48 개의 아쿠아포린-유사 유전자를 확인하였다. NPA 모티프 및/또는 막통과 영역 중 하나가 절단 또는 결실된 부분적인 MIP-유사 서열을 암호화하는 몇 개의 유전자는 비기능성 유사유전자로 간주하였고, MIP 서열 분석으로부터 제외하였다. 유사하게, 몇 개의 절단된 스플라이싱(splicing) 변이체도 분석으로부터 제외하였다. 전장(full-length) 단백질을 암호화하는 유전자를 나타내는 아쿠아포린 서열은 41 개가 감자 게놈에서 확인되었다. 전체적으로, 감자 MIP는 대응하는 애기장대, 목화 및 벼의 경우와 유사한 방식으로 계통발생적 패턴을 따랐고, 5 개의 구별되는 서브패밀리로 나누어졌다. 본래의 단백질 서열에 대한 명명법은 대부분의 감자 MIP 유전자에 대해서도 부합되었다.

본 발명자들은 TIP 서브패밀리에 속하는 2개의 단백질과 XIP 서브패밀리에 속하는 2개의 단백질을 감자 유래의 아쿠아포린 단백질로 선별하였고, 각각 TIP2-3(서열번호 1), TIP3-1(서열번호 2), TIP3-2(서열번호 3), XIP3-1(서열번호 4) 및 XIP4-1(서열번호 5)로 명명하였다. 상기 단백질들을 암호화하는 유전자들은 각각 서열번호 6 내지 서열번호 10으로 기재되는 염기서열을 갖는다.

실시예 2. 감자 아쿠아포린의 구조적 특징

상기에서 선별된 5가지 감자 아쿠아포린 유전자의 인트론/엑손 구조를 Spud DB 게놈 브라우저(S. tuberosum group Phureja DM1-3, PGSC v4.03 Pseudomolecules,http://potato.plantbiology.msu.edu/cgi-bin/gbrowse/potato/)로부터 대응하는 유전자 ID를 이용하여 확인한 결과, 감자 TIP2-3, TIP3-1 및 TIP3-2 유전자는 2 개의 인트론을 보였지만, 감자 XIP3-1 및 XIP4-1 유전자는 인트론이 없었다(도 1).

또한, 클러스탈W2 프로그램을 이용하여 아미노산 유사성 및 동질성의 백분율을 계산하였다. 이를 위하여, 애기장대, 목화 및 벼 아쿠아포린의 복수의 서열 정렬로부터 이중(dual) NPA 모티프(motif), ar/R 선택성 필터 및 프로거 위치를 추론하였다. 또한, 이중 NPA 모티프, ar/R 선택적 필터 및 프로거 위치(P1-P5)에 기초하여 감자 아쿠아포린의 기능 예측을 수행하였고, WoLF PSORT 도구(http://www.genscript.com/psort/wolf_psort.html)를 이용하여 감자 아쿠아포린의 단백질 부분세포성(subcellular) 위치화를 결정하였으며, 웹 서버인 TOPCONS(http://topcons.cbr.su.se/)를 이용하여 막 단백질 토폴로지(topology)를 예측하였다.

그 결과, 감자 아쿠아포린의 서브패밀리 사이에 높은 서열 다양성이 존재함을 확인하였다. 상기 감자 XIP 단백질은 TIP 단백질과 16-25%의 서열 유사성을 보였다. 또한, TOPCON 분석으로 감자 아쿠아포린 단백질 서열에 대해 토폴로지(topology) 모델을 예측한 결과, 모든 감자 아쿠아포린 서열은 6 개의 막통과 나선 도메인(TM)의 전형적인 아쿠아포린 토폴로지를 보였다. 본 발명자들은 매우 보존된 이중(dual) NPA 모티프, ar/R 선택성 필터의 본질, 5 개의 프로거(Froger) 위치를 포함하는 몇 가지 특성들을 추가로 분석하고, 상이한 식물 종들과 감자 MIP 서브패밀리 사이를 비교한 결과, 감자 TIP 및 XIP 서브패밀리의 위치는 다양하였으며, 예측된 위치는 세포질, 세포막, 액포 및 엽록체였다(표 1).

상기에서, *는 WoLF PSORT 수단에 의한 세포내 예측 위치를 나타내는 것으로서, Chlo는 염록체, Cyto는 세포질, Cysk는 세포골격(cytoskeleton), E.R.은 소포체, Golg는 골지체, Lyso는 리소좀, Mito는 미토콘드리아, Nucl은 핵, Pero는 퍼옥시좀, Plas는 세포막, Vacu는 액포막을 나타낸다.

또한, 상기 TIP 서브패밀리 구성원의 아미노산 길이는 247 내지 260 개 범위였다. TIP2 구성원은 76-91%의 서열 동일성을 보였고, 다른 TIP 구성원과는 46-51% 동일성을 보였다. TIP3-1 및 TIP3-2는 83%의 동일성을 공유하였다. TIP에서, 이중 NPA 모티프와 P3, P4 및 P5 위치는 감자 TIP를 포함하는 식물 종들에서 매우 보존되어 있고, 또한 선택성 필터(ar/R)는 감자 TIP을 포함하는 식물 종들에서 매우 다양하였다. 아울러, 감자 TIP에서, 친수성 및 소수성 아미노 잔기는 각각 R1 및 R3 위치를 점유하지만, 친수성 또는 소수성 잔기 중 하나는 R2 및 R4 위치를 점유하였다.

실시예 3. 비생물적 스트레스에 대한 감자 아쿠아포린의 발현 분석

<3-1> 식물 재료 및 스트레스 처리

균일하게 키운 4 주령의 시험관내 감자 묘목을 사용하여 스트레스 실험을 수행하였다. 식물을 고체 아가 배지로부터 조심스럽게 분리하였고, 뿌리를 멸균수로 세척한 후, 기초 MS 액체 배지로 전달하였다. 대조군은 1.0% 수크로오스를 함유하는 절반 강도의 액체 MS(Duchefa)로 처리하였다. 스트레스 처리를 위하여, 식물을 염도, 가뭄 및 호르몬 처리에 대해 각각 150 mM NaCl, 5% PEG 및 50 μM ABA를 갖는 절반 강도 MS 배지로 전달하였다. 대조군 및 스트레스-처리된 샘플 모두를 식물 성장 챔버에서 22±2℃ 및 60% RH로 인큐베이션(incubation)하였다. 또한, 성장 챔버를 37℃에서 24시간 동안 유지하여 감자 묘목에 고온 스트레스를 주었다. 각각의 처리로부터 샘플 당 4개의 식물을 모았고, 이후의 RNA 추출을 위해 액체 질소에서 급속 동결하였다. 기관 특이적 발현 연구를 위하여, 심은 후 40-55일의 괴경화 기간 동안에 완전히 확장된 잎, 싹, 뿌리, 줄기, 팽윤(swelling) 줄기 및 괴경을 온실에서 키운 식물로부터 수집하였다.

<3-2> 총 RNA 단리 및 cDNA 합성

NucleoSpin RNA 식물 미니프렙 키트(Macherey-Nagel, Germany)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 총 RNA를 추출하였다. 총 RNA의 온전함(integrity)은 포름알데히드 아가로오스 겔 전기영동을 통해 확인하였다. 총 RNA의 순도 및 농도는 분광광도법(Nanodrop ND-1000 Spectrophotometer; Celbio, Italy)으로 결정하였다. cDNA 합성 반응 혼합물(20 ㎕)은 1 ㎍의 총 RNA, 25 pM의 oligo-DT 프라이머 및 RT-프리믹스(Bioneer, Korea)를 함유하였고, cDNA 합성은 37℃에서 90분 동안 수행하였다. 사용 전에 최종 cDNA 생성물을 5배 희석하였다.

<3-3> 실시간 정량적 PCR(qPCR) 분석

다중 정렬에 기초하여 상이한 상동체의 3' 및 5' 비번역 영역(UTR)을 표적으로 하는 서열 특이적 프라이머를 IDT 올리고 디자인 수단을 이용하여 디자인하였다. 스플라이스(splice) 변이체의 경우, 상이한 증폭을 위한 독특한(unique) 서열로 디자인하였다. 그 해당 스플라이스 변이체의 누적 발현을 위해 각각의 XIP1 및 XIP2의 발현을 위한 프라이머 쌍의 세트를 디자인하였다. qPCR을 위해 사용된 모든 프라이머는 보충 표 2에 나열되어 있다. 녹는 곡선(melting curve) 분석(40 사이클 후) 및 아가로오스 겔 전기영동에 의해 각각의 유전자에 대한 프라이머 특이성 및 증폭 효율을 확인하였다.

실험에 사용된 q PCR 프라이머

프라이머	서열	서열번호
액틴	F: gaatggaagcagctggaatc	11
	R: ctggtggtgcaacaacctta	12
TIP2-3	F: TGGCGGCGTAGCTATTGGAA	13
	R: TGCAGCATTTGCTGTCAACTTGC	14
TIP3-1	F: CACTGTTTATGCAACAGCCA	15
	R: AACAAGGACATTAGCTCCAAC	16
TIP3-2	F: GTGATGTTTGTAGTCCAGTTTATGG	17
	R: CTGGGATCATCGTCTTGGAAA	18
XIP3-1	F: ATGTTGGATACAATAGTAATCTCCACTTTA	19
	R: GTAGGATTGTGATTATAACTGCTGC	20
XIP4-1	F: GATTTCCACCCTAGAAAGTGATGTC	21
	R: AGCAAGGATTAGAATGGTGAGTG	22

실시간 qPCR 분석을 위하여, 5 ㎕의 희석된 cDNA, 12.5 ㎕의 Accupower® 2x 그린스타 qPCR 마스터 혼합물(Bioneer, Korea), 0.4 μM의 각각의 프라이머를 함유하는 총 부피 25 ㎕의 각각의 반응 혼합물을 다음의 PCR 사이클 조건에 적용하였다: 95℃에서 10분, 95℃에서 20초, 60℃에서 45초 및 40 사이클의 증폭. CFX96™ 실시간 시스템(Biorad, USA)에서 qPCR을 수행하였다. 액틴 유전자를 내부 대조군으로 사용하여 표적의 정량을 표준화하였다. mRNA 발현에서의 배수 변화를 ΔΔCT 방법에 의해 결정하였다(Kenneth J. Livak and Thomas D. Schmittgen, "Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 22DDCT Method", METHODS 25, 402-408, 2001)

그래프로 나타내기 위하여, 다양한 감자 조직의 ΔΔCT 값을 최소 발현 샘플에 대해 표준화하였고, 스트레스를 받은 샘플의 경우에는 상기 ΔΔCT 값을 비처리 대조군에 대해 표준화하였다. 발현 변화는 log2 배수 변화로 표현하였다. 3번의 독립적인 총 RNA 샘플을 이용하여 qPCR 분석을 수행하였다.

잎, 싹, 뿌리, 굽은(hooked) 줄기, 팽윤(swelling) 줄기 및 성숙한 괴경과 같은 다양한 감자 조직 샘플을 사용하여 qPCR에 의한 아쿠아포린의 발현 프로필을 확인한 결과, 감자 TIP의 mRNA 전사체의 레벨은 조직에 따라 다양하였으며, 다른 조직과 비교하여 감자 TIP2-3, TIP3-1 및 TIP3-2 전사체는 뿌리 및 잎에서 상대적으로 높은 발현을 보였다. 또한, XIP는 분석된 모든 감자 조직에서 발현되었으며, 감자 XIP3-1 및 XIP4-1은 뿌리 조직에서 상대적으로 높은 발현을 보였다. 흥미롭게도, 감자 XIP3-1과 XIP4-1은 유사한 발현 패턴을 보였다.

다양한 비생물적 스트레스 환경 조건 하에 감자 아쿠아포린 유전자 패밀리의 발현 패턴을 조사하였다. 이를 위하여, 가뭄(5% PEG), 저온(4℃), 고온(35℃), 고염(150 mM NaCl) 및 ABA(50 μM)과 같은 다양한 비생물적 스트레스 조건 하에 감자 아쿠아포린의 발현 패턴을 qPCR에 의해 분석하였다. 감자 MIP의 발현은 액틴 내부 대조군에 대해 표준화하였다.

그 결과, 감자 TIP2-3, 3-1 및 3-2의 발현은 조사된 모든 스트레스에서 상향조절되었다. 감자 TIP2-3 및 TIP3-2의 발현은 ABA에 대한 반응시 강하게 유도되었고, 5% PEG 처리시에는 모든 TIP의 발현이 상향조절되었다. 또한, 고온에서는 모든 TIP의 발현이 증가되었고, ABA에 대한 반응시에는 모든 TIP가 상향조절되었으며, 고온 스트레스 조건에서 상대적으로 높은 발현을 보였다(도 2). 아울러, 감자 XIP3 및 XIP4는 고온 스트레스를 제외하고는 모든 스트레스에서 유사한 하향조절 발현 패턴을 보였다(도 3).

실시예 4. 감자 XIP의 클로닝

감자 XIP의 mRNA 서열 정렬에 기초하여 표 3에 기재된 2 쌍의 프라이머를 디자인 및 합성하여 모든 감자 XIP 전사체를 증폭하였다. 상기 PCR 증폭된 cDNA 절편을 TA 클로닝한 후, 확인을 위해 시퀀싱하였다.

실험에 사용된 XIP 클로닝 프라이머

프라이머	서열	서열번호
XIP3	F: ATGTTGGATACAATAGTAATCTCCACTTTA	23
	R: TTATACATTCGACCCAAACAAAGC	24
XIP4	F: ATGTTGGACACCATAGTGATTTCCACCC	25
	R: CTATCTCTGATTGAACAATGCCTCGATTATCGC	26

<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp <120> Aquaporin Genes of Potato Having Abiotic Stress Resistance and Use There of <130> 2013-dpa-0591 <160> 26 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 249 <212> PRT <213> Solanum tuberosum <400> 1 Met Ala Gly Gly Val Ala Ile Gly Ser Phe Ser Asp Ser Phe Ser Val 1 5 10 15 Val Ser Leu Lys Ala Tyr Leu Ala Glu Phe Ile Ser Thr Leu Ile Phe 20 25 30 Val Phe Ala Gly Val Gly Ser Ala Ile Ala Tyr Ser Lys Leu Thr Ala 35 40 45 Asn Ala Ala Leu Asp Pro Ala Gly Leu Val Ala Ile Ala Val Cys His 50 55 60 Gly Phe Ala Leu Phe Val Ala Val Ser Val Ser Ala Asn Ile Ser Gly 65 70 75 80 Gly His Val Asn Pro Ala Val Thr Cys Gly Leu Thr Phe Gly Gly His 85 90 95 Ile Thr Phe Ile Thr Gly Ser Phe Tyr Met Leu Ala Gln Leu Thr Gly 100 105 110 Ala Ala Val Ala Cys Phe Leu Leu Lys Phe Val Thr Gly Gly Cys Ala 115 120 125 Ile Pro Thr His Gly Val Gly Ala Gly Val Gly Ile Ile Glu Gly Leu 130 135 140 Val Met Glu Ile Ile Ile Thr Phe Gly Leu Val Tyr Thr Val Phe Ala 145 150 155 160 Thr Ala Ala Asp Pro Lys Lys Gly Ser Leu Gly Thr Ile Ala Pro Ile 165 170 175 Ala Ile Gly Phe Ile Val Gly Ala Asn Ile Leu Ala Ala Gly Pro Phe 180 185 190 Ser Gly Gly Ser Met Asn Pro Ala Arg Ser Phe Gly Pro Ala Met Ala 195 200 205 Thr Gly Asn Phe Glu Gly Phe Trp Ile Tyr Trp Ile Gly Pro Leu Val 210 215 220 Gly Gly Ser Leu Ala Gly Leu Ile Tyr Thr Asn Val Phe Met Gln Gln 225 230 235 240 Glu His Ala Pro Leu Ser Asn Glu Phe 245 <210> 2 <211> 259 <212> PRT <213> Solanum tuberosum <400> 2 Met Gln Pro Arg Arg Tyr Glu Phe Gly Arg Ala Asp Glu Ala Thr His 1 5 10 15 Pro Asp Ser Met Arg Ala Thr Leu Ser Glu Phe Leu Ser Thr Phe Ile 20 25 30 Phe Val Phe Ala Gly Glu Gly Ser Val Leu Ala Leu Asp Lys Leu Tyr 35 40 45 Pro Asp Arg Gly Leu Gly Ala Ser Arg Leu Thr Ala Ile Ala Leu Ala 50 55 60 His Ala Phe Ser Leu Phe Ala Ala Val Ala Ser Ser Met Asn Val Ser 65 70 75 80 Gly Gly His Ile Asn Pro Ala Val Thr Phe Gly Ala Leu Val Gly Gly 85 90 95 Arg Val Ser Val Leu Arg Ala Ile Tyr Tyr Trp Ile Gly Gln Leu Leu 100 105 110 Gly Ala Val Val Ala Ser Ala Leu Leu Arg Leu Ala Thr Asp Gly Leu 115 120 125 Arg Pro Val Gly Phe Ala Val Ala Pro Gly Val Gly Asn Gly Asn Ala 130 135 140 Leu Val Met Glu Ile Val Met Thr Phe Gly Leu Val Tyr Thr Val Tyr 145 150 155 160 Ala Thr Ala Ile Asp Pro Lys Arg Gly Ser Leu Gly Ile Ile Ala Pro 165 170 175 Leu Ala Ile Ala Phe Ile Val Gly Ala Asn Val Leu Val Gly Gly Pro 180 185 190 Phe Glu Gly Ala Ser Met Asn Pro Ala Arg Ala Phe Gly Pro Ala Leu 195 200 205 Val Gly Trp Arg Trp Arg Asn His Trp Ile Tyr Trp Leu Gly Pro Phe 210 215 220 Ile Gly Ala Ala Ile Ala Gly Ile Ile Tyr Glu Phe Gly Leu Ile Gln 225 230 235 240 Ala His Asp Glu Ala Pro Val His Thr His His Gln Pro Leu Ala Pro 245 250 255 Glu Asp Tyr <210> 3 <211> 260 <212> PRT <213> Solanum tuberosum <400> 3 Met Ala Met Pro Ala Arg Arg Tyr Ala Phe Gly Arg Ala Asp Glu Ala 1 5 10 15 Thr His Pro Asp Ser Met Arg Ala Thr Leu Ser Glu Leu Leu Ser Thr 20 25 30 Phe Ile Phe Val Phe Ala Gly Glu Gly Ser Val Leu Ala Ile Asp Lys 35 40 45 Leu Tyr Pro Asp Thr Gly Leu Gly Ser Ser Arg Leu Ile Val Ile Ala 50 55 60 Leu Ala His Ala Phe Ser Phe Phe Ala Ala Val Ala Ser Ser Leu Asn 65 70 75 80 Val Ser Gly Gly His Ile Asn Pro Ala Val Thr Phe Gly Ser Leu Val 85 90 95 Gly Gly Arg Ile Ser Val Val Arg Ala Ile Tyr Tyr Trp Val Ala Gln 100 105 110 Leu Phe Gly Ser Val Leu Ala Ser Leu Leu Leu Arg Leu Ala Thr Asp 115 120 125 Gly Leu Arg Pro Arg Gly Phe Ser Val Ala Ala Gly Val Gly Asn Leu 130 135 140 Asn Ala Leu Val Met Glu Ile Val Met Thr Phe Gly Leu Met Tyr Thr 145 150 155 160 Val Tyr Ala Thr Ala Val Asp Pro Arg Arg Gly Ser Leu Ser Thr Ile 165 170 175 Ala Pro Leu Ala Ile Ala Phe Ile Leu Gly Ala Asn Thr Leu Val Gly 180 185 190 Gly Pro Phe Glu Gly Ala Ser Met Asn Pro Ala Arg Ala Phe Gly Pro 195 200 205 Ala Leu Val Gly Trp Arg Trp Arg Asn His Trp Ile Tyr Trp Leu Gly 210 215 220 Pro Phe Val Gly Ala Ala Leu Ala Gly Leu Ile Tyr Glu Tyr Gly Ile 225 230 235 240 Ile Gln His Glu Thr Val Pro Arg Pro Thr Thr His Gln Pro Leu Ala 245 250 255 Pro Glu Asp Tyr 260 <210> 4 <211> 262 <212> PRT <213> Solanum tuberosum <400> 4 Met Gly Glu Leu Leu Gly Thr Ala Val Leu Val Phe Met Leu Asp Thr 1 5 10 15 Ile Val Ile Ser Thr Leu Glu Ser Asp Thr Lys Met Pro Asn Leu Ile 20 25 30 Leu Ser Ile Leu Ala Ala Val Ile Ile Thr Ile Leu Leu Leu Ala Val 35 40 45 Val Pro Val Ser Gly Gly His Ile Asn Pro Val Ile Ser Phe Ser Ala 50 55 60 Ala Leu Val Gly Ile Ile Ser Met Ser Arg Ala Ile Ile Tyr Ile Met 65 70 75 80 Ala Gln Cys Val Gly Ala Ile Leu Gly Ala Leu Ala Leu Lys Ala Val 85 90 95 Val Ser Ser Thr Ile Glu Gly Thr Phe Ser Leu Gly Gly Cys Thr Val 100 105 110 Thr Val Ile Ala Pro Gly Pro Asn Gly Pro Val Thr Val Gly Leu Glu 115 120 125 Thr Ala Gln Ala Leu Trp Leu Glu Ile Phe Cys Thr Phe Val Phe Leu 130 135 140 Phe Ala Ser Ile Trp Met Ala Tyr Asp His Arg Gln Ala Lys Ala Leu 145 150 155 160 Gly His Val Thr Val Leu Ser Ile Val Gly Val Val Leu Gly Leu Leu 165 170 175 Val Phe Ile Ser Thr Thr Val Thr Ala Lys Lys Gly Tyr Ala Gly Ala 180 185 190 Gly Ile Asn Pro Ala Arg Cys Phe Gly Pro Ala Ile Val Arg Gly Gly 195 200 205 His Leu Trp Asp Gly His Trp Ile Phe Trp Val Gly Pro Thr Ile Gly 210 215 220 Cys Val Ala Phe Tyr Val Tyr Thr Lys Ile Ile Pro Thr Lys His Phe 225 230 235 240 Asn Ala Glu Tyr Glu Tyr Lys His Asp Phe Val Gly Val Val Lys Ala 245 250 255 Leu Phe Gly Ser Asn Val 260 <210> 5 <211> 248 <212> PRT <213> Solanum tuberosum <400> 5 Met Leu Asp Thr Ile Val Ile Ser Thr Leu Glu Ser Asp Val Lys Met 1 5 10 15 Pro Asn Leu Ile Met Ser Ile Leu Ile Ala Ile Thr Leu Thr Ile Leu 20 25 30 Ile Leu Ala Val Phe Pro Val Ser Gly Gly His Ile Ser Pro Val Ile 35 40 45 Thr Phe Ser Ser Ala Leu Val Gly Leu Ile Ser Met Ser Arg Ala Ile 50 55 60 Ile Tyr Ile Val Ala Gln Cys Ile Gly Ala Ile Leu Gly Ala Leu Ala 65 70 75 80 Leu Lys Ala Val Leu Ser Ser Thr Ile Glu Gln Arg Phe Ser Leu Gly 85 90 95 Gly Cys Thr Val Thr Val Val Thr Pro Gly Leu Asn Gly Pro Glu Ile 100 105 110 Val Gly Leu Glu Ile Ala Gln Ala Phe Trp Leu Glu Phe Met Cys Thr 115 120 125 Phe Ala Leu Leu Phe Gly Ser Leu Trp Met Ala Tyr Asp His Arg Gln 130 135 140 Ser Lys Ala Leu Gly Leu Ile Thr Val Met Ser Ile Val Gly Leu Leu 145 150 155 160 Ala Gly Ile Leu Val Phe Ile Ser Thr Ser Val Thr Ala Lys Lys Gly 165 170 175 Tyr Ala Gly Ala Gly Met Asn Pro Ala Arg Cys Phe Gly Ala Ala Phe 180 185 190 Val Arg Gly Gly His Leu Trp Asn Gly His Trp Ile Phe Trp Val Gly 195 200 205 Pro Gly Leu Ala Cys Phe Ala Phe Tyr Phe Tyr Ile Lys Ile Ile Pro 210 215 220 Ser Asn His Phe Gln Thr Asp Gly Tyr Lys Tyr Asp Phe Leu Ala Ile 225 230 235 240 Ile Glu Ala Leu Phe Asn Gln Arg 245 <210> 6 <211> 750 <212> DNA <213> Solanum tuberosum <400> 6 atggctggcg gcgtagctat tggaagtttt agtgattcat tcagcgttgt gtctcttaag 60 gcctatcttg ctgaattcat ctccacactc atctttgtct tcgccggagt tggttccgcc 120 attgcttaca gcaagttgac agcaaatgct gcacttgatc cggctgggct cgtagctatt 180 gcagtttgcc atggatttgc tctatttgtg gccgtttcag tttcagctaa catctctggt 240 ggtcatgtta accctgctgt cacctgcgga ttaaccttcg gcggccatat tacctttatc 300 actggctcct tctacatgct tgctcaactt accggcgccg ctgtagcttg cttcctcctc 360 aaattcgtca ccggaggatg tgctattcca acccatggag tgggagctgg tgtggggata 420 attgaaggac ttgtgatgga aataattatc acatttggtt tagtgtacac tgtattcgca 480 acagccgctg acccgaagaa gggttcattg ggcacaattg caccaattgc tattggtttc 540 attgttggag ctaatatttt ggctgctggt ccattttccg gcggatcaat gaacccagct 600 cgttcatttg gacctgcaat ggctactggt aactttgagg gtttctggat ctactggatt 660 ggtccattag ttggtggtag tttggctggt cttatttaca ccaatgtgtt catgcaacaa 720 gagcatgctc ctctatccaa tgagttctaa 750 <210> 7 <211> 780 <212> DNA <213> Solanum tuberosum <400> 7 atgcagccac ggagatatga gtttggcagg gcggatgaag ctacacaccc tgattctatg 60 cgtgccacct tgtctgagtt cctctctacc ttcattttcg tctttgctgg agaaggatct 120 gttcttgccc ttgataagtt gtaccctgat agaggtttag gagcgtccag attgacggcg 180 atcgcactgg cgcatgcatt ttcgctcttt gctgcggtag catccagtat gaacgtctct 240 ggcggtcata ttaacccggc tgtcaccttt ggtgctctcg tgggtggccg agttagcgtc 300 cttcgtgcta tctactattg gattggtcag ttgctaggtg ctgttgtagc ctctgccttg 360 ttgaggcttg ctactgatgg cttgaggcca gtgggatttg cggtagcacc 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tgtctattgt tgggcttcta 480 gcagggattc ttgtgtttat ttcaacttca gttactgcta aaaaaggcta tgctggagct 540 ggaatgaatc cagctaggtg ctttggagct gcttttgtta gaggaggcca cctttggaat 600 gggcattgga tcttttgggt tgggcctgga cttgcttgtt ttgctttcta cttctatata 660 aagatcattc cttcgaatca tttccaaact gatggataca agtatgattt cttagcgata 720 atcgaggcat tgttcaatca gagatag 747 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for actin <400> 11 gaatggaagc agctggaatc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for actin <400> 12 ctggtggtgc aacaacctta 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for TIP2-3 <400> 13 tggcggcgta gctattggaa 20 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for TIP2-3 <400> 14 tgcagcattt gctgtcaact tgc 23 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for TIP3-1 <400> 15 cactgtttat gcaacagcca 20 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for TIP3-1 <400> 16 aacaaggaca ttagctccaa c 21 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for TIP3-2 <400> 17 gtgatgtttg tagtccagtt tatgg 25 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for TIP3-2 <400> 18 ctgggatcat cgtcttggaa a 21 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for XIP3-1 <400> 19 atgttggata caatagtaat ctccacttta 30 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for XIP3-1 <400> 20 gtaggattgt gattataact gctgc 25 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for XIP4-1 <400> 21 gatttccacc ctagaaagtg atgtc 25 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for XIP4-1 <400> 22 agcaaggatt agaatggtga gtg 23 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward cloning primer for XIP3 <400> 23 atgttggata caatagtaat ctccacttta 30 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse cloning primer for XIP3 <400> 24 ttatacattc gacccaaaca aagc 24 <210> 25 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward cloning primer for XIP4 <400> 25 atgttggaca ccatagtgat ttccaccc 28 <210> 26 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse cloning primer for XIP4 <400> 26 ctatctctga ttgaacaatg cctcgattat cgc 33

Claims (10)

1. 감자 유래의 서열번호 1 내지 서열번호 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성되는 아쿠아포린 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터로 형질전환된 비생물적 스트레스에 대한 저항성을 갖는 식물로서,
   상기 비생물적 스트레스는 저온, 고온 및 아브시스산(abscisic acid, ABA) 처리로 이루어진 군으로부터 선택되고,
   상기 식물은 감자인 비생물적 스트레스에 대한 저항성을 갖는 식물.
2. 삭제
3. 청구항 1에 있어서,
   상기 유전자는 서열번호 6 내지 서열번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기서열로 구성되는 비생물적 스트레스에 대한 저항성을 갖는 식물.
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 감자 유래의 서열번호 1 내지 서열번호 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성되는 아쿠아포린 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계; 및
   상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터를 이용한 비생물적 스트레스에 대한 저항성을 갖는 형질전환 식물체의 제조 방법으로서,
   상기 비생물적 스트레스는 저온, 고온 및 아브시스산(ABA) 처리로 이루어진 군으로부터 선택되고,
   상기 식물은 감자인 비생물적 스트레스에 대한 저항성을 갖는 식물체의 제조 방법.
9. 삭제
10. 청구항 8에 있어서,
    상기 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 및 전체 식물로 이루어진 군으로부터 선택되는 형질전환 식물체의 제조 방법.

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