KR101665632B1 - 차세대 염기서열분석법을 이용한 cDNA 말단 서열의 대량 분석방법 - Google Patents

차세대 염기서열분석법을 이용한 cDNA 말단 서열의 대량 분석방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 cDNA 말단 염기서열에 특이적인 프라이머를 사용하여 cDNA의 말단 염기서열만을 대량 증폭시킨 후 NGS를 이용하여 cDNA의 염기서열을 분석하는 방법에 관한 것으로, 벡터에 삽입된 cDNA의 말단 염기서열 정보를 신속하고 간편하며 저렴하게 대량 생산할 수 있고, 필요시 해당 클론을 클론 저장소로부터 꺼내어 사용함으로써 완전장 유전자 해독, 발현량 측정, 단백질 연구 등 2차 기능연구를 보다 용이하게 진행할 수가 있다.

Description

차세대 염기서열분석법을 이용한 cDNA 말단 서열의 대량 분석방법{Sequencing method of cDNA end sequence using NGS}
본 발명은 NGS를 이용한 cDNA 서열분석방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 벡터의 특이적인 프라이머를 사용하여 cDNA의 말단 염기서열만을 대량 증폭시킨 후 NGS를 이용하여 cDNA의 말단 염기서열을 분석하는 방법에 관한 것이다.
현재 주류를 이루고 있는 유전자 해독 방식인 차세대 염기서열분석(Next Generation Sequencing, NGS) 기술은 세포로부터 추출한 mRNA로부터 cDNA(complementary DNA)를 합성하여 이를 단편화한 후, 단편화된 DNA 조각의 염기서열을 단시간에 대량으로 해독하고, 컴퓨터의 알고리즘을 이용하여 해독된 수십억 개의 DNA 단편 염기서열을 재조합하여 원래의 유전자 구조를 완성하는 방법이다.
유전자 염기서열의 정확한 정보는 유전자의 발현량 검증, 단백질 분석을 위한 유전자 클론닝 등 후속적으로 진행되는 유전자의 2차 기능연구에 있어서 시간과 비용을 절감하는 매우 중요한 요소로 작용한다. NGS 방법은 단시간에 대량의 유전자 정보를 확보하고 유전자의 발현 양상을 신속하게 파악할 수 있다는 장점을 가지고 있지만, 생산된 유전자 염기서열 정보 및 유전자 구조 정보가 NGS 기기 자체의 DNA 해독 오류 및 컴퓨터 어셈블링(assembling) 프로그램 오류로 인하여 전통적인 방법에 비해서 부정확하다는 단점이 있기 때문에, 이를 기반으로 한 유전자 기능연구 등 후속 연구에 애로점이 많다.
이에 비하여 전통적인 방법은 먼저 cDNA 라이브러리(cDNA library)를 제작한 후 각각의 cDNA 클론의 DNA 염기서열을 규명하는 것으로, 유전자 염기서열의 정보가 정확할 뿐만 아니라 해독한 염기서열에 해당하는 cDNA 클론이 남아 있기 때문에 완전장 유전자의 클로닝 및 유전자의 단백질 발현 등 2차적인 유전자 기능연구에 매우 효과적인 방법이지만, 유전자 정보를 해독하는 시간이 길고 비용이 비싸다는 단점이 있다.
1. 대한민국 특허등록 제10-1406720호 2. 대한민국 특허등록 제10-1447593호 3. 대한민국 특허등록 제10-1533792호 4. 대한민국 특허공개 제10-2015-0017525호
상기 문제점들을 해결하기 위하여, 본 발명은 벡터의 염기서열을 이용하여 삽입된 cDNA의 말단 염기서열을 NGS 방법으로 대량 생산하고, 생산된 정보에 해당하는 클론의 위치를 규명할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 분석 대상으로부터 추출된 mRNA를 역전사하여 cDNA를 합성한 후 cDNA 클론을 제작하고, 각 cDNA 클론을 384-웰 플레이트에 모아 세포 스톡을 제작하는 단계; 상기 세포 스톡용 384-웰 플레이트 20장의 cDNA 클론들을 3차원적으로 조합하여 60개 저장소로 구성된 3차원 풀을 제작하는 단계; 대장균 배양액을 이용하여 상기 3차원 풀의 cDNA 클론들을 증식시킨 후 cDNA 클론 DNA를 추출하는 단계; 상기 추출한 cDNA 클론 DNA를 분석에 적합한 크기로 절단하는 단계; 상기 절단한 DNA 단편의 양쪽 말단을 평활 말단화시킨 후 단편의 양쪽 말단에 Y-형 어댑터 프라이머를 부착하는 단계; 서열번호 3의 포워드 어댑터, 3차원 풀에서 클론의 위치를 표시하는 바코드 서열 및 서열번호 4의 5TSP로 이루어진 GSB-5TSP 프라이머; 또는 서열번호 5의 포워드 어댑터, 3차원 풀에서 클론의 위치를 표시하는 바코드 서열 및 서열번호 6의 3TSP로 이루어진 GSB-3TSP 프라이머를 이용하여 상기 cDNA의 양쪽 말단 서열을 증폭하는 단계; 상기 증폭된 DNA를 정제하여 NGS 서열분석에 적합한 크기로 분획하는 단계; 상기 분획된 DNA를 emPCR에 의하여 증폭하는 단계; 상기 증폭된 DNA의 서열을 NGS로 분석하여 서열데이터를 얻는 단계; 및 상기 서열데이터를 이용하여 cDNA 클론의 위치를 규명하는 단계를 포함하는, 차세대 염기서열분석법을 이용한 cDNA 말단서열의 대량 분석방법을 제공한다.
상기 방법에서, 상기 세포 스톡용 384-웰 플레이트에 X축(수평), Y축(수직) 및 Z축(플레이트)으로 수집한 cDNA의 유래를 구별할 수 있도록 횡렬, 종렬 및 플레이트 단위로 표식자 번호를 붙이는 것이 바람직하다.
상기 방법에서, 상기 3차원 풀은,
세포 스톡용 384-웰 플레이트에서 동일한 번호에 해당하는 수평축(X축)의 24개의 cDNA 클론들을 하나의 저장소에 모으는 단계; 세포 스톡용 384-웰 플레이트에서 동일한 번호에 해당하는 수직축(Y축)의 16개의 cDNA 클론들을 하나의 저장소에 모으는 단계; 세포 스톡용 384-웰 플레이트 한 장에 담겨있는 384개 cDNA 클론들을 하나의 저장소에 모아 플레이트 풀(Z축)을 얻는 단계를 포함하는 방법에 의하여 제작되는 것이 바람직하다.
상기 방법에서, 상기 Y-형 어댑터 프라이머는 서열번호 1과 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 프라이머로서, 말단의 5개의 염기서열이 비상보적인 프라이머인 것이 바람직하다.
상기 방법에서, 상기 추출한 cDNA 클론 DNA는 초음파를 사용하여 절단하는 것이 바람직하다.
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상기 방법에서, 상기 cDNA 양쪽 말단 서열의 증폭은 상기 GSB-5TSP 프라이머와 서열번호 7의 GSB-RP 프라이머, 또는 상기 GSB-3TSP 프라이머와 서열번호 7의 GSB-RP 프라이머를 사용하여 행하는 것이 바람직하다.
본 발명의 방법은 분석하고자 하는 cDNA의 양쪽 말단 염기서열을 대량 증폭하여 NGS 기기를 이용하여 대량 해독하고 각 말단 염기서열에 해당하는 cDNA 클론의 위치를 신속하게 파악할 수 있어, 벡터에 삽입된 cDNA의 말단 염기서열 정보를 신속, 간편, 저렴하게 대량 생산할 수 있다.
본 발명의 실시예에서 실시한 7,680 클론을 기준으로 비교할 때, 전통적인 1세대 유전자분석 기술(ABI3730XL 1대 기준)은 약 1개월 이상이 소요되는 반면, 본 발명의 방법을 사용하면 1일이면 분석이 가능하며, 비용 측면에서도 1세대 유전자분석 기술의 1/10 이하의 비용이 소요된다. 또한 1세대 유전자 분석기술의 경우 서열분석의 전처리 단계가 매우 복잡하기 때문에 수 명의 인력이 필요하지만, 본 발명의 방법은 1인이 전 과정을 수행할 수 있을 정도로 일이 간단하다.
또한 본 발명의 방법은 해독한 말단염기서열 정보로 클론 저장소에 보관된 해당하는 클론의 위치 규명이 가능하기 때문에 유전자의 완전장 염기서열 해독, 유전자 발현량 측정, 단백질 발현 등 해당 유전자의 2차적 기능연구에 이용될 수 있다.
도 1은 cDNA 클론의 구조이다.
도 2는 본 발명의 전체 구성도이다.
도 3은 3차원 풀(pool) 제작 모식도이다.
도 4는 cDNA 클론 DNA의 추출 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 cDNA 클론 DNA의 단편화 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 GSB-YAP 프라이머 염기서열정보이며, 밑줄부위는 비상보성 염기서열을 나타낸 것이다.
도 7은 cDNA 벡터에 삽입된 cDNA 말단염기서열의 증폭에 사용한 어댑터 프라이머 서열이다.
도 8은 GSB-5TSP/GSB-RP 및 GSB-3TSP/GSB-RP 프라이머를 사용한 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 PCR DNA의 크기 분획을 나타낸 것이다.
도 10은 GS-FLX로 피로시퀀싱한 서열 판독들의 염기배열구조이다.
도 11은 서열데이터 분석 구성도이다.
본 발명의 방법의 전체 구성도는 도 2에 나타낸 바와 같으며, 각 단계에 대한 구체적인 내용은 다음과 같다.
1. 세포 스톡(cell stock)의 제작
분석하고자 하는 대상으로부터 추출한 RNA를 사용하여 cDNA 라이브러리를 제작하고 각 cDNA 클론을 384-웰 플레이트(384-웰 플레이트)에 모아 세포 스톡을 제작한다.
일반적으로 cDNA 클론은 벡터와 이에 삽입된 cDNA로 구성된다. 예를 들어, 도 1에 나타낸 바와 같이 pTriplEx2 벡터를 이용한 경우, cDNA가 삽입된 플라스미드 클론은 벡터와 이에 삽입되는 cDNA의 두 개 부위로 구성된다. 이때 벡터에 내재된 벡터의 특이적인 염기서열{5'영역의 TriplEX2 서열분석 프라이머(TriplEX2 Sequencing Primer, 이하 '5TSP'라 함)와 3'영역의 TriplEX2 서열분석 프라이머(TriplEX2 Sequencing Primer, 이하 '3TSP'라 함)}은 삽입된 cDNA의 양쪽 말단부위에 근접하여 위치하게 된다. 따라서 이들 5TSP와 3TSP 서열은 벡터에 삽입된 cDNA의 양쪽 말단부위의 염기서열을 해독할 수 있는 염기 서열분석 프라이머(sequencing primer)로 이용이 가능하다.
pTriplEx2 벡터를 예로 들어 설명했지만, 사용가능한 벡터는 이에 한정되지 않으며 통상적으로 사용되는 모든 벡터를 사용할 수 있다.
2. cDNA 라이브러리의 3차원 풀 제작
상기 세포 스톡용 384-웰 플레이트 20장의 cDNA 클론들을 3차원적으로 조합하여(3-dimentional pooling; 3D-pool) 60개 저장소로 구성된 3차원 풀(pool)을 제작한다. 3차원 풀이란 384-웰 플레이트에 보관된 각각의 cDNA 클론을 수평축(X축), 수직축(Y축), 플레이트 풀(Plate pool, Z축) 별로 일정량씩 적출한 후, X축, Y축, Z축 별로 모아진 각각의 cDNA 클론을 하나의 저장소(reservoir)에 혼합해 놓은 라이브러리를 말한다.
3차원 풀을 제작하는 구체적인 과정은 다음과 같다.
(1) 세포 스톡용 384-웰 플레이트에서 동일한 번호에 해당하는 수평축(horizontal; X축)의 24개의 cDNA 클론들을 하나의 저장소에 모은다.
(2) 세포 스톡용 384-웰 플레이트에서 동일한 번호에 해당하는 수직축(vertical; Y축)의 16개의 cDNA 클론들을 하나의 저장소에 모은다.
(3) 세포 스톡용 384-웰 플레이트 한 장에 담겨있는 384개 cDNA 클론들을 하나의 저장소에 모아 플레이트 풀(plate pool, Z축)을 얻는다.
상기 세포 스톡용 384-웰 플레이트에는 X축, Y축 및 Z축으로 수집한 cDNA의 유래를 구별할 수 있도록 횡렬, 종렬 및 플레이트 단위로 표식자 번호를 붙이는 것이 바람직하다. 상세하게는, 384-웰 플레이트의 상단에는 수평축(X축)으로 24개의 아라비아 숫자 일련번호(1~24)를, 좌측에는 수직축(Y축)으로 16개의 알파벳(A~P)을 새기고, 혼합하고자 하는 각각의 플레이트에서 동일한 X축 열 혹은 Y축 열에 해당하는 cDNA 클론들을 일정량씩 적출하여 각 열에 따라서 각각의 용기에 담고, Z축은 384-웰 플레이트 1장에 들어 있는 384개 cDNA 클론에서 동량을 적출하여 하나의 용기에 담아 3차원 풀을 제작한다.
3. cDNA 클론의 증식 및 DNA 추출
대장균을 배양하는 배양액을 이용하여 상기 3차원 풀의 cDNA 클론들을 증식시킨 후 cDNA 클론 DNA를 추출한다.
4. 추출한 DNA 의 절단
상기 추출한 cDNA 클론 DNA를 분석에 필요한 적절한 크기로 절단한다. 이때 DNA를 절단하는 방법은 통상적으로 사용되는 다양한 방법을 사용할 수 있지만, 초음파를 사용하여 절단하는 것이 보다 바람직하다.
5. Y-형 어댑터 프라이머(Y-type adapter primer)의 부착
상기 절단한 DNA 단편의 양쪽 말단을 평활 말단화(blunt end)시킨 후, DNA 단편끼리 결합하지 못하도록 단편의 양쪽 말단에 Y-형 어댑터 프라이머를 부착한다. Y-형 어댑터 프라이머는 말단에 비상보적 서열을 가지고 있어서 cDNA 말단서열을 증폭하는 과정에서 cDNA의 자가결합을 방지한다.
Y-형 어댑터 프라이머의 한 예를 서열목록의 서열번호 1과 서열번호 2, 및 도 6에 나타내었다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 말단 5개의 서열은 서로 비상보적이다.
6. cDNA 양쪽 말단 서열의 증폭
벡터에 내재된 서열을 이용하여 cDNA의 양쪽 말단 서열을 PCR을 실시하여 증폭한다.
예를 들어, pTriplEx2 벡터를 이용하는 경우, 백터에 내재된 5TSP 서열 또는 3TSP 서열을 이용하여 cDNA의 양쪽 말단 서열을 증폭한다. 즉, 5TSP서열을 포함하는 프라이머 또는 3TSP 서열을 포함하는 프라이머를 사용하여 cDNA의 양쪽 말단 서열을 증폭하는 것이 바람직하다.
5TSP서열을 포함하는 프라이머의 한 예인 GSB-5TSP는 서열번호 3의 포워드 어댑터(30bp), 바코드 서열(10bp) 및 서열번호 4의 5TSP(18bp)로 이루어진다. 3TSP 서열을 포함하는 프라이머의 한 예인 GSB-3TSP 프라이머는 서열번호 5의 포워드 어댑터(30bp), 바코드 서열(10bp) 및 서열번호 6의 3TSP(20bp)로 이루어진다. 상기 프라이머와 함께 사용되는 역방향 프라이머의 한 예인 GSB-RP 프라이머는 서열번호 7의 서열을 가진다. 이때, 바코드 서열은 3차원 풀에서 클론의 위치를 표시하는 표식자 서열이다. 상기 프라이머들의 구성을 도 7에 나타내었다.
하나의 저장소의 DNA를 2개로 나누어 하나는 GSB-5TSP 프라이머와 GSB-RP 프라이머를 넣어 PCR을 실시하고, 다른 하나는 GSB-3TSP 프라이머와 GSB-RP 프라이머를 넣어 PCR을 실시하는 것이 바람직하다.
7. 증폭된 DNA 의 정제 및 크기분획
상기 증폭된 DNA를 정제하여 NGS 서열분석에 적합한 크기로 분획한다. 예를 들어 NGS 분석에 GS-FLX 서열분석기를 사용하는 경우에는 평균사이즈가 700bp인 것이 바람직하다.
8. emPCR 에 의한 DNA 의 증폭
상기 적합한 크기로 분획된 DNA를 emPCR에 의하여 증폭한다. DNA 증폭에는 dNTP, PCR 버퍼, 프라이머, Taq 중합효소, PPiase(Peptidyl-Prolyl Cis-Trans Isomerase)를 혼합한 프리믹스(premix)를 사용하여 PCR 오일분자를 만든 후 PCR을 실시하여 오일분자에 혼합된 DNA를 증폭한다.
9. NGS 에 의한 서열분석
상기 증폭된 DNA의 서열을 NGS로 분석하여 서열데이터를 얻는다.
10. cDNA 클론의 위치 규명
상기 NGS 서열분석을 통해 얻은 서열데이터를 이용하여 cDNA 클론의 위치를 규명한다.
얻어진 서열데이터에서 3' 말단 부위의 어댑터 프라이머를 제거하고 5' 말단 부위의 어댑터 프라이머를 가진 서열데이터를 확보한다. 확보한 서열데이터를 3차원 서열 라이브러리 제작에 사용한 바코드 서열을 이용하여 60종류로 다시 분리한 후 바코드별로 모아진 서열데이터를 콘틱으로 만든다. X축, Y축 및 Z축 각각에 해당하는 콘틱들간의 상동성 검색을 실시하여 동일한 서열별로 분류한 후 5TSP 또는 3TSP의 위치가 동일한 클론별로 재분류하여 cDNA 클론의 위치를 규명한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1>
세포 스톡의 제작
밤나무의 잎으로부터 전체 RNA를 추출하고, 전체 RNA 중 mRNA를 역전사하여 cDNA를 합성한 후, pTriplEX2 클로닝 키트(Clontech)를 이용하여 cDNA 클론을 제작하고, 각각의 cDNA 클론을 384-웰 플레이트에 모아(picking) 세포 스톡을 만들었다. 얻어진 세포 스톡은 -80℃ 냉동고에 보관하였다.
< 실시예 2>
3차원 풀(3D-dimentional pool)의 제작
상기 방법으로 제작한 세포 스톡인 20장의 384-웰 플레이트를 혼합하여 60개의 저장소로 구성된 3차원 풀을 제작하였다. 3차원 풀의 제작과정을 도 3에 나타내었으며, 구체적인 제작방법은 다음과 같다.
(1) -80℃ 냉동고에 세포 스톡으로 보관된 384-웰 플레이트 20장을 4℃ 냉장고로 옮겨 해동시켰다.
(2) 384-웰 플레이트는 수평축(X축)으로 24개('×1'~'×24'), 수직축(Y축)으로 16개(×A~×P)의 웰이 배열된 구조로써, 본 발명에서는 20개의 384 투명웰 플레이트에 보관된 7,680개의 cDNA 클론(384클론/플레이트×20플레이트)을 이용하였다.
(3) 먼저, 각 플레이트의 동일한 위치에 있는 웰(예, #1 플레이트의 h1 레인(16개 웰), #2 플레이트의 h1 레인(16개 웰)...#20 플레이트의 h1 레인(16개 웰)로부터 각 2㎕씩 스톡 세포를 취하여 50㎖의 1×LB배지가 들어있는 1개의 저장소(Rx)에 혼합하여, X축으로부터 24개의 혼합물('Rx1'~'Rx24')을 만들었다. 동일한 방법으로 Y축으로부터는 16개의 혼합물('RyA'~'RyP')을 만들었다. 또한 각 플레이트의 384개 세포를 1개의 저장소(Rp)에 혼합한 플레이트 풀(plate pool)(Z축)로 20개의 혼합물('Rz1'~'Rz20')을 만들었다. 최종적으로 7,680개의 cDNA 클론으로부터 60개의 혼합물 저장소(X축:24개, Y축:16개, Z축:20개)를 만들었다.
(4) 각 저장소에 모아진 cDNA 클론 혼합물과 동량의 DMSO 동결보존액을 섞어 준 후, -80℃ 냉동고에 보관하였다.
(5) -80℃ 냉동고의 저장소 스톡으로부터 각각 312㎕(X축), 208㎕(Y축), 500㎕(Z축)를 취하여 50㎖의 1×LB 배지와 혼합한 후, 37℃ 배양기에서 200rpm으로 진탕(shaking)하면서 6시간 동안 배양하였다(OD=약 1.0).
< 실시예 3>
cDNA 클론 DNA의 추출
cDNA 클론 DNA의 추출은 HiPure 플라스미드 키트(Invitrogen)를 사용하였다. 키트에 설명된 사용방법에 따라서 배양한 용액을 원심분리방법으로 모은 균체에 현탁버퍼(suspension buffer) 4㎖, 라이시스버퍼(lysis buffer) 4㎖, 중화버퍼(neutralize buffer) 4㎖를 순차적으로 넣고 일정시간씩 반응시켜 최종적으로 균체의 세포막을 용해시켰다. 용해된 액체를 원심분리하여 취한 상층액을 칼럼에 넣고 일정시간 실온에 둔 후 칼럼을 통과시켜 cDNA 클론 DNA를 추출하였다.
cDNA 클론 DNA를 추출한 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에서 1~6레인은 cDNA 클론 DNA를 각 1㎕ 로딩(=100~120ng)한 것이며, M은 1kb 람다 래더(lambda ladder)이다.
상기 방법으로 총 60개의 저장소로부터 추출한 cDNA 클론 DNA의 양은 각각 1~4㎍이었다.
< 실시예 4>
DNA 의 단편화
1.5㎖ 마이크로튜브에 추출한 cDNA 클론 DNA 1㎕을 넣고 1×TE로 전체 부피를 50㎕로 조정한 후, 초음파 기기(US portable cleaners, 모델명:US-05, JEIOTECH, Korea)의 '하이 모드(high mode)'에서 30~120초간 반응시켜, DNA를 100bp~10kb 크기로 단편화시켰다. 그 결과를 도 5에 나타내었다. 각각 3㎕ 로딩(=100~120ng)한 것이고, 사이즈 마커는 100bp 래더이다.
<실시예 5>
단편화된 DNA 말단부위 수복
단편화된 DNA의 말단 부위를 평활말단(blunt form)으로 만들기 위해 말단 수복 효소 믹스 키트(end repairing enzyme mix kit, Fermentas, K0771)를 사용하였다.
제조회사의 키트 사용방법에 따라서 각각의 DNA가 담겨있는 1.5㎖ 마이크로튜브에 버퍼와 효소를 넣고 혼합하여 20℃ 수조블록(water bath block)에서 5분간 반응시킨 후, 페놀클로로포름(phenolchloroform)과 에탄올 침전법으로 DNA를 정제하고 멸균수 6㎕에 DNA를 녹여서 그 농도를 측정하였다.
<실시예 6>
Y-형 어댑터 프라이머의 결합
중합효소반응시 시발체가 되고, DNA 단편들이 자가결합(self ligation)되는 것을 막기 위해 Y-형 어댑터 프라이머(GSB-YAP)을 양쪽 말단에 결합시켜 주었다.
사용한 GSB-YAP은 18bp의 이중가닥 DNA로서 말단부위 5개 염기서열이 서로 상보적이지 않는 구조를 가지고 있다. GSB-YAP 프라이머 염기서열 정보를 도 6에 나타내었으며, 도 6에서 밑줄친 부위는 비상보성 염기서열을 나타낸다.
평활말단화시킨 DNA 200ng과 GSB-YAP 200ng을 넣은 튜브에 리가아제(ligase) 2.5㎕를 혼합하고 16℃ 수조에서 3시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝나면 DNA 정제키트를 사용하여 정제한 후 DNA를 멸균수 30㎕에 녹였다.
<실시예 7>
벡터에 삽입된 cDNA 말단 염기서열의 증폭
삽입된 cDNA의 양쪽말단 염기서열을 특이적으로 증폭하기 위하여 벡터의 5TSP 또는 3TSP 서열, 바코드(Barcode) 서열, emPCR용 포워드 어댑터 프라이머(forward adaptor primer)를 결합한 프라이머(GSB-5TSP 프라이머와 GSB-3TSP 프라이머)를 각각 디자인하여 제작하였다. 벡터에 삽입된 cDNA 말단염기서열의 증폭에 사용한 프라이머인 GSB-5TSP 프라이머(서열번호 3의 포워드 어댑터, 바코드 서열 및 서열번호 4의 5TSP로 이루어짐), GSB-3TSP 프라이머(서열번호 5의 포워드 어댑터, 바코드 서열 및 서열번호 6의 3TSP로 이루어짐) 및 GSB-RP 프라이머(서열번호 7)의 서열을 도 7에 나타내었다.
하나의 저장소 DNA를 두 개의 튜브로 나눈 후, 한 튜브에는 GSB-5TSP 프라이머와 GSB-RP 프라이머를 넣고, 다른 튜브에는 GSB-3TSP 프라이머와 GSB-RP 어댑터 프라이머를 넣어 PCR을 실시하였다.
PCR 증폭반응은 ProDNi 유전자증폭기(ProDNi thermocycler, GnC Bio.)를 사용하여 실시하였으며, 각 반응은 Taq DNA 중합효소(Taq DNA polymerase) 0.25㎕, 10×버퍼 2.5㎕, 50×dNTP 0.5㎕, GSB-5TSP 프라이머 10pmol, GSB-RP 프라이머 1㎕/10pmol, 주형 DNA(Template DNA) 3㎕를 함유하는 PCR 혼합액으로 총 25㎕의 양으로 수행하였다. 반응은 96℃에서 3분간 변성하고, 96℃ 20초, 50℃ 20초, 72℃ 20초로 40회 반복시킨 후 72℃에서 10분간 반응시켰다. 증폭반응 후 1% 농도의 아가로스 젤에서 전기영동한 후 에티디움 브로마이드(ethidium bromide)로 착색시켜 UV 트랜스일루미네이커(transilluminator)에서 확인하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8에는 M은 100bp 사이즈 마커이다.
그 결과, 도 8의 a에서 2.0kb 이하의 PCR 단편이 증폭되는 것을 확인하였으며, X축, Y축, Z축으로 수집한 60개의 저장소의 cDNA 클론에 대하여 동일한 방법으로 PCR을 실시하여 도 8의 b와 같은 결과를 얻었다.
<실시예 8>
크기 분획(Size fraction)
GSB-3TSP/GSB-RP 60종류, GSB-5TSP/GSB-RP 60종류로 증폭된 120종류의 DNA를 하나의 튜브로 다시 합친 후, GS-FLX 서열분석기(sequencer)에 사용가능한 크기인 평균크기 700bp의 DNA를 추출하기 위해 크로마 스핀 TE1000 칼럼 키트(chroma spin TE1000 column kit, Clontech)와 앰퓨어 비드(Ampure bead, Beckmancoulter)로 크기 분획을 실시하였다. 키트는 제품설명서에 따라서 사용하였다.
DNA 약 100㎕를 크기 분획 비드가 들어있는 TE1000 칼럼에 통과시키고 자유낙하시켜 총 10개 방울을 받아낸 뒤 전기영동으로 크기를 확인하고(도 9의 a), 큰 사이즈의 DNA가 상대적으로 적은 10번째 방울의 DNA로 다음 과정을 진행하였다.
작은 크기의 DNA를 제거하기 위하여 큰 사이즈의 DNA를 제거한 10번째 방울의 DNA가 들어있는 튜브에 앰퓨어 XP 비드(AMPure XP Bead) 250㎕를 넣어 MPC 장치에 장착한 후 버퍼를 제거하고, 사이징 용액(sizing solution) 500㎕를 첨가하여 앰퓨어 XP 비드와 혼합하였다. 사이징 혼합액(sizing mix) 125㎕를 회수한 10번째 방울의 PCR 산물 50㎕와 재혼합한 후, 25℃ 수조에서 5분간 인큐베이션하고, MPC에 장착하여 상층액을 회수하였다. 회수한 상층액 125㎕를 사용하고 남은 사이징 혼합액 375㎕에 넣고 혼합하여 25℃ 수조에서 인큐베이션한 후, MPC에 다시 장착하여 상층액을 제거하였다. 상층액을 제거한 튜브에 TE 버퍼 100㎕를 첨가하여 흔들어준(vortex) 후 사이징 용액 500㎕를 첨가하여 흔들어주고 25℃ 수조에서 5분간 인큐베이션하였다. 이 용액을 MPC에 장착하여 상층액을 제거하고, 70% 에탄올로 2회 세척한 후 앰퓨어 XP 비드를 대기건조시켰다. 건조된 비드에 TE 버퍼 23㎕를 넣어 흔들어준 후, 다시 MPC에 장착하여 상층액 21㎕를 회수하였다. 회수한 DNA의 크기와 농도는 피코RNA 칩(PicoRNA chip)을 사용하여 바이오애널라이저 2100(Bioanalyzer 2100, BECKMAN Co.)으로 측정하였다. 그 결과 DNA 농도는 127.86pg/㎕, 평균 크기는 667bp임을 확인하였다(도 9의 b).
< 실시예 9>
emPCR 을 통한 DNA 의 증폭
전과정에 필요한 시약 및 방법은 Roche사의 사용방법에 따라서 실시하였다. dNTP, PCR 버퍼, 프라이머, Taq 중합효소, PPiase를 혼합한 프리믹스(premix)를 32개 에멀젼 튜브(emulsion tube)에 분주하고, 실시예 8에서 회수하여 바이오애널라이저 PicoRNA 칩(Bioanalyzer PicoRNA chip)으로 계산한 DNA의 카피 개수와 비드의 개수를 적정량 혼합 후 비드와 단일가닥 DNA가 결합할 수 있도록 PCR 기기로 80℃에서 20℃까지 순차적으로 온도를 내리는 반응을 실시하였다. 반응이 끝난 DNA 포획 비드(DNA captured bead)에 멸균수를 넣은 후, PCR 프리믹스가 혼합된 오일(oil)과 혼합시켜 티슈라이저(Tissue lyser)를 사용하여 12Hz에서 5분 동안 셰이킹(shaking)하여 PCR 오일 분자(microreactors)를 만들었다. PCR 오일분자가 들어있는 튜브를 PCR기기에 장착하여 PCR을 실시하여 오일분자에 혼합된 DNA를 증폭하였다.
< 실시예 10>
GS - FLX 서열분석
전과정에 필요한 시약 및 방법은 Roche사의 사용방법에 따라서 실시하였다. emPCR이 끝난 시료에, 이소프로판올(iso-propanol), 에탄올, 증진 유체 버퍼(enhancing fluid buffer) 등을 사용하여 스트렙토아비딘(streptoavidin)이 코팅된 비드를 회수하였다. 용융용액(Melting solution)과 어닐링버퍼(annealing buffer)로 비드를 중화시킨 후 강화 프라이머(enrichment primer)를 넣고 65℃ 수조에서 5분 동안 반응시켜 서열분석 시료를 준비하였다. 증진버퍼(enhancing buffer)로 수차례 세척한 강화 비드(enrichment bead)를 준비된 DNA 시료와 혼합하고 용융용액으로 세척하여 서열분석 프라이머가 표적 DNA가 결합된 비드만을 회수하였다. 회수한 포획비드를 PicoTiterTM 플레이트에 넣고 12시간 동안 피로시퀀싱(pyrosequencing)을 진행하였다. 최종적으로 얻어지는 시퀀스의 구조는 도 10에 나타낸 바와 같다. 각 서열 판독들은 5TSP 서열, 3TSP 서열 및 바코드 서열로 분류할 수 있다.
< 실시예 11>
서열데이터( Sequence data ) 분석
XL70 서열분석 라이브러리 키트(XL70 sequencing library kit)로 피로시퀀싱을 실시하여 647,759개의 서열분석 판독(sequencing read)을 확보한 후, BlastN 방법으로 서열 라이브러리 제작과정에서 3' 말단에 부착시킨 어댑터 서열(GSB-RP)을 모두 제거하고, 5' 말단 부위에 어댑터 프라이머로 부착시킨 GSB-5TSP와 GSB-3TSP를 가지고 있는 서열분석 판독 171,104개와 234,984개를 각각 확보하였다. 확보한 각각의 서열분석 판독을 3D-풀 라이브러리(3D-pool library) 제작에 사용한 바코드 서열을 이용하여 60종류(X축: 24, Y축: 16, Z축: 20)로 다시 분리한 후, 바코드별로 모아진 서열분석 판독은 CAP3 어셈블러(assembler)를 사용하여 콘틱으로 만들었다. X축, Y축, Z축 각각에 해당하는 콘틱들간에 상동성 검색을 실시하여 동일한 서열별로 분류한 후, 5TSP 및 3TSP에서 위치가 동일한 클론별로 재분류하여 최종적으로 cDNA 클론의 위치를 규명하였다. 서열데이터 분석구성도를 도 11에 나타내었다.
BlastN을 사용하여 서열 상동성을 X축, Y축, Z축으로 상호교차검색 한 결과, 본 실험에 사용한 7,680종류(384-웰 플레이트 20장)에서 클론의 위치가 판명된 cDNA 클론의 수는 총 6,785개(실험군의 88%)였으며, 각 판독들의 서열 길이는 22bp~782bp 분포를 보였으며, 평균길이는 275bp였다. 위치가 판명된 6,785개 중에서 cDNA 클론의 양쪽 말단서열 5TSP와 3TSP이 모두 확인된 클론은 4,863개(실험군의 63%), 5TSP만 확인된 클론은 866개(실험군의 12%), 3TSP만 확인된 클론은 1056개(15%)였다.
<110> GnC Bio Co.,LTD. <120> Sequencing method of gene DNA end sequence using NGS <130> 00 <160> 7 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GSB-YAP primer <400> 1 ccgatctaga tcgtccga 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GSB-YAP primer <400> 2 tcctgcgatc tagatcgg 18 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward adaptor in GSB-5TSP primer <400> 3 ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag 30 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5TSP in GSB-5TSP primer <400> 4 tccgagatct ggacgagc 18 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward adaptor in GSB-3TSP primer <400> 5 ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag 30 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3TSP in GSB-3TSP primer <400> 6 taatacgact cactataggg 20 <210> 7 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GSB-RP primer <400> 7 cctatcccct gtgtgccttg gcagtctcag tcctgcgatc tagatcgg 48

Claims (8)

  1. 분석 대상으로부터 추출된 mRNA를 역전사하여 cDNA를 합성한 후 cDNA 클론을 제작하고, 각 cDNA 클론을 384-웰 플레이트에 모아 세포 스톡을 제작하는 단계;
    상기 세포 스톡용 384-웰 플레이트 20장의 cDNA 클론들을 3차원적으로 조합하여 60개 저장소로 구성된 3차원 풀을 제작하는 단계;
    대장균 배양액을 이용하여 상기 3차원 풀의 cDNA 클론들을 증식시킨 후 cDNA 클론 DNA를 추출하는 단계;
    상기 추출한 cDNA 클론 DNA를 분석에 적합한 크기로 절단하는 단계;
    상기 절단한 DNA 단편의 양쪽 말단을 평활 말단화시킨 후 단편의 양쪽 말단에 Y-형 어댑터 프라이머를 부착하는 단계;
    서열번호 3의 포워드 어댑터, 3차원 풀에서 클론의 위치를 표시하는 바코드 서열 및 서열번호 4의 5TSP로 이루어진 GSB-5TSP 프라이머; 또는 서열번호 5의 포워드 어댑터, 3차원 풀에서 클론의 위치를 표시하는 바코드 서열 및 서열번호 6의 3TSP로 이루어진 GSB-3TSP 프라이머를 이용하여 상기 cDNA의 양쪽 말단 서열을 증폭하는 단계;
    상기 증폭된 DNA를 정제하여 NGS 서열분석에 적합한 크기로 분획하는 단계;
    상기 분획된 DNA를 emPCR에 의하여 증폭하는 단계;
    상기 증폭된 DNA의 서열을 NGS로 분석하여 서열데이터를 얻는 단계; 및
    상기 서열데이터를 이용하여 cDNA 클론의 위치를 규명하는 단계를 포함하는, 차세대 염기서열분석법을 이용한 cDNA 말단서열의 대량 분석방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 세포 스톡용 384-웰 플레이트에 X축(수평), Y축(수직) 및 Z축(플레이트)으로 수집한 cDNA의 유래를 구별할 수 있도록 횡렬, 종렬 및 플레이트 단위로 표식자 번호를 붙이는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 3차원 풀은,
    세포 스톡용 384-웰 플레이트에서 동일한 번호에 해당하는 수평축(X축)의 24개의 cDNA 클론들을 하나의 저장소에 모으는 단계;
    세포 스톡용 384-웰 플레이트에서 동일한 번호에 해당하는 수직축(Y축)의 16개의 cDNA 클론들을 하나의 저장소에 모으는 단계;
    세포 스톡용 384-웰 플레이트 한 장에 담겨있는 384개 cDNA 클론들을 하나의 저장소에 모아 플레이트 풀(Z축)을 얻는 단계를 포함하는 방법에 의하여 제작되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 Y-형 어댑터 프라이머는 서열번호 1과 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 프라이머로서, 말단의 5개의 염기서열이 비상보적인 프라이머인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 추출한 cDNA 클론 DNA는 초음파를 사용하여 절단하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서,
    상기 cDNA 양쪽 말단 서열의 증폭은 제1항의 GSB-5TSP 프라이머와 서열번호 7의 GSB-RP 프라이머, 또는 제1항의 GSB-3TSP 프라이머와 서열번호 7의 GSB-RP 프라이머를 사용하여 행하는 것을 특징으로 하는 방법.
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