KR101665261B1 - 위축성 질염의 치료용 조성물 및 위축성 질염의 진단용 마커 조성물 - Google Patents

위축성 질염의 치료용 조성물 및 위축성 질염의 진단용 마커 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명의 위축성 질염의 치료용 조성물은 질 상피세포에서 VDR(Vitamin D Receptor)의 활성화와 에즈린(Ezrin) 단백질의 활성화를 유도하는 활성화제를 포함하여 기존의 호르몬 요법을 대체하여 위축성 질염을 예방, 치료할 수 있다.

Description

위축성 질염의 치료용 조성물 및 위축성 질염의 진단용 마커 조성물{COMPOSITIONS FOR TREATING OR DETECTING ATROPHIC VAGINITIS}
본 발명은 위축성 질염의 예방 또는 치료용 조성물과 위축성 질염 진단용 마커 조성물에 대한 것으로, 기존의 위축성 질염에 처방되던 호르몬 요법을 대체하여 위축성 질염을 예방 또는 치료하기 위한 조성물과, 질 상피세포로부터 단백질 수준을 검출하여 위축성 질염 여부를 진단할 수 있는 바이오 마커 조성물에 관한 것이다.
위축성 질염(atrophic vaginitis)은 비특이성 질염이나 노인성 질염이라고도 부르는 질환으로, 질 점막의 성숙 부족으로 발생하는 폐경 증상 중 하나이다. 에스트로겐 농도의 감소가 근본 원인으로, 폐경 후 가장 흔히 발생하나, 난소 절제 후, 암에 대한 화학요법이나 골반 방사선 요법 후, 유방암에 대한 호르몬요법 후에도 발생할 수 있으며, 질 벽이 얇아지고, 조직의 탄력성이 줄어들며, 질 건조, 질 작열감, 염증 발생 등의 증상을 보인다.
위축성 질염이 심해지는 경우에는, 에스트로겐 대체 요법이 적용되며, 국소적으로 또는 경구로 투여 된다. 그러나, 이러한 에스트로겐 대체 요법은 자궁내막암 등 발암의 원인이 될 수 있다는 보고가 있어 많은 폐경 여성들은 호르몬 치료에 두려움을 가지고 있는 실정이다.
칼슘 대사와 관련해 폐경기에 골다공증의 예방과 치료제로 알려져 있는 비타민 D는, 지용성 스테로이드 호르몬의 한 종류이다. 비타민 D의 칼슘과 인의 항상성을 조절 기능은 잘 알려져 있었다. 최근 비타민 D 대사물질이 세포의 성장과 분화에도 관여한다는 연구들이 많이 보고되고 있다.
비타민 D의 작용기전에는 유전체적 기전과 비유전체적 기전이 있다. 전형적인 유전체적 기전(genomic pathway)은 비타민 D 수용체(Vitamin D Receptor, VDR)을 통해 매개되고, 비유전체적(nongenomic) 기전에 의하여 비타민 D는 여러 세포질 내 신호 전달 기전들 (Protein C kinase C, ras, MAPK 등)을 조절한다. 세포질 내 신호 전달 기전들의 활성화는 세포 성장, 분화, 자멸사에 영향을 미치고 전형적인 유전체적 기전과 함께 작용하며, 다양한 생체 기능을 조절하는 역할을 수행한다.
1. 국제공개번호 제 WO 2002/78682호 2. 국내공개번호 제 10-2007-0018121호
본 발명의 목적은 기존의 호르몬 요법을 대체하여 위축성 질염의 예방 또는 치료할 수 있는 약학 또는 식품 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 위축성 질염 진단용 마커 조성물과 이를 이용하여 위축성 질염의 예방 또는 치료용 약물을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 위축성 질염의 치료용 조성물은 질 세포에서 VDR(Vitamin D Receptor)의 활성화와 에즈린(Ezrin) 단백질의 활성화를 유도하는 활성화제를 포함한다.
상기 활성화제는 비타민 D 또는 이의 약학적으로 허용되는 염(유도체)을 유효 성분으로 함유하는 것일 수 있다.
상기 위축성 질염의 예방 또는 치료용 조성물은, 위축성 질염 치료시 호르몬 대체요법으로 적용되며, 질 상피세포가 치밀하게 형성되도록 돕는 것일 수 있다.
상기 조성물은 약학 또는 식품(특히, 기능성 식품) 조성물일 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 위축성 질염 진단용 마커 조성물은, 질 상피세포에서 에즈린(Ezrin) 단백질과 인산화된 에즈린 단백질의 수준을 검출하는 제제를 함유한다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 위축성 질염 치료제의 스크리닝 방법은, 위축성 질염 상피세포주를 함유하는 스크리닝용 세포를 배양하는 제1단계; 상기 스크리닝용 세포에 약물을 처리하여 처리군을 준비하는 제2단계; 상기 처리군내의 에즈린(Ezrin) 단백질과 인산화된 에즈린 단백질의 발현수준, 또는 상기 처리군내의 인산화된 에즈린 단백질의 발현수준과 상기 약물을 처리하지 않은 대조군의 인산화된 에즈린 단백질의 발현수준을 비교하는 제3단계;를 포함한다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 위축성 질염의 예방 또는 치료용 조성물은, 질 상피세포에서 VDR(Vitamin D Receptor, VDR)의 활성화와 에즈린(Ezrin) 단백질의 활성화를 유도하는 활성화제를 유효량으로 포함하는 것을 특징으로 한다.
에즈린(Ezrin) 단백질은 ERM(moesin-ezrin-radixin) protein family에 속하는 단백질 중 하나로, 이들 ERM 단백질들은 세포막의 단백질들과 세포 골격의 연접과 신호 전달을 함께 수행한다. 즉, ERM은 세포의 구조, 움직임, 세포와 세포간, 세포와 기질간의 부착을 조절하면서, 세포 내외의 신호를 인식하고 전달하며, 이들 중 대표적인 단백질인 에즈린 단백질은 세포의 항상성 유지 기능을 수행한다.
본 발명의 발명자들은, 폐경 후 혈중 에스트로겐의 수준이 낮아지면, 질 세포의 골격과 세포간의 상호관계에 중요한 역할을 하는 에즈린으로 대표되는 ERM의 발현, Rho A와 VDR(Vitamin D Receptor, VDR) 활성에 변화가 생길 것이라는 점에 기초해, 질 세포에서의 에스트라디올 및/또는 프로게스테론과 Rho A, ezrin과의 관계를 연구하였다. 또한, 질 상피세포에서 비타민 D와 이들 Rho A 및 ezrin 단백질과의 관계를 확인하고, VDR, Rho A과 ezrin 단백질의 발현율과 기존의 에스티라디올 등에서의 발현율 등을 비교함으로써 질 상피세포에서 VDR(Vitamin D Receptor, VDR)의 활성화와 에즈린 단백질의 활성화를 유도하는 활성화제가 위축성 질염을 예방 또는 치료할 수 있다는 점을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
상기 활성화제는 비타민 D 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효 성분으로 함유하는 것일 수 있다. 이때, "약학적으로 허용되는 염"이 염을 형성할 수 있는 작용기, 예를 들어, 산 또는 아민 작용기를 갖는 본 발명의 화합물의 경우 제조될 수 있다. 약학적으로 허용되는 염은 모 화합물의 활성을 유지하며, 투여되는 피검자에게 및 투여되는 상황에 해롭거나 불리한 효과를 부여하지 않는 임의의 염을 의미한다. 약학적으로 허용되는 염은 유기 또는 무기 염기로부터 유도될 수 있고, 상기 염은 1가 또는 다가 이온일 수 있다. 상기 염은 무기 이온, 나트륨, 칼륨, 칼슘 및 마그네슘일 수 있고, 또한 상기 염은 유기 염인 아민, 특히 암모늄 염, 예컨대 모노-, 디- 및 트리알킬아민 또는 에탄올아민과 함께 이루어지는 것일 수 있다. 염은 또한 카페인, 트로메타민 및 유사한 분자와 함께 형성될 수 있다. 상기 비타민 D는 유도체나 활성화제의 형태로 함유될 수 있으며, 예를 들어 1,25-다이하이드록시비타민 D3(1,25-dihydroxyvitamin D3, 1α,25(OH)2-비타민 D3)가 상기 활성화제의 유효성분으로 포함될 수 있다.
상기 비타민 D를 상기 활성화제의 유효성분으로 적용하는 경우, 1,25(OH)2D3가 세포질의 VDR과 결합하여 비유전체적 기전으로 세포 내로 칼슘의 유입을 유발하고, Rho A와 Ezrin이 활성화되어, 세포와 세포 사이의 연결을 견고하게 하는 과정으로 작용하는 것으로 보이며, 이는 위축성 질염의 예방 또는 치료 용도로 활성을 가질 수 있다. 또한, 비타민 D 수용체도 에스트라디올(E2)-매개성 강화의 양상을 보여 E2와 비타민 D 사이에 상승작용이 있을 것으로 여겨진다.
에즈린(Ezrin)으로 대표되는 ERM protein family가 질벽에 널리 분포하며, 에즈린(ezrin)이 질 세포들의 세포골격, 세포간의 결합과 극성, 그리고 생물이나 화학물질들의 이동을 조절하여 질의 탄력성과 장력, 산성도 유지 같은 특별한 기능을 할 것이라고 생각된다.
Rho, Rac, Cdc42를 포함하는 저분자 GTP-결합 단백질들로서 Rho-하부족의 구성원들은 액틴 세포골격의 구조화를 조절하는데 중요한 역할을 함으로써, 세포 이동, 세포 부착 등 여러 가지 세포과정을 조절한다. Rho 단백질들은 GTP 결합 상태인 활성 형태와 GDP 결합 상태인 비활성 형태 사이를 순환하면서 세포의 작용을 조절하는 분자적 스위치 역할을 한다. Actin의 구성과 역동에 영향을 미치는 하류의 수많은 표적 단백질들을 조절함으로써 복잡하고 역동적인 세포구조의 변화가 일어난다. 세포 골격의 재형성에 대한 Rho족 단백질들의 역할은 섬유아세포 (fibroblast)에 Rho 단백질들을 미세주입(microinjection)하면 세포 표면의 돌출 및 초점 부탁, stress fiber 형성과 같은 세포 골격의 변화를 유도한다는 실험을 통하여 증명된 바 있다. Rho족 단백질들의 활성이 섬유아세포에만 적용되는 것이 아니라는, 진핵 세포의 서로 다른 유형에서도 액틴 세포 골격을 조절하는 데 비슷한 역할을 한다. 정상 상피 세포에서는 주로 E-cadherin(Epithelial cadherin)이 세포와 세포 사이의 연접을 유지하는 역할을 한다. E-cadherin은 세포 연접의 중요한 구성성분이고, 치밀한 상피층을 형성하기 위해서 필요한 세포 내 구조물이기 때문에 E-cadherin으로 연관되어 있는 상피세포들은 움직일 수가 없고, 상피층이 유지된다. 그리고 E-cadherin은 Rho family에 의하여 조절될 수 있다.
상기 위축성 질염의 예방 또는 치료용 조성물에 포함되는 활성화제는, 질 상피세포에서 VDR(Vitamin D Receptor)의 활성화와 에즈린(Ezrin) 단백질의 활성화를 유도하며, RhoA로 대표되는 Rho족 단백질의 활성화도 유도할 수 있다. 이를 통하여 상기 위축성 질염의 예방 또는 치료용 조성물은 질 상피세포가 치밀하게 형성되도록 도울 수 있고, 위축성 질염 치료시 기존에 사용되던 호르몬 대체요법으로 적용될 수 있다.
본 명세서에서 상기 조성물은 약학 조성물일 수 있다.
상기 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체(carrier) 또는 첨가제를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 상기 "약학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다. 상기 "담체"는 세포 또는 조직 내로의 화합물의 부가를 용이하게 하는 화합물로 정의된다.
본 명세서의 약학 조성물은 단독으로 또는 어떤 편리한 담체 등과 함께 혼합하여 투여될 수 있고, 그러한 투여 제형은 단회투여 또는 반복투여 제형일 수 있다. 상기 약학 조성물을 포함하는 약학 조성물은 고형 제제 또는 액상 제제일 수 있다. 고형 제제는 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 좌제 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 고형 제제에는 담체, 착향제, 결합제, 방부제, 붕해제, 활택제, 충진제 등이 포함될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 액상 제제로는 물, 프로필렌 글리콜 용액 같은 용액제, 현탁액제, 유제 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 적당한 착색제, 착향제, 안정화제, 점성화제 등을 첨가하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 산제는 본 명세서의 유효 성분인 약학 조성물과 유당, 전분, 미결정셀룰로오스 등 약제학적으로 허용되는 적당한 담체를 단순 혼합함으로써 제조될 수 있다. 과립제는 본 명세서의 상기 약학 조성물; 약학적으로 허용되는 적당한 담체; 및 폴리비닐피롤리돈, 히드록시프로필셀룰로오스 등의 약학적으로 허용되는 적당한 결합제를 혼합한 후, 물, 에탄올, 이소프로판올 등의 용매를 이용한 습식과립법 또는 압축력을 이용한 건식과립법을 이용하여 제조될 수 있다. 또한 정제는 상기 과립제를 마그네슘스테아레이트 등의 약학적으로 허용되는 적당한 활택제와 혼합한 후, 타정기를 이용하여 타정함으로써 제조될 수 있다.
본 명세서의 약학 조성물은 치료해야 할 질환 및 개체의 상태에 따라 경구제, 주사제(예를 들어, 근육주사, 복강주사, 정맥주사, 주입(infusion), 피하주사, 임플란트), 흡입제, 비강투여제, 질제, 직장투여제, 설하제, 트랜스더말제, 토피칼제 등으로 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 투여 경로에 따라 통상적으로 사용되고 비독성인, 약학적으로 허용되는 운반체, 첨가제, 비히클을 포함하는 적당한 투여 유닛 제형으로 제제화될 수 있다.
특히, 상기 약학 조성물은 국소적 또는 질내 투여의 방법으로 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물이 질내 투여를 위해 제조될 때, 이들은 일반적으로, 제약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 조합하여, 약학적 제형 또는 단위 투여 형태를 형성한다. 질내 투여를 위해, 조성물은 용액, 현탁액, 에멀션, 분말, 과립 제형, 또는 천연 또는 합성 중합체 또는 수지로서 제시될 수 있다. 활성 조성물은 또한 볼루스 또는 페이스트로서 제시될 수 있다. 본 발명의 질내 투여된 치료 조성물은 또한 서방성을 위해 제형화될 수 있으며, 예를 들어, 조성물은 코팅되거나, 미소캡슐화되거나, 또는 서방성 운반 장치 내에 배치될 수 있다. 상기 제형의 전체 활성 성분은 제형의 0.1 내지 99.9중량％를 포함할 수 있다.
본 명세서의 약학 조성물은 매일 약 0.0001 mg/kg 내지 약 10 g/kg이 투여될 수 있으며, 약 0.001 mg/kg 내지 약 1 g/kg의 1일 투여 용량이 바람직하다. 그러나 상기 투여량은 상기 혼합물의 정제 정도, 환자의 상태(연령, 성별, 체중 등), 치료하고 있는 상태의 심각성 등에 따라 다양할 수 있다. 필요에 따라 편리성을 위하여 1일 총 투여량이 나누어지고 하루 동안 여러 번 나누어 투여될 수 있다.
본 명세서의 조성물이 약학 조성물로 사용될 경우, 상기 조성물 내의 약학 조성물의 함량은 질환의 증상, 증상의 진행 정도, 환자의 상태 등에 따라서 항염 활성을 나타낼 수 있는 유효량을 적절히 조절 가능하며, 예컨대, 상기 약학 조성물의 양은 전체 조성물 총 중량을 기준으로 0.0001 중량% 이상, 구체적으로 0.001 중량% 이상일 수 있고, 80 중량% 이하, 구체적으로는 50 중량% 이하일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 상기 조성물은 식품 조성물일 수 있다.
본 명세서의 조성물이 식품 조성물로 사용될 경우, 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
본 명세서에서 식품은 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 구체적으로 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 각종 식품, 기능성 식품, 음료, 식품 첨가제 및 음료 첨가제를 모두 포함하는 의미로 사용된다. 상기 식품의 예로서 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본 명세서의 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실,채소류 음료, 두유류, 발효음료류, 아이스크림류 등), 천연조미료(예, 라면 스프 등), 비타민 복합제, 알코올 음료, 주류 및 그 밖의 건강보조식품류를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 기능성 식품, 음료, 식품첨가제 또는 음료첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.
상기 "기능성 식품"이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병 방지와 회복 등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 구체적으로는 건강 기능성 식품일 수 있다. 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
또한, 상기 식품 조성물에서, 상기 약학 조성물의 유효성분의 양은 식품 조성물 총 중량의 0.00001 중량% 이상, 구체적으로 0.1 중량% 이상일 수 있고, 800 중량% 이하, 구체적으로 50 중량% 이하, 더욱 구체적으로 40 중량% 이하로 포함될 수 있으며, 상기 식품이 음료인 경우에는 식품 전체의 부피 100 ml 를 기준으로 0.001 g 이상, 구체적으로 0.01 g 이상, 50 g 이하, 구체적으로 10 g이하, 더욱 구체적으로 2g 이하의 비율로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서의 식품 조성물에는 그 유효성분 이외에 감미제, 풍미제, 생리활성 성분, 미네랄 등이 포함될 수 있다. 감미제는 식품이 적당한 단맛을 나게 하는 양으로 사용될 수 있으며, 천연의 것이거나 합성된 것일 수 있다. 구체적으로는 천연 감미제를 사용하는 경우인데, 천연 감미제로서는 옥수수 시럽 고형물, 꿀, 수크로오스, 프룩토오스, 락토오스, 말토오스 등의 당 감미제를 들 수 있다. 풍미제는 맛이나 향을 좋게 하기 위하여 사용될 수 있는데, 천연의 것과 합성된 것 모두 사용될 수 있다. 구체적으로는 천연의 것을 사용하는 경우이다. 천연의 것을 사용할 경우에 풍미 이외에 영양 강화의 목적도 병행할 수 있다. 천연 풍미제로서는 사과, 레몬, 감귤, 포도, 딸기, 복숭아 등에서 얻어진 것이거나 녹차잎, 둥굴레, 대잎, 계피, 국화 잎, 자스민 등에서 얻어진 것일 수 있다. 또 인삼(홍삼), 죽순, 알로에 베라, 은행 등에서 얻어진 것을 사용할 수 있다. 천연 풍미제는 액상의 농축액이나 고형상의 약학 조성물일 수 있다. 경우에 따라서 합성 풍미제가 사용될 수 있는데, 합성 풍미제는 에스테르, 알콜, 알데하이드, 테르펜 등이 이용될 수 있다. 생리 활성 물질로서는 카테킨, 에피카테킨, 갈로가테킨, 에피갈로카테킨 등의 카테킨류나, 레티놀, 아스코르브산, 토코페롤, 칼시페롤, 티아민, 리보플라빈 등의 비타민류 등이 사용될 수 있다. 미네랄로서는 칼슘, 마그네슘, 크롬, 코발트, 구리, 불소화물, 게르마늄, 요오드, 철, 리튬, 마그네슘, 망간, 몰리브덴, 인, 칼륨, 셀레늄, 규소, 나트륨, 황, 바나듐, 아연 등이 사용될 수 있다.
또한 본 명세서의 식품 조성물은 상기 감미제 등 이외에도 필요에 따라 보존제, 유화제, 산미료, 점증제 등을 포함할 수 있다.
이러한 보존제, 유화제 등은 그것이 첨가되는 용도를 달성할 수 있는 한 극미량으로 첨가되어 사용되는 것이 바람직하다. 극미량이란 수치적으로 표현할 때 식품 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.0005 중량％ 내지 약 0.5 중량％ 범위를 의미한다.사용될 수 있는 보존제로서는 소듐 소르브산칼슘, 소르브산나트륨, 소르브산칼륨, 벤조산칼슘, 벤조산나트륨, 벤조산칼륨, EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 등을 들 수 있다. 사용될 수 있는 유화제로서는 아카시아검, 카르복시메틸셀룰로스, 잔탄검, 펙틴 등을 들 수 있다. 사용될 수 있는 산미료로서는 연산, 말산, 푸마르산, 아디프산, 인산, 글루콘산, 타르타르산, 아스코르브산, 아세트산, 인산 등을 들 수 있다. 이러한 산미료는 맛을 증진시키는 목적 이외에 미생물의 증식을 억제할 목적으로 식품 조성물이 적정 산도로 되도록 첨가될 수 있다. 사용될 수 있는 점증제로서는 현탁화 구현제, 침강제, 겔형성제, 팽화제 등을 들 수 있다.
상기 조성물은 에스트라디올이나 프로게스테론를 처리한 세포보다 VDR과 인산화된 활성 형태의 Rho A와 Ezrin의 발현이 증가시켜서, 위축성 질염의 예방 또는 치료용으로 유용하게 활용될 수 있으며, 특히 질 상피세포 조직 강화 용도를 가지며, 기존의 호르몬 요법을 대체하는 위축성 질염 예방과 치료용으로 활용될 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 위축성 질염 진단용 바이오 마커 조성물은, 질 상피세포에서 에즈린(Ezrin) 단백질의 활성화 수준을 검출하는 검출제제를 포함하는 것일 수 있고, 에즈린(Ezrin) 단백질과 인산화된 에즈린(Ezrin) 단백질의 수준을 검출하는 제제를 함유하여 위축성 질염 여부를 진단에 활용될 수 있다.
상기 에즈린(Ezrin) 단백질의 활성화 수준을 검출하는 검출제제는, 비활성형 에즈린(Ezrin) 단백질을 검출하는 제1제제를 함유하거나, 활성형 에즈린(Ezrin) 단백질을 검출하는 제2제제를 함유할 수 있고, 상기 제1제제와 상기 제2제제를 함께 함유하는 것일 수 있다.
또한, 상기 위축성 질염 진단용 바이오 마커 조성물은 Rho A(Ras homolog gene family, member A) 단백질과 인산화된 Rho A 단백질의 수준을 검출하는 제제를 더 함유하여 위축성 질염 여부를 진단에 활용될 수 있다.
여기서 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미하며, 본 발명의 목정상 진단은 위축성 질염 발병 여부를 확인하는 것이다. 또한, "진단용 마커, 진단용 마커 조성물, 또는 진단용 바이오 마커" 등의 표현은 위축성 질염 세포와 정상 세포를 구분하여 진단에 도움을 줄 수 있는 물질로, 정상 세포에 비해서 위축성 질염 세포에서 증가하거나 감소하는 단백질 등과 같은 유기 생체 분자 수준을 정상 세포와 구분할 수 있거나 그 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함한다.
여기서 "진단"은 "생물학적 시료"를 활용하여 진행될 수 있으며, 구체적으로 질 조직, 보다 좋게는 질 상피조직이나 질 상피세포를 포함하는 시료(검체)인 생물학적 시료를 활용한 검사 결과를 활용하여 진행될 수 있다.
위에서 단백질과 인산화된(활성화된) 단백질의 수준 측정은, 생물학적 시료 내에서 상기 단백질들의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 바람직하게는, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다. 즉, 상기 단백질의 수준을 측정하는 제제는, 예를 들어 에즈린 단백질 또는 활성화된 에즈린 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 것일 수 있다.
이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역분석(Immunoassay), 면역화학염색분석(Immunohistochemistry Assay), 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질칩(protein chip) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
상기 항체란, 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미하고, 본 발명의 목적상, 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 상기한 바와 같이 위축성 질염 마커 단백질이 제시되었으므로, 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 다클론 항체는 상기한 위축성 질염 마커 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 위축성 질염 진단용 키트는 의심 환자의 생물학적 시료의 분석을 통해서 위축성 질염 진단을 도와주는 키트로, 위에서 설명한 위축성 질염 진단용 마커 조성물을 포함한다. 이러한 위축성 질염 조성물을 이용한 키트를 이용하여 위축성 질염 의심 환자의 생물학적 시료 분석에 활용할 경우, 간단한 방식으로 편리하게 위축성 질염 진단을 위한 자료를 제공할 수 있다. 상기 위축성 질염의 진단용 키트는 면역분석(immunoassay)키트일 수 있다.
본 발명이 또 다른 일 실시예에 따른 위축성 질염 치료제의 스크리닝 방법은,위축성 질염 상피세포주를 함유하는 스크리닝용 세포를 배양하는 제1단계; 상기 스크리닝용 세포에 약물을 처리하여 처리군을 준비하는 제2단계; 상기 처리군내의 에즈린(Ezrin) 단백질과 인산화된 에즈린 단백질의 발현수준, 또는 상기 처리군내의 인산화된 에즈린 단백질의 발현수준과 상기 약물을 처리하지 않은 대조군의 인산화된 에즈린 단백질의 발현수준을 비교하는 제3단계;를 포함한다.
상기 위축성 질염 치료제의 스크리닝 방법은 상기 제3단계에서 에즈린 단백질과 인산화된 에즈린 단백질의 발현수준과 함께, Rho A(Ras homolog gene family, member A) 단백질과 인산화된 Rho A 단백질의 발현수준을 비교할 수 있다.
상기 스크리닝 방법은, 위축성 질염 치료 과정에서 질 세포 강화에 도움을 주는 1가지 이상의 단백질을 활용하여 이 단백질의 발현을 촉진 또는 억제하는 물질을 찾아내는 방식으로 위축성 질염 치료제의 후보물질을 효과적으로 스크리닝 할 수 있다.
본 발명의 위축성 질염의 예방 또는 치료용 조성물은 에스트라디올이나 프로게스테론를 처리한 세포보다 VDR과 인산화된 활성 형태의 Rho A와 Ezrin의 발현이 증가시켜서 특히 질 상피세포 조직 강화 용도를 가지며, 위축성 질염의 예방 또는 치료용으로 유용하게 활용될 수 있으며, 기존의 호르몬 요법을 대체할 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예 1에서 질 상피세포주를 이용하여 세포증식실험(MTT assay 분석)을 한 결과 중에서 1,25(OH)2D(1,25-dihydroxyvitamin D3, Vit. D)를 처리한 샘플들의 농도별 세포 성장률을 나타낸 그래프이다(농도 표시에서 M앞의 "-숫자"는 윗첨자로 예를 들어 10-10M은 10-10M을 의미함. 이하 도면에서 모두 동일하게 적용).
도 2는 본 발명의 실시예 1에서 질 상피세포주를 이용하여 세포증식실험(MTT assay 분석)을 한 결과 중에서 에스트라디올(estradiol, E2)을 처리한 샘플들의 농도별 세포 성장률을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 실시예 1에서 질 상피세포주를 이용하여 세포증식실험(MTT assay 분석)을 한 결과 중에서 프로게스테론(progesterone, P4)을 처리한 샘플들의 농도별 세포 성장률을 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 실시예 1에서 질 상피세포주를 이용하여 세포증식실험(MTT assay 분석)을 한 결과를 정리한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 실시예 2에서 질 상피세포주에 각각 표시된 농도의 Vit. D, E2, 그리고 (E2 + P4)로 처리한 샘플을 이용하여 활성형과 비활성형의 Rho A 발현을 웨스턴 블롯팅으로 확인한 결과이다.
도 6은 본 발명의 실시예 2에서 질 상피세포주에 각각 표시된 농도의 Vit. D, E2, 그리고 (E2 + P4)로 처리한 샘플을 이용하여 활성형과 비활성형의 Ezrin 발현을 웨스턴 블롯팅으로 확인한 결과이다.
도 7은 도 5의 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 8은 도 6의 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명의 실시예 3에서 질 상피세포주에 각각 표시된 농도의 Vit. D, E2, 그리고 (E2 + P4)로 처리한 샘플을 이용하여 Immunocytochemistry 분석한 결과이다(X400).
도 10은 도 9의 결과 중에서 핵에서의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 11은 도 9의 결과 중에서 세포질에서의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 12는 본 발명의 실시예 4에서 질 상피세포주에 각각 표시된 농도의 Vit. D, E2, 그리고 (E2+P4)로 처리한 샘플을 이용하여 면역형광염색 (Immunofluorescence) 분석한 결과이다(scale bars-50μm).
도 13은 도 12의 결과 중에서 VDR의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 14는 도 12의 결과 중에서 Rho와 p-Rho의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 15는 도 12의 결과 중에서 Ezrin과 p-Ezrin의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
본 발명에서는, 질 상피세포주인 VK2/E6E7에 1,25(OH)2D(1,25-dihydroxyvitamin D3, Vit. D), 에스트라디올(estradiol, E2), 프로게스테론 (progesterone, P4)을 각각 처리하여 MTT assay법을 통하여 세포 배양에 가장 효과적인 농도를 찾고, 배양된 세포에 적당한 농도를 처리하여 VDR, Rho A, Ezrin 단백질들의 발현을 웨스턴 블롯법, 면역세포화학염색법, 면역형광염색법으로 검출하여 이하 구체적으로 설명하는 내용과 같이 비타민 D의 질 상피세포주에서의 VDR과 인산화된 활성 형태의 Rho A와 Ezrin의 발현 정도를 확인하였다. 이러한 결과로부터, 이들이 질 상피세포주에서의 VDR과 인산화된 활성 형태의 Rho A와 Ezrin 등이 위축성 질염의 진단에 활용될 수 있다는 점과 함께, 비타민 D의 투여로 질의 탄력성과 장력 유지, 산성도 유지 등과 같은 기능을 회복할 수 있다는 위축성 질염 치료제로써의 가능성도 확인하였다. 각각의 도면에서 NC는 control을, VH는 vehicle을 의미한다.
< 실시예 1: 세포 증식 실험( MTT assay 분석) >
질 상피 세포의 성장률을 비교하기 위하여 MTT assay 분석법으로 확인하였다.
VK2/E6E7 cell을 96 well plate에 5 X 103 cell/well로 48시간 배양하고 도 1 내지 도 4에 표시된 농도의 vit.D, E2, P4 혹은 E2과 P4를 함께(E2 + P4) 처리하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양시켰다.
각각 24, 48, 및 72시간 후(1일, 2일 및 3일 후) well 당 40μl의 MTT (Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide) 용액으로 처리하고, 37℃, 5% CO2 incubator에서 4 시간 동안 방치시켰다.
4 시간 동안 방치된 각 well의 배양액을 회수되어 상층액을 버리고 DMSO를 처리하여 MTT 염료의 대사성 전환을 종료한 후 565nm로 흡광도를 측정하여 판독하였다. 이렇게 처리된 결과를 도 1 내지 4에 나타내었다.
도 1 내지 도 4를 참조하면, 10-8 M의 vit. D, 10-9 M E2, 10-7 M P4를 처리한 세포에서 성장률이 가장 높게 측정되었고, 48 시간 후에 측정된 10-8 M의 vit. D와 (10-9 M E2 + 10-7 M P4)를 처리한 세포의 성장률이 높게 나타났다. 또한, vit. D를 처리한 세포의 성장률이 E2 또는 P4로 처리한 세포의 성장률보다 높게 나타났다. 따라서 vit. D를 처리한 세포에서 성장률의 증가는 질 상피세포의 세포활성을 증가시켜 위축성 질염의 치료에 도움이 됨을 확인할 수 있었다.
< 실시예 2: 웨스턴 블롯 (Western blot) 분석 >
Vit. D, E2, 그리고 (E2 + P4)로 처리한 질 상피세포에서 단백질을 추출하여 활성형과 비활성형의 Rho A, Ezrin에 대한 발현의 차이를 확인하기 위하여 웨스턴 블롯 분석을 진행하였다. 구체적으로, 위의 실시예 1에서 가장 우수한 결과를 보여주었던 10-8 M의 vit. D, 10-9 M E2, 그리고 (10-9 M E2 + 10-7 M P4)를 처리한 세포를 이용하여 실험을 진행했다.
각각의 세포는 lysis buffer로 단백질을 추출하여 동량의 단백질을 8 ~ 15 % gel에서 전기영동을 실시한 후, PVDF 막(poly(vinylidenedifluoride) memberane)에 transfer 시켰다. 이후, 4 ℃에서 12시간 이상 1차 항체와 반응되고, 1차 항체로는 아래의 항체 패널들이 사용되었다.
(1) Rho A (sc-418, 1:100, Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA, USA);
(2) p-Rho A (sc-32954, 1:100, Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA, USA);
(3) Ezrin (ab4069, 1:1000, Abcam Inc., Cambridge, MA, USA);
(4) Thr567 phospho-Ezrin (ab47293, 1:1000, Abcam Inc., Cambridge, MA, USA).
1차 항체와 반응이 끝난 PVDF 막은 실온에서 1시간 동안 적당한 농도의 2차 항체와 반응되었다. 2차 항체로는 goat anti-rabbit IgG-HRP (sc-2004, 1:5000, Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA, USA)와 goat anti-mouse IgG-HRP (sc-2005, 1:5000, Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA, USA)이 사용되었다.
이후, ECL 시약을 뿌려 필름에 현상된 결과와 이를 정량분석한 결과를 각각 도 5 내지 도 8에 나타내었다. 액틴은 내적 대조군으로 사용하였다.
도 5 내지 도 8을 참조하면, vit. D를 처리한 세포에서 활성화 형태인 인산화된 Rho A (phospho-Rho A)와 인산화된 Ezrin (phospho-Ezrin)의 발현이 다른 호르몬을 처리한 군보다 높게 나타나서, 다른 호르몬을 처리한 세포보다 vit. D를 처리한 세포에서 활성 형태의 단백질이 더 발현된 것을 확인할 수 있었다.
< 실시예 3: 면역세포화학염색( Immunocytochemistry ) 분석 >
Rho A와 Ezrin의 발현 위치를 확인 하기 위해 VK2/E6E7 세포에 각각 vit. D, E2, 또는 (E2+ P4)를 처리하여 면역세포화학염색법을 실시하였다. 6 well plate에 cover glass를 깔고, 그 위에 3~5 X 105 cell/well로 48시간 배양하였다.
10-8 M의 vit. D, 10-9 M E2, 그리고 (10-9 M E2 + 10-7 M P4)로 각각 처리하여 48시간 후에 각 well의 세포를 4% PFA(paraformaldehyde)로 고정되고, TBS-T로 세척되고, 100% iced-methanol로 투명화되었다. 이후, 세포는 4℃에서 1% bovine serum albumin로 적당한 1차 항체와 반응되었다. 1차 항체는 웨스턴 블롯 분석에 이용된 Rho A, p-Rho A, Ezrin, p-Ezrin이 1:200으로 희석되어 반응되었다. 면역염색은 HRP(EXPOSE mouse- and rabbit-specific horseradish peroxidase), 3',3-디아미노벤지다인(3',3-diaminobenzidine, DAB) 검출 면역조직화학(immunohistochemistry, IHC) 키트 (Abcam Inc., Cambridge, MA, USA) 을 이용하여 매뉴얼에 따라 수행되었다. 세포는 키트에 포함된 rabbit anti-mouse secondary antibody와 secondary antibody-HRP conjugate를 이용하여 실온에서 2차 항체와 반응되었다. 핵의 대조염색을 위해, 세포의 핵은 헤마톡실린으로 염색되었다. 이렇게 처리된 결과를 도 9에 나타내었다.
활성 또는 비활성화된 Rho A 및 Ezrin의 발현율을 확인하기 위하여 H-score를 측정하여 수치화 하였다. H-score는 핵과 세포질에서 발현율을 각각 ‘strong’은 ‘+3’, ‘moderate’는 ‘+2’, ‘week’는 ‘+1’로 카운팅하여 측정되었고, 측정된 발현율은 아래와 같이 계산되었으며, 그 결과를 각각 도 10과 도 11에 나타내었다.
H-score = (percentage of cells of weak intensity × 1) + (percentage of cells of moderate intensity × 2) + (percentage of cells of strong intensity × 3)
도 9 내지 도 10을 참조하면, vit. D 및 호르몬을 처리한 세포에서 활성화 형태인 인산화된 Rho A (phospho-Rho A)와 phospho-Ezrin의 발현이 증가함을 보여준다. 특히, 발현이 증가하는 위치는 세포의 핵과 세포질에서 동시에 발현되고 있고, phospho-Ezrin보다는 phospho-Rho A의 발현이 뚜렷이 확인된다.
그와 반대로, 비활성화 형태의 Rho A와 Ezrin은 vehicle에서만 발현이 되고, vit. D 및 호르몬을 처리한 세포에서는 단백질의 발현이 현저히 감소되는 것을 확인할 수 있었다.
< 실시예 4: 면역형광염색 ( Immunofluorescence ) 분석 >
VDR, Rho A와 Ezrin의 발현 위치 및 발현율을 확인 하기 위해 VK2/E6E7 세포에 vit. D 및 E2, E2+ P4를 처리하여 면역형광염색법을 실시하였다.
6 well plate에 cover glass를 깔고, 그 위에 3~5 X 105 cell/well로 48시간 배양하였다. 10-8 M의 vit. D, 10-9 M E2, 그리고 (10-9 M E2 + 10-7 M P4)로 각각 처리하여 48시간 후에 각각의 세포는 4% PFA로 고정되고, PBS로 세척되고, 100% iced-methanol로 투명화되었다. 이후, 세포는 4℃에서 1% bovine serum albumin로 1차 항체와 반응되었다.
1차항체는 웨스턴 블롯 분석에 사용된 항체를 1:200로 희석하여 반응되었고, 추가적으로 VDR (sc-13133, 1:200, Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA, USA)도 반응되었다. 세포는 실온에서 형광 처리된 2차 항체와 반응되었다. 2차 항체로는 아래의 항체 패널들이 사용되었다.
(1) Goat anti-rabbit IgG H&L (Alexa Fluor® 647) antibody (ab150079, 1:250, Abcam Inc., Cambridge, MA, USA)
(2) Goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor® 488) antibody (ab150113, 1:250, Abcam Inc., Cambridge, MA, USA).
핵의 대조염색을 위해, 세포의 핵은 DAPI로 염색되었다. 이렇게 처리된 결과를 도 12에 나타내었다. 또한, 도 12의 결과를 정량화하여 도 13 내지 도15에 나타내었다.
상기 도 12 내지 15를 참조하면, vit. D를 처리한 세포에서 VDR, 인산화된 활성 형태의 Rho A와 Ezrin이 비활성 형태의 단백질보다 많이 발현되었다. 다른 호르몬을 처리한 세포보다 vit. D를 처리한 세포에서 활성 형태의 단백질이 더 발현된 것을 확인할 수 있었다.
이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

Claims (5)

  1. 인산화된 Rho A 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는, 위축성 질염 진단용 마커 조성물.
  2. 제1항에 있어서, VDR(Vitamin D Receptor) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 인산화된 에즈린 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 더 포함하는 것인, 위축성 질염 진단용 마커 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항의 조성물을 포함하는 위축성 질염 진단용 키트.
  4. 위축성 질염 상피세포주를 함유하는 스크리닝용 세포를 배양하는 제1단계;
    상기 스크리닝용 세포에 약물을 처리하여 처리군을 준비하는 제2단계; 및
    상기 처리군내의 인산화된 Rho A 단백질의 발현수준과 상기 약물을 처리하지 않은 대조군의 인산화된 Rho A 단백질의 발현수준을 비교하여, 상기 약물 처리군에서 인산화된 Rho A 단백질의 발현이 증가하면, 상기 약물을 치료제로 선택하는 제3단계;를 포함하여 위축성 질염 치료제를 스크리닝 하는, 위축성 질염 치료제의 스크리닝 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 약물 처리군내의 VDR(Vitamin D Receptor) 단백질 및 인산화된 에즈린 단백질의 발현수준과 상기 약물을 처리하지 않은 대조군의 VDR(Vitamin D Receptor) 단백질 및 인산화된 에즈린 단백질의 발현수준을 추가로 비교하여, 상기 약물 처리군에서 VDR(Vitamin D Receptor) 단백질 및 인산화된 에즈린 단백질의 발현이 증가하면, 상기 약물을 치료제로 선택하는 것인, 위축성 질염 치료제의 스크리닝 방법.
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