KR102095014B1 - 에프린 a1을 포함하는 산유량 증가용 조성물, 및 유방염 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents
에프린 a1을 포함하는 산유량 증가용 조성물, 및 유방염 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 에프린 A1을 포함하는 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 에프린 A1을 유효성분으로 포함하는 산유량 증가용 조성물, 사료 첨가제 조성물, 에프린 A1을 유효성분으로 포함하는 유방염 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 에프린 A1을 유효성분으로 포함하는 조성물은 체내 합성 단백질을 원료로 하는바 화학적 합성물에 비해 체내 독성 내지 부작용을 최소화할 수 있으며, PI3K/AKT 및 MAPK 신호전달경로 내 단백질의 발현 활성화를 통해 유방상피세포의 증식을 향상시키고, 소포체 스트레스 유도 단백질의 발현을 감소시키며, 염증 반응을 완화시키는 효과가 있는바, 산유량 증가용 조성물, 사료 첨가제 조성물, 유방염을 예방 및 치료할 수 있는 의약품 및 기능성 식품과 관련된 분야에서 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 에프린 A1을 유효성분으로 포함하는 조성물은 체내 합성 단백질을 원료로 하는바 화학적 합성물에 비해 체내 독성 내지 부작용을 최소화할 수 있으며, PI3K/AKT 및 MAPK 신호전달경로 내 단백질의 발현 활성화를 통해 유방상피세포의 증식을 향상시키고, 소포체 스트레스 유도 단백질의 발현을 감소시키며, 염증 반응을 완화시키는 효과가 있는바, 산유량 증가용 조성물, 사료 첨가제 조성물, 유방염을 예방 및 치료할 수 있는 의약품 및 기능성 식품과 관련된 분야에서 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 에프린 A1을 포함하는 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 에프린 A1을 유효성분으로 포함하는 산유량 증가용 조성물, 사료 첨가제 조성물, 에프린 A1을 유효성분으로 포함하는 유방염 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 식품 조성물에 관한 것이다.
정상적인 우유 생산은 소의 자손 번식 및 성장 뿐 아니라 사람의 건강과도 직결되는 문제이다(Nissen A et al., Jopurnal of Dairy Science, 2013). 또한, 유방상피세포는 유선을 이루는 기능적 단위로서 우유 생산에 관여하는 가장 중요한 세포이다(Arendt LM and Kuperwasser C, Mammary Gland Biology and Neoplasia, 2015). 따라서, 유방상피세포 증식력 유지는 산유량 향상을 위해 필수적이며, 유방상피세포의 증식에는 다양한 성장인자, 사이토카인, 케모카인 등이 이에 관여하는 것으로 알려져 있다(Inman JL et al., Development, 2015).
한편, 소의 유선에 염증반응이 지속적으로 일어나 유방염이 발생하게 되면 생성되는 우유 내의 카세인 및 칼슘의 감소가 나타나 우유 품질을 떨어뜨리는 요인이 된다. 관련하여 에프린 B2와 그의 표적 수용체는 유선 상피세포에서 발현하며 유선 내 세포의 악성화를 유도하는 것으로 보고된바 있다(Vaught D et al., Molecular Biology of the Cell, 2009).
그러나 현재까지 유방상피세포의 증식 또는 염증 반응과 관련하여 에프린 A1의 기능에 대해서는 알려진 바가 없다.
전술한 기술적 배경하에서, 본 발명자들은 유방상피세포의 증식력을 향상시켜 산유량을 증가시키고, 염증 반응을 완화시켜 유방염을 치료할 수 있는 물질을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 에프린 A1이 PI3K/AKT와 MAPK 신호전달 경로를 활성화시켜 유방상피세포의 증식을 향상시키고, 소포체 스트레스 유도 단백질의 발현 감소 및 염증 반응을 완화시키는 효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 에프린 A1을 유효성분으로 포함하는 산유량 증가용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한, 에프린 A1을 유효성분으로 포함하는 사료 첨가제 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한, 에프린 A1을 유효성분으로 포함하는 유방염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한, 에프린 A1을 유효성분으로 포함하는 유방염 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한, 에프린 A1을 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용하여 유방상피세포의 증식 능력을 향상시키는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 에프린 A1을 유효성분으로 포함하는 산유량 증가용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 에프린 A1을 유효성분으로 포함하는 사료 첨가제 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 에프린 A1을 유효성분으로 포함하는 유방염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 에프린 A1을 유효성분으로 포함하는 유방염 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 에프린 A1을 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용하여 유방상피세포의 증식 능력을 향상시키는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 에프린 A1을 유효성분으로 포함하는 조성물은 체내 합성 단백질을 원료로 하는바 화학적 합성물에 비해 체내 독성 내지 부작용을 최소화할 수 있으며, PI3K/AKT 및 MAPK 신호전달경로 내 단백질의 발현 활성화를 통해 유방상피세포의 증식을 향상시키고, 소포체 스트레스 유도 단백질의 발현을 감소시키며, 염증 반응을 완화시키는 효과가 있는바, 산유량 증가용 조성물, 사료 첨가제 조성물, 유방염을 예방 및 치료할 수 있는 의약품 및 기능성 식품과 관련된 분야에서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 소의 유방상피세포 증식에 에프린 A1이 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 에프린 A1 처리에 따른 소의 유방상피세포 세포주기 변화 양상을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 에프린 A1 처리에 따른 소의 유방상피세포 내 PI3K/AKT 및 MAPK 신호전달기전 경로 변화 양상을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 AKT, ERK1/2, JNK의 표적 억제제와 에프린 A1의 혼합 조성물에 의한 신호전달 단백질의 인산화 양상 및 유방상피세포의 증식력 변화를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 소의 유방상피세포 내 에프린 A1 처리에 따른 소포체 스트레스에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 소의 유방상피세포 내 에프린 A1 처리에 따른 항염증 효과를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 소의 유방상피세포의 증식, 소포체 스트레스 완화 및 항염증 효과와 관련된 에프린 A1의 작용기전을 나타낸 것이다.
도 2는 에프린 A1 처리에 따른 소의 유방상피세포 세포주기 변화 양상을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 에프린 A1 처리에 따른 소의 유방상피세포 내 PI3K/AKT 및 MAPK 신호전달기전 경로 변화 양상을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 AKT, ERK1/2, JNK의 표적 억제제와 에프린 A1의 혼합 조성물에 의한 신호전달 단백질의 인산화 양상 및 유방상피세포의 증식력 변화를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 소의 유방상피세포 내 에프린 A1 처리에 따른 소포체 스트레스에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 소의 유방상피세포 내 에프린 A1 처리에 따른 항염증 효과를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 소의 유방상피세포의 증식, 소포체 스트레스 완화 및 항염증 효과와 관련된 에프린 A1의 작용기전을 나타낸 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 유방상피세포의 증식, 소포체 스트레스 완화 및 항염증 효과와 관련된 에프린 A1의 작용 기전을 밝혔다(도 7).
본 발명은 에프린 A1을 유효성분으로 포함하는 산유량 증가용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 약학적 조성물, 식품 조성물, 사료 첨가제 조성물을 모두 포함한다.
본 발명에서 사용된 용어 "조성물"은 특정 성분을 포함하는 산물뿐만 아니라, 특정 성분의 배합에 의해 직접 또는 간접적으로 만들어지는 임의의 산물을 포함하는 것으로 간주된다.
본 발명에 있어서, 상기 유방상피세포는 포유동물 유래의 세포일 수 있으며, 상기 포유동물은 설치목(예를 들어, 생쥐, 쥐, 햄스터, 게르빌루스 및 기니피그), 우제목(예를 들어, 소, 양, 돼지, 염소, 사슴, 기린 및 영양), 기제목(예를 들어, 말, 당나귀, 코뿔소 및 맥), 식육목(예를 들어, 개, 고양이, 호랑이, 늑대, 여우, 사자, 치타, 표범, 너구리, 오소리, 퓨마, 재규어 및 삵쾡이), 토끼목(토끼 및 우는 토끼), 식충목(예를 들어, 고슴도치, 두더지 및 솔레노돈) 및 영장목(예를 들어, 침팬지, 오랑우탄, 고릴라, 보노보노, 일본원숭이, 붉은털원숭이)일 수 있다.
발명에 있어서, 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 담체는 이온 교환 수지, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질, 완충 물질, 물, 염, 전해질, 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌 글리콜 및 양모지로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 약학적 조성물은 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 구강, 심장내, 골수내, 경막내, 경피, 장관, 피하, 설하 또는 국부 투여용으로 제형화하는 것을 특징으로 할 수 있고, 완충제, 항균성 보존제, 계면활성제, 산화방지제, 긴장성 조정제, 방부제, 증점제 및 점도 개질제로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 보조제를 추가로 함유하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 용액, 현탁액, 에멀젼, 겔 및 분말로 구성된 군에서 선택되는 제형을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 증상의 경중도, 환자의 체중, 연령, 성, 투여 방식 및 투여시간 등과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정할 수 있다.
본 발명에 있어서, 건강기능식품은 건강기능식품에 관한 법률 제6722호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 식품을 의미한다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 건강기능식품의 제형으로 제제화될 수 있고, 과립제, 정제, 환제, 현탁액, 에멀젼, 시럽제, 껌, 차, 젤리, 각종 음료수, 드링크제, 알코올 음료 등으로 제조될 수 있으며, 상기 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한이 없다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 인체를 비롯한 동물 신체에 투여하기 적합한 임의의 생약 형태, 더욱 구체적으로는 경구 투여에 통상적인 임의의 형태, 예를 들어 식품 또는 사료, 식품 또는 사료의 첨가제 및 보조제, 강화된 식품 또는 사료, 정제, 환제, 과립, 캡슐 및 발포 배합물 등과 같은 고체 형태 또는 용액, 현탁액, 유화액, 음료, 페이스트 등과 같은 액체형태 일 수 있고, 영양제, 비타민, 전해질, 감미제, 착색제, 유기산, 방부제 등을 함유할 수 있으며, 이러한 성분들을 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명에서 사료 첨가제 조성물은 가축용 사료 첨가제 조성물일 수 있으며, 상기 가축은 이에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 소, 말, 양, 돼지, 사슴, 닭, 오리, 거위, 칠면조, 메추리, 타조, 꿩, 그 밖에 농림축산식품부령으로 정하는 동물일 수 있으며, 바람직하게 반추동물일 수 있다. 상기 반추동물은 되새김동물이라고도 하며, 이에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 낙타과, 애기사슴과, 사슴과, 기린과, 소과의 동물을 말한다.
본 발명에서 상기 반추동물은 바람직하게 소과의 동물일 수 있으며, 더욱 바람직하게 젖소일 수 있고, 더더욱 바람직하게 전환기 젖소일 수 있다.
본 발명의 가축용 사료 첨가제 조성물을 가축에게 급여함으로써, 산유량, 유질을 개선시키고, 유선에서 발생하는 염증을 완화시키는 것을 특징으로 하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따르면, 상기 에프린 A1은 PI3K/AKT 및 MAPK 신호전달기전을 활성화시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 에프린 A1은 소포체 스트레스 유도 단백질의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
이때, 상기 소포체 스트레스 유도 단백질은 IRE1α, ATF6α, PERK, p-eIF2α, GRP78 및 GADD153로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
또한, 본 발명은 에프린 A1을 유효성분으로 포함하는 유방염 예방, 치료 또는 개선용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 약학적 조성물 또는 식품 조성물을 모두 포함한다.
상기 약학적 조성물 또는 식품 조성물은 상술한 에프린 A1을 유효성분으로 포함하는 약학적 제제 또는 식품 제제를 포함하기 때문에, 상술한 본 발명의 조성물과 중복된 내용은 중복된 내용의 기재에 의한 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명은 또한, 상기 에프린 A1을 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용하여 유방상피세포의 증식 능력을 향상시키는 방법을 제공한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
실시예
<실험 방법>
실험동물 및 세포배양
소 유방상피세포주(bovine mammary epithelial, MAC-T)를 건국대학교 이홍구 박사의 연구실 (Konkuk University, Republic of Korea)로부터 제공받았으며, 일차배양한 소 유선세포에 SV40 large T항체를 도입하여 불멸화시켰다. 소 유방상피세포의 단층배양을 위해서 DMEM 배지(Dulbecco’s Modified Eagle’s medium, HyClone, Logan, UT)에 10%의 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)를 혼합하여 사용하였다.
실험 재료
에프린 A1은 R&D Systems로부터 구매하여 사용하였으며, tunicamycin과 LPS는 sigma에서 구입하였다. ephrin A1에 의한 신호전달메커니즘을 확인하기 위하여 phospho-AKT, ERK1/2, JNK, P38, P70S6K, S6, eIF2α 단백질 및 total-AKT, ERK1/2, JNK, P38, P70S6K, S6, eIF2α, IRE1α 단백질에 대한 항체를 Cell Signaling Techonology사로부터 구매하였다. phospho-PERK, total-PERK, ATF6α, GRP78, GADD153 단백질에 대한 항체는 Santa Cruz Biotechnology사로부터 구매하였다. 또한 타겟 신호전달과정을 억제함에 따른 효과를 규명하기 위하여 PI3K/AKT 억제제인 wortmannin을 Cell Signaling Technology사로부터, ERK1/2 억제제인 U0126과 JNK 억제제인 SP600125를 Enzo Life Science사로부터 구매하여 사용하였다.
BrdU를
이용한 세포 증식 능력 분석
소 유방상피세포의 증식 능력에 에프린A1이 미치는 영향을 확인하기 위하여 5×103개의 세포와 배지 100 μl를 96 well에 분주하고 FBS 기아 조건으로 세포를 배양하였다. 그 다음 ephrin A1 및 LPS를 같이 처리하여 48시간 동안 배양하였다. 그 다음, BrdU 키트 (Cat No: 1167229001, Roche)를 사용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 실험을 수행하였다. 48시간 인큐베이션 이후, 10 μM BrdU를 각 well에 추가적으로 넣어 37℃/5% CO2 인큐베이터 내에서 2시간 동안 배양하였다. 소 유방상피세포에 BrdU를 labeling 하고 세포를 고정하여 anti-BrdU-POD 용액을 상온에서 90분 인큐베이션 시킨 이후 3차례 씻어주었다. 마지막으로 100 μl의 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine substrate으로 세포를 반응시키고 ELISA 리더기를 사용하여 370 nm, 492 nm 내 흡광도를 측정하여 세포 증식 능력을 분석하였다.
세포 주기 분석
에프린 A1에 의한 소 유방상피세포의 세포주기 변화 양상을 확인하기 위하여 5×105 세포를 6 well에 배양하고 70 ~ 80% 배양 접시에 세포가 찼을 때 24시간 FBS 기아상태로 추가 배양하였다. 이후, ephrin A1을 용량의존적(0, 1, 5, 10, 20 ng/mL)으로 처리하여 48시간 동안 37℃/5% CO2 인큐베이터 내에서 배양하였다. 이후, 트립신을 사용하여 세포를 배양 접시에서 떼어 0.1% BSA/PBS로 워싱을 진행하고 70% Ethanol에서 16시간 동안 세포를 고정시켰다. 이후, 0.1% BSA/PBS로 워싱하고 RNase A (Sigma) 처리 하에서 PI 염색을 수행하였다. FACS 튜브에 염색된 용액을 옮겨 유세포 분석기를 사용하여 형광 강도를 분석하여 세포 주기를 분석하였다.
면역형광법
3×104 개의 소 유방상피세포를 10% FBS가 포함된 DMEM 배지 300 μl와 함께 confocal dish (catalog number: 100350, SPL Life Science, Republic of Korea)에 분주하여 배양한 뒤, 24시간 FBS 기아상태로 추가로 배양하여 에프린A1 (20 ng/mL)를 24시간 동안 처리한 뒤 메탄올로 10분간 세포를 고정하고, 1:100으로 희석된 PCNA, cyclin D1 항체를 처리하였으며 대조군에는 mouse IgG 또는 rabbit IgG를 처리하여 4℃에서 16시간 인큐베이션 하였다. 이후, 0.1% BSA (bovine serum albumin)이 포함된 PBS로 2번의 워싱과정을 거쳐 2차 항체로는 goat anti-mouse IgG Alexa 488 (catalog number: A11017, Invitrogen, Carlsbad, CA) 또는 goat anti-rabbit IgG Alexa 488 (catalog number: A-11008, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 antibody dilution buffer에 1:200으로 희석하여 상온에서 1시간 동안 배양하였다. MAC-T 세포를 0.1% BSA-PBS로 워싱한 다음 DAPI 염색을 추가적으로 시행하여 MAC-T 세포 내 타겟 단백질뿐만 아니라 핵을 동시에 관찰할 수 있도록 하였다. 실험 종료 후 LSM710 (Carl Zeiss, Thornwood, NY, USA) 공초점 현미경을 이용하여 세포를 관찰 및 촬영하였다.
단백질 발현 분석 (
웨스턴블롯
)
소 유방상피세포에 에프린 A1 또는 세포 신호전달 억제제와의 혼합물을 처리한 다음 MAC-T 세포로부터 전체 단백질을 추출하여 Bradford protein assay (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)로 단백질을 정량하였다. 이후, 추출한 단백질을 95℃에서 5분간 변성하였으며 10% SDS/PAGE 젤을 이용하여 전기영동 수행한 뒤, nitrocellulose membrane으로 옮겨주고, 1차 항체와 2차 항체를 차례로 인큐베이션 시킨 다음 chemiluminescence detection (SuperSignal West Pico, Pierce, Rockford, IL, USA) 시약을 사용하여 ChemiDoc EQ system과 Quantity One software (Bio-Rad) 기기를 사용하여 타겟 단백질의 발현을 분석하였다.
mRNA
발현 분석 (
qPCR
)
소 유방상피세포에 에프린 A1 및 LPS를 처리한 다음 Trizol reagent (Invitrogen)을 이용하여 전체 RNA를 추출하였다. 이후, 1 μg의 RNA를 AccuPower RT PreMix (Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 유전자 발현은 SYBR Green (Sigma)과 StepOnePlus Real-Time PCR system (Applied Biosystems, Foster City, CA)를 이용하여 측정하였다. PCR 조건은 95℃에서 3분동안 인큐베이션 후 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 3분 조건을 40회 증폭하였으며 GAPDH 발현량에 기반하여 정규화하였다.
통계분석
본 실험결과는 SAS (statistical analysis system) 통계프로그램을 이용하여 평균과 표준오차를 계산하였고, 일원배치분산분석 (one-way ANOVA)을 실시하였다. P < 0.05 수준에서 유의성 검정을 실시하였다.
<결과 및 고찰>
에프린
A1이 소의
유방상피세포
증식력에 미치는 영향
에프린 A1이 소의 유방상피세포의 증식력에 영향을 미치는지 확인하였다. 측정 결과, 체외배양한 소의 유방상피세포의 증식력은 20 ng/ml 에프린 A1 처리시 대조군에 비해 40% 이상 증가함을 확인하였다. 또한, 면역형광염색 기법을 통해 소의 유방상피세포 핵 내에 발현하며 세포 증식에 필수 단백질인 PCNA를 염색할 경우 에프린 A1 처리 시 대조군에 비해 상대적인 염색 강도가 약 2.2배 가량 증가함을 확인하였다(도 1).
에프린
A1에 의한 소의
유방상피세포의
세포주기 변화 분석
소의 유방상피세포 내에 propidium iodide (PI) 염색 후 유세포 분석을 통해 에프린 A1이 세포주기를 조절할 수 있는지 확인하였다. 그 결과, 에프린 A1 처리는 소의 유방상피세포 세포 주기 비율을 용량 의존적으로 변화시켰다. 대조군에 비하여 1-20 ng/mL의 에프린 A1을 처리하였을 때 처리 용량이 증가할수록 G0/G1기에 해당하는 소의 유방상피세포의 비율이 줄어들었으며 반대로 G2/M기에 해당하는 세포의 비율은 증가함을 확인하였다. 뿐만 아니라, 면역형광염색 기법을 통해 G1/S기 transition을 담당하는 단백질인 Cyclin D1의 발현을 분석한 결과, 소의 유방상피세포 핵 내의 Cyclin D1의 발현이 에프린 A1을 처리하였을 때 확연히 증가함을 확인하였다. 염색 신호 강도를 정량화한 결과 에프린 A1의 처리는 대조군에 비해 약 5.9배의 증가율을 보임을 확인하였다(도 2).
에프린
A1의 투여에 따른 소의
유방상피세포
내 신호전달기전 변화 분석
에프린 A1이 소의 유방상피세포의 증식력과 세포 주기 진행을 조절한다는 결과에 기반하여 에프린 A1이 세포 증식에 관여하는 신호전달 기전을 조절할 것임을 추측할 수 있었다. 이에 소의 유방상피세포 내 에프린 A1에 의해 유도되는 신호전달 단백질의 발현을 웨스턴 블롯을 통해 분석한 결과 PI3K와 MAPK 신호전달 단백질 발현이 0-20 ng/mL의 에프린 A1 처리 시 용량 의존적으로 증가함을 확인하였다. 인산화된 인산화된 AKT (p-AKT) 단백질은 다양한 농도(1, 5, 10, 20 ng/mL)의 에프린 A1 처리에 따라 발현이 모두 유의적으로 증가하였다. 또한 에프린 A1은 P70S6K, S6, ERK1/2, JNK, P38 단백질의 인산화 형태의 발현을 증가시켰다. 특히 20 ng/mL의 에프린 A1 처리 시 AKT, P70S6K, S6, ERK1/2, JNK, P38의 인산화 형태 발현은 각각 5.3, 2.4, 3.4, 2.5, 1.3, 7.8배 가량 증가하였다 (도 3).
뿐만 아니라, 에프린 A1이 유도하는 소의 유방상피세포 내 신호전달 경로와 그들의 상호작용을 분석하기 위해 세포는 PI3K 신호전달경로 억제제(wormannin, 1 μM), ERK1/2 억제제(U0126, 20 μM), JNK 억제제(SP600125, 20 μM)를 에프린 A1 20 ng/mL과 함께 병용처리하였다 (도 4). 앞서 기술한 바와 같이 에프린 A1은 p-AKT, p-P70S6K, p-S6, p-ERK1/2, p-JNK의 발현을 증가시켰으며 이들의 발현은 PI3K, ERK1/2, 또는 JNK 경로의 억제에 의해 영향을 받았다. 에프린 A1에 의해 증가한 AKT 인산화는 PI3K와 JNK 억제제에 의해 감소하였으며 ERK1/2 억제제에 의하여는 인산화가 유지되었다. 에프린 A1에 의해 유도된 p-P70S6K와 S6는 PI3K, ERK1/2, 또는 JNK 경로의 억제에 의해 유의적으로 감소하였으며, 이는 P70S6K와 S6가 에프린 A1에 의해 유도되는 신호전달 경로의 하위 표적 단백질임을 암시한다. 에프린 A1에 의해 증가한 ERK1/2 활성화는 PI3K 또는 JNK 억제에 의해서는 영향을 받지 않았다. 비슷하게, JNK의 활성화는 PI3K 또는 ERK1/2 억제에 의해서 영향을 받지 않았다. 다음으로, 에프린 A1에 의한 소의 유방상피세포 증식력 증가가 PI3K아 MAPK 신호전달경로의 활성화를 통해 일어남을 확인하기 위해 에프린 A1 20 ng/mL과 wortmanin (1 μM), U0126 (20 μM), SP600125 (20 μM)을 병용처리 하였다. 에프린 A1에 의해 증가한 소의 유방상피세포 증식력은 PI3K, ERK1/2 또는 JNK 억제에 의해 유의적으로 감소하였다. 이를 통해, 에프린 A1에 의해 증가한 소의 유방상피세포 증식력은 PI3K와 MAPK를 매개함을 확인하였다.
소의
유방상피세포
내
에프린
A1 처리에 따른 소포체 스트레스 완화 효과
에프린 A1이 소포체 스트레스 매개 세포사멸에 미치는 영향을 분석하기 위해 소의 유방상피세포에 에프린 A1 (20 ng/mL)과 tunicamycin (0.25 μg/mL)의 병용처리 후 소포체 스트레스 조절 단백질의 발현과 세포 증식력 변화를 확인하였다 (도 5). 소포체 스트레스 유도제인 tunicamycin은 소의 유방상피세포 증식력을 유의적으로 감소시켰으며 에프린 A1과의 병용처리에 의해 다시 회복됨을 확인하였다. 또한 tunicamycin에 의해 증가한 소의 유방상피세포 내 소포체 스트레스 조절 단백질 중 IRE1α, p-PERK, GADD153의 발현은 에프린 A1과의 병용 처리에 의해 감소함을 확인하였다.
소의
유방상피세포
내
에프린
A1 처리에 따른 항염증 효과
소의 유방상피세포 내 염증 반응에 미치는 에프린 A1의 역할을 분석하기 위해 lipopolysaccharide (LPS)와 에프린 A1을 병용처리 하였다 (도 6). 소의 유방상피세포 증식력은 LPS에 의해 용량 의존적으로 (0, 0.5, 1, 5, 10, 20 μg/mL) 감소하였으며 에프린 A1은 LPS에 의한 세포 증식력 감소를 완화하였다. 뿐만 아니라, 유방상피세포 내 염증 반응과 관련된 염증성 사이토카인인 IL-6, IL-8, TNF-α의 발현은 LPS 처리에 따라 증가하였지만 이는 에프린 A1 처리에 따라 다시 감소함을 확인하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (8)
- 에프린 A1을 유효성분으로 포함하는 산유량 증가용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 에프린 A1은 PI3K/AKT 및 MAPK 신호전달기전을 활성화시키는 것을 특징으로 하는 산유량 증가용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 에프린 A1은 소포체 스트레스 유도 단백질의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 산유량 증가용 조성물. - 제3항에 있어서,
상기 소포체 스트레스 유도 단백질은 IRE1α, ATF6α, PERK, p-eIF2α, GRP78 및 GADD153로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 산유량 증가용 조성물. - 에프린 A1을 유효성분으로 포함하는 산유량 증가용 사료 첨가제 조성물.
- 에프린 A1을 유효성분으로 포함하는 유방염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 에프린 A1을 유효성분으로 포함하는 유방염 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 에프린 A1을 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용하여 인간을 제외한 포유동물 유래 유방상피세포의 증식 능력을 향상시키는 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020180088445A KR102095014B1 (ko) | 2018-07-30 | 2018-07-30 | 에프린 a1을 포함하는 산유량 증가용 조성물, 및 유방염 예방 또는 치료용 약학적 조성물 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| KR1020180088445A KR102095014B1 (ko) | 2018-07-30 | 2018-07-30 | 에프린 a1을 포함하는 산유량 증가용 조성물, 및 유방염 예방 또는 치료용 약학적 조성물 |
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008518022A (ja) | 2004-10-27 | 2008-05-29 | メディミューン，インコーポレーテッド | 線維症関連疾患を治療するためのＥｐｈＡ２およびエフリンＡ１モジュレーター |
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2018
- 2018-07-30 KR KR1020180088445A patent/KR102095014B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (1)
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| JP2008518022A (ja) | 2004-10-27 | 2008-05-29 | メディミューン，インコーポレーテッド | 線維症関連疾患を治療するためのＥｐｈＡ２およびエフリンＡ１モジュレーター |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Stephanie Erzinger, "Investigating the Effects of Silencing EphA2 in Metastatic Breast Cancer Cells", (2011). UT GSBS Dissertations and Theses (Open Access). 116. |
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| KR20200013351A (ko) | 2020-02-07 |
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| KR102498800B1 (ko) | 크리소파놀을 포함하는 난소암 또는 유방암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 | |
| KR102154235B1 (ko) | Ccl2를 유효성분으로 포함하는 산유량 증가용 조성물, 및 유방염 예방 또는 치료용 약학적 조성물 | |
| Wang et al. | Lithium‐induced overexpression of β‐catenin delays murine palatal shelf elevation by Cdc‐42 mediated F‐actin remodeling in mesenchymal cells | |
| Suryawan et al. | Preterm birth alters the feeding-induced activation of Akt signaling in the muscle of neonatal piglets | |
| KR102141451B1 (ko) | 4-mbc, 아보벤존 또는 이들의 혼합물을 포함하는 임신성 영양막 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 | |
| KR20200069643A (ko) | 아디포넥틴을 유효성분으로 포함하는 유선상피세포 증식 촉진용 조성물 | |
| Petkova et al. | Iodine supplementation activates folliculogenesis in rabbit ovary | |
| KR20200069642A (ko) | Fgf2를 유효성분으로 포함하는 유선상피세포 증식 촉진용 조성물 | |
| KR102201231B1 (ko) | 부틸파라벤을 포함하는 임신성 영양막 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 | |
| Tian et al. | Lactogenic hormones regulate mammary protein synthesis in bovine mammary epithelial cells via the mTOR and JAK–STAT signal pathways |
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