KR101661507B1 - Nucleic Acid Aptamer for inhibiting Acetohydroxyacid Synthase of Mycobacterium tuberculosis - Google Patents

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Abstract

본 발명은 결핵 원인균인 미코박테리움 튜버쿨로시스의 AHAS(Acetohydroxyacid Synthase) 단백질에 결합하여 활성을 저해하는 핵산 앱타머 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물을 사용함으로써 부작용 없이 미코박테리움 튜버쿨로시스를 억제할 수 있다. The present invention relates to a nucleic acid aptamer composition which binds to an AHAS (Acetohydroxyacid Synthase) protein of Mycobacterium tuberculosis, which is a causative agent of tuberculosis, and inhibits its activity. By using the composition of the present invention, Mycobacterium tuberculosis can be inhibited without side effects.

Description

미코박테리움 튜버쿨로시스 억제용 단일가닥 핵산 앱타머{Nucleic Acid Aptamer for inhibiting Acetohydroxyacid Synthase of Mycobacterium tuberculosis}Nucleic Acid Aptamer for inhibiting Acetohydroxyacid Synthase of Mycobacterium tuberculosis < RTI ID = 0.0 >

본 발명은 결핵 원인균인 미코박테리움 튜버쿨로시스의 AHAS(Acetohydroxyacid Synthase)에 결합하여 활성을 저해하는 핵산 앱타머 조성물에 관한 것이다.
The present invention relates to a nucleic acid aptamer composition which inhibits activity by binding to AHAS (Acetohydroxyacid Synthase) of Mycobacterium tuberculosis .

결핵은 결핵 병원체인 미코박테리움 튜버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)에 의해 발병되는 병으로서 그 흔적이 발견된 이래 인류역사상 가장 많은 생명을 앗아간 감염질환으로 알려져 있으며 현재도 매년 세계 여러 지역에 대략 2백만명 정도의 사상자를 발생 시키는 심각한 질병이다.Tuberculosis is a disease caused by Mycobacterium tuberculosis , a tuberculosis pathogen. Since its discovery, it has been known as the most life-threatening infectious disease in human history. Today, approximately 2 million people It is a serious disease that causes casualties.

항결핵제 개발은 1940년대 스트렙토마이신을 시작으로 아이나(아이소니아지드), 리팜피신, 에탐부톨 등 스트렙토마이신보다 더 강력한 결핵약이 속속 등장하면서 인류 최대의 질병 결핵을 퇴치하는 듯하였다. 그러나 1980년대 '다제내성결핵'(MDR: Multi drug resistance-TB)의 발생과 함께 많은 수의 감염성 질환은 기존의 항생제로 통제할 수 없는 내성균주의 등장으로 인하여 새로운 항생제의 개발을 요구하고 있다. The development of anti-tuberculosis drugs seemed to eliminate the biggest disease tuberculosis of humanity after the introduction of streptomycin in the 1940s, followed by stronger tuberculosis drugs than those of streptomycins such as ANA (isoniazid), rifampicin and ethambutol. However, with the development of MDR (Multi Drug Resistance-TB) in the 1980s, many infectious diseases require the development of new antibiotics due to the emergence of resistant bacteria that can not be controlled by conventional antibiotics.

현재 내성 결핵균에 대한 대처는 기존 치료제의 복합적인 사용을 통해 임상 치료효과를 증진시키는 방향으로 집중되어졌을 뿐 새로운 치료제 개발은 미미하며 따라서 새로운 항생제의 개발은 현재 의약시장의 가장 큰 부분을 차지하고 있다.
Currently, treatment for resistant Mycobacterium tuberculosis has been focused on enhancing the effectiveness of clinical treatment through the combined use of existing therapies. However, the development of new therapeutic agents is minimal and the development of new antibiotics is the largest part of the current pharmaceutical market.

측쇄 사슬 필수 아미노산(branched-chain amino acids, BCAA)은 동물에 의해서 합성되지 않으며 다만 식물과 미생물에 의해 합성이 된다. 박테리아의 필수 아미노산 생합성 과정의 첫 단계를 담당하는 AHAS는 균의 생장을 위하여 필수적이다. AHAS(acetohydroxyacid synthase)는 측쇄 사슬 필수 아미노산인 발린, 류신, 이소류신의 생합성에 공통적으로 관여하는 효소이며, 이들 아미노산의 생합성을 조절하는 중요한 단계에 관여하는 효소이다. AHAS는 두 분자의 피루베이트로부터 발린과 류신의 생합성의 중간체 2-아세토락테이트를 생성하며, 한 분자의 피루베이트와 2-케토부티레이트로부터 이소류신 생합성 중간체 2-아세토-2-히드록시부티레이트를 생성하는 두 가지 축합반응에 촉매 역할을 한다. 이런 특징은 AHAS가 항결핵제 개발의 표적효소로써 다른 효소와 구별이 되는 중요한 역할을 한다. 이 효소의 활성을 저해함으로써 균의 생장을 저해할 수 있다. 또한, 식물, 미생물 등은 AHAS를 가지고 있는 반면 동물 내에서는 AHAS가 존재 하지 않으므로 이 효소를 저해하는 결핵 치료제는 동물 내에서 적은 부작용을 가질 것으로 사료되고 있다.
The branched-chain amino acids (BCAA) are not synthesized by animals but synthesized by plants and microorganisms. AHAS, which is responsible for the first step in the bacterial essential amino acid biosynthetic process, is essential for the growth of bacteria. AHAS (acetohydroxyacid synthase) is an enzyme commonly involved in the biosynthesis of valine, leucine and isoleucine, which are side chain chain essential amino acids, and is involved in an important step to control the biosynthesis of these amino acids. AHAS produces the intermediate 2-acetolactate from valine to leucine biosynthesis from two molecules of pyruvate and produces the isoleucine biosynthesis intermediate 2-aceto-2-hydroxybutyrate from one molecule of pyruvate and 2-ketobutyrate It serves as a catalyst for two condensation reactions. This feature plays an important role in distinguishing AHAS from other enzymes as a target enzyme for the development of anti-tuberculosis drugs. By inhibiting the activity of the enzyme, the growth of the microorganism can be inhibited. In addition, plants and microorganisms have AHAS, whereas AHAS is not present in animals. Therefore, TB drugs that inhibit these enzymes are thought to have fewer side effects in animals.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
Numerous papers and patent documents are referenced and cited throughout this specification. The disclosures of the cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety to better understand the state of the art to which the present invention pertains and the content of the present invention.

본 발명자들은 결핵 원인균인 미코박테리움 튜버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)에 대한 효과적이고 부작용이 적은 새로운 억제제를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 특정의 핵산 서열을 갖는 핵산 앱타머를 이용하는 경우, 결핵 원인균인 미코박테리움 튜버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)의 AHAS(Acetohydroxyacid Synthase)에 특이적으로 결합하여 그 활성을 억제함을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다. The present inventors have made extensive efforts to develop a novel inhibitor effective against Mycobacterium tuberculosis , a tuberculosis causative organism, Mycobacterium tuberculosis . As a result, it has been found that when a nucleic acid aptamer having a specific nucleic acid sequence is used, it specifically binds to AHAS (Acetohydroxyacid Synthase) of Mycobacterium tuberculosis, which is a causative organism of tuberculosis , Thereby completing the invention.

따라서, 본 발명의 목적은 결핵 원인균인 미코박테리움 튜버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)의 AHAS(acetohydroxyacid synthase)에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머를 제공하는데 있다. Accordingly, it is an object of the present invention to provide a nucleic acid aptamer that specifically binds to AHAS (acetohydroxyacid synthase) of Mycobacterium tuberculosis, a tuberculosis causative organism.

본 발명의 다른 목적은 상기 핵산 앱타머를 포함하는 미코박테리움 튜버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 억제용 조성물을 제공하는데 있다.Another object of the present invention is to provide a composition for inhibiting Mycobacterium tuberculosis comprising the nucleic acid aptamer.

본 발명의 다른 목적은 상기 핵산 앱타머를 포함하는 결핵 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는데 있다.Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating tuberculosis comprising the nucleic acid aptamer.

본 발명의 다른 목적은 상기 핵산 앱타머를 포함하는 미코박테리움 튜버쿨로시스 검출용 조성물을 제공하는데 있다. Another object of the present invention is to provide a composition for detecting Mycobacterium tuberculosis comprising the nucleic acid aptamer.

본 발명의 다른 목적은 미코박테리움 튜버쿨로시스 검출 방법을 제공하는데 있다.
It is another object of the present invention to provide a method for detecting Mycobacterium tuberculosis .

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 미코박테리움 튜버쿨로시스(M. tuberculosis) AHAS(Acetohydroxyacid Synthase)에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머로서, 상기 핵산 앱타머는 서열목록 제6서열 또는 제10서열의 염기서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 핵산 앱타머를 제공한다. According to one aspect of the present invention, the present invention provides a nucleic acid aptamer that specifically binds to M. tuberculosis AHAS (Acetohydroxyacid Synthase), wherein the nucleic acid aptamer is selected from the group consisting of SEQ ID No. 6 or 10 Wherein the nucleotide sequence is an oligonucleotide having a nucleotide sequence having 90% or more identity with the nucleotide sequence of the nucleotide sequence.

본 발명자들은 결핵 원인균인 미코박테리움 튜버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)에 대한 효과적이고 부작용이 적은 새로운 억제제를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 특정의 핵산 서열을 갖는 핵산 앱타머를 이용하는 경우, 결핵 원인균인 미코박테리움 튜버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)의 AHAS(Acetohydroxyacid Synthase)에 특이적으로 결합하며, 더 나아가 그 활성을 억제함을 규명하였다. The present inventors have made extensive efforts to develop a novel inhibitor effective against Mycobacterium tuberculosis , a tuberculosis causative organism, Mycobacterium tuberculosis . As a result, when a nucleic acid aptamer having a specific nucleic acid sequence was used, it was found that it specifically binds to AHAS (Acetohydroxyacid Synthase) of Mycobacterium tuberculosis, which is a causative organism of tuberculosis , and further inhibits its activity Respectively.

본 발명은 결핵 원인균인 미코박테리움 튜버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)에 대한 특정 서열의 핵산 앱타머의 결합력 및 활성 저해 효과를 이용한 발명이다. 본 발명의 미코박테리움 튜버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)는 결핵을 일으키는 주 원인이 되는 그람음성 세균이다. 본 발명의 AHAS(Acetohydroxyacid Synthase)는 박테리아의 필수 아미노산인 발린, 류신, 그리고 이소류신의 합성과정의 처음 과정을 촉매하는 효소로써 항생제의 타겟으로써 주목받고 있으며 기존 항생제의 내성문제와 부작용 문제를 우회할 수 있는 물질로써 각광을 받고 있고, 미코박테리움 튜버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)의 AHAS 단백질 및 다른 박테리아 종의 AHAS일지라도 미코박테리움 튜버쿨로시스의 AHAS와 90% 이상의 서열 상동성, 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 98% 이상의 서열 상동성을 갖는 AHAS를 포함한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10(1990))은 NCBI (National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 /에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 에서 확인할 수 있다.The present invention is an invention using the binding force and the inhibitory effect of a nucleic acid aptamer of a specific sequence against Mycobacterium tuberculosis which is a tuberculosis causative organism. Mycobacterium tuberculosis of the present invention is a gram-negative bacterium that is the main cause of tuberculosis. AHAS (Acetohydroxyacid Synthase) of the present invention is an enzyme that catalyzes the initial process of the synthesis of valine, leucine and isoleucine, which are essential amino acids of bacteria, and is attracting attention as a target of antibiotics. It can bypass the problems of antibiotics resistance and side effects has been highlighted as a material which, Mycobacterium M. tuberculosis (Mycobacterium tuberculosis) in the AHAS protein, and even AHAS of other bacterial species Mycobacterium M. tuberculosis AHAS and at least 90% sequence homology, preferably at least 95% Sequence homology, more preferably at least 98% sequence homology. Alignment methods for sequence comparison are well known in the art. Various methods and algorithms for alignment are described by Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981) ; Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48: 443 (1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31 (1988); Higgins and Sharp, Gene 73: 237-44 (1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5: 151-3 (1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16: 10881-90 (1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8: 155-65 (1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24: 307-31 (1994). The NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-10 (1990)) is accessible from NCBI (National Center for Biological Information) It can be used in conjunction with sequence analysis programs such as blastx, tblastn and tblastx. BLSAT is accessible from /. The sequence homology comparison method using this program can be found in.

AHAS는 상술한 바와 같이 동물에 의해서 합성되지 않으며 다만 식물과 미생물에 의해 합성이 되는 측쇄 사슬 필수 아미노산인 발린, 류신, 이소류신의 생합성에 공통적으로 관여하는 효소로서, 항생제의 타겟으로써 주목받고 있으며 기존 항생제의 내성문제와 부작용 문제를 우회할 수 있는 물질로써 각광을 받고 있다. As described above, AHAS is an enzyme that is not synthesized by animals but is involved in the biosynthesis of valine, leucine, and isoleucine, which are side chain chain essential amino acids synthesized by plants and microorganisms, and is attracting attention as an antibiotic target. As a substance that can bypass the problems of immunity and side effects.

본 발명의 앱타머(Aptamer)는 저분자 탐침으로써 특정 화합물부터 단백질까지 다양한 종류의 표적 리간드에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특성을 가지는 짧은 길이(20~60 뉴클레오티드)의 단일가닥 핵산 조각을 뜻한다. 본 명세서에서 "앱타머"는 "핵산 앱타머" 또는 "올리고뉴클레오타이드"와 혼용하여 사용한다. 본 명세서의 용어 "핵산 앱타머"는 DNA 앱타머 및 RNA 앱타머를 모두 포함하는 용어이다. 앱타머의 선별은 SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment)방법으로 공지된 생체내 또는 시험관내 선택 기술을 이용할 수 있다(Ellington et al., Nature 346, 818-22, 1990; 및 Tuerk et al., Science 249, 505-10, 1990). 앱타머의 선별 및 제조에 대한 구체적인 방법은 미국특허 5,582,981, WO 00/20040, 미국특허 5,270,163, Lorsch and Szostak, Biochemistry, 33:973 (1994), Mannironi et al.,Biochemistry 36:9726 (1997), Blind, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:3606-3610 (1999), Huizenga and Szostak, Biochemistry, 34:656-665 (1995), WO 99/54506, WO 99/27133, WO 97/42317 및 미국특허 5,756,291에 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로써 삽입된다. The Aptamer of the present invention is a low molecular probe, which means a single-stranded nucleic acid fragment of short length (20 to 60 nucleotides), which is capable of binding with high affinity and specificity to various kinds of target ligands from a specific compound to a protein do. In the present specification, "aptamer" is used in combination with "nucleic acid aptamer" or "oligonucleotide ". The term "nucleic acid aptamer" in the present specification is a term including both a DNA aptamer and an RNA aptamer. Selection of an aptamer can utilize in vivo or in vitro selection techniques known as SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) method (Ellington et al., Nature 346, 818-22, 1990; and Tuerk et al. , Science 249, 505-10, 1990). Specific methods for screening and manufacturing the aptamer are described in U.S. Patent 5,582,981, WO 00/20040, U.S. Patent 5,270,163, Lorsch and Szostak, Biochemistry, 33: 973 (1994), Mannironi et al., Biochemistry 36: 9726 Blind, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 3606-3610 (1999), Huizenga and Szostak, Biochemistry, 34: 656-665 (1995), WO 99/54506, WO 99/27133, WO 97/42317 and U.S. Patent 5,756,291, Are incorporated herein by reference.

앱타머는 표적 물질에 대해 나노 몰 내지 피코 몰 수준의 높은 결합력과 선택성을 지니고 있다는 점에서 항체와 유사한 특성을 가지는 핵산 분자로 여겨지고 있다. 한편 항체와 비교할 때 앱타머는 다음과 같은 여러 가지 장점을 가지고 있다: (1) 화학적 합성이 용이하며 또한 비교적 작고 단순한 분자이므로 여러 가지 필요한 변형이 가능하고, (2) SELEX 과정을 통해 선택성과 친화도를 극대화할 수 있으며, (3) 화학적 합성으로 만들어지므로 순도가 높고, (4) 동물에 주입하여 항체를 생성하기 어려운 독소 등에 대한 앱타머의 개발이 가능하며, (5) 열에 안정하여 실온에서 장기간 보존도 가능하고, (6) 생체 내 면역반응을 거의 일으키지 않는다. 앱타머 선별 과정에는 일반적으로 1014-1015 정도의 서로 다른 서열, 즉 다양성을 가지는 라이브러리로부터 단일 가닥 DNA 풀(pool)을 얻는 과정이 필요하다. 이를 위한 방법으로 비대칭 PCR을 사용하여 한쪽 가닥만을 증폭시키는 방법이 있고, 이중 가닥 DNA의 한 가닥 끝 부분에 비오틴(biotin)을 붙인 후 스트렙타비딘(streptavidin)으로 감싼 비드(bead)를 이용하여 한 가닥만을 선택적으로 분리하는 방법이 있다. 본 발명에서는 비대칭 PCR을 이용하였다.Aptamers are thought to be nucleic acid molecules with antibody-like properties in that they have high binding and selectivity for nanomolar to picomole levels for the target material. Compared to antibodies, aptamers have several advantages: (1) they are easy to chemically synthesize, and because they are relatively small and simple molecules, they can be modified in many ways, and (2) selectivity and affinity (3) high purity since it is made by chemical synthesis, (4) it is possible to develop an aptamer for toxins that are difficult to generate antibodies by injection into animals, and (5) (6) Almost no in vivo immune response occurs. The aptamer screening process typically involves obtaining a pool of single-stranded DNA from 10 14 -10 15 different sequences, ie, libraries with diversity. For this, there is a method of amplifying only one strand using asymmetric PCR. A biotin is attached to one strand of the strand DNA, and a bead wrapped with streptavidin is used There is a method of selectively separating only the strands. Asymmetric PCR was used in the present invention.

이렇게 만들어진 라이브러리를 표적 리간드에 결합시켜 결합력이 높은 앱타머를 골라내는 선택 과정을 진행하게 된다. 표적 물질이 저분자인 경우에는 보통 비드나 레진(resin)에 공유결합을 통해 고정화한 후 이들을 이용한 친화도 컬럼(affinity column)을 만들게 된다. 이 컬럼에 핵산 라이브러리를 흘려 결합을 유도한 후 버퍼로 씻어내려 리간드에 결합하지 않는 핵산들을 제거한다. 컬럼에 고정되어 있는 리간드에 결합한 앱타머들은 낮은 염도를 가지는 버퍼나 리간드가 포함된 용액으로 씻어내려 획득하게 된다. 표적 물질이 단백질인 경우에는 보통 니트로셀룰로오스 필터(nitrocellulose filter)를 이용하여 단백질에 결합한 앱타머를 분리한다. 이러한 방법들을 사용하여 리간드에 대해 친화도를 가지는 앱타머들을 얻을 수 있다. 보통 5-15 사이클(cycle)의 선별-증폭 과정을 반복하면 높은 친화도를 가지는 앱타머를 얻을 수 있다. 선별 과정이 종료되면 증폭한 DNA를 클로닝한 후 개개의 클론으로부터 서열 분석을 통해 그 서열을 확인하고, 앱타머를 합성하여 대상물질과의 친화도 및 결합력을 측정하게 된다.The resulting library is then coupled to the target ligand, and a selection process is performed to select a high affinity aptamer. When the target substance is a low-molecular substance, it usually bonds to beads or resins through covalent bonds and forms an affinity column using them. A nucleic acid library is flowed through the column to induce binding, followed by washing with buffer to remove nucleic acids that do not bind to the ligand. The aptamers bound to the ligand immobilized on the column are washed off with a solution containing a low-salt buffer or ligand. When the target substance is a protein, usually a nitrocellulose filter is used to separate the aptamer bound to the protein. These methods can be used to obtain aptamers having affinity for the ligand. Repeating the 5-15 cycle selection-amplification procedure usually yields an aptamer with high affinity. At the end of the screening process, the amplified DNA is cloned and sequenced from individual clones to identify the sequence, and the aptamer is synthesized to measure the affinity with the target substance and the binding force.

본 발명의 핵산 앱타머는 미코박테리움 튜버쿨로시스의 AHAS에 결합하는 특성을 유지하면서, 서열목록 제6서열 또는 제10서열에 개시된 염기서열 및 이와 실질적인 동일성을 나타내는 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은 상기한 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘(Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981) Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994))을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 90％의 동일성, 보다 바람직하게는 최소 95％의 동일성, 가장 바람직하게는 최소 98％의 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. The nucleic acid aptamer of the present invention also includes an oligonucleotide having a nucleotide sequence substantially identical to the nucleotide sequence disclosed in SEQ ID No. 6 or 10 and retaining the property of binding to AHAS of Mycobacterium tuberculosis . The above-mentioned substantial identity can be determined by aligning the nucleotide sequence of the present invention with any other sequence as much as possible and using an algorithm commonly used in the art (Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981) Hewgins and Sharp, Gene 73: 237-44 (1988); < RTI ID = 0.0 > Higgins and Sharp, CABIOS 5: 151-3 (1989); Corpet et al., Nuc Acids Res. 16: 10881-90 (1988); Huang et al., Comp. (At least 90% identity, more preferably at least 95% identity, more preferably at least 95% identity) to the amino acid sequence of SEQ ID NO: Identity, most preferably at least 98% identity to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.

본 발명의 일 구현예에 의하면, 본 발명의 핵산 앱타머는 서열목록 제6서열 또는 제10서열의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드이다. 본 명세서의 서열목록 제6서열의 핵산 앱타머는 DNA 앱타머이며, 서열목록 제10서열은 상술한 서열목록 제6서열의 DNA 앱타머와 같은 서열을 갖는 RNA 앱타머를 나타내고, 다만, RNA의 서열 특성에 따라 DNA 앱타머 서열의 티민(T)이 우라실(U)로 치환되어 있다. RNA에서 U는 DNA의 T와 유사하게 아데닌(A)과 2개의 수소결합을 통해 결합하며, DNA 앱타머의 핵산 서열 중 T를 U로 치환한 RNA 앱타머 서열도 대응되는 DNA 앱타머와 비슷한 구조를 형성하여 타겟 분자인 목표 단백질과 결합하여 단백질의 활성 저해까지도 일으킬 것으로 쉽게 예상할 수 있다.
According to one embodiment of the present invention, the nucleic acid aptamer of the present invention is an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 10. The nucleic acid aptamer of Sequence Listing 6 of the present specification is a DNA aptamer and the sequence of SEQ ID No. 10 represents an RNA aptamer having the same sequence as the DNA aptamer of Sequence Listing 6 described above, Depending on the nature, thymine (T) in the DNA aptamer sequence is replaced by uracil (U). In RNA, U is linked to adenine (A) through two hydrogen bonds, similar to DNA of T, and the RNA aptamer sequence in which the T of the nucleotide sequence of DNA aptamer is replaced by U also has a structure similar to the corresponding DNA aptamer And binds to a target protein, which is a target molecule, to cause the inhibition of protein activity.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 핵산 앱타머를 포함하는 미코박테리움 튜버쿨로시스 억제용 조성물을 제공한다. 본 발명의 핵산 앱타머는 결핵 원인균인 미코박테리움 튜버쿨로시스의 AHAS 단백질에 결합하는 능력 및 AHAS 단백질의 효소 활성을 저해하는 능력을 모두 가지므로 미코박테리움 튜버쿨로시스의 증식을 억제할 수 있다.
According to one aspect of the present invention, there is provided a composition for inhibiting Mycobacterium tuberculosis comprising the aforementioned nucleic acid aptamer. The nucleic acid aptamer of the present invention can suppress the proliferation of Mycobacterium tuberculosis because it has both the ability to bind to the AHAS protein of M. tuberculosis and the ability to inhibit the enzyme activity of the AHAS protein.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 핵산 앱타머를 포함하는 결핵 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 핵산 앱타머는 상술한 바와 같이 결핵 원인균인 미코박테리움 튜버쿨로시스의 AHAS 단백질에 결합하는 능력 및 AHAS 단백질의 효소 활성을 저해하는 능력을 모두 갖는다. 또한, 본 발명인 조성물의 타겟이 되는 AHAS는 식물, 미생물 등에서만 존재하고, 동물 내에서는 존재하지 않으므로 이 효소를 저해하는 결핵 치료제는 동물 내에서 적은 부작용을 가질 것으로 사료되고 있다.According to one aspect of the present invention, there is provided a pharmaceutical composition for preventing or treating tuberculosis comprising the nucleic acid aptamer described above. As described above, the nucleic acid aptamer of the present invention has both the ability to bind to the AHAS protein of M. tuberculosis and the ability to inhibit the enzyme activity of the AHAS protein. In addition, since AHAS, which is a target of the composition of the present invention, exists only in plants, microorganisms and the like, and does not exist in animals, it is considered that the therapeutic agent for tuberculosis inhibiting this enzyme has less side effects in animals.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.When the composition of the present invention is manufactured from a pharmaceutical composition, the pharmaceutical composition of the present invention includes a pharmaceutically acceptable carrier. The pharmaceutically acceptable carriers to be contained in the pharmaceutical composition of the present invention are those conventionally used in the present invention and include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, But are not limited to, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrups, methylcellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil. It is not. The pharmaceutical composition of the present invention may further contain a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, etc. in addition to the above components. Suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations are described in detail in Remington ' s Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여, 점막 투여 및 점안 투여 등으로 투여할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally. In the case of parenteral administration, the composition can be administered by intravenous infusion, subcutaneous injection, muscle injection, intraperitoneal injection, transdermal administration, mucosal administration, or topical administration.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 성인 기준으로 0.001-10000 ㎎/kg(체중)이다.The appropriate dosage of the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on factors such as the formulation method, administration method, age, body weight, sex, pathological condition, food, administration time, administration route, excretion rate, . Preferably, the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is 0.001-10000 mg / kg (body weight) on an adult basis.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
The pharmaceutical composition of the present invention may be formulated into a unit dose form by formulating it using a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to a method which can be easily carried out by a person having ordinary skill in the art to which the present invention belongs. Or by intrusion into a multi-dose container. The formulations may be in the form of solutions, suspensions, syrups or emulsions in oils or aqueous media, or in the form of excipients, powders, powders, granules, tablets or capsules, and may additionally contain dispersing or stabilizing agents.

본 발명의 일 양태에 따르면 본 발명은 상술한 핵산 앱타머를 포함하는 미코박테리움 튜버쿨로시스 검출용 조성물을 제공한다. 본 발명자들은 본 발명의 핵산 앱타머가 미코박테리움 튜버쿨로시스의 AHAS에 특이적으로 결합하는 것을 규명하였다. 따라서, 본 발명인 조성물을 이용하는 경우 효과적으로 미코박테리움 튜버쿨로시스를 검출할 수 있고, 객체(subject)의 체내에서의 검출에도 부작용 없이 효과적으로 이용할 수 있다. According to one aspect of the present invention, there is provided a composition for detecting Mycobacterium tuberculosis comprising the nucleic acid aptamer described above. The present inventors have found that the nucleic acid aptamer of the present invention specifically binds to AHAS of Mycobacterium tuberculosis . Therefore, when the composition of the present invention is used, it is possible to effectively detect Mycobacterium tuberculosis and effectively use it without any adverse effect on the detection of the subject in the body.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 핵산 앱타머는 검출가능한 표지가 부착되어 있는 것이다. 핵산 앱타머에 검출가능한 표지를 부착시킴으로 인하여, 타겟과 핵산 앱타머의 결합 여부 및 결합 정도를 손쉽게 관찰 및 측정하는 것이 가능하다. 상기 검출가능한 표지는 당업계에 알려진 검출 방법에 의하여 검출될 수 있는 모이어티일 수 있고, 특별히 한정되지 않는다. In one embodiment of the invention, the nucleic acid aptamer of the present invention is attached with a detectable label. By attaching the detectable label to the nucleic acid aptamer, it is possible to easily observe and measure the binding and the degree of binding between the target and the nucleic acid aptamer. The detectable label may be a moiety that can be detected by a detection method known in the art, and is not particularly limited.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 검출가능한 표지는 광학적 표지, 전기화학적 표지, 방사성 동위원소 또는 이들의 조합이다. 상기 표지는 앱타머의 특정 염기 또는 3' 말단 또는 5' 말단에 부착될 수 있다. 상기 광학적 표지는 예를 들면, 형광물질일 수 있다. 상기 형광물질은 플로레세인(fluorescein), 6-FAM, 로다민, 텍사스 레드(Texas Red), 테트라메틸로다민, 카르복시로다민, 카르복시로타민6G, 카르복시로돌, 카르복시로다민110, 캐스케이드 블루(Cascade Blue), 캐스케이트 옐로우(Cascade Yellow), 코마린, Cy2(cyanine 2), Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy-크롬, 피코에리트린, PerCP(페리디닌 클로로필-a 단백질), PerCP-Cy5.5, JOE(6-카르복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시플루오레신), NED, ROX(5-(및-6)-카르복시-X-로다민), HEX, 루시퍼 옐로우(Lucifer Yellow), 마리나 블루(Marina Blue), 오레곤 그린(Oregon Green) 488, 오레곤 그린 500, 오레곤 그린 514, 알렉사 플로어, 7-아미노-4-메틸코마린-3-아세트산, 보디피(BODIPY) FL, 보디피 FL-Br 2, 보디피 530/550, 이의 콘쥬게이트화물 및 이들의 배합물로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 예를 들면, 상기 형광물질은 플로레세인, Cy3 또는 Cy5일 수 있다. 또한, 상기 광학적 표지는, 적절한 거리에 의하여 이격되어 있는 형광 도너 발색소 및 형광 수용자 발색소를 포함하고 도너의 형광 발광이 수용자에 의하여 억제되어 있는 형광공명에너지전달 (fluorescence resonance energy transfer: FRET) 쌍일 수 있다. 도너 발색소는 FAM, TAMRA, VIC, JOE, Cy3, Cy5 및 Texas Red를 포함할 수 있다. 수용자 발색소는 그의 여기 스펙트럼이 도너의 발광 스펙트럼과 겹치도록 선택될 수 있다. 또한, 상기 수용자는 넓은 범위의 도너를 켄칭 (quenching)하는 비형광 수용자일 수 있다. 도너-수용자 FRET 쌍의 다른 예는 당업계에 알려져 있다. 상기 전기화학적 표지는 당업계에 알려진 전기화학적 표지를 포함한다. 예를 들면, 상기 전기화학적 표지는 메틸렌 블루일 수 있다.
In one embodiment of the invention, the detectable label of the present invention is an optical label, an electrochemical label, a radioactive isotope, or a combination thereof. The label may be attached to a specific base or 3 ' or 5 ' end of the aptamer. The optical label may be, for example, a fluorescent substance. The fluorescent material may be selected from the group consisting of fluorescein, 6-FAM, rhodamine, Texas red, tetramethylrhodamine, carboxydodamine, carboxyrotamine 6G, carboxyrodone, carboxydodamine 110, cascade blue Cascade Blue), Cascade Yellow, Comarine, Cy2 (cyanine 2), Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy-chrome, Picoeritrin, PerCP (Peridinin chlorophyll- , PerCP-Cy5.5, JOE (6-carboxy-4 ', 5'-dichloro-2', 7'-dimethoxyfluorescein), NED, ROX (5- Hex, Lucifer Yellow, Marina Blue, Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, Alexa Floor, 7-amino-4-methylcomarine- -Acetic acid, BODIPY FL, BODIPY FL-Br 2, BODIPY 530/550, conjugated cargoes thereof, and combinations thereof. For example, the fluorescent material may be fluorescein, Cy3 or Cy5. In addition, the optical label may include a fluorescent donor dye and a fluorescent acceptor dye separated by an appropriate distance, and the fluorescence emitted by the donor is fluorescence resonance energy transfer (FRET) pair . The donor pigments may include FAM, TAMRA, VIC, JOE, Cy3, Cy5 and Texas Red. The acceptor dye can be selected such that its excitation spectrum overlaps the donor emission spectrum. The receiver can also be a non-fluorescent receiver that quenches a wide range of donors. Other examples of donor-acceptor FRET pairs are known in the art. The electrochemical label includes an electrochemical label known in the art. For example, the electrochemical label may be methylene blue.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 미코박테리움 튜버쿨로시스 검출 방법을 제공한다:According to one aspect of the present invention, the present invention provides a method for detecting Mycobacterium tuberculosis comprising the following steps:

(a) 청구항 제 7 항의 조성물을 시료와 접촉시키는 단계; 및(a) contacting the composition of claim 7 with a sample; And

(b) 단계(a)를 거친 시료로부터 결합 신호를 측정하는 단계.(b) measuring the coupling signal from the sample after step (a).

본 발명의 시료는 미코박테리움 튜버쿨로시스의 감염 대상이 되는 객체(subject)로부터 분리한 시료이다. 본 발명인 미코박테리움 튜버쿨로시스 검출 방법에 있어서의 결합 신호 측정은 사용된 검출 신호의 특성에 따라 공지된 방법을 이용하여 측정할 수 있고, 대조군에 비하여 증가된 신호를 보이는지 여부를 판단하여 미코박테리움 튜버쿨로시스의 존재를 확인할 수 있다.
The sample of the present invention is a sample isolated from an object to be infected by Mycobacterium tuberculosis . The inventors Mycobacterium tube M. measuring combined signal in tuberculosis detection method can be measured using known methods, depending on the characteristics of the detected signals are used, M. determines whether it looks for the signal is increased compared with the control group tumefaciens The presence of lumen tuberculosis can be confirmed.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:The features and advantages of the present invention are summarized as follows:

(a) 본 발명은 결핵 원인균인 미코박테리움 튜버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)의 AHAS(acetohydroxyacid synthase)에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머를 제공한다. (a) The present invention provides a nucleic acid aptamer that specifically binds to AHAS (acetohydroxyacid synthase) of Mycobacterium tuberculosis, a tuberculosis causative organism.

(b) 본 발명은 상기 핵산 앱타머를 포함하는 미코박테리움 튜버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 억제용 조성물을 제공한다.(b) The present invention provides a composition for inhibiting Mycobacterium tuberculosis comprising the nucleic acid aptamer.

(c) 본 발명은 상기 핵산 앱타머를 포함하는 결핵 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.(c) The present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating tuberculosis comprising the nucleic acid aptamer.

(d) 본 발명은 상기 핵산 앱타머를 포함하는 미코박테리움 튜버쿨로시스 검출용 조성물 및 이를 이용한 검출 방법을 제공한다. (d) The present invention provides a composition for detecting Mycobacterium tuberculosis containing the nucleic acid aptamer and a detection method using the same.

(e) 본 발명을 이용하면, 동물에 대한 부작용 없이 미코박테리움 튜버쿨로시스의 생장을 억제할 수 있고, 이에 의한 결핵에 대한 예방 또는 치료가 가능하다. (e) Using the present invention, it is possible to inhibit the growth of Mycobacterium tuberculosis without adverse effect on an animal, thereby preventing or treating tuberculosis.

(f) 본 발명을 이용하면, 미코박테리움 튜버쿨로시스를 높은 정확성으로 특이적으로 검출이 가능하다.
(f) Using the present invention, it is possible to specifically detect Mycobacterium tuberculosis with high accuracy.

도 1은 결핵균 AHAS에 결합하는 압타머의 결합력(Kd) 분석을 나타낸다. 선별한 9종의 압타머의 5'지역에 비오틴 물질을 라벨링하여 결합력을 분석하였고, 압타머의 결합력(Kd)은 나노몰라 농도(nM) 수준인 것을 확인하였다.
도 2는 발굴한 압타머의 특이도를 분석한 결과를 나타낸다. M. tuberculosis, P. aeruginosae, S. sonnei, 그리고 H. influezae 각각의 AHAS와 압타머 6의 결합을 통하여 특이도를 분석하였다. 본 발명에서 합성한 압타머 6이 결핵균 AHAS에 특이적 결합력을 갖는 것을 확인하였다.
도 3은 In vitro 상에서 압타머를 이용한 결핵균 AHAS 활성 저해를 확인한 결과를 나타낸다. 발굴된 압타머에 대해 AHAS의 활성 저해를 확인한 결과 단백질의 활성을 저해하는 것을 확인하였다. 압타머의 IC50값을 측정한 결과 22.32 nM의 결과를 얻었다.
도 4는 In vitro 상에서 압타머를 이용한 결핵균 AHAS 활성 저해 특이도를 확인한 결과를 나타낸다. M. tuberculosis, P. aeruginosae, S. sonnei, 그리고 H. influezae 각각의 AHAS에 대한 압타머의 저해 특이도를 확인하였다. 압타머 6가 결핵균 AHAS에 대하여 특이도를 갖는 것을 확인하였다.Figure 1 shows the binding force (Kd) analysis of platemers binding to the Mycobacterium tuberculosis AHAS. Biotin substances were labeled on the 5 'regions of 9 selected platamers and the binding force was analyzed. The binding force (Kd) of the platamer was confirmed to be at the nanomolar concentration (nM).
Fig. 2 shows the results of analyzing the specificity of the excavated plaster. Specificity was analyzed by the combination of AHAS and Uttamer 6 in M. tuberculosis, P. aeruginosae, S. sonnei, and H. influezae . It was confirmed that the platemer 6 synthesized in the present invention has a specific binding force to the Mycobacterium tuberculosis AHAS.
FIG. 3 shows the results of confirming the inhibition of AHAS activity of Mycobacterium tuberculosis using an extramammary in vitro . As a result of confirming the inhibition of AHAS activity against the digested tamtamer, it was confirmed that the activity of protein was inhibited. The IC 50 value of the platemer was measured to be 22.32 nM.
Fig. 4 shows the results of confirming the specificity of Inhibition of AHAS activity against M. tuberculosis in vitro using aptamer. The specificity of inhibition of platemer against AHAS in M. tuberculosis, P. aeruginosae, S. sonnei and H. influezae was confirmed. It was confirmed that Abamer 6 had a specificity for AHAS of M. tuberculosis.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the present invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention .

실시예Example

실시예 1: 결핵균 AHAS 단백질에 특이적으로 결합하는 단일가닥 DNA 앱타머 스크리닝 (SELEX)Example 1 Single-stranded DNA aptamer screening (SELEX) specifically binding to Mycobacterium tuberculosis AHAS protein

대략 7.2×1014개의 서로 다른 DNA 서열들로 구성된 랜덤 단일가닥 DNA 라이브러리(Bioneer)로부터 AHAS(Acetohydroxyacid Synthase)에 특이적으로 결합할 수 있는 단일가닥 DNA 앱타머를 SELEX 방법에 의해 선별하였다.A single stranded DNA aptamer capable of specifically binding to AHAS (Acetohydroxyacid Synthase) from a random single stranded DNA library (Bioneer) consisting of approximately 7.2 x 10 14 different DNA sequences was selected by the SELEX method.

DNA 클로닝을 이용 결핵균 AHAS 발현 DNA를 pET28a 벡터에 삽입 시킨 후 E.coli BL21(DE3)를 숙주세포로 이용 형질 전환을 하였다. 단백질의 대량 생산을 위하여 1L LB 배지를 이용하여 O.D값이 0.5가 될 때까지 키운 후 IPTG를 넣어 단백질의 발현을 개시하였다. 라이소자임을 이용 세포벽을 깬 후 원심분리를 이용 단백질 추출물을 얻었고 이를 Ni-세파로오스 레진(resin)을 이용하여 친화성 크로마토그래피로 정제하였다. Using DNA cloning, the AHAS-expressing DNA of Mycobacterium tuberculosis was inserted into the pET28a vector and E. coli BL21 (DE3) was transformed into a host cell. For mass production of protein, 1 L LB medium was used to grow OD until the value of OD became 0.5, and IPTG was added to initiate protein expression. The lysozyme was used to break the cell wall, and the protein extract was obtained by centrifugation and purified by affinity chromatography using Ni-Sepharose resin.

정제한 AHAS효소를 이용하여 특이적 결합 앱타머를 발굴하기 위해서는, 가장 먼저 랜덤 DNA 라이브러리가 필요하다. 이를 위해 총 60개 염기에서 30개 랜덤으로 구성된 염기서열((N)30)을 포함한 단일가닥 DNA 라이브러리(5'-ATGCGGATCCCGCGC(N)30GCGCGAAGCTTGCGC-3')를 이용하였다. 주형(template) DNA 라이브러리를 증폭시키기 위하여 다음과 같이 프라이머를 제작하고 합성하였다. In order to discover a specific binding aptamer using the purified AHAS enzyme, a random DNA library is first required. To do this, a single stranded DNA library (5'-ATGCGGATCCCGCGC (N) 30 GCGCGAAGCTTGCGC-3 ') containing 30 nucleotides in total (N) 30 in a total of 60 bases was used. Primers were prepared and synthesized as follows to amplify the template DNA library.

정방향 프라이머 : 5'-ATGCGGATCCCGCGC-3' (BamHⅠ site 포함) Forward primer: 5'-ATGCGGATCCCGCGC-3 '(including BamHI site)

역방향 프라이머 : 5'-GCGCAAGCTTCGCGC-3' (HindⅢ site 포함)Reverse primer: 5'-GCGCAAGCTTCGCGC-3 '(including HindIII site)

단일가닥 DNA 만을 얻기 위해 100 μM의 정방향 프라이머, 10 μM의 역방향 프라이머를 사용하여 비대칭 PCR로 주형 DNA 라이브러리를 증폭시켰다. PCR 산물은 2.5% 아가로즈 겔에 전기영동하여 산물을 육안으로 확인하였다. PCR 수행 후 단일가닥 DNA 라이브러리를 분리하기 위하여 Crush and Soak 방법을 이용하였다. PCR 산물을 12% 네이티브겔에 전기영동하여 이중가닥과 단일가닥 DNA를 분리하였다. 전기영동 후 EtBr로 DNA를 염색 후 단일가닥 DNA 밴드를 절단한 후, 절단된 겔을 Crush and Soak 버퍼(500 mM NH4OAc, 0.1% SDS, 0.1 mM EDTA)에 분쇄하여 단일가닥 DNA를 추출하였다. 추출물을 원심분리하여 고형겔을 분리 후 에탄올 침전 등을 통하여 정제 후 UV/Vis 분광광도계(spectrophotometer)를 사용하여 정량하여 SELEX에 사용하였다.The template DNA library was amplified by asymmetric PCR using 100 μM forward primer and 10 μM reverse primer to obtain single-stranded DNA only. The PCR product was electrophoresed on 2.5% agarose gel and the product was visually confirmed. After PCR, Crush and Soak method was used to isolate single stranded DNA library. The PCR product was electrophoresed on a 12% native gel to separate double stranded and single stranded DNA. After electrophoresis, DNA was stained with EtBr, and single stranded DNA bands were cut. The digested gels were then crushed into Crush and Soak buffer (500 mM NH 4 OAc, 0.1% SDS, 0.1 mM EDTA) . The extract was centrifuged and the solid gel was separated and purified by ethanol precipitation and then quantified using a UV / Vis spectrophotometer and used for SELEX.

단일가닥 DNA를 이용하여 AHAS에 특이적으로 결합하는 앱타머를 스크리닝하기 위하여 올리고뉴클레오타이드의 In vitro 셀렉션 SELEX를 수행하였다. 기존의 SELEX 방법에서 변형된 방법으로 농축 필터를 이용하였다. 단백질과 앱타머가 결합하면 멤브레인의 크기보다 커지므로 멤브레인을 통과하지 못하고 멤브레인 상부에 남아 있게 되며 결합하지 않은 단일가닥 DNA는 멤브레인을 통과하여 분리할 수 있게 되는 원리를 이용하였다. 이를 위해 초여과(Ultrafiltration)(30 kDa 커팅 멤브레인 포함, Millipore)를 이용하여 AHAS와 단일가닥 DNA를 각 라운드의 반응시간만큼 상온에서 반응시키고, 원심분리를 통해 AHAS와 결합하지 않은 단일가닥 DNA는 멤브레인 밑으로 통과시켜 분리하고, 멤브레인을 통과하지 못하고 상부에 남아 있는 잔여물을 PCR을 통해 증폭하여 12% 네이티브 DNA 전기영동을 통하여 AHAS에 결합하는 DNA 서열만을 얻고 다음 라운드를 진행하였다. 이 때 AHAS와 ssDNA를 결합시킬 때 버퍼 조건에 따른 단백질과 ssDNA의 농도, 결합 시간, 결합조건을 통하여(참조: 표 1) 극한 조건에서도 높은 결합력으로 결합할 것으로 예상되는 ssDNA를 확보하였으며, 또한 음성 셀렉션 과정을 통하여 비 특이적으로 결합하는 ssDNA들을 제거하였다. 표 1은 SELEX 수행을 위한 선별 조건을 나타내는 것으로, 1단계부터 10단계까지 버퍼, 염(NaCl) 농도, 단백질 양, 라이브러리 농도 및 라이브러리 결합시간을 조절하여 강력하고 특이적으로 결합하는 압타머를 분리하였다. In vitro selection SELEX of oligonucleotides was performed to screen for aptamers that specifically bind to AHAS using single stranded DNA. A concentrated filter was used as a modified method in the conventional SELEX method. The combination of protein and aptamer is larger than the size of the membrane, so it does not pass through the membrane and remains on the membrane. The unbound single stranded DNA can be separated through the membrane. To this end, AHAS and single stranded DNA were reacted at room temperature for each round of reaction time using Ultrafiltration (30 kDa cutting membrane, Millipore), and single stranded DNA not bound to AHAS by centrifugation was separated from the membrane And the residue remaining on the top without passing through the membrane was amplified by PCR to obtain DNA sequence binding to AHAS through 12% native DNA electrophoresis, and the next round was performed. At this time, when binding AHAS and ssDNA, ssDNA was expected to bind with high binding force even under extreme conditions through protein, ssDNA concentration, binding time, and binding conditions according to buffer conditions (see Table 1) The selection process eliminated nonspecifically binding ssDNAs. Table 1 shows the screening conditions for SELEX execution. From step 1 to step 10, the potent and specific binding tympanic membrane was isolated by controlling the buffer, salt (NaCl) concentration, protein amount, library concentration and library binding time Respectively.

Figure 112014064959518-pat00001
Figure 112014064959518-pat00001

최종 10라운드의 SELEX 과정을 통해 얻은 ssDNA의 서열을 분석하고자 클로닝 과정을 진행하였다. 동일한 농도의 프라이머를 사용하여 ssDNA를 dsDNA로 증폭 후 서열 분석을 위해 T7 프로모터를 갖고 있는 박테리아 발현용 벡터인 pET 28a 벡터에 삽입하고자 하였다. 제한효소는 각각 BamHⅠ과 HindⅢ를 선택하여 처리하였으며, 발현 벡터에 유전자 서열의 삽입을 위해 DNA 리가아제를 이용하여 유전자를 확보하였다. AHAS에 대한 총 3번의 선별 및 증폭 과정을 통하여 최종적으로 9개의 ssDNA 앱타머를 선별하였다. 이들 앱타머의 염기서열은 하기 표 2와 같다.Cloning was performed to analyze the sequence of ssDNA obtained through SELEX process in the final 10 rounds. The ssDNA was amplified with dsDNA using primers of the same concentration and then inserted into pET 28a vector, a vector for bacterial expression having the T7 promoter for sequencing. BamHI and HindIII were selected for the restriction enzymes, respectively, and genes were obtained by using DNA ligase for insertion of the gene sequence into the expression vector. Finally, nine ssDNA aptamers were screened through a total of three screening and amplification procedures for AHAS. The nucleotide sequences of these aptamers are shown in Table 2 below.

Figure 112014064959518-pat00002
Figure 112014064959518-pat00002

실시예 2: 합성된 앱타머 서열과 AHAS 효소의 결합력 분석Example 2: Analysis of binding force between synthesized aptamer sequence and AHAS enzyme

상기 실시예 1에서 찾은 염기서열의 AHAS에 대한 결합력은 앱타머를 기반으로 한 효소면역법(ELISA)을 이용하여 측정되었으며, 측정을 위해 앱타머 서열 5'말단에 바이오틴을 합성. M. tuberculosis AHAS(0.5 μg/웰)가 결합된 플레이트에 서열목록 제1서열 내지 제9서열의 앱타머를 농도별로 희석시켜 결합시키고 바이오틴과 스트렙트아비딘 결합을 이용하여 대상물질과 결합한 앱타머를 측정하였다. 측정 과정에서 세척용액은 1X TBST(0.05 M Tris, 0.5 M NaCl, 0.05% Tween-20 in dH2O, pH 7.5)을 사용하였으며, 앱타머의 비특이적 결합을 줄이기 위해 TBST에 녹인 2% BSA(200 μl/웰)를 처리하였다. 결합력은 Kd(Dissociation constant)값으로 나타내며, 도 1에서 보는 바와 같이 본 발명에 따른 앱타머는 나노몰(nM) 수준의 결합력을 보여주고 있다.
The binding ability of the nucleotide sequence found in Example 1 to AHAS was measured using an aptamer-based enzyme immunoassay (ELISA). For measurement, biotin was synthesized at the 5'-end of the aptamer sequence. Aptamers from Sequence Listing Nos. 1 to 9 were diluted by concentration to a plate to which M. tuberculosis AHAS (0.5 μg / well) was added, and an aptamer bound to the target substance using biotin and streptavidin binding Respectively. In the measurement, 1X TBST (0.05 M Tris, 0.5 M NaCl, 0.05% Tween-20 in dH 2 O, pH 7.5) was used as the washing solution. To reduce nonspecific binding of the aptamer, 2% BSA mu] l / well). The binding force is represented by a Kd (dissociation constant) value. As shown in FIG. 1, the aptamer according to the present invention shows a binding force at a nano-mol (nM) level.

실시예 3: 합성된 앱타머 서열의 특이도 분석Example 3: Specificity analysis of synthesized aptamer sequence

상기 실시 예 1에서 찾은 염기서열의 특이도를 알아보기 위해 앱타머를 기반으로 한 효소면역측정법(ELISA)을 이용하여 발굴한 앱타머와 M. tuberculosis, P. aeruginosae, S. sonnei, 그리고 H. influezae 각각의 AHAS 결합력을 통하여 특이도를 분석하였다. 측정을 위해 앱타머 서열 5'말단에 바이오틴을 합성. M. tuberculosis AHAS(0.5 μg/웰)가 결합된 플레이트에 서열목록 제6서열의 앱타머를 농도별로 희석시켜 결합시키고 바이오틴과 스트렙트아비딘 결합을 이용하여 대상물질과 결합한 앱타머를 측정하였다. 측정 과정에서 세척용액은 1X TBST(0.05 M Tris, 0.5 M NaCl, 0.05% Tween-20 in dH2O, pH 7.5)을 사용하였으며, 앱타머의 비특이적 결합을 줄이기 위해 TBST에 녹인 2% BSA(200 μl/웰)를 처리하였다. 도 2에서 보는 바와 같이 본 발명에 따른 서열목록 제6서열의 앱타머는 M. tuberculosis AHAS효소에 대한 특이도 또한 갖는 것을 확인하였다.
In order to investigate the specificity of the nucleotide sequence found in Example 1, aptamers and M. tuberculosis , P. aeruginosae , S. sonnei , and H. sonnei , which were extracted using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) specificity was analyzed by the AHAS binding force of each influezae . Biotin is synthesized at the 5 'end of the aptamer sequence for measurement. Aptamer of Sequence Listing 6 was diluted by concentration in a plate coupled with M. tuberculosis AHAS (0.5 μg / well) and the aptamer bound to the target substance was measured using biotin and streptavidin binding. In the measurement, 1X TBST (0.05 M Tris, 0.5 M NaCl, 0.05% Tween-20 in dH 2 O, pH 7.5) was used as the washing solution. To reduce nonspecific binding of the aptamer, 2% BSA mu] l / well). As shown in FIG. 2, the aptamer of Sequence Listing No. 6 according to the present invention was confirmed to have specificity for M. tuberculosis AHAS enzyme.

실시예 4: 앱타머를 이용한 Example 4: Using an aptamer In vitroIn vitro 상에서 AHAS의 활성 저해 효과 및 특이도 분석 Activity inhibition and specificity analysis of AHAS

M. tuberculosis AHAS 단백질을 타겟으로 SELEX 스크리닝을 통해 발굴한 9개의 앱타머에 대한 In vitro 상에서 효소의 활성 저해 효과를 분석하였다. AHAS는 피루베이트(pyruvate) 두 분자의 결합을 촉매하여 아세토락테이트를 생성한다. 이 생성된 아세토락테이트는 산성 환경(황산)에서 아세토인으로 변환되며, 아세토인과 α-나프톨의 결합을 통해 생성된 디아세틸이 구아니딘과 결합하여 색을 나타내는 성질을 이용하여 525 nm의 흡광도를 측정함으로 AHAS의 활성 측정이 가능하다. 이러한 활성법을 이용하여 단백질의 활성 측정과 앱타머에 의한 AHAS의 활성 저해를 확인하였다. 더 구체적으로 반응의 전체 부피를 200 μl로 하여 0.25 mg/ml의 AHAS와 100 mM 포타슘 포스페이트 버퍼(pH 7.4), 100 mM 피루베이트, 1 mM 티아민 디포스페이트, 10 mM MgCl2, 50 μM 플라빈 아데닌 디뉴클레오타이드와 농도의 따른 앱타머를 처리하여 단백질의 활성 정도를 비교 분석하였다. 발굴한 9개의 앱타머들은 In vitro에서 활성 저해 효과를 보였으며, 각 앱타머의 IC50 값은 수 nM 수준이었다(참조: 도 3). In vitro inhibition of enzymatic activity of 9 aptamers was investigated by SELEX screening with M. tuberculosis AHAS protein. AHAS catalyzes the coupling of two molecules of pyruvate to produce acetolactate. The resulting acetolactate is converted to acetone from an acidic environment (sulfuric acid), and the absorbance at 525 nm is measured using the property of the color that diacetyl produced through the coupling of acetone and α-naphthol binds with guanidine Measurement of the activity of AHAS is possible. This activity method was used to measure the activity of the protein and inhibit the activity of AHAS by the aptamer. More specifically, AHAS and 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.4), 100 mM pyruvate, 1 mM thiamine diphosphate, 10 mM MgCl 2 , 50 μM flavin adenine The activity of the protein was compared and analyzed by treating the aptamer with the dinucleotide and the concentration. The 9 aptamers that were excavated showed in vitro inhibitory effects, and the IC 50 values of each aptamer were several nM levels (see FIG. 3).

M. tuberculosis AHAS의 저해에 대한 앱타머 특이도 측정은 위에서 사용된 활성 저해 시험을 이용하여 실행하였다. SELEX 스크리닝을 통해 발굴된 앱타머의 M. tuberculosis, P. aeruginosae, S. sonnei, 그리고 H. influezae 각각의 AHAS에 대한 저해효과를 분석하였으며, 각각 0.25 mg/ml의 AHAS에 1 μM 앱타머를 처리하여 앱타머의 저해효과를 살펴보았다(참조: 도 4). 이를 통하여 서열목록 제6서열의 앱타머가 M. tuberculosis AHAS에 대하여 특이적으로 저해 효과를 보이는 것을 확인하였다.
 The determination of the aptamer specificity for the inhibition of M. tuberculosis AHAS was carried out using the active inhibition test used above. The inhibitory effects of A. tuberculosis , P. aeruginosae , S. sonnei , and H. influezae on AHAS of aptamer, which were found through SELEX screening, were analyzed and treated with 1 μM aptamer at 0.25 mg / ml AHAS To examine the inhibitory effect of the aptamer (see Fig. 4). As a result, it was confirmed that aptamer of Sequence Listing 6 sequence specifically inhibited M. tuberculosis AHAS.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the same is by way of illustration and example only and is not to be construed as limiting the scope of the present invention. Accordingly, the actual scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.

<110> IUCF-HYU (Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University) <120> Nucleic Acid Aptamer for inhibiting Acetohydroxyacid Synthase of Mycobacterium tuberculosis <130> PN140272 <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA from random ssDNA library(Bioneer) <400> 1 cgagtgaggg cgaggcgcgc tcctgccggt 30 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA from random ssDNA library(Bioneer) <400> 2 ggcacccagt gtggcgcgcc tccctccgtc 30 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA from random ssDNA library(Bioneer) <400> 3 gcccacctgt ggggcgcgcc tccctccgtc 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA from random ssDNA library(Bioneer) <400> 4 gcccacgtgt ggtgcgcgcc tcctcgtagt 30 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA from random ssDNA library(Bioneer) <400> 5 ggcacccagt gtggcgcgcc tcctcgtagt 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA from random ssDNA library(Bioneer) <400> 6 cggccagggg acgagcgcgc cctgatcgtg 30 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA from random ssDNA library(Bioneer) <400> 7 acgcgacagc agtgcgcgcc ccgtcccggt 30 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA from random ssDNA library(Bioneer) <400> 8 cgacggaggg aggcgcgcca cactgggtgc 30 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA from random ssDNA library(Bioneer) <400> 9 gcaccggcag gagcgcgcct cgccctcact 30 <210> 10 <211> 30 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssRNA corresponding ssDNA of SEQ ID NO: 6. <400> 10 cggccagggg acgagcgcgc ccugaucgug 30 <110> IUCF-HYU (Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University) <120> Nucleic Acid Aptamer for inhibiting Acetohydroxyacid Synthase of          Mycobacterium tuberculosis <130> PN140272 <160> 10 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA from random ssDNA library (Bioneer) <400> 1 cgagtgaggg cgaggcgcgc tcctgccggt 30 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA from random ssDNA library (Bioneer) <400> 2 ggcacccagt gtggcgcgcc tccctccgtc 30 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA from random ssDNA library (Bioneer) <400> 3 gcccacctgt ggggcgcgcc tccctccgtc 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA from random ssDNA library (Bioneer) <400> 4 gcccacgtgt ggtgcgcgcc tcctcgtagt 30 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA from random ssDNA library (Bioneer) <400> 5 ggcacccagt gtggcgcgcc tcctcgtagt 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA from random ssDNA library (Bioneer) <400> 6 cggccagggg acgagcgcgc cctgatcgtg 30 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA from random ssDNA library (Bioneer) <400> 7 acgcgacagc agtgcgcgcc ccgtcccggt 30 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA from random ssDNA library (Bioneer) <400> 8 cgacggaggg aggcgcgcca cactgggtgc 30 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA from random ssDNA library (Bioneer) <400> 9 gcaccggcag gagcgcgcct cgccctcact 30 <210> 10 <211> 30 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssRNA corresponding ssDNA of SEQ ID NO: 6. <400> 10 cggccagggg acgagcgcgc ccugaucgug 30

Claims (8)

서열목록 제6서열 또는 제10서열의 핵산 서열로 이루어진 미코박테리움 튜버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) AHAS(Acetohydroxyacid Synthase)에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머.
A nucleic acid aptamer that specifically binds to Mycobacterium tuberculosis AHAS (Acetohydroxyacid Synthase) comprising a nucleic acid sequence of SEQ ID No. 6 or 10.
삭제delete 제 1 항의 핵산 앱타머를 포함하는 미코박테리움 튜버쿨로시스 억제용 조성물.
A composition for inhibiting Mycobacterium tuberculosis comprising the nucleic acid aptamer of claim 1.
제 1 항의 핵산 앱타머를 포함하는 결핵 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
A pharmaceutical composition for preventing or treating tuberculosis comprising the nucleic acid aptamer of claim 1.
제 1 항의 핵산 앱타머를 포함하는 미코박테리움 튜버쿨로시스 검출용 조성물.
A composition for detecting Mycobacterium tuberculosis comprising the nucleic acid aptamer of claim 1.
제 5 항에 있어서, 상기 핵산 앱타머는 검출가능한 표지가 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
6. The composition of claim 5, wherein the nucleic acid aptamer is attached with a detectable label.
제 6 항에 있어서, 상기 검출가능한 표지는 광학적 표지, 전기화학적 표지, 방사성 동위원소 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 조성물.
7. The composition of claim 6, wherein the detectable label is an optical label, an electrochemical label, a radioisotope, or a combination thereof.
다음의 단계를 포함하는 미코박테리움 튜버쿨로시스 검출 방법:
(a) 제 7 항의 조성물을 시료와 접촉시키는 단계; 및
(b) 단계(a)를 거친 시료로부터 결합 신호를 측정하는 단계.A method for detecting mycobacterial tubercurosis comprising the steps of:
(a) contacting the composition of claim 7 with a sample; And
(b) measuring the coupling signal from the sample after step (a).
KR1020140086751A 2014-07-10 2014-07-10 Nucleic Acid Aptamer for inhibiting Acetohydroxyacid Synthase of Mycobacterium tuberculosis KR101661507B1 (en)

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