KR101659894B1

KR101659894B1 - 열 안정성이 우수하고 알러지가 없는 무독화 봉독 펩타이드의 제조방법

Info

Publication number: KR101659894B1
Application number: KR1020160079374A
Authority: KR
Inventors: 김용수; 김호채; 이대웅; 박은영; 김성균; 박효진; 강승준; 이서윤; 백영미; 이학용; 서창우; 강봉석; 최성환; 정영진; 김종현; 이경욱; 정아롱; 이수형; 고환주; 이상희
Original assignee: 김용수
Priority date: 2016-06-24
Filing date: 2016-06-24
Publication date: 2016-09-26

Abstract

본 발명은 (a) 봉독에 완충용액을 첨가하여 희석하는 단계; (b) 상기 (a)단계의 희석한 희석액에 단백질분해효소를 첨가한 후 효소반응시키는 단계; (c) 상기 (b)단계의 효소 반응한 반응물을 가열하는 단계; (d) 상기 (c)단계의 가열한 반응물에 냉각된 에탄올을 가하여 반응물의 단백질을 응고시키는 단계; (e) 상기 (d)단계의 응고시킨 반응물을 원심분리하여 응고물을 침전시키는 단계; 및 (f) 상기 (e)단계의 응고물이 침전된 반응물에서 상등액을 취한 후 건조하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 알러지 성분이 제거된 정제 봉독의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 알러지 성분이 제거된 정제 봉독에 관한 것이다.

Description

열 안정성이 우수하고 알러지가 없는 무독화 봉독 펩타이드의 제조방법{Method for producing nontoxic bee venom peptide having excellent thermal stability and removing allergy}

봉독(蜂毒)이란 벌이 가지고 있는 독이며, 봉독은 예로부터 의학적인 치료 효과를 인정받아 왔다. 최근 연구 결과 봉독은 항암작용, 관절염 완화, 동맥경화 완화, 요통완화, 피부 상처의 치료, 면역증강 작용, 항염증 작용, 혈압을 낮추고 혈액 중의 임파세포 및 적혈구의 재생증가와 같은 의학적 기능 이외에, 미용의 목적으로도 주름개선, 미백작용 등이 발견되고 있다.

봉독의 주요 구성 성분과 그 약리적 기능들을 살펴보면 하기 표 1과 같다.

성분	약리기능	성분비(%)
펩타이드(멜리틴, 아파민)	진정작용, 면역작용	50% 내외
단백질(포스포리파제 A2)	세포파괴, 알러지	15%
아민류(히스타민)	혈압강하	1 내지 2%

봉독은 펩티드, 단백질 및 낮은 분자의 활성아민 등을 포함하여, 40가지 이상의 물질로 구성되고, 주된 유효성분은 상기 표에 나타낸 바와 같다.

봉독 구성 중 단백질류는 13kDa 이상의 분자량을 가지는 포스포리파아제 A2(Phospholipase A2, PLA2), 히알루로니다제(Hyaluronidase), 포스파타아제(phosphatase), α-글루코시다아제(α-Glucosidase) 등의 성분으로 구성되고, 주로 혈액세포막 파괴, 혈액응고, 혈관확장 및 투과, 혈액순환 촉진, 단백질의 가수분해 촉진 등의 생리활성 역할이 있다.

특히, 포스포리파아제와 히알루로니다제는 강력한 알러지 반응을 유발하는 봉독 구성물로서, 봉독에 대한 과민성을 지닌 사용자에게는 매우 심각한 안전상의 문제를 야기할 수 있다. 따라서, 봉독을 치료의 목적으로 사용하기 위해서는 상기 성분의 불활성화나, 완전제거가 필연적이라 할 수 있다.

이에 따라, 봉독으로부터 상기 알러지 유발물질을 제거하려는 기술들이 공지되어 있다. 예를 들면, 한국등록특허 제1382404호에는 봉독을 용해시켜 봉독 용해액을 제조하고, 이 봉독 용해액을 PSA(primary secondary amine) 흡착제에 넣고 혼합물을 만든 다음, 이를 정밀여과하여 불순물이 제거된 순수 봉독을 대량 제조하는 방법이 기술되어 있다. 또한, 한국등록특허 제1364506호에는 분자량 컷-오프(cut-off) 사이즈가 10kDa 이상의 한외여과막을 사용하여 봉독 중의 포스포리파아제를 제거하고, 정제봉독 중에 아파민이 4중량% 이상, 멜리틴이 50중량% 이상 함유되도록 하는 방법이 개시되어 있다. 또한, 한국등록특허 제1608045호에는 양이온 교환수지를 이용하여, 봉독 중의 포스포리파아제를 제거하고 멜리틴만을 분리하는 기술이 개시되어 있다. 그러나, 본 발명과 같이 단백질분해효소를 이용하여 알러지 성분이 제거된 정제 봉독의 제조하는 방법은 전무한 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 멜리틴 및 아파민과 같은 봉독의 유효성분은 그대로 유지하면서 봉독의 알러지 성분인 포스포리파아제 A2 및 히알루로니다제는 효과적으로 완전히 제거할 수 있는 단백질 분해효소를 이용한 정제 봉독의 제조방법을 제공하는 데 있다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 (a) 봉독에 완충용액을 첨가하여 희석하는 단계; (b) 상기 (a)단계의 희석한 희석액에 단백질분해효소를 첨가한 후 효소반응시키는 단계; (c) 상기 (b)단계의 효소 반응한 반응물을 가열하는 단계; (d) 상기 (c)단계의 가열한 반응물에 냉각된 에탄올을 가하여 반응물의 단백질을 응고시키는 단계; (e) 상기 (d)단계의 응고시킨 반응물을 원심분리하여 응고물을 침전시키는 단계; 및 (f) 상기 (e)단계의 응고물이 침전된 반응물에서 상등액을 취한 후 건조하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 알러지 성분이 제거된 정제 봉독의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 알러지 성분이 제거된 정제 봉독을 제공한다.

본 발명의 방법으로 제조된 정제 봉독은 강력한 알러지 반응을 유도하는 포스포리파아제 A2 및 히알루로니다제를 완전히 제거함으로써, 알러지 반응으로부터 근본적으로 안전한 정제 봉독을 제조할 수 있으며, 봉독에 포함된 유효성분은 그대로 유지하여 다양한 약리적 기능을 위해 보다 안심하고 사용할 수 있는 이점이 있다.

도 1은 비정제 봉독을 인산 완충용액에 희석한 희석액과 제조예 1의 방법으로 제조된 정제 봉독 인산 완충용액의 전기영동 패턴을 분석한 결과를 보여준다.
PLA2: 포스포리파아제 A2

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

(a) 봉독에 완충용액을 첨가하여 희석하는 단계;

(b) 상기 (a)단계의 희석한 희석액에 단백질분해효소를 첨가한 후 효소반응시키는 단계;

(c) 상기 (b)단계의 효소 반응한 반응물을 가열하는 단계;

(d) 상기 (c)단계의 가열한 반응물에 냉각된 에탄올을 가하여 반응물의 단백질을 응고시키는 단계;

(e) 상기 (d)단계의 응고시킨 반응물을 원심분리하여 응고물을 침전시키는 단계; 및

(f) 상기 (e)단계의 응고물이 침전된 반응물에서 상등액을 취한 후 건조하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 알러지 성분이 제거된 정제 봉독의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 정제 봉독의 제조방법에서, 상기 알러지 성분은 포스포리파아제 A2(Phospholipase A2) 및 히알루로니다제(Hyaluronidase)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 정제 봉독의 제조방법에서, 상기 (a)단계의 완충용액은 바람직하게는 pH 5~9 및 1~150 mM 농도의 EDTA, Tris, 인산염(phosphate) 또는 구연산염(citrate) 완충용액일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 pH 6~9 및 50~150 mM 농도의 인산 완충액, 가장 바람직하게는 pH 7.5 및 100 mM 농도의 인산 완충액일 수 있다. 상기 완충용액은 봉독의 알러지 성분인 포스포리파아제 A2의 보조인자(cofactor)로 작용하는 Ca 이온을 제거할 수 있다. 또한, 완충용액 중에 산소가 있으면 반응 중 산화반응이 일어나 얻어진 봉독의 역가가 저하될 수 있다. 따라서, 완충용액 중의 산소를 제거하기 위해 완충용액을 90℃ 이상의 온도에서 5~30분 동안 가열하거나, 정제된 질소가스를 완충액에 30분 이상 치환하여 산소를 제거할 수 있다.

또한, 본 발명의 정제 봉독의 제조방법에서, 상기 (a)단계의 희석은 바람직하게는 봉독에 pH 6~9 완충용액을 첨가하여 8~12%(w/v)로 희석할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 봉독에 pH 7.5 완충용액을 첨가하여 10%(w/v)로 희석할 수 있다. 봉독 중 멜리틴으로 대표되는 펩타이드 성분은 봉독의 고형 성분의 약 50%이고, 나머지 50%는 포스포리파제 A2와 같은 알러지 유발 단백질 성분이다. 이 두 성분을 합한 총 고형분 성분은 봉독의 30%에 이른다. 따라서, 봉독 1 mL 중의 알러지 단백질 성분의 함량은 약 150 mg에 달한다고 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 봉독을 약 10% 농도로 완충용액에 희석하므로 반응물 1 mL 중의 알러지 유발 단백질의 함량은 약 15 mg이 된다.

또한, 본 발명의 정제 봉독의 제조방법에서, 상기 (b)단계의 단백질분해효소는 트립신 및 판크레아제 등과 같은 동물유래 단백질분해효소, 브로멜라민 및 파파야와 같은 식물성 단백질분해효소와 미생물 유래 단백질분해효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 가수분해효소일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 알칼라제(Alcalase)이다. 알칼라제는 다른 단백질분해효소에 비해 봉독 중의 알러지 성분을 효과적으로 제거할 수 있었고, 사용 농도는 바람직하게는 0.8~1.2 unit/mL, 더욱 바람직하게는 1 unit/mL 사용할 수 있다. 상기 농도로 처리하는 것이 봉독의 알러지 유발 성분을 효과적으로 제거할 수 있었으나, 사용 농도가 상기 범위를 초과할 경우 봉독의 유효성분인 멜라틴 등이 분해되어 유효성분 함량이 저하되는 문제점이 있다.

또한, 본 발명의 정제 봉독의 제조방법에서, 상기 (c)단계는 바람직하게는 효소 반응한 반응물을 75~85℃에서 10~20분 동안 가열할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 효소 반응한 반응물을 80℃에서 15분 동안 가열할 수 있다. 상기와 같은 조건으로 열처리함으로써, 반응물에 포함된 단백질분해효소의 효소 활성을 중단시키고, 반응물에 존재할 수 있는 봉독 알러지 단백질인 포스포리파아제 A2와 히알루로니다제를 열변성시키게 된다.

또한, 본 발명의 정제 봉독의 제조방법에서, 상기 (d)단계는 바람직하게는 가열한 반응물에 -15~-25℃로 냉각된 에탄올을 가하여 반응물의 단백질을 응고시킬 수 있으며, 더욱 바람직하게는 가열한 반응물에 -20℃로 냉각된 에탄올을 가하여 반응물의 단백질을 응고시킬 수 있다. 가열하면 반응물에 포함된 열변성된 단백질 화합물들은 마치 달걀 흰자가 삶아진 것처럼 단백질이 물에 녹지 않는 단단한 고화된 겔이 형성되는데, 단백질들이 서로 뭉쳐 물에 대하여 불용성의 침전물을 형성하게 된다. 이 현상은 불가역 반응이지만, 농도가 낮은 경우에는 가역 반응이 일어날 확률이 있으므로, 반응이 끝나면 온도를 급격히 내려 응고물을 빨리 침전시켜 제거하는 것이 바람직하다. 반응물 냉각을 위해 -20℃로 냉각된 에탄올, 드라이 아이스 첨가, 액체 질소 첨가 등의 방법이 있을 수 있지만, 봉독 펩타이드들은 에탄올에 용해성이 있으므로, -20℃로 냉각된 에탄올을 사용하는 것이 바람직하다. 이때 사용하는 에탄올은 95% 순도의 에탄올로서, 에탄올 첨가는 반응물에 에탄올 함량이 30~65%가 되도록 첨가할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 50%가 되도록 첨가할 수 있다. 에탄올 첨가량이 상기 범위 미만일 경우 단백질 응고 효과가 적고, 첨가량이 상기 범위를 초과하여도 단백질 응고 정도가 변함이 없으므로 상기 범위로 첨가하는 것이 바람직하다.

본 발명의 정제 봉독의 제조방법은, 보다 구체적으로는

(a) 봉독에 pH 6~9 완충용액을 첨가하여 8~12%(w/v)로 희석하는 단계;

(b) 상기 (a)단계의 희석한 희석액에 알칼라제(Alcalase)를 0.8~1.2 unit/mL로 첨가한 후 34~40℃에서 5~20분 동안 효소반응시키는 단계;

(c) 상기 (b)단계의 효소 반응한 반응물을 75~85℃에서 10~20분 동안 가열하는 단계;

(d) 상기 (c)단계의 가열한 반응물에 -15~-25℃로 냉각된 에탄올을 가하여 반응물의 단백질을 응고시키는 단계;

(f) 상기 (e)단계의 응고물이 침전된 반응물에서 상등액을 취한 후 건조하는 단계를 포함할 수 있으며,

더욱 구체적으로는

(a) 봉독에 pH 7.5 완충용액을 첨가하여 10%(w/v)로 희석하는 단계;

(b) 상기 (a)단계의 희석한 희석액에 알칼라제(Alcalase)를 1 unit/mL로 첨가한 후 37℃에서 10분 동안 효소반응시키는 단계;

(c) 상기 (b)단계의 효소 반응한 반응물을 80℃에서 15분 동안 가열하는 단계;

(d) 상기 (c)단계의 가열한 반응물에 -20℃로 냉각된 에탄올을 가하여 반응물의 단백질을 응고시키는 단계;

(f) 상기 (e)단계의 응고물이 침전된 반응물에서 상등액을 취한 후 건조하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조된 알러지 성분이 제거된 정제 봉독을 제공한다. 본 발명의 정제 봉독은 알러지 유발 물질인 포스포리파아제 A2(Phospholipase A2) 및 히알루로니다제(Hyaluronidase)는 검출되지 않았고, 봉독의 유효성분인 멜리틴을 50% 이상, 아파민을 1% 이상 포함하는 것을 특징으로 한다. 또한, 마우스를 대상으로 한 독성 평가에서, 정제 전 봉독의 LD50 값보다 현저히 높은 LD50 값을 나타내어 거의 독성이 없는 것으로 나타났다. 또한, 본 발명의 정제 봉독은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 균주 및 프로피오니박테리움 아크네(Propionibacterium acne) 균주를 대상으로 한 항균 실험에서 정제 전 봉독과 비교하였을 때 비슷한 항균 효과를 나타내었고, 기니아 피그를 대상으로 정제 봉독의 알러지 억제 효과를 확인한 결과, 기니아 피그에 이상 변화가 관찰되지 않았으며, 항원성이 없는 것을 확인할 수 있었다.

이하, 본 발명의 실시예를 들어 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

제조예 1: 알러지 유발 물질 제거된 정제 봉독의 제조

(a) 대한양봉협회로부터 구입한 고형분 30%(w/w) 봉독 0.1 g에 pH 7.5 및 100mM 인산 완충용액 1 mL를 첨가하여 봉독을 10%(w/v)로 희석하였다.

(b) 상기 (a)단계의 희석한 희석액에 알칼라제(Alcalase)를 1 unit/mL로 첨가한 후 37℃에서 10분 동안 효소반응시켰다.

(c) 상기 (b)단계의 효소 반응한 반응물을 80℃에서 15분 동안 가열하였다.

(d) 상기 (c)단계의 가열한 반응물에 -20℃로 냉각된 95%(v/v) 에탄올 1 mL를 가하여 반응물의 단백질을 응고시켰다.

(e) 상기 (d)단계의 응고시킨 반응물을 원심분리하여 응고물을 침전시켰다.

(f) 상기 (e)단계의 응고물이 침전된 반응물에서 상등액을 취한 후 저온진공건조(Speed Vac)하여 용액 중의 에탄올을 제거하여 정제 봉독 인산 완충용액 1 mL를 획득하였다.

실시예 1: 정제 봉독의 항균력

제조예 1에서 얻어진 정제 봉독의 생리 활성이 유지되고 있는지 확인하기 위하여, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 균주 및 프로피오니박테리움 아크네(Propionibacterium acne) 균주에 대한 항균력을 MIC(minimum inhibition concentration)와 MBC(minimum bacteriocidal concentration)를 분석하였다.

정제 전 봉독과 정제 후 봉독의 항균력 비교

균주	MIC(㎍/㎖)		MBC(㎍/㎖)
균주	정제 전 봉독	정제 후 봉독	정제 전 봉독	정제 후 봉독
Staphylococcus aureus	0.18	0.21	0.71	0.83
Propionibacterium acne	0.08	0.10	0.31	0.40

그 결과, 제조예 1의 정제 봉독은 정제 전 봉독과 비교하였을 때, MIC와 MBC가 다소 증가한 면은 있지만, 그 증가폭은 크지 않아 봉독 본연의 항균 효과를 그대로 유지하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 2: 정제 봉독의 성분 변화

비정제 봉독을 인산 완충용액에 희석한 희석액과 제조예 1의 방법으로 제조된 정제 봉독 인산 완충용액의 전기영동 패턴을 분석한 결과는 도 1과 같다. 전기영동 패턴에서 비정제 봉독과 비교하였을 때 본 발명의 정제 봉독은 포스포리파아제 A2가 완전히 제거되었으며, 멜리틴의 농도는 비정제 봉독과 비교하였을 때 크게 변화되지 않음을 보여주었다.

제조예 1의 방법으로 제조된 정제 봉독 인산 완충용액과 제조예 1의 방법으로 정제 봉독을 제조하되, (b)단계의 단백질분해효소 종류를 달리하여 제조된 정제 봉독 인산 완충용액을 각각 동결건조한 분말을 가지고 멜라틴, 아파민, 포스포리파아제 A2, 히알루로니다제 성분을 분석하였다.

분석 장치로는 액체크로마토그래피, 칼럼은 Sephadex TM 75, Source 15RPC ST, C18, RP-amide, Peptide ES-C18을 사용하였으며, 봉독 중의 멜리틴, 아파민, 포스포리파아제 A2, 히알루로니다제의 함량을 아래식으로 구하고 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

표준품 취한량(㎎)×(표준품의 순도/100)×(봉독 중의 원하는 성분 피크면적)/ 표준품의 피크 면적)×(100/봉독 양)

정제 봉독의 성분 변화(%)

성분함량(%)	멜리틴	아파민	포스포리파아제 A2	히알루로니다제
정제 전 봉독	65	2.5	11	1.8
제조예 1	52	1.8	0	0
비교예 1(Neutrase)	44	1.2	2.5	0.2
비교예 2(Protamex)	45	1.4	3.4	0.5

그 결과, 제조예 1의 정제 봉독은 알러지 유발 물질인 포스포리파아제 A2(Phospholipase A2) 및 히알루로니다제(Hyaluronidase)는 검출되지 않았고, 봉독의 유효성분인 멜리틴을 50% 이상, 아파민을 1% 이상 포함하는 것을 확인할 수 있었다. 반면, 알칼라제를 사용하지 않고, 뉴트라제 또는 프로타멕스를 사용하여 제조된 정제 봉독의 경우 봉독의 유효성분 함량이 제조예 1에 비해 현저하게 감소하고, 봉독의 알러지 유발 물질이 완전히 제거되지 않음을 확인할 수 있었다.

실시예 3: 정제 봉독의 알러지 억제 효과 시험

본 발명의 제조예 1에 따른 정제 봉독의 알러지 억제 효과를 확인하기 위하여 다음과 같은 PCA(Passive cutaneous anaphylaxis: 수동 피부 아나팔락시스) 시험을 수행하였다.

1) 시험물질: 제조예 1의 정제 봉독

2) 부형제: 생리식염주사액

3) 양성대조물: 오발부민(Ovalbumin: 달걀 유래)

4) 양성대조물질 부형제: 생리식염주사제

5) 시험동물: 300~380 g 특정병원체 부재(SPF) 기니아피그(guinea pig)

6) 시험군 구성, 투여량 결정, 군 분리 및 투여

시험군 구성 및 투여량 결정

군	동물수	투여액량(㎖/㎏)	투여량(㎎/㎏)
G1(부형제대조군)	5	1	0
G2(저용량군)	5	1	0.025
G3(고용량군)	5	1	0.05
G4(OVA+adjuvant군)	5	1	2.5

7) 투여량 결정: 감작과 PCA 투여량을 동일하게 하였다.

8) 투여: 감작은 기니아 피그의 경배부에 투여하였으며, PCA 반응 야기는 감작 후 채혈한 혈액의 혈청을 사용하였다. PCA 야기일에 피검 혈청은 개체별로 각 혈청당 2마리의 야기용 동물을 사용하여 PCA 반응을 수행하였다. 피검 혈청은 생리식염 주사액으로 10배에서 5120배까지 2배식 연속적으로 희석한 후, 각 100 ㎕씩 기니아 피그 배부 피내에 투여하였다. 피내 투여 4시간 후 Evan's blue를 2% 함유한 야기 항원액을 후지 정맥 내에 투여하여 PCA 반응을 야기하였다.

9) 관찰 및 검사: 일반증상 및 체중을 검사하였다. PCA 반응의 판정은 PCA 반응 야기 30분 후에 에테르 마취법으로 시험 동물을 도살한 후, 기니아 피그 배부 피부를 각피하여 청백반의 유무를 관찰하였다. 청백반이 나올 경우 장경과 단경을 측정하고 (장경+단경)/2로 산출한 평균치가 5 mm 이상인 것을 양성으로 판정하였으며, 양성을 나타내는 가장 마지막 혈청희석배수(최대희석배수)를 그 혈청의 최종 역가(항체가)로 정하였다.

10) 시험결과

- 일반증상: 본 발명에 따른 봉독에 의한 특이 증상 및 사망동물은 관찰되지 않았다.

- 체중변화: 본 발명에 따른 봉독에 의한 체중 변화는 관찰되지 않았다.

- PCA 판정: 본 발명에 따른 봉독의 항원성을 기니아 피그를 이용한 PCA 반응 유발성을 지표로 하여 실시하여 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

PCA 결과(양성반응 동물 수/전체실험 동물 수)

희석배수	G1	G2	G3	G4
10	0/10	0/10	0/10	10/10
20	0/10	0/10	0/10	10/10
40	0/10	0/10	0/10	10/10
80	0/10	0/10	0/10	10/10
160	0/10	0/10	0/10	10/10
320	0/10	0/10	0/10	10/10
640	0/10	0/10	0/10	8/10
1280	0/10	0/10	0/10	6/10
2560	0/10	0/10	0/10	5/10
5120	0/10	0/10	0/10	3/10

PCA 반응 결과 음성 대조군인 G1을 비롯하여 봉독 저용량 투여군 G2, 고용량 투여군 G3 모두 청백반이 관찰되지 않았다. 반면, 양성 대조군인 G4에서는 항체가가 5120배로서 분명한 PCA 반응을 나타내었다. 이 결과로서, 본 발명에 따라 제조된 정제 봉독은 항원성이 없는 것으로 판단된다.

Claims

(a) 봉독에 완충용액을 첨가하여 희석하는 단계;
(b) 상기 (a)단계의 희석한 희석액에 단백질분해효소를 첨가한 후 효소반응시키는 단계;
(c) 상기 (b)단계의 효소 반응한 반응물을 가열하는 단계;
(d) 상기 (c)단계의 가열한 반응물에 냉각된 에탄올을 가하여 반응물의 단백질을 응고시키는 단계;
(e) 상기 (d)단계의 응고시킨 반응물을 원심분리하여 응고물을 침전시키는 단계; 및
(f) 상기 (e)단계의 응고물이 침전된 반응물에서 상등액을 취한 후 건조하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 알러지 성분이 제거된 정제 봉독의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 알러지 성분은 포스포리파아제 A2(Phospholipase A2) 및 히알루로니다제(Hyaluronidase)인 것을 특징으로 하는 알러지 성분이 제거된 정제 봉독의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 (b)단계의 단백질분해효소는 알칼라제(Alcalase)인 것을 특징으로 하는 알러지 성분이 제거된 정제 봉독의 제조방법.
제3항에 있어서,
(a) 봉독에 pH 6~9 완충용액을 첨가하여 8~12%(w/v)로 희석하는 단계;
(b) 상기 (a)단계의 희석한 희석액에 알칼라제(Alcalase)를 0.8~1.2 unit/mL로 첨가한 후 34~40℃에서 5~20분 동안 효소반응시키는 단계;
(c) 상기 (b)단계의 효소 반응한 반응물을 75~85℃에서 10~20분 동안 가열하는 단계;
(d) 상기 (c)단계의 가열한 반응물에 -15~-25℃로 냉각된 에탄올을 가하여 반응물의 단백질을 응고시키는 단계;
(e) 상기 (d)단계의 응고시킨 반응물을 원심분리하여 응고물을 침전시키는 단계; 및
(f) 상기 (e)단계의 응고물이 침전된 반응물에서 상등액을 취한 후 건조하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 알러지 성분이 제거된 정제 봉독의 제조방법.
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