KR101636934B1 - 폼 프랙션 공법을 활용한 유기태 철분의 제조방법 - Google Patents

폼 프랙션 공법을 활용한 유기태 철분의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 폼 프랙션(foam fraction) 방법을 이용하여 유기태 철분을 제조하는 방법에 관한 것으로, 유기태 철분을 고순도로 대량 생산할 수 있으며, 본 발명에 의해 제조된 유기태 철분은 맥주 효모를 이용하기 때문에 부작용이 거의 없고, 헴철보다 우수한 분말 용해도 및 철분 용해도를 가짐으로써 체내 흡수율이 우수하며, 무기철의 단점으로 지적되는 변비를 개선할 수 있다.

Description

폼 프랙션 공법을 활용한 유기태 철분의 제조방법 {Method for the production of oranic iron with foam fraction}
본 발명은 유기태 철분의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 효모를 이용하여 부작용 없이 안전하고 체내 흡수율이 우수하며, 폼 프랙션(foam fraction) 공법을 이용하여 다량의 유기태 철분을 제조하여 회수할 수 있는 방법에 관한 것이다.
철분은 인체뿐만 아니라 동물에게도 필수적인 미량의 광물질로서 생체 내에서 산소 운반, 전자 전달 등과 같은 생명 유지에 관계되는 역할을 수행하는 중요한 요소이다. 철분 결핍시, 적혈구 감소와 헤모글로빈 수 감소가 유발되어 빈혈, 식욕부진, 설사, 호흡곤란, 성장부진 및 스트레스와 질병에 대한 감수성이 증가하는 등 생체 내 신진대사에 관련되는 전반적인 문제점을 야기시킨다.
생체 내 철분은 약 0.04%가 함유되어 있으며, 이중 약 70%는 적혈구 중에 포함되어 산소 운반기능을 하는 헤모글로빈 형태로 존재하고, 나머지 약 30% 정도는 간, 지라, 골수 등에 존재하면서 산소 운반과 생체 에너지 획득에 중요한 전자 전달요소인 시토크롬, 카달라아제 및 옥시다아제 등의 구성 성분으로 존재한다.
한편, 철의 결핍은 전세계적으로 가장 흔한 영양문제로, 그 원인으로는 부적절한 섭취, 흡수 불량, 빠른 성장과 혈액손실, 반복되는 임신에 의한 저장 철 고갈 등이 있다.
철 결핍의 위험성이 높은 시기는 급격한 신체성장이 이루어지는 6개월~4세의 영유아기, 사춘기, 월경혈의 손실이 있는 가임기 여성, 철의 요구가 증가하는 임신기이며, 특히 영유아와 임산부는 철 결핍이 되기 쉬운 것으로 알려져 있다.
철 결핍을 예방 및 치료하기 위하여 염화 제2철(ferric chloride), 구연산 철(ferric citrate), 구연산 철 암모늄(ferric ammonium citrate), 호박산 구연산 철 나트륨(iron and sodium succinate citrate), 젖산 철(ferrous lactate), 피로인산 제2철(ferric pyrophosphate), 헴철(heme iron) 등의 철 화합물이 철 강화제 및 제약 원료로 식품에 사용되고 있다.
하지만, 상기 철 화합물 중 헴철을 제외한 나머지는 생체에서 흡수율이 낮고 과잉 섭취시 철 중독을 유발할 수 있는 단점이 있어, 흡수율이 비교적 높고 부작용이 없는 헴철의 사용이 가장 많았다. 다만, 헴철은 철분의 함량, 가용성, 비가용성에 따라 가격 차이가 나며, 가용성 제품은 가격이 매우 비싸고, 비가용성 헴철 제품은 흡수율 및 철분 함량이 적다는 단점이 있다. 또한, 헴철은 소, 돼지, 말 등의 혈액을 기반으로 제조되기 때문에, 소비자가 동물성 질환에 노출될 수 있다는 우려가 있다.
한편, 효모를 이용하여 유기태 철분을 제조하는 기술은 종래에 다수 공개되었지만, 유기태 철분을 다량으로 생산할 수 있는 기술은 전혀 개시된 바 없다. 이에, 본 발명의 발명자들은 높은 체내 흡수율 및 높은 순도를 갖는 유기태 철분을 대량으로 생산할 수 있는 방법에 대하여 예의 연구하였고, 본 발명의 완성에 이르게 되었다.
대한민국 등록특허 제10-0892050호 (등록일자: 2009.03.31)에는 효모유기철의 함량이 높은 효모를 생산하기 위한 기술로, YH 배지(Yeast extract 3%, malt extract 3%, peptone 5%, dextrose 10%)에 고농도의 무기철인 황산철(ferrous sulfate) 500 ppm을 첨가한 후, 28℃, 150 rpm으로 24시간 동안 증식시키는 기술이 개시되어 있다. 다만, 본 발명이 폼 프랙션 공정을 이용하여 유기태 철분을 다량으로 제조함에 특징이 있는데, 상기 등록특허 제10-0892050호에는 이에 대한 언급이 없다. 대한민국 공개특허 제10-1996-0037823호 (공개일자: 1996.11.19)에는 생체내 흡수가 용이한 유기철 함유 효모를 제조하기 위한 기술로, 효모 추출물, 말트 추출물, 트립톤, 글루코오즈 및 황산철이 포함된 생산용 배지에서 선정된 효모를 배양하여 철분 훈양시킨 다음 생육대수기에 황산철과 글로코오즈를 동시에 첨가하여 효모내로 무기철을 유입시켜서 유기철 함유 효모를 제조하는 기술이 개시되어 있다. 다만, 본 발명이 폼 프랙션 공정을 이용하여 유기태 철분을 다량으로 제조함에 특징이 있는데, 상기 공개특허 제10-1996-0037823호에는 이에 대한 언급이 없다.
본 발명은 효모를 이용하여 부작용이 낮고 높은 체내 흡수율을 보이는 유기태 철분의 제조방법을 개발하여 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 폼 프랙션(foam fraction) 공법을 이용하여 유기태 철분을 대량 생산함으로써, 유기태 철분을 저렴한 가격으로 제공할 수 있는 유기태 철분의 제조방법을 개발하여 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하고자, 본 발명은 반응조에 효모 및 단백질분해효소를 넣고 효소반응을 수행함으로써 반응액을 제조하는 단계 (a); 상기 반응액으로부터 효모 박(粕)을 제거하는 단계 (b); 상기 효모 박이 제거된 반응액에 무기철(inorganic iron; Fe)을 첨가하는 단계 (c); 및 상기 무기철이 첨가된 반응액을 반응조의 상부로 순환시킨 후, 반응액으로 낙하시켜 반응액 표면에 거품을 생성시키는 단계 (d);를 포함하는 것을 특징으로 하는 유기태 철분의 제조방법을 제공한다.
이하에서는 본 발명의 유기태 철분 제조방법에 대하여 상세히 설명하고자 한다.
<단계 (a): 반응조에 효모 및 단백질분해효소를 넣고 효소반응을 수행함으로써 반응액을 제조하는 단계>
본 단계는 반응조에 효모 및 단백질분해효소를 넣고 효소반응을 수행함으로써 반응액을 제조하는 단계이다. 바람직하게는 반응조에 효모 및 단백질분해효소를 넣고, 40~60℃에서 5~15시간 동안 펌프순환시키면서 효소반응을 유도하는 것이다. 더욱 바람직하게는 물이 담긴 반응조에 물 100중량% 대비 효모 5~15중량% 및 단백질분해효소 0.2~0.5중량%를 첨가하여 효소반응을 수행함으로써 반응액을 제조하는 것이다.
한편, 상기 효모는, 바람직하게 맥주효모인 것이 좋다. 맥주효모란 맥주의 제조에 사용되는 사카로마이세스(Saccharomyces) 속의 효모를 건조한 것으로 비발효성이며, 45% 정도의 단백질을 함유하고 있으며, 비타민 B군과 인의 함량이 높다. 이러한 맥주효모에 단백질분해효소를 첨가하여 효소반응을 수행함으로써 맥주 효모로부터 단백질을 수득할 수 있는 것이다.
한편, 상기 단백질분해효소는 본 기술이 속하는 분야에서 통상적으로 사용되는 효소를 이용할 수 있으나, 바람직하게는 델보라제(Delvolase)를 이용하는 것이 좋다.
<단계 (b): 상기 반응액으로부터 효모 박(粕)을 제거하는 단계>
본 단계는 상기 반응액으로부터 효모 박을 제거하는 단계이다. 바람직하게는 상기 반응액을 원심분리하여 효모 박을 제거하는 것이다. 더욱 바람직하게는 상기 반응액을 10,000~15,000 rpm의 속도로 원심분리하여 효모 박을 제거하는 것이다.
<단계 (c): 상기 효모 박이 제거된 반응액에 무기철(inorganic iron; Fe)을 첨가하는 단계>
본 단계는 상기 효모 박이 제거된 반응액에 무기철을 첨가하는 단계이다. 이때, 무기철은 상기 단계 (a)에서 첨가된 물 100중량% 대비 2~5중량%를 첨가하는 것이 좋다.
상기 효모 박이 제거된 반응액에는 다량의 단백질이 존재하는데, 상기 반응액에 무기철에 첨가한 후 킬레이팅 반응을 시킴으로써 유기태 철분을 제조하는 것이다. 즉, 상기 킬레이팅 반응은 무기철을 킬레이트제로 하여 단백질-무기철 결합체(유기태 철분)를 제조하는 것이다. 여기서, 킬레이트란 중금속이온과 배위결합을 하는 배위기를 1분자 내에 복수로 갖는 배위자가 금속과 배위결합했을 때의 결합, 또는 그 결합에 의하여 생성된 복합체, 화학결합 형식의 일종을 말한다.
한편, 상기 무기철은 바람직하게 황산철(FeSO47H2O)인 것이 좋다. 상기 황산철은 철의 산화수가 2가인 황산철(Ⅱ)과 3가인 황산철(Ⅲ) 및 2가와 3가의 철을 모두 함유한 황산철(Ⅱ)철(Ⅲ) 중 선택되는 어느 하나일 수 있다.
<단계 (d): 상기 무기철이 첨가된 반응액을 반응조의 상부로 순환시킨 후, 반응액으로 낙하시켜 반응액 표면에 거품을 생성시키는 단계>
본 단계는 상기 무기철이 첨가된 반응액을 반응조의 상부로 순환시킨 후, 반응액으로 낙하시켜 반응액 표면에 거품을 생성시키며 유기태 철분 생성을 가속화하는 단계이다. 바람직하게는 상기 효모 박이 제거된 반응액에 무기철을 첨가한 후, 25~35℃에서 1~2시간 동안 펌프순환하면서 반응액을 낙하시키는 것이 좋다. 반응액을 순환시켜 반응액의 표면으로 낙하시키는 소위 '폼 프랙션(foam fraction)' 방법을 이용함으로써, 유기태 철분 생성 반응을 가속화시키는 것이다.
폼 프랙션(foam fraction)은 액체 반응액에서 소수성 물질을 선별하는 분리 방법으로서 일반적으로 유기물질을 분리하는데 효과적인 방법으로 알려져 있다. 본 발명에서는 기존에 시도되지 않았던 폼 프랙션 공정을 유기태 철분 제조 공정에 적용함으로써 유기태 철분의 함량을 더욱 증대시킨 것이다.
한편, 본 발명의 유기태 철분 제조방법은 바람직하게 상기 단계 (d) 후, 원심분리를 통해 반응액을 침전물과 상등액으로 분리한 후, 침전물 또는 상등액을 회수하는 단계 (e)를 더 포함할 수 있다. 본 단계 (e)는 상기 단계 (d) 후, 원심분리를 통해 반응액을 침전물과 상등액으로 분리한 후, 침전물 또는 상등액을 회수하는 단계이다. 바람직하게는 상기 단계 (d) 후, 12,000~15,000 rpm의 속도로 원심분리하여 반응액을 침전물과 상등액으로 분리한 후, 침전물 또는 상등액을 회수할 수 있다.
한편, 상기 단계 (e) 후, 더욱 바람직하게 회수한 침전물 또는 상등액으로부터 무기철을 제거하고 유기태 철분을 회수하는 단계 (f);를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 무기철의 제거는 한외여과막을 이용한 투석을 통해 수행되는 것이 좋다.
한편, 본 발명의 '유기태 철분'은 침전물로부터 회수된 유기태 철분(1차산물), 상등액으로부터 회수된 유기태 철분(2차산물) 및 '침전물과 상등액' 모두로부터 회수된 유기태 철분(혼합물)을 모두 의미한다.
본 발명에 의해 제조된 유기태 철분은 맥주 효모를 이용하기 때문에 부작용이 거의 없으며, 헴철보다 우수한 분말 용해도 및 철분 용해도를 가짐으로써 체내 흡수율이 우수하며, 무기철의 단점으로 지적되는 변비를 개선할 수 있다.
또한, 본 발명은 폼 프랙션(foam fraction) 공법을 이용하여 유기태 철분을 대량 생산함으로써 유기태 철분을 저렴한 가격으로 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 유기태 철분 제조방법을 모식화한 도이다.
도 2는 유기태 철분 투여에 따른 철분겹핍이 유도된 실험동물의 체중 변화를 확인한 결과 그래프이다. D0~D31은 철분결핍 유도 0~31일을 의미하고, T0~T7은 실험물질 투여 0~7일을 의미한다.
도 3은 유기태 철분 투여에 따른 철분결핍이 유도된 실험동물의 사료 섭취량 변화를 확인한 결과 그래프이다. D0~D31은 철분결핍 유도 0~31일을 의미하고, T0~T7은 실험물질 투여 0~7일을 의미한다.
도 4는 유기태 철분 투여에 따른 철분결핍이 유도된 실험동물의 장기무게 측정 및 대장 내 잔변수를 확인 결과 그래프이다. (A)는 간 무게, (B)는 비장 무게, (C)는 신장 무게, (D)는 잔변수에 대한 결과이다.
도 5는 유기태 철분 투여에 따른 철분결핍이 유도된 실험동물의 전혈을 분석 결과이다. (A)는 백혈구 세포수(White Blood Cell, WBC), (B)는 적혈구 세포수(Red Blood Cell, RBC), (C)는 헤모글로빈 수치(Hemoglobin, Hb), (D)는 적혈구 용적률(Hematocrit, HCT), (E)는 평균혈구용적(Mean Corpuscular Volume, MCV), (F)는 평균 혈구내 혈색소 양(Mean Corpuscular Hemoglobin, MCH), (G)는 평균 혈구내 혈색소 농도(mean corpuscular hemoglobin concentration, MCHC), (H)는 혈소판(platelet, PLT) 수치에 대한 결과이다.
도 6은 유기태 철분 투여에 따른 철분결핍이 유도된 실험동물의 혈장 내 철분을 분석한 결과 그래프이다. (A)는 혈청 철량, (B)는 총철결합능(TIBC), (C)는 불포화철결합능(UIBC)에 대한 결과이다.
도 7은 유기태 철분 투여에 따른 철분결핍이 유도된 실험동물의 전혈 내 철분의 함량을 분석한 결과 그래프이다.
도 8은 유기태 철분 투여에 따른 철분결핍이 유도된 실험동물의 간 및 비장 내 철분의 함량을 분석한 결과 그래프이다. (A)는 간, (B)는 비장에 대한 결과이다.
도 9는 유기태 철분 투여에 따른 철분결핍이 유도된 실험동물의 분변 내 철분의 함량을 분석한 결과 그래프이다.
이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
[실시예 1: 유기태 철분(1차산물)의 제조]
물 200 L에 맥주효모(한국효모) 20 kg, 델보라제(Delvolase, 역가 130,000 PC/g, 제조사 DSM food specialties) 500 ㎖를 첨가한 뒤, 50℃에서 9시간 동안 펌프순환을 통해 반응시켰다. 반응 후, 연속식 대용량 원심분리기를 이용하여 12,000 rpm의 속도로 원심분리하여 효모 박을 제거한 후, 상등액을 회수하였다. 회수된 반응액에 황산철(FeSO47H2O, 영진)을 4 kg을 첨가하고, 30℃도에서 1.5시간 동안 펌프순환을 수행하였다. 이때, 낙차를 이용한 폼 프랙션(foam fraction) 방법을 이용하여 유기태 철분 반응을 가속화시켰다.
폼 프랙션은 펌프 순환을 통해 반응액을 반응조 상부로 끌어올린 후, 반응액의 표면으로 떨어뜨리는 방법을 의미한다. 반응액의 표면으로 반응액을 떨어뜨려면, 표면에 거품이 발생되며, 반응이 지속됨에 따라 거품은 반응조 상부로 계속 성장하게 된다.
상기와 같은 폼 프랙션 펌프 순환을 통해 제조된 유기태 철분을 13,000 rpm에서 연속식 원심분리기를 이용하여 침전물과 상등액으로 분리한 후, 상등액은 별도 보관하고, 침전물을 회수하였다. 상기 회수한 침전물은 한외여과막(MWCO:1,000, 7Spectra/por Dialysis membrane)을 이용하여 24시간 동안 투석하여 무기철을 제거함으로써 유기태 철분(1차산물)을 회수하였다 (도 1 참조 요망).
도 1은 본 발명의 유기태 철분의 제조방법을 모식화한 도이다.
[실시예 2: 유기태 철분(2차산물)의 제조]
상기 실시예 1에서 유기태 철분 반응 후, 원심분리하여 분리된 상등액을 한외여과막(MWCO:1,000, 7Spectra/por Dialysis membrane)을 이용하여 24시간 동안 투석하여 무기철을 제거함으로써 유기태 철분(2차산물)을 회수하였다 (도 1 참조 요망).
[실시예 3: 유기태 철분(1차산물 및 2차산물의 혼합물)의 제조]
상기 실시예 1 및 실시예 2에서 회수된 1차산물 및 2차산물을 50:50의 비율로 혼합하여 유기태 철분(1차산물 및 2차산물의 혼합물)을 제조하였다 (도 1 참조 요망).
[비교예 1: 일반공정을 이용하여 유기태 철분(1차산물) 제조]
폼 프랙션(foam fraction)을 제외한 모든 공정은 상기 실시예 1과 동일하게 수행함으로써 소위 '일반공정'을 이용한 유기태 철분(1차산물)을 회수하였다.
[비교예 2: 일반공정을 이용하여 유기태 철분(2차산물) 제조]
폼 프랙션(foam fraction)을 제외한 모든 공정은 상기 실시예 2와 동일하게 수행함으로써, 소위 '일반공정'을 이용한 유기태 철분(2차산물)을 회수하였다.
[실험예 1: 침전물의 무게 및 철분함량 분석]
본 실험예에서는 폼 프랙션(foam fraction) 공정의 유무에 따라 제조된 유기태 철분의 무게 및 철분 함량을 분석하고자 하였다.
상기 실시예 1 내지 2 및 비교예 1 내지 2에서 회수한 각각의 유기태 철분의 무게를 잰 후, ICP(Inductively coupled plasma) 분석을 통해 철함량을 측정하였다. ICP 분석은 식품공전의 건식회화법을 이용하여 전처리한 후 분석에 사용하였다. 그 결과는 하기 표 1에 나타내었다.
1차산물(침전물) 2차산물(상등액)
일반공정으로 제조된 유기태 철분 무게(kg) 0.788 13.72
철분 함량(mg/g) 170.17 43.45
유기태 철분 함량(%) 94.38 8.19
폼 프랙션 공정으로 제조된 유기태 철분 무게(kg) 2.9 8.6
철분 함량(mg/g) 111.20 48.94
유기태 철분 함량(%) 100.0 5.7
실험결과, 폼 프랙션(foam fraction)을 이용하여 제조된 1차산물의 경우, 일반공정으로 제조된 유기태 철분보다 산물의 무게가 증가하고 유기태 철분 함량이 더 증가함을 확인할 수 있었다. 다만, g당 철분 함량을 감소하였으나, 전체 무게를 고려하면 폼 프랙션을 이용하여 제조된 1차산물이 더 많은 유기태 철분을 함유하고 있음을 알 수 있다.
폼 프랙션(foam fraction)을 이용하여 제조된 2차산물의 경우, 일반공정으로 제조된 유기태 철분보다 산물의 무게 및 유기태 철분 함량이 감소함을 확인할 수 있었다. 이는 폼 프랙션을 통해 2차산물의 일부가 1차산물로 회수되었기 때문이라고 판단되었다.
[실험예 2: 유기태 철분 용해도 분석]
본 실험예에서는 상기 실시예 1 및 2에서 제조된 유기태 철분의 용해도를 분석하고자 하였다.
헴철 ((주)네오크레마), 1차산물 (실시예 1) 및 2차산물 (실시예 2) 각각 50 mg에 10 mM 포스페이트 버퍼(Phosphate buffer, pH 7.0) 5 ㎖씩 넣고 30분간 둔 뒤, 5분간 1,500 rpm에서 원심분리하여 침전물과 상등액으로 분리하였다. 분리된 상등액과 침전물을 각각 90℃ 오븐에 넣고 건조한 뒤 무게를 측정하였다. 분말 용해도는 하기 수학식 1을 이용하여 산출하였고, 철분 용해도는 침전물 및 상등액을 건조회화법으로 전처리한 후, ICP를 이용하여 철분 함량을 분석하였다. 그 결과는 하기 표 2에 나타내었다.
Figure 112014081519744-pat00001
분말 용해도(%) 철분 용해도
헴철 21.8±0.63 1.8±0.57
1차산물 32.6±1.27 14.1±2.63
2차산물 84.4±0.41 38.8±3.02
분말 용해도 실험결과, 본 발명의 1차산물 및 2차산물이 흡수력이 뛰어나다고 알려진 헴철보다 더욱 우수한 분말 용해도 및 철분 용해도를 나타냄을 확인할 수 있었다.
상기와 같은 결과로부터, 폼 프랙션 공정을 이용하여 제조된 유기태 철분은 체내 흡수율이 높을 것으로 판단되었다.
[실험예 3: 유기태 철분 투여에 따른 철분결핍이 유도된 실험동물의 체중 변화 및 사료 섭취량 변화 확인]
본 실험예에서는 유기태 철분 투여에 따른 철분결핍이 유도된 실험동물의 체중 변화량 및 사료 섭취량 변화를 확인하고자 하였다.
4주령 암컷 랫드(Wistar rat, 새론바이오(주)) 42마리를 1주일간 순화시킨 후 실험에 사용하였다. 순화된 랫드의 체중을 측정한 후, 군분리 하고 5주(31일)간 철분결핍 사료(Harlan TD.80396)와 탈이온수를 급여하여 철분결핍을 유도하였다. 5주 후, 빈혈을 확인 한 뒤 하기 표 3과 같이 사료, 식수 및 실험물질을 1주 동안 투여하였다.
한편, 실험동물은 자동환경조절장치로 온도 22±3℃, 상대습도 50±10%, 조도 200~300 Lux, 명암주기 12시간 점등, 12시간 소등, 조명시간 8시~20시로 조절하여 사육하였다.
또한, 실험물질의 투여는 비클(vehicle)로 1×PBS를 사용하였으며, 실험물질 투여군은 대조군(일반식이군), 철분결핍군, 헴철 투여군, 1차산물 투여군, 2차산물 투여군, 혼합물(1차 및 2차산물 혼합) 투여군으로 구분하여 실험물질을 경구투여 하였다. 대조군과 철분결핍군은 비클(vehicle)만 투여하였고, 다른 투여군은 철분이 0.8 mg에 해당하는 양을 직전에 비클(vehicle) 1 ㎖에 분산시켜 1주일간 투여하였고, 투여 물질은 투여 직전에 신선하게 만들어 투여하였다. 투여물질의 철분 함량과 투여량은 아래의 표 3과 같다. 또한, 체중 측정은 오전 9시~10시 사이에 측정하였고, 희생 전 24시간동안 절식하였다.
한편, 본 실험을 포함한 모든 실험예에서의 결과값은 SAS system for Windows Ver. 9.2 (SAS Institute, Cary, NC)을 이용하여 0.05% 오차수준에서 던컨 다중분석을 통하여 유의성을 분석하였다.
실험군 사료 식수 투여물질 Fe함량 (%) Fe 0.8mg
환산 무게 (mg)		 비고
일반식이 일반사료
(AIN-76A)		 수돗물 vehicle - - 1 ㎖
철분결핍 철분결핍사료 탈이온수 vehicle - -
헴철 투여 헴철 2.2 36.36
1차산물 투여 1차산물 11.1 7.21
2차산물 투여 2차산물 4.894 16.35
혼합물 투여 혼합물 6.793 11.78 1차산물 50%
2차산물 50%
체중 변화 측정결과, 유기태 철분 투여군(1차산물, 2차산물, 혼합물)은 철분결핍군 및 헴철 투여군보다 체중이 증가함을 확인할 수 있었다 (도 2). 또한, 사료 섭취량 변화 측정결과, 철분결핍 유도 초기에 증가하다가 철분결핍 유도 17일부터 비슷한 수준의 사료 섭취량을 보이는 것으로 나타났다 (도 3).
도 2는 유기태 철분 투여에 따른 철분겹핍이 유도된 실험동물의 체중 변화를 확인한 결과 그래프이고, 도 3은 유기태 철분 투여에 따른 철분결핍이 유도된 실험동물의 사료 섭취량 변화를 확인한 결과 그래프이다. D0~D31은 철분결핍 유도 0~31일을 의미하고, T0~T7은 실험물질 투여 0~7일을 의미한다.
[실험예 4: 유기태 철분 투여에 따른 철분결핍이 유도된 실험동물의 장기무게 측정 및 대장 내 잔변수 확인]
본 실험예에서는 유기태 철분 투여에 따른 철분결핍이 유도된 실험동물의 장기무게 및 대장 내 잔변수를 측정하고자 하였다.
상기 실험예 3 및 표 3과 같이 준비된 각각의 실험동물을 희생시킨 후, 간(Liver), 비장(Spleen) 및 신장(Kidney)을 적출한 후, 표준분동으로 교정한 전자저울로 각각의 무게를 측정하고 대장내 잔변 수를 측정하여 시험군 별로 평균과 표준편차를 구하였다.
실험결과, 간 무게는 헴철 투여군에서 가장 감소하였고, 비장의 무게는 철분결핍군과 헴철 투여군에서 증가하였으며, 신장의 무게는 철분결핍군이 가장 감소하였다 (도 4(A) 내지 (C)).
또한, 대장 내 잔변수 측정결과, 실험물질 투여군 중 혼합물 투여군이 잔변수가 가장 많이 감소하였음을 확인할 수 있었다. 상기와 같이 대장 내 잔변수가 감소하여 본 발명의 유기태 철분이 변비 개선효과가 있음을 확인할 수 있었다 (도 4(D)).
도 4는 유기태 철분 투여에 따른 철분결핍이 유도된 실험동물의 장기무게 측정 및 대장 내 잔변수를 확인 결과 그래프이다. (A)는 간 무게, (B)는 비장 무게, (C)는 신장 무게, (D)는 잔변수에 대한 결과이다.
[ 실험예 5: 유기태 철분 투여에 따른 철분결핍이 유도된 실험동물의 전혈 분석]
본 실험예에서는 유기태 철분 투여에 따른 철분결핍이 유도된 실험동물의 전혈을 분석하고자 하였다.
상기 실험예 3 및 표 3과 같이 준비된 각 실험동물의 심장에서 체혈한 후, 3 ㎖는 EDTA 튜브(tube)에 담아 전혈 분석에 사용하였다. EDTA 튜브(tube)에 넣은 혈액을 얼음에 보관하여 혈액 체취한 당일 Oxford Science 사 (미국)의 FORCYTE를 사용하여 전혈의 백혈구 세포수(White Blood Cell, WBC), 적혈구 세포수(Red Blood Cell, RBC), 헤모글로빈 수치(Hemoglobin, Hb), 적혈구 용적률(Hematocrit, HCT), 평균혈구용적(Mean Corpuscular Volume, MCV, 단일 적혈구의 크기 혹은 적혈구의 평균 용적을 의미), 평균 혈구내 혈색소 양(Mean Corpuscular Hemoglobin, MCH, 한 개의 적혈구 안에 들어 있는 평균 헤모글로빈 수치를 의미), 평균 혈구내 혈색소 농도(mean corpuscular hemoglobin concentration, MCHC, 한 개의 적혈구 안에 들어있는 헤모글로빈의 백분율 또는 헤모글로빈의 평균 농축도를 의미) 및 혈소판(platelet, PLT) 수치를 분석하였다.
백혈구 세포수 분석 결과, 모든 실험군에서 유의적인 차이를 보이지 않았다 (도 5(A)).
적혈구 세포수 분석 결과, 헴철 투여군, 1차산물 투여군, 2차산물 투여군 및 혼합물 투여군의 경우 일반식이군과 철분결핍군 대비 유의적인 상승을 나타내었다 (도 5(B)).
헤모글로빈 수치 분석 결과, 철분결핍군에서 큰 감소를 나타내어 빈혈이 유도 되었음을 확인할 수 있었으며, 헴철 투여군에서 약간의 회복을 보였고, 1차산물 투여군, 2차산물 투여군 및 혼합물 투여군에서는 정상수준으로 회복됨을 확인할 수 있었다 (도 5(C)).
적혈구 용적률 분석 결과, 철분결핍군에서 큰 감소를 나타내었으며, 헴철 투여군에서 약간의 회복을 보였고, 1차산물 투여군, 2차산물 투여군 및 혼합물 투여군에서는 정상수준으로 회복됨을 확인할 수 있었다 (도 5(D)).
평균혈구용적 분석 결과, 철분결핍군과 헴철 투여군에서 크게 감소하여 철분결핍성 빈혈이 나타난 것을 확인할 수 있었으며, 1차산물 투여군, 2차산물 투여군 및 혼합물 투여군에서는 정상수준까지는 아니지만 어느 정도 회복됨을 확인할 수 있었다 (도 5(E)).
평균 혈구내 혈색소 양 분석 결과, 철분결핍군과 헴철 투여군에서 크게 감소하였고, 1차산물 투여군, 2차산물 투여군 및 혼합물 투여군에서는 어느정도 회복됨을 확인할 수 있었다 (도 5(F)).
평균 혈구내 혈색소 농도 분석 결과, 모든 실험군에서 유의적인 차이를 보이지 않았다 (도 5(G)).
혈소판 수치 분석 결과, 일반식이군에 비하여 나머지 모든 처리군에서 수치가 상승한 것으로 나타났는데, 이는 철분결핍사료 식이에 따른 빈혈로 인한 일시적인 반응성으로 혈소판이 증가한 것으로 판단되었다 (도 5(H)).
도 5는 유기태 철분 투여에 따른 철분결핍이 유도된 실험동물의 전혈을 분석 결과이다. (A)는 백혈구 세포수(White Blood Cell, WBC), (B)는 적혈구 세포수(Red Blood Cell, RBC), (C)는 헤모글로빈 수치(Hemoglobin, Hb), (D)는 적혈구 용적률(Hematocrit, HCT), (E)는 평균혈구용적(Mean Corpuscular Volume, MCV), (F)는 평균 혈구내 혈색소 양(Mean Corpuscular Hemoglobin, MCH), (G)는 평균 혈구내 혈색소 농도(mean corpuscular hemoglobin concentration, MCHC), (H)는 혈소판(platelet, PLT) 수치에 대한 결과이다.
[실험예 6: 유기태 철분 투여에 따른 철분결핍이 유도된 실험동물의 혈장 내 철분 분석]
본 실험예에서는 유기태 철분 투여에 따른 철분결핍이 유도된 실험동물의 혈장 내 철분을 분석하고자 하였다.
상기 실험예 3 및 표 3과 같이 준비된 각 실험동물의 심장에서 체혈한 후, 혈액을 일반 튜브(tube)에 넣고 3000 rpm으로 20분간 원심분리하여 혈장을 분리한 후, -80℃에서 보관한 뒤 혈장 내 철분 및 생리 지표(총철결합능, 불포화철결합능) 분석에 사용하였다.
혈청 철분과 총철결합능(Total iron binding capacity, TIBC)은 아산제약의 총철결합능 측정용 시약 (NPS법)을 이용하여 590 nm에서 흡광도를 측정하여 계산하였고, 불포화철결합능(Unsaturated iron binding capacity, UIBC)은 하기 수학식 2를 이용하여 계산하였다.
Figure 112014081519744-pat00002
혈청 철량 분석 결과, 일반사료 식이군 대비 철분결핍군과 헴철 투여군에서 철량이 200 ㎍/dl 정도 감소하였으며, 1차산물 투여군, 2차산물 투여군 및 혼합물 투여군은 일반사료 식이군과 비슷한 수준으로 철량이 회복되는 것을 확인할 수 있었다 (도 6(A)).
총철결합능(TIBC) 및 불포화철결합능(UIBC) 분석 결과, 일반사료 식이군 대비 철분결핍군과 헴철 투여군에서 유의적으로 증가하였고, 1차산물 투여군, 2차산물 투여군 및 혼합물 투여군에서는 어느정도 정상수준에 가깝게 빈혈이 회복되는 것을 확인할 수 있었다 (도 6(B) 및 (C)).
도 6은 유기태 철분 투여에 따른 철분결핍이 유도된 실험동물의 혈장 내 철분을 분석한 결과 그래프이다. (A)는 혈청 철량, (B)는 총철결합능(TIBC), (C)는 불포화철결합능(UIBC)에 대한 결과이다.
[ 실험예 7: 유기태 철분 투여에 따른 철분결핍이 유도된 실험동물의 전혈 , 분변, 간 및 비장 내 철분 함량 분석]
본 실험예에서는 유기태 철분 투여에 따른 철분결핍이 유도된 실험동물의 전혈, 분변, 간 및 비장 내 철분 함량을 분석하고자 하였다.
상기 실험예 3 및 표 3과 같이 준비된 각 실험동물의 혈액, 분변, 간 및 비장을 채취한 후, 식품공전의 건식회화법으로 전처리 한 뒤 ICP를 이용하여 철분 함량을 분석하였다.
전혈 내 철분 함량 분석 결과, 1차산물 투여군, 2차산물 투여군 및 혼합물 투여군 모두가 헴철 투여군보다 유의적인 철분 함량 증가를 나타냄을 확인할 수 있었다 (도 7).
간 및 비장 내 철분 함량 분석 결과, 1차산물 투여군, 2차산물 투여군 및 혼합물 투여군 모두가 헴철 투여군보다 유의적인 철분 함량 증가를 나타냄을 확인할 수 있었다 (도 8).
분변 내 철분 함량 분석 결과, 헴철 투여군에서 가장 높은 철분 함량을 나타내었고, 1차산물 투여군, 2차산물 투여군 및 혼합물 투여군은 헴철 투여군 보다 낮은 철분 함량을 나타냄을 확인할 수 있었다 (도 9).
상기와 같은 결과로부터, 폼 프랙션 공정을 이용하여 제조된 유기태 철분은 체내 흡수율이 우수함을 알 수 있었다.
도 7은 유기태 철분 투여에 따른 철분결핍이 유도된 실험동물의 전혈 내 철분의 함량을 분석한 결과 그래프이고, 도 8은 유기태 철분 투여에 따른 철분결핍이 유도된 실험동물의 간 및 비장내 철분의 함량을 분석한 결과 그래프이며 [(A)는 간, (B)는 비장에 대한 결과이다], 도 9는 유기태 철분 투여에 따른 철분결핍이 유도된 실험동물의 분변 내 철분의 함량을 분석한 결과 그래프이다.

Claims (6)

  1. 반응조에 효모 및 단백질분해효소를 넣고 효소반응을 수행함으로써 반응액을 제조하는 단계 (a);
    상기 반응액으로부터 효모 박(粕)을 제거하는 단계 (b);
    상기 효모 박이 제거된 반응액에 무기철(inorganic iron; Fe)을 첨가하는 단계 (c);
    상기 무기철이 첨가된 반응액을 반응조의 상부로 순환시킨 후, 반응액으로 낙하시켜 반응액 표면에 거품을 생성시키는 단계 (d); 및
    원심분리를 통해 반응액을 침전물과 상등액으로 분리한 후, 침전물을 회수하는 단계 (e);를 포함하는 것을 특징으로 하는 유기태 철분의 제조방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (e) 후,
    회수한 침전물로부터 무기철을 제거하고 유기태 철분을 회수하는 단계 (f);를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 유기태 철분의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 효모는,
    맥주효모인 것을 특징으로 하는 유기태 철분의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 효모 박(粕)의 제거는,
    원심분리를 통해 수행하는 것을 특징으로 하는 유기태 철분의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 무기철은,
    황산철(FeSO47H2O)인 것을 특징으로 하는 유기태 철분의 제조방법.
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