KR101626217B1

KR101626217B1 - 타우로우루소데옥시콜릭산을 유효성분으로 함유하는 조혈모세포 증식용 조성물

Info

Publication number: KR101626217B1
Application number: KR1020140157151A
Authority: KR
Inventors: 박상규; 홍신희
Original assignee: 아주대학교산학협력단
Priority date: 2014-11-12
Filing date: 2014-11-12
Publication date: 2016-06-01
Also published as: KR20160057013A

Abstract

본 발명은 타우로우루소옥시콜릭산(Tauroursodeoxycholic acid; TUDCA)을 유효성분으로 함유하는 조혈모세포 증식용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 타우로우루소옥시콜릭산(TUDCA)을 처리한 조혈모세포군의 경우, 타우로우루소옥시콜릭산(TUDCA)이 처리되지 않은 조혈모세포군 보다 4배 이상 조혈모세포를 증식시키는 효과를 나타내었으며, 세포수 유지에도 효과적인 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명의 조혈모세포 증식용 조성물을 이용하면 적혈구 전구 세포의 증식을 향상시켜 최종산물인 적혈구(red blood cell; RBC)의 확보율을 높일 수 있으며, 이를 인공혈액 조성물로 사용하여 혈액 공급 문제를 해결할 수 있다.

Description

타우로우루소데옥시콜릭산을 유효성분으로 함유하는 조혈모세포 증식용 조성물{Composition for hematopoieitic stem cell proliferation comprising tauroursodeoxycholic acid}

본 발명은 타우로우루소데옥시콜릭산(Tauroursodeoxycholic acid; TUDCA)을 포함하는 조혈모세포 증식용 조성물에 관한 것이다.

혈액은 조직에 영양소를 운반하고 배설을 위해 조직으로부터 노폐물을 제거하는 기능을 한다. 이러한 혈액은 적혈구(RBCs 또는 erythrocytes), 백혈구(WBCs) 및 혈소판이 부유되어 있는 혈장으로 구성되어 있다.

그 중 적혈구(red blood cell 또는 erythrocyte)는 척추동물의 순환계(circulatory system)에서 산소 전달(oxygen transport)을 담당한다. 적혈구는 폐 내의 상대적 높은 산소 분압(partial pressure of oxygen)(pO₂)으로 산소를 결합하고 산소를 상대적으로 낮은 pO2를 갖는 신체 부위로 전달하는 단백질인 헤모글로빈(hemoglobin)을 고농도로 포함한다.

최근에는 기증된 적혈구의 부족 문제가 심화 됨에 따라 조혈모세포로부터 적혈구의 인 비트로 생산이 매우 중요하게 되었다. 그러나, 후기 단계의 적아 세포의 높은 증가 배수에도 불구하고 최종 성숙기간 동안 적혈구의 낮은 생존율로 인하여 조혈모세포로부터 성숙한 적혈구들의 전체 회수율은 높지 않다. 이의 원인으로 후기 단계의 적혈구는 증식하지 않아 성숙한 세포의 수가 점차 감소하기 때문에 세포의 증가 배수는 17일부터 빠르게 감소하기 때문으로 보고되어 졌다.

최근에는 인 비트로에서 조혈줄기세포 및 인간 배아줄기세포로부터 적혈구 생산 기술에 대한 연구가 진행되었으며, 기질세포와 함께 공동배양 방법으로 이용하여 적혈구를 획득하였다. 그러나, 이러한 방법들은 본질적으로 임상에 적용하기에 여러 가지 문제점들을 나타내었는데, 그 이유로 2×10¹² 이상의 수준으로 임상 등급의 적혈구들을 수득하기 위해서는 매우 많은 기질 세포가 필요하며, 이전의 연구들에서 이용된 기질 세포는 배지 또는 배양 중에 소태아혈청으로부터 이종 병원체에 의한 오염 위험성이 있다. 따라서, 상기 문제점을 해결할 수 있는 효과적인 인공혈액 개발이 필요한 실정이다.

한국공개특허 제10-2010-0081678호

앞서 전술한 바와 같이 인 비트로에서 조혈모세포의 증식 및 분화 기술이 어려운 문제를 해결하기 위해, 본 발명은 조혈모세포인 CD34+ 세포를 타우로우루소데옥시콜릭산(Tauroursodeoxycholic acid; TUDCA)을 유효성분으로 함유하는 증식용 조성물에 배양시켜 인 비트로 조건에서 조혈모세포를 효과적으로 증식시키고 이를 인공혈액 조성물로 사용함으로써 부족한 혈액 공급 문제를 해결하고자 한다.

본 발명은 타우로우루소데옥시콜릭산(Tauroursodeoxycholic acid; TUDCA)을 유효성분으로 함유하는 조혈모세포 증식용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 본 발명의 조혈모세포 증식용 조성물로 분화된 적혈구를 유효성분으로 함유하는 인공혈액 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 타우로우루소데옥시콜릭산(TUDCA)을 처리한 조혈모세포군의 경우, 타우로우루소데옥시콜릭산(TUDCA)이 처리되지 않은 조혈모세포군 보다 4배 이상 조혈모세포를 증식시키는 효과를 나타내었으며, 세포수 유지에도 탁월한 효과를 나타내는 것이 확인되었다.

따라서, 본 발명의 조혈모세포 증식용 조성물을 이용하면 적혈구 전구 세포의 증식을 향상시켜 최종산물인 적혈구(red blood cell; RBC)의 확보율을 높일 수 있으며, 이를 인공혈액 조성물로 사용하여 혈액 공급 문제 해결에 이용할 수 있다.

도 1은 골수액으로부터 분리한 CD34+ 세포에 타우로우루소데옥시콜릭산(Tauroursodeoxycholic acid; TUDCA)을 0, 50 및 100 μM로 처리한 후 3일 마다 세포 증식율을 확인한 그래프이다.

본 발명은 타우로우루소데옥시콜릭산(Tauroursodeoxycholic acid; TUDCA)을 유효성분으로 함유하는 조혈모세포 분화용 조성물을 제공한다.

본 발명의 조혈모세포는 CD34+ 세포일 수 있다.

조혈모세포는 StemPro® 및 IMDM와 같은 배지에서 배양될 수 있으나, 본 발명은 조혈모세포 증진을 촉진시키기 위해 상기 배지에 타우로우루소데옥시콜릭산(TUDCA)을 10 내지 150 μM 범위로 포함할 수 있으며, 보다 상세하게는, 타우로우루소데옥시콜릭산(TUDCA) 10 내지 150 μM, 히드로코르티손(Hydrocortisone; HC) 0.1 내지 10 μM, SCF(stem cell factor) 10 내지 150 ng/ml, IL-3 1 내지 20 ng/ml, 에리트로포이에틴(Erythropoetin; EPO) 0.5 내지 10 IU/ml 및 F-68(poloxamer 188; pluronic F68) 50 μg/ml를 포함할 수 있으며, 보다 바람직하게는 Ⅰ단계(배양 0-7일)에서는 타우로우루소데옥시콜릭산(TUDCA) 50 내지 100 μM, 히드로코르티손(Hydrocortisone; HC) 1 μM, SCF 100 ng/ml, IL-3 10 ng/ml 및 에리트로포이에틴(Erythropoetin; EPO) 6 IU/ml가 포함된 배지에서 배양될 수 있으며, Ⅱ 단계(배양 7-13일)에서는 타우로우루소데옥시콜릭산(TUDCA) 50 내지 100 μM, SCF 50 ng/ml, IL-3 10 ng/ml 및 에리트로포이에틴(Erythropoetin; EPO) 3 IU/ml가 포함된 배지에서 배양될 수 있으며, Ⅲ 단계(배양 13-17일)에서는 타우로우루소데옥시콜릭산(TUDCA) 50 내지 100 μM, SCF 50 ng/ml, 에리트로포이에틴(Erythropoetin; EPO) 2 IU/ml 및 F-68(poloxamer 188; pluronic F68) 50 μg/ml를 포함하는 배지에서 배양될 수 있으며, Ⅳ 단계(배양 17-21일)에서는 타우로우루소데옥시콜릭산(TUDCA) 50 내지 100 μM 및 F-68(poloxamer 188; pluronic F68) 50 μg/ml를 포함하는 배지에서 배양될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 타우로우루소데옥시콜릭산(TUDCA)은 담즙산의 일종으로 콜레스테롤을 전구체로 하여 간으로부터 생성된다. 타우로우루소데옥시콜릭산(TUDCA)은 당뇨 쥐의 췌도 세포를 재생시키는 것으로 보고된 바 있으며, 심근경색에 의해 유발되는 심근세포의 사멸을 억제함으로써 심근세포를 보호하는 것으로 알려져 있으나, 타우로우루소데옥시콜릭산(TUDCA)이 조혈모세포를 적혈구로 분화시키는데 효과적이라는 보고는 아직까지 보고된 바 없다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 도 1과 같이 골수액으로부터 분리된 CD34+ 세포에 TUDCA를 처리한 CD34+ 세포군에서 TUDCA가 처리되지 않은 CD34+ 세포군보다 4배 이상 증식하였으며, 세포 수 유지에도 탁월한 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

또한 본 발명은 상기 조성물 중 어느 한로 분화된 조혈모세포를 유효성분으로 함유하는 인공혈액 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 참고예 > 물질

DPBS(DPBS/Modified, Thermo, SH30028.02)를 구입하여 세척완충액[washing buffer; DPBS + 0.5% BSA (Albumin solution form bovine serum, Sigma, A9576) + 2mM EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate, Sigma, E5134; pH7.2)]을 제조하였다.

MACS CD34+ microbead kit(MACS Separation Columns, MACS, 130-042-401), 100um 메쉬(mesh)(Cell strainer 100um Nylon, BD Falcon, 352360), 1.077 피콜 용액(ficoll solution; Ficoll-paque plus, GE Healthcare, 17-1440-03), StemPro®-34 SFM(1x) 배지(StemProSFM (1X) Liquid, Gibco, 10639-011), 히드로코르티손(Hydrocortisone(HC); Sigma, H0888), 사이토카인인 SCF(stem cell factor; Human SCF, Pepro Tech INC, 300-07), IL-3(Human IL-3, Pepro Tech INC, 200-03), 에리트로포이에틴(Erythropoetin(EPO); R&D systems, 287-TC), 타우로우루소데옥시콜릭산(Tauroursodeoxycholic acid(TUDCA) Sodium Salt, Calbiochem, 580-549) 및 F-68(poloxamer 188; pluronic F68, Sigma, P1300)을 각각 구입하여 사용하였다.

< 실시예 1> 조혈 모세포 증식 방법

골수액 21 ㎖에 세척완충액[washing buffer; DPBS + 0.5% human albumin + 2mM EDTA (pH7.2)] 3 ㎖을 첨가하여 희석시키고, 이를 100 μM 메쉬(mesh)로 여과하여 혈병을 제거하였다.

50 ㎖ 새 튜브에 1.077 피콜(ficoll) 용액 12 ㎖를 넣은 후, 상기 여과된 골수액을 느린 속도로 적재시킨 후 20 ℃, 445×g에서 35분간 원심분리한 후, 혈청부분을 제거하고 백혈구연층(buffy coat)을 모아 새 튜브로 옮겨담았다. 상기 튜브에 세척완충액(washing buffer)를 첨가하고 20 ℃, 300×g에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 제거하고, 상기 과정을 1회 반복하였다.

상기 세척 과정 후, 세포계수(cell counting)를 수행하여 컬럼 용적에 적합한 세포 수를 확인하고, 세척완충액 300 ㎕를 세포에 첨가하여 재부유시킨 후 FcR blocking 시약(제조사)을 100 ㎕ 첨가하고, 2분간 반응시킨 다음, CD34+ 마이크로비드(microbead)를 넣고 잘 혼합시킨 후, 4℃에서 30분간 반응시켰다.

그 후, 세척완충액을 첨가한 후 300×g에서 10분간 원심분리하고 500 ㎕ 세척완충액으로 약하게 재부유시켰다.

컬럼을 자석판(magnetic board)에 고정시킨 후, 세척완충액 5 ㎕로 적셔 준비한 후, 재부유시킨 세포를 컬럼에 흘려 주었다. 그 후 세척완충액 3 ㎖씩 3번 반복하여 컬럼에 흘려보내어 결합하지 않은 세포들을 제거하였다.

자석판에서 컬럼을 분리한 후, 컬럼에 결합한 CD34+ 세포를 분리하였다.

분리된 세포에 StemPro® CD34+ Cell media를 10 ㎖ 첨가한 후, 세포 수를 측정하고, 하기 표 1과 같은 조성으로 세포를 배양하였으며, 3일마다 배지를 교체하였다. 배지 교체시 0, 50 및 100 μM TUDCA를 첨가하고 세포 증가 수준을 확인하였다.

단계( Phase )	시간( Time )	세포수( cell )	배지조성( Media )
Ⅰ	0-7일	1×10⁵ cell/well (24 well)	0, 50, 100 μM TUDCA 1 μM HC 100 ng/㎖ SCF 10 ng/㎖ IL-3 6 IU/㎖ EPO
Ⅱ	7-13일	5×10⁵ cell/well (6 well)	0, 50, 100 μM TUDCA 50 ng/㎖ SCF 10 ng/㎖ IL-3 3 IU/㎖ EPO
Ⅲ	13-17일	1×10⁶ cell/㎖	0, 50, 100 μM TUDCA 50 ng/㎖ SCF 2 IU/㎖ EPO 50 μg/㎖ F-68
Ⅳ	17-21일	1×10⁶ cell/㎖	0, 50, 100 μM TUDCA 50 μg/㎖ F-68

< 실시예 2> 조혈 모세포 증식 확인

골수액으로부터 분리한 CD34+ 세포를 적혈구로 분화시킬 때, 적혈구 세포의 조혈 모세포 증식에 TUDCA가 어떤 영향을 나타내는지 확인하였다.

상기 실시예 1에서 전술한 바와 같이, 골수액으로부터 분리한 CD34+ 세포 배양시 3일마다 배지를 교체하였으며, 상기 표 1과 같이 각 단계별로 배지 조성물인 히드로코르티손(Hydrocortisone; HC), SCF, IL-3, EPO의 양을 조절하며 CD34+에서 적혈구로의 분화를 유도하고, 그와 동시에 0, 50 및 100 μM TUDCA를 배지에 처리하였다.

그 후 각 단계의 세포들을 모아 원심분리한 후, 상등액을 제거하였다.

세포에 1 ㎖의 배양액을 첨가하여 현탁시킨 후, 트립토판 블루(Trypan Blue solution, SIGMA, T8154)10 ㎕를 첨가하여 혼합시키고, 그 혼합물을 hemocytometer를 이용하여 3번씩 반복하여 세포 수를 측정하였다.

그 결과, 도 1과 같이 TUDCA를 처리하지 않은 세포군의 단계 Ⅰ에서 약 50% 가량의 세포 증식이 일어났으며, 단계 Ⅱ 및 Ⅲ으로 진행될수록 세포 증식이 점차 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 반면, 100 μM TUDCA를 처리한 세포군에서는 단계 Ⅰ에서 약 150% 정도의 급격한 세포 증식이 확인되었으며, 단계 Ⅱ에서 정체적인 경향을 보이다가 단계 Ⅲ에서는 세포 수가 감소하는 것이 확인되었으나, 이는 단계 Ⅲ 및 Ⅳ에서는 적혈구 세포의 탈핵이 일어나는 단계로 세포 수의 감소가 예상될 수 있다.

상기 결과로부터 TUDCA를 처리한 세포군에서 TUDCA가 처리되지 않은 세포군보다 4배 이상 조혈모세포를 증식시키는 탁월한 효과를 나타내었으며, 세포수 유지에도 효과적인 것을 확인할 수 있었다. 따라서, TUDCA를 이용하면 적혈구 전구 세포의 증식을 향상시켜 최종산물인 적혈구(red blood cell; RBC)의 확보율을 높일 수 있는 방법으로 사용될 수 있다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

타우로우루소데옥시콜릭산(Tauroursodeoxycholic acid; TUDCA)을 10 내지 150 μM, 히드로코르티손(Hydrocortisone; HC) 0.1 내지 10 μM, SCF(stem cell factor) 10 내지 150 ng/ml, IL-3 1 내지 20 ng/ml, 에리트로포이에틴(Erythropoetin; EPO) 0.5 내지 10 IU/ml 및 F-68(poloxamer 188; pluronic F68) 50 μg/ml을 유효성분으로 함유하는 CD34+ 조혈모세포 증식용 배지조성물.
골수액으로부터 분리된 CD34+ 조혈모세포를 타우로우루소데옥시콜릭산(Tauroursodeoxycholic acid; TUDCA) 100 μM, 히드로코르티손(Hydrocortisone; HC) 1 μM, SCF(stem cell factor) 100 ng/ml, IL-3 10 ng/ml 및 에리트로포이에틴(Erythropoetin; EPO) 6 IU/ml이 포함된 배지 10 ml로 세포배양 시작일부터 7일까지 배양시키는 단계(제1단계);
상기 제1단계의 배양된 CD34+ 조혈모세포를 타우로우루소데옥시콜릭산(Tauroursodeoxycholic acid; TUDCA) 100 μM, SCF(stem cell factor) 50 ng/ml, IL-3 10 ng/ml 및 에리트로포이에틴(Erythropoetin; EPO) 3 IU/ml이 포함된 배지 10 ml로 세포배양 7일부터 13일까지 배양시키는 단계(제2단계);
상기 제2단계의 배양된 CD34+ 조혈모세포를 타우로우루소데옥시콜릭산(Tauroursodeoxycholic acid; TUDCA) 100 μM, SCF(stem cell factor) 50 ng/ml, 에리트로포이에틴(Erythropoetin; EPO) 2 IU/ml 및 F-68(poloxamer 188; pluronic F68) 50 μg/ml이 포함된 배지 10 ml로 세포배양 13일부터 17일까지 배양시키는 단계(제3단계); 및
상기 제3단계의 배양된 CD34+ 조혈모세포를 타우로우루소데옥시콜릭산(Tauroursodeoxycholic acid; TUDCA) 100 μM 및 및 F-68(poloxamer 188; pluronic F68) 50 μg/ml이 포함된 배지 10 ml로 세포배양 17일부터 21일까지 배양시키는 단계(제4단계)를 포함하는 것을 특징으로 하는 CD34+ 조혈모세포 증식방법.
삭제
삭제
삭제