KR20200025168A - 조혈모세포의 분화 및 자가증식 조절기능을 갖는 ｐｄｃｄ２의 용도 - Google Patents

조혈모세포의 분화 및 자가증식 조절기능을 갖는 ｐｄｃｄ２의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 조혈모세포의 분화 및 자가증식 조절기능을 갖는 PDCD2의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 PDCD2(programmed cell death 2) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 조혈모세포의 분화 또는 자가증식 촉진용 조성물, 혈액 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 분화능 또는 자가증식능이 증가된 조혈모세포의 생산방법, 상기 방법으로 제조된 조혈모세포 및 조혈모세포를 포함하는 혈액 관련 질환의 예방 또는 치료용 세포치료제에 관한 것이며, 또한 본 발명은 PDCD2(programmed cell death 2) 유전자 또는 PDCD2 단백질을 포함하는 세포에 후보물질을 처리하는 단계; 및 PDCD 유전자의 발현양 또는 PDCD 단백질의 양 또는 PDCD 단백질의 활성을 측정하는 단계를 포함하는, 혈액 관련 질환의 치료제 스크리닝 방법에 관한 것이다.

Description

조혈모세포의 분화 및 자가증식 조절기능을 갖는 ＰＤＣＤ２의 용도{Use of PDCD2 having regulation of differentiation and self-renewal of hematopoietic stem cells}
본 발명은 조혈모세포의 분화 및 자가증식 조절기능을 갖는 PDCD2의 용도에 관한 것이다.
조혈작용(hematopoiesis)은 매우 특수한 기능과 한정된 수명이 있는 수많은 성숙 혈액세포들이 생성되어 계속적으로 공급되는 일련의 발생과정이다. 조혈계는 발생능력(developmental capacities)의 체계에 따라 정렬될 수 있는 조혈전구세포(hematopoietic precursor cell)들의 매우 복잡한 조직체계로 구성되어 있다. 모든 계통의 성숙 혈액세포들의 근원지는 골수인데 이 골수조직은 여러 단계의 성숙 단계에 있는 세포들을 포함하고 있으며, 골수에서 생성된 혈액세포들은 일정 시간이 지나면 말초조직에서 파괴되고, 이러한 과정은 동물의 일생을 통하여 계속적으로 반복해서 일어나게 된다.
조혈작용은 여러 가지 계통의 세포로 증식, 분화할 수 있는 조혈모세포군(Hematopoietic Stem Cells: HSCs)에 의하여 유지되고 있다. 초기에 조혈모세포는 다능성 조혈모세포(Pluripotent Hematopoietic Stem Cells: PHSCs)라고 하는데, 아직까지도 잘 밝혀져 있지 않은 여러 과정을 거쳐서 매우 다양한 성숙 혈액세포들로 분화할 수 있는 조혈전구세포들을 만들어 내게 되고, 이 조혈전구세포들은 그 다음 단계의 더 분화된 세포들을 생산하게 된다.
이러한 조혈모세포는 두 가지 중요한 특징이 있는데, 자신과 똑같은 세포를 만들어낼 수 있는 자가증식(self renewal)능력(또는 자기복제)과 성숙된 임파조혈세포의 모든 계통으로 분화할 수 있는 능력이다. 조혈모세포에 대한 연구는 동물에 준치사량(sublethal dose)의 방사선을 조사한 후 골수결핍으로 고통받는 동물에게 정상골수세포를 주사함으로써 이 결핍증이 회복될 수 있다는 것을 처음으로 알게 되었을 때부터 시작되었다. 이러한 전신 방사선 조사를 받은 마우스의 골수회복에 대한 최초의 정량적인 실험으로부터 방사선 조사를 받은 동물의 비장과 골수에서 골수세포와 적혈구 계통의 세포 콜로니를 형성할 수 있는 능력을 갖는 조혈전구세포의 개념이 도입되었다.
자가증식능이 있는 다능성 조혈모세포 (PHSCs)에 의한 혈구세포들의 재구성과 조혈계통에 대한 발생생물학적 측면을 이해하기 위하여 순수한 다능성 조혈모세포의 분리가 요구되고 있고, 조혈모세포의 이상으로 유발되는 혈액관련 질환의 치료를 위한 방안으로 시험관내에서 조혈모세포를 다량으로 분화, 증식 및 생산하고자 하는 연구가 시도되고 있다.
그러나 조혈모세포는 매우 낮은 비율로 존재하기 때문에 분리에 어려운 점이 많으며, 분화 및 증식 조건도 복잡하고 까다롭기 때문에 효과적인 조혈모세포의 분화 및 자가증식 촉진 기술개발이 아직까지 이루어지지 않고 있다.
한편, PDCD2(programmed cell death 2)는 효모에서 인간에 이르는 모든 진핵생물에서 발현하는 구조적으로 보존된 단백질이며, 아직까지 세포내 작용 메커니즘이 구체적으로 알려져 있지 않다. 다양한 조직에서 발현하며 세포핵과 세포질 모두에서 기능하는 이 단백질은 흉선 세포의 세포 자멸사 과정에서 합성량이 증가하는 mRNA의 발현 단백질로 알려져 있다.
PDCD2는 MYND 도메인을 갖으며 이를 통해 HCF-1, N-CoR/mSin3A와 같은 세포주기와 개체의 발달에 관여하는 전사 조절 인자들과 상호작용하는 것으로 알려져 있으며, 초파리(Drosophila melanogaster)에서 발견된 PDCD2의 상동 단백질인 Zfrp8에 대한 연구를 통해 이 단백질은 핵(nucleus) 뿐만 아니라 세포질에서도 발견되며 절대적인 양으로 보았을 때는 오히려 핵 내부에 비해 외부에 더 많이 분포함이 보고된 바 있다.
그러나 아직까지 PDCD2가 조혈모세포의 분화 및 자가증식에 관여하는지에 대한 연구 내용은 보고된 바 없다.
이에 본 발명자들은 혈액세포 관련 질환의 효과적은 치료기술로서 조혈모세포의 활용도를 증진시킬 수 있는 연구를 진행하던 중, PDCD2가 결핍된 동물 마우스 모델에서 조혈모세포의 분화 및 자가증식에 이상이 발생함을 확인하였고, PDCD2가 조혈모세포의 분화 및 자가증식 조절자로 작용함을 최초로 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.
대한민국 공개특허 제10-2016-0131569호 대한민국 등록특허 제10-1626217호
따라서 본 발명의 목적은 PDCD2(programmed cell death 2) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는, 조혈모세포의 분화 또는 자가증식 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 PDCD2(programmed cell death 2) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는, 혈액 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 분리된 조혈모세포에 PDCD2(programmed cell death 2) 유전자의 발현 또는 PDCD2 단백질의 활성을 촉진시키는 제제를 처리하는 단계를 포함하는 분화능 또는 자가증식능이 증가된 조혈모세포의 생산방법; 상기 방법으로 제조된 분화능 또는 자가증식능이 증가된 조혈모세포; 및 상기 분화능 또는 자가증식능이 증가된 조혈모세포를 유효성분으로 포함하는 혈액 관련 질환의 예방 또는 치료용 세포치료제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 PDCD2(programmed cell death 2) 유전자 또는 PDCD2 단백질을 포함하는 세포에 후보물질을 처리하는 단계; 및 PDCD 유전자의 발현양 또는 PDCD 단백질의 양 또는 PDCD 단백질의 활성을 측정하는 단계를 포함하는, 혈액 관련 질환의 치료제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은, PDCD2(programmed cell death 2) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는, 조혈모세포의 분화 또는 자가증식 촉진용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 PDCD2(programmed cell death 2) 단백질은 서열번호 1의 아미노산으로 이루어진 것이고, 상기 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한 본 발명은 PDCD2(programmed cell death 2) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는, 혈액 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 PDCD2(programmed cell death 2) 단백질은 서열번호 1의 아미노산으로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것이며, PDCD2(programmed cell death 2) 유전자가 작동가능하게 연결된 발현 벡터 내에 함유되어 있는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 혈액 관련 질환은 급성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 골수이형성 증후군, 림프종, 다발성 골수종, 재생불량성 빈혈, 적혈구병증, 고셔씨병, 헌터 증후군, ADA 효소결핍증 및 Wiskot-Aldrich 증후군으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.
또한 본 발명은, 분리된 조혈모세포에 PDCD2(programmed cell death 2) 유전자의 발현 또는 PDCD2 단백질의 활성을 촉진시키는 제제를 처리하는 단계를 포함하는, 분화능 또는 자가증식능이 증가된 조혈모세포의 생산방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 방법으로 제조된 분화능 또는 자가증식능이 증가된 조혈모세포를 제공한다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 분화능 또는 자가증식능이 증가된 조혈모세포를 유효성분으로 포함하는, 혈액 관련 질환의 예방 또는 치료용 세포치료제를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 혈액 관련 질환은 급성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 골수이형성 증후군, 림프종, 다발성 골수종, 재생불량성 빈혈, 적혈구병증, 고셔씨병, 헌터 증후군, ADA 효소결핍증 및 Wiskot-Aldrich 증후군으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.
나아가 본 발명은, PDCD2(programmed cell death 2) 유전자 또는 PDCD2 단백질을 포함하는 세포에 후보물질을 처리하는 단계; 및 PDCD 유전자의 발현양 또는 PDCD 단백질의 양 또는 PDCD 단백질의 활성을 측정하는 단계를 포함하는, 혈액 관련 질환의 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 PDCD2 단백질은 서열번호 1의 아미노산으로 이루어진 것이고, 상기 PDCD 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 PDCD 유전자의 발현양 또는 PDCD 단백질의 양 또는 PDCD 단백질의 활성이 후보물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 증가되는 경우, 상기 후보물질을 혈액 관련 질환의 예방 또는 치료용 물질로 판정하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 혈액 관련 질환은 급성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 골수이형성 증후군, 림프종, 다발성 골수종, 재생불량성 빈혈, 적혈구병증, 고셔씨병, 헌터 증후군, ADA 효소결핍증 및 Wiskot-Aldrich 증후군으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명은 조혈모세포의 분화 및 자가증식 조절기능을 갖는 PDCD2의 신규용도를 규명한 것으로, 조혈모세포에서 PDCD2 유전자가 삭제된 PDCD2 유전자 적중 생쥐(PDCD2fl / fl;Vav-iCre)를 대상으로 PDCD2가 발현되는 정상 생쥐와 비교한 결과, 생쥐 태아 간의 총세포수 및 면역세포수가 감소되어 있었고, 적혈구계 세포의 발달 과정에 이상을 초래할 뿐만 아니라 조혈모세포의 분화능을 상실한다는 사실을 확인함으로써, PDCD2가 조혈모세포의 분화 및 자가증식에 매우 중요한 기능을 한다는 것을 확인하였다. 따라서 조혈모세포 내에서 PDCD2의 발현 또는 활성을 촉진시킬 경우, 분화 및 자가증식이 향상된 조혈모세포를 생산할 수 있는 효과가 있으며, 이를 혈액 관련 질환의 치료제로서 사용할 수 있는 효과가 있다.
도 1a는 임신 14.5일령의 정상 생쥐태아(W)와 조혈모세포 특이적 PDCD2 유전자 적중 생쥐태아(PDCD2fl/fl;Vav-iCre)의 외형(윗쪽) 및 태아간(아래쪽)의 형태를 나타낸 사진이다.
도 1b는 임신 16.5일령의 정상 생쥐태아(PDCD2fl/fl)와 조혈모세포 특이적 PDCD2 유전자 적중 생쥐태아(PDCD2fl/fl;Vav-iCre)의 외형(윗쪽) 및 태아간(아래쪽)의 형태를 나타낸 사진이다.
도 2a는 임신 14.5일령의 정상 생쥐태아(PDCD2fl/fl)와 조혈모세포 특이적 PDCD2 유전자 적중 생쥐태아(PDCD2fl/fl;Vav-iCre) 태아간의 총 세포수를 비교한 결과이다.
도 2b는 임신 14.5일령의 정상 생쥐태아(PDCD2fl/fl)와 조혈모세포 특이적 PDCD2 유전자 적중 생쥐태아(PDCD2fl/fl;Vav-iCre) 태아간의 총 세포수를 비교한 결과이다.
도 3a는 임신 14.5일령의 정상 생쥐태아(PDCD2fl/fl)와 조혈모세포 특이적 PDCD2 유전자 적중 생쥐태아(PDCD2fl/fl;Vav-iCre)의 태아간 내 미분화 전구세포(lineage negative population)를 유세포분석 기법을 이용해 나타낸 것이다(왼쪽: 정상생쥐태아, 오른쪽: PDCD2 유전자 적중 생쥐태아).
도 3b는 임신 14.5일령의 정상 생쥐태아(PDCD2fl/fl)와 조혈모세포 특이적 PDCD2 유전자 적중 생쥐태아(PDCD2fl/fl;Vav-iCre)의 태아간 내 적혈구계 세포(erythroid lineage population)를 성숙단계별로 유세포분석 기법을 이용해 나타낸 것이다(왼쪽: 정상생쥐태아, 오른쪽: PDCD2 유전자 적중 생쥐태아).
도 4a는 임신 14.5일령의 정상 생쥐태아(PDCD2fl/fl)와 조혈모세포 특이적 PDCD2 유전자 적중 생쥐태아(PDCD2fl/fl;Vav-iCre)의 태아간 내 조혈모세포의 분화능을 집락형성단위(colony forming unit) 기법을 이용해 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4b는 임신 16.5일령의 정상 생쥐태아(PDCD2fl/fl)와 조혈모세포 특이적 PDCD2 유전자 적중 생쥐태아(PDCD2fl/fl;Vav-iCre)의 태아간 내 조혈모세포의 분화능을 집락형성단위(colony forming unit) 기법을 이용해 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 PDCD2 유전자 적중 생쥐 제조를 위해 생쥐에 주입한 PDCD2 유전자 제거용 벡터의 개열지도를 나타낸 것이다.
본 발명은 조혈모세포의 분화 및 자가증식 조절기능을 갖는 PDCD2의 신규한 용도를 제공함에 특징이 있다.
구체적으로 본 발명은 PDCD2(programmed cell death 2) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는, 조혈모세포의 분화 또는 자가증식 촉진용 조성물을 제공함에 특징이 있으며, 또한 PDCD2(programmed cell death 2) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는, 혈액 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공함에 특징이 있다.
앞서 종래기술에서도 기술한 바와 같이, 조혈 과정(hematopoiesis)은 자가증식능(self-renewal) 및 다분화능(multipotent)을 갖는 조혈모세포가 모든 종류의 혈액세포로 분화 및 발달하는 과정을 말한다. 이러한 과정을 통해 생성된 혈액 세포에는 적혈구, 혈소판, 림프구, 과립백혈구 및 대식세포 등이 포함되어 있고, 각각의 세포는 모두 면역계가 정상적으로 기능하는데 있어 매우 중요한 역할을 수행한다.
또한, 조혈모세포의 자가증식과 분화는 주변 미세환경으로부터 유래한 사이토카인(cytokine), 키모카인(chemokine), 콜로니 자극인자(colony-stimulating factor)와 세포 표면과 내부의 수용체, 신호 전달 기전 및 이로 인해 발현되는 여러 종류의 세포내 단백질 간의 복잡한 상호작용에 의해 조절되어지는 것으로 알려져 있다.
특히 최근들어 혈액 관련 질환의 치료를 위한 방법으로 조혈모세포의 치료 효능 가능성이 규명되면서 시험관 내에서 조혈모세포를 다량 분리, 분화 및 증식시키려는 연구가 시도되고 있고, 조혈모세포의 분화와 증식을 조절할 수 있는 조절자 발굴에 대한 연구가 진행되고 있으나, 아직까지 효과적인 기술이 개발되지 못하고 있다.
이에 본 발명에서는 조혈모세포의 분화 또는 자가증식 과정에 PDCD2(programmed cell death 2)가 중요한 역할을 한다는 사실을 최초로 규명하였다.
구체적으로 본 발명의 일실시예에 의하면, 생쥐 동물모델을 대상으로 PDCD2(programmed cell death 2) 유전자가 결핍된 PDCD2 조건부 유전자 적중 생쥐를 제조한 후, 정상생쥐와 형태학적, 유전학적 분석 및 조혈모세포의 분화능 분석을 수행하였다.
그 결과, 정상생쥐에 비해 PDCD2 유전자가 결핍된 PDCD2 유전자 적중 생쥐(PDCD2fl / fl;Vav-iCre)의 경우, 태아 간(fetal liver) 의 크기 감소 및 색 변화가 있는 것으로 나타났고, 태아의 조기 사산이 발생하는 것으로 나타났다.
또한, PDCD2 유전자 결핍으로 인한 생쥐 태아의 조기 사산의 원인을 확인하기 위해 태아의 주요 면역기관인 태아 간(fetal liver) 내 면역세포에 대한 분석을 수행한 결과, PDCD2 유전자 결핍 생쥐(PDCD2fl/fl;Vav-iCre)의 태아간 총 세포수가 정상 생쥐(PDCD2fl /fl)에 비해 50배 이상 감소해 있는 것으로 나타났고, lineage 음성 그룹의 절대세포수(absolute cell number)도 정상 생쥐에 비해 6배 이상 감소해 있는 것으로 나타났다.
뿐만 아니라, 이들 실험 생쥐군에 대해 적혈구계 세포(erythroid lineage population)의 대표적인 세포표면 마커인 TER-119와 CD71을 이용하여 유세포 분석(fluorescence-activated cell sorting)을 실시하여 적혈구계 세포를 성숙단계별로 확인해보았는데, 그 결과, 정상 생쥐(PDCD2fl /fl)와 비교해보았을 때 PDCD2 유전자 결핍 생쥐(PDCD2fl / fl;Vav-iCre)의 경우 단계별 적혈구계 세포의 비정상적인 비율 변화가 발생한 것으로 나타났고, 이로써 적혈구의 발달 과정상에 문제가 발생했다는 것을 확인할 수 있었다.
따라서 PDCD2 유전자는 혈액 관련 세포의 발달과정 및 기능에 중요한 역할을 함을 알 수 있었다.
나아가 본 발명의 또 다른 일실시예에 의하면, DCD2 유전자가 조혈모세포의 분화능에 미치는 영향을 분석하기 위해 PDCD2 유전자 적중 생쥐(PDCD2fl /+;Vav-iCre)와 정상 생쥐의 태아간 세포를 이용해 집락형성단위(colony forming unit) 분석으로 세포의 분화능을 분석하였는데, 그 결과 PDCD2 유전자가 결합된 생쥐(PDCD2fl/+;Vav-iCre)의 태아간 세포는 분화능력을 상실한 것으로 나타났다.
그러므로 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 PDCD2가 조혈모세포의 분화 및 자가증식능을 조절하는 역할을 하며, 보다 구체적으로는 PDCD2가 조혈모세포의 분화 및 자가증식능을 촉진시키는 작용이 있음을 알 수 있었다.
한편, 특정 유전자의 생체 내 기능을 확인하기 위한 방법으로 당업계에서 사용되고 있는 대표적인 방법은 loss of function 및 gain of function이 있다. Loss of function은 특정 유전자의 기능 소실에 따른 변화를 분석함으로써 해당 특정 유전자의 기능을 확인하는 방법이며, gain of function은 특정 유전자의 기능을 활성화시켜 그에 따른 변화 분석을 통해 해당 특정 유전자의 기능을 확인하는 방법이다.
본 발명의 일실시예에서는 타겟 유전자의 결손(결핍)에 의한 방법으로 PDCD2의 기능을 확인할 수 있었는데, 구체적으로 당업계에서 사용되고 있는 Cre-Lox 시스템을 사용하여 PDCD2 유전자가 결핍된 생쥐 동물모델을 제조한 후, PDCD2 유전자가 발현되는 정상 생쥐와 형태학적 분석, 면역기관 형태, 면역세포수 및 조혈모세포의 분화능을 분석하였다.
여기서 상기 Cre-Lox 시스템은 특정 유전자의 기능을 확인할 수 있는 시스템으로, Cre는 Cre 재조합 효소를 의미하며, LoxP 염기서열을 인식하여 재조합을 일으키는 효소로서, Cre는 LoxP 사이에 특정 유전자가 삽입된 구조체에 작용하여 LoxP 사이의 특정 유전자를 제거하여, 특정 유전자의 제거로 인한 현상을 확인할 수 있다.
본 발명에서는 LoxP 사이에 특정 유전자로서 PDCD2 유전자를 삽입한 재조합 벡터를 사용하여 세포 내에서 PDCD2 유전자가 제거된 형태의 세포, 조직 또는 기관을 제조하였으며, 구체적으로 본 발명에서 PDCD2 유전자의 제거를 위해 사용한 재조합 벡터의 개열지도는 도 5에 나타내었다.
따라서 본 발명의 일실시예를 통해 확인한 PDCD2(programmed cell death 2) 의 신규 기능은 PDCD2가 조혈모세포의 분화 및 자가증식능을 촉진시킬 수 있는 기능이라는 것을 알 수 있었다.
그러므로 본 발명은 PDCD2(programmed cell death 2) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는, 조혈모세포의 분화 또는 자가증식 촉진용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명에서 상기 PDCD2(programmed cell death 2) 단백질은 바람직하게 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 대해 기능적 동등물일 수 있다. 상기 '기능적 동등물'이란, 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 보다 바람직하게는 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로서 본 발명의 PDCD2와 실질적으로 동질의 활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다. 여기서, '실질적으로 동질의 활성'이란 상기에서 기재한 PDCD2의 활성을 의미한다. 상기 기능적 동등물에는, 예를 들어, 본 발명에 따른 PDCD2의 아미노산 서열의 아미노산 중 일부가 치환되거나, 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체가 포함될 수 있다. 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환일 수 있으며, 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산 (Asp, Glu), 염기성 아미노산 (His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 아미노산의 결실은 바람직하게는 본 발명의 PDCD2의 활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치할 수 있다.
또한 상기 기능적 동등물의 범위에는 PDCD2의 기본 골격 및 이의 생리 활성을 유지하면서 폴리펩티드의 일부 화학 구조가 변형된 폴리펩티드 유도체도 포함될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경 및 생리활성을 유지하면서 다른 단백질과 융합으로 만들어진 융합 단백질 등이 이에 포함될 수 있다.
또한 상기 PDCD2 유전자는 플라스미드 또는 바이러스 벡터와 같은 발현 벡터 내로 공지의 방법에 의해 도입시킨 후 상기 발현 벡터를 당업계에 공지된 다양한 방법으로 형질도입(transduction) 또는 형질주입(transfection)에 의해 발현형으로 표적 세포 내에 도입시킬 수 있다. 플라스미드 발현 벡터는 사람에게 사용할 수 있는 FDA의 승인된 유전자 전달방법으로 사람 세포에 직접적으로 플라스미드 DNA를 전달하는 방법으로(Nabel, E. G. et al., Science, 249:1285-1288, 1990), 플라스미드 DNA는 바이러스 벡터와는 달리 균질하게 정제될 수 있는 장점이 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 플라스미드 발현 벡터로는 당업계에 공지된 포유동물 발현 플라스미드를 사용할 수 있으며, 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 플라스미드 발현 벡터(plasmid expression vector)는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질주입(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질주입(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질주입(DEAE Dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질 주입(polybrene-mediated trans fection), 전기침공법(electropora tion), 유전자 건(gene gun) 및 세포 내로 DNA를 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 목적세포 내로 도입할 수 있다(Wu. et al., J. Bio. Chem., 267:963-967, 1992; Wu. et al., Bio. Chem., 263:14621-14624, 1988).
또한 상기 PDCD2를 발현시킬 수 있는 벡터는 공지의 방법에 의해 세포, 조직 또는 체내로 투여될 수 있는데, 예를 들면, 국소적으로, 비경구, 경구, 비강, 정맥, 근육 내, 피하 내 또는 다른 적절한 수단에 의해 투여될 수 있다. 특히, 상기 벡터는 표적 조직 또는 표적세포를 치료하기 위한 유효량으로 직접 주사할 수 있다.
또한 본 발명은 PDCD2(programmed cell death 2) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는, 혈액 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 경구 투여용 담체 및 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르 브산과 같은 항산화제가있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995). 본 발명에 따른 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 적합한 형태로 제형화 될 수 있다. 즉, 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구투여용 형태로 제조될 수 있으며, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다. 또한 경구 투여용 제형으로는, 이에 한정되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 환약 및 캡슐 등이 있다.
상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 상기에서 '유효량' 이란 환자에게 투여하였을 때, 예방 또는 치료 효과를 나타내는 양을 말한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 투여 대상, 연령, 성별 체중, 개인차 및 질병 상태에 따라 적절히 선택할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 바람직하게는 1~10000㎍/체중kg/day, 더욱 바람직하게는 10~1000㎎/체중kg/day의 유효용량으로 하루에 수회 반복 투여될 수 있다.
또한 본 발명의 조성물은 혈액 관련 질환을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수도 있다.
본 발명의 조성물이 치료 또는 예방할 수 있는 혈액 관련 질환으로는 이에 제한되지는 않으나, 급성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 골수이형성 증후군, 림프종, 다발성 골수종, 재생불량성 빈혈, 적혈구병증, 고셔씨병, 헌터 증후군, ADA 효소결핍증 및 Wiskot-Aldrich 증후군을 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 분리된 조혈모세포에 PDCD2(programmed cell death 2) 유전자의 발현 또는 PDCD2 단백질의 활성을 촉진시키는 제제를 처리하는 단계를 포함하는 분화능 또는 자가증식능이 증가된 조혈모세포의 생산방법을 제공할 수 있으며, 상기 본 발명의 방법으로 제조된 분화능 또는 자가증식능이 증가된 조혈모세포를 제공할 수 있다.
상기 방법으로 제조된 분화능 또는 자가증식능이 증가된 조혈모세포는 혈액 관련 질환의 치료를 위한 세포치료제로도 사용될 수 있다.
상기 본 발명의 방법으로 생산된 조혈모세포를 함유한 세포치료제로 치료할 수 있는 질환은 앞서 기술한 혈액 관련 질환일 수 있으며, 예를 들면 백혈병을 치료하는 방법 중 하나로 조혈모세포 이식(Hematopoietic Stem Cell Transplantation)이 있다. 조혈모세포는 혈액의 주요한 구성성분으로 잠재적으로 분화할 수 있는 세포이며, 골수에서 생산되는(단핵구, 대식세포, 호중구, 호염기성 백혈구, 적혈구, 혈소판 등)세포들과 림프계(T세포, B세포, NK세포)등으로 분화 가능하며, 골수 조직에 있는 세포들의 1/10000라는 그 중요성과는 달리 상대적으로 작은 비율을 차지하지만, 자기 자신을 복제 할 수 있는 능력을 지녔기 때문에 혈액의 구성 성분을 항상 제때에 생산 할 수 있다. 따라서 백혈병과 같이 세포분화 과정에서 이상이 생긴 경우나 재생불량성 빈혈과 같이 조혈모세포의 숫자가 줄어들어 이상이 오는 경우에, 조혈모세포를 이식함으로써 백혈병을 포함하는 혈액 관련 질환들을 근본적으로 치료할 수 있다.
나아가 본 발명은 혈액 관련 질환의 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공할 수 있는데 바람직하게 상기 방법은, PDCD2(programmed cell death 2) 유전자 또는 PDCD2 단백질을 포함하는 세포에 후보물질을 처리하는 단계; 및 PDCD 유전자의 발현양 또는 PDCD 단백질의 양 또는 PDCD 단백질의 활성을 측정하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 상기 방법은 조혈모세포의 분화 및 자가증식을 활성화시켜 혈액 이상과 관련된 질환의 치료제를 PDCD2를 이용하여 발굴할 수 있는 방법으로서, 상기 "후보물질"이란 PDCD2 유전자의 발현양, PDCD2 단백질의 양 또는 PDCD2 단백질의 활성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시료는 화합물, 단백질, 펩타이드, 올리고뉴클레오티드, 또는 천연물 추출물 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 후보물질의 처리는 바람직하게 PDCD2 유전자 또는 PDCD2 단백질을 포함하는 세포 또는 조직에 후보물질을 처리한 후 배양하는 과정으로 수행할 수 있다.
또한, 상기에서 PDCD2 단백질의 세포 내 수준 증가의 의미는 PDCD2 유전자의 발현이 증가되거나 또는 PDCD2 단백질의 분해가 억제되어 PDCD2 단백질의 양이 증가되는 것을 말한다. 상기 PDCD2 유전자 발현은 PDCD2 유전자의 전사 및 단백질로의 번역 과정을 포함한다. 따라서 상기 후보물질이 세포 내에서 PDCD2 유전자의 발현 및 단백질의 수준을 증가시킬 경우, 상기 후보물질을 혈액 관련 질환의 신규 치료제로 판단할 수 있다.
상기 유전자의 발현 수준 측정은 바람직하게는 mRNA의 수준을 측정하는 것이며, mRNA의 수준을 측정하는 방법으로는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소연쇄반응, RNase 보호 분석법, 노던 블럿 및 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 상기 단백질의 양 또는 단백질의 활성 측정은 항체를 이용할 수 있는데, 이러한 경우, 생물학적 시료 내의 상기 마커 단백질과 이에 특이적인 항체는 결합물, 즉, 항원-항체 복합체를 형성하며, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 이에 제한되지는 않으나, 웨스턴 블럿, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있다.
이와 같이, 상기 PDCD2 유전자의 발현양 또는 PDCD2 단백질의 양 또는 PDCD2 단백질의 활성을 측정하는 방법은 기술된 바와 같이 당업계에 공지된 여러 가지 방법을 사용할 수 있는데, 바람직하게 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소연쇄반응, 면역침전법(coimmunoprecipitation), 효소면역분석법(enzymelinked immunosorbentassay), 방사능면역분석법(RIA), 면역조직화학, 웨스턴 블로팅(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)을 사용할 수 있다.
이상 기술한 바와 같이, 본 발명의 PDCD2는 조혈모세포의 분화 및 자가증식에 매우 중요한 작용을 한다는 사실을 확인하였는 바, 조혈모세포 내에서 PDCD2의 발현 또는 활성을 촉진시킬 경우, 분화 및 자가증식이 향상된 조혈모세포를 생산할 수 있으며, 본 발명의 방법으로 생산된 조혈모세포 또는 PDCD2 유전자가 함유된 유전자 치료제를 혈액 관련 질환의 새로운 치료제로서 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1>
PDCD2 조건부 유전자 적중생쥐의 표현형 분석
PDCD2가 조혈모세포 기능에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위해, 당업계에 알려진 Cre-Lox 재조합 시스템을 이용한 유전자 적중법을 통해 조건적으로 PDCD2 유전자가 삭제된, 조혈모세포 특이적 PDCD2 유전자 적중 생쥐 모델(PDCD2fl / fl;Vav-iCre)을 제조하였는데, 이를 위해 도 5의 개열지도를 갖는 PDCD2 유전자 삭제용 재조합 벡터를 생쥐에 주입시켜 PDCD2 유전자 적중 생쥐 모델을 제조하였다. 또한, 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction)을 이용한 유전자형 분석을 통해 조혈모세포 특이적 PDCD2 유전자 적중 생쥐(PDCD2fl / fl;Vav-iCre)와 정상 생쥐(WT, PDCD2fl /fl)를 구분하였으며, 이 때 사용한 프라이머 서열은 하기 표 1 나타내었다.
PDCD2 유전자 적중 생쥐의 유전자형 분석을 위해 사용한 프라이머 서열
유전자명 프라이머 프라이머 서열(5'->3') 서열번호
PDCD2fl /fl
정방향 CAACTTAGCCTTACCGTCTCTG 3
역방향 GGGATGCATGAATGTGATTG 4
Vav-iCre+
 정방향 AGATGCCAGGACATCAGGAACCTG 5
역방향 ATCAGCCACACCAGACACAGAGATC 6
또한, 조혈모세포 특이적 PDCD2 유전자 적중 생쥐(PDCD2fl / fl;Vav-iCre) 모델을 구축하기 위해 Ldb1fl /fl 표현형 생쥐와 Ldb1fl /+;Vav-iCre 표현형 생쥐의 교배를 실시하였고, 교배를 통해 얻은 자손 생쥐가 4주령이 되었을 때, 꼬리로부터 게놈 DNA를 채취하여 생쥐의 유전자형을 상기 표 1의 프라이머를 이용한 PCR 분석으로 분석하였다. 교배를 통해 얻은 새끼가 4주령이 되었을 때의 유전자형 분석결과는 하기 표 2에 나타내었다.
PDCD2fl / fl표현형 생쥐와 PDCD2fl /+;Vav1-Cre+ 표현형 생쥐 간 교배를 통해 얻은 새끼의 개체수를 유전자형 별로 분석한 결과
유전자형 자손 개체수
PDCD2fl/+ 16
PDCD2fl/fl 21
PDCD2fl/+;Vav-iCre 22
PDCD2fl/fl;Vav-iCre 0
분석 결과, PDCD2fl /fl 표현형 생쥐와 PDCD2fl /+;Vav-iCre 표현형 생쥐 간의 교배를 통해 나온 새끼는 상기 표 2의 4종류 유전자형 중 하나를 갖게 되며 그 확률은 각각 25%로 동일하였으나, 교배를 통해 얻은 59개체의 새끼 중 유독 조혈모세포 특이적 PDCD2 유전자 적중 유전자형(PDCD2fl / fl;Vav-iCre)을 갖는 개체[즉, PDCD2 유전자가 삭제된 개체]만은 얻을 수 없었다.
이러한 조기 태아 사산(embryonic lethality)의 이유가 조혈모세포의 발달 이상 때문인지를 확인하기 위해, 플러그 체크를 통한 임신 일령별 태아 분석을 실시하였다.
그 결과, 상기 결과와 달리 임신 14.5 일령의 태아 중에서는 조혈모세포 특이적 PDCD2 유전자 적중 유전자형(PDCD2fl / fl;Vav-iCre )을 갖는 개체를 확인할 수 있었고 정상 태아(PDCD2fl /fl)와 비교해 창백한 외형을 보임을 확인할 수 있었으며(도 1a 참조), 태아의 주요 면역기관인 태아 간(fetal liver)을 분리하여 그 외형을 정상 생쥐와 비교한 결과, 유전자 적중 생쥐의 태아 간에서는 크기가 감소되고 색의 변화가 있음을 확인할 수 있었다(도 1a 참조). 이러한 태아 및 태아간의 외형 변화는 임신 16.5일령의 태아에서도 동일하게 관찰하였다(도 1b 참조). 한편, 임신 18.5일령의 태아에서는 조혈모세포 특이적 PDCD2 유전자 적중 유전자형을 갖는 개체를 확인할 수 없었다. 따라서 이를 통해 임신 17.5일을 기점으로 PDCD2 유전자가 삭제된 태아는 조기 사산이 일어난다는 것을 예상할 수 있었다.
<실시예 2>
PDCD2 조건부 유전자 적중생쥐의 면역기관 분석
조혈모세포 특이적 PDCD2 유전자 발현 억제가 태아의 출생 전 사산(embryonic lethality)을 유발할 정도로 면역계에 심각한 기능 부전을 초래함을 확인하였다. 이에 이러한 현상의 원인을 알아보기 위해 태아의 주요 면역기관인 태아 간(fetal liver) 내의 면역세포에 대한 분석을 실시하였다. 이를 위해 임신 14.5일령 태아로부터 태아 간을 분리한 후 Gey’s 용액을 처리하여 적혈구를 제거하였고, 이후 마이크로슬라이드(frosted microslide) 및 40 μm 세포여과기를 이용해 단일세포로 분리한 태아 간 샘플 내 세포의 총 개수를 혈구계수기(hemacytometer)를 이용해 측정하였다.
그 결과, PDCD2 유전자가 삭제된 조혈모세포 특이적 PDCD2 유전자 적중 생쥐(PDCD2fl/+;Vav-iCre) 태아간의 총 세포수가 정상 생쥐(PDCD2fl /fl)에 비해 50배 이상 감소되어 있는 것으로 나타났고(도 2a 참조). 이러한 태아간 세포수의 급격한 감소 현상은 임신 16.5일령의 태아에서도 나타났다(도 2b 참조).
이러한 결과를 통해 조혈모세포 특이적 PDCD2 유전자 적중 생쥐(PDCD2fl /+;Vav-iCre)의 태아간 내 면역세포의 수가 대폭 감소함을 확인함에 따라 다음으로, 남아있는 태아간의 세포 구성에 어떠한 변화가 생겼는지 확인하기 위해 Lineage 항체(lineage antibody cocktail)를 이용한 유세포 분석(fluorescence-activated cell sorting)을 실시하였다.
태아간 내 면역세포는 크게 lineage 음성 그룹과 lineage 양성 그룹으로 나눌 수 있으며, Lineage 음성 그룹의 경우 태아간의 5~10% 정도를 차지하는 세포군집으로써 조혈모세포를 포함하는 림프계 및 골수계 전구세포를 포함한다. Lineage 양성 그룹은 T 림프구, B 림프구, 대식세포, 수지상세포, 호중구, 적혈구계열 세포 등을 포함하는 분화를 마친 세포군집으로써 앞서 언급한 lineage 음성 그룹으로부터 유래한다.
본 발명에 따른 유세포 분석 결과, PDCD2 유전자 적중 생쥐의 태아간 내 lineage 음성 그룹의 비율이 정상 생쥐에 비해 20% 증가한 것을 확인하였으며, lineage 음성 그룹의 절대 세포수(absolute cell number)를 분석한 결과, 정상 생쥐에 비해 6배 이상 감소하는 것으로 확인되었다(도 3a 참조).
이를 통해 본 발명자들은 PDCD2 유전자가 발현 되지 않는 경우, 생쥐 태아 간 내 전구세포의 분화능과 자가증식능 모두에 이상이 생겼다는 것을 확인할 수 있었다.
나아가 본 발명자들은 상기 실험결과에 따른 도 1a에서 조혈모세포 특이적 PDCD2 유전자 적중 생쥐(PDCD2fl /+;Vav-iCre) 태아 및 태아간의 핏기가 사라지는 것을 확인함으로써, 이는 적혈구 부족으로 인한 태아 빈혈(fetal anemia)이 조기 태아 사산(embryonic lethality)의 이유일 것으로 예상하였고, 이를 확인하기 위해 적혈구계 세포(erythroid lineage population)의 대표적인 세포표면 마커인 TER-119와 CD71을 이용하여 유세포 분석(fluorescence-activated cell sorting)을 실시하여 적혈구계 세포를 성숙단계별로 분석하였다.
그 결과, 정상 생쥐(PDCD2fl /fl)와 비교해보았을 때 PDCD2 유전자가 발현 되지 않은 PDCD2 유전자 적중 생쥐((PDCD2fl /+;Vav-iCre)는 단계별 적혈구계 세포의 비정상적인 비율 변화를 확인할 수 있었으며 적혈구의 발달 과정에 이상이 발생하였음을 알 수 있었다(도 3b 참조).
< 실시예 3>
PDCD2 조건부 유전자 적중생쥐에서 조혈모세포의 분화능 분석
PDCD2 유전자가 조혈모세포의 분화능에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위해, 정상 생쥐(PDCD2fl /fl)와 조혈모세포 특이적 PDCD2 유전자 적중 생쥐(PDCD2fl /+;Vav-iCre)의 태아간 세포를 이용해 집락형성단위(colony forming unit) 분석을 수행하였다. 임신 14.5일령 태아의 태아간 세포 10,000개를 집락형성단위 기법 전용 배지에 뿌린 후 10일 뒤 태아간 세포의 CFU-GEMM (multilineage progenitor), CFU-GM (granulocyte and monocyte committed stem cell), BFU-E (erythroid committed stem cell)의 숫자를 측정하였다.
그 결과, PDCD2 유전자가 삭제된 유전자 적중생쥐(KO) 태아간의 세포는 분화를 할 수 있는 능력이 없음을 확인하였다(도 4a 참조). 이러한 태아간 세포의 분화능 상실 현상은 임신 16.5일령의 태아에서도 확인할 수 있었다(도 4b 참조).
이상의 결과를 통해 본 발명자들은 PDCD2가 조혈모세포의 자가능력 및 분화능을 조절할 수 있음을 알 수 있었으며, 나아가 PDCD2의 발현 또는 활성을 촉진시키는 경우, 조혈모세포의 수를 증가시키고 기능을 유지시킬 수 있으며, 분화를 촉진시킬 수 있어 백혈병, 다발성경화증, 림프종, 골수형성 이상증후군과 같은 혈액 유래 질환의 치료에 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Korea University <120> Use of PDCD2 having regulation of differentiation and self-renewal of hematopoietic stem cells <130> NPDC70666 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 343 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PDCD2 amino acid sequence <400> 1 Met Ala Ala Ala Ala Pro Gly Pro Val Glu Leu Gly Phe Ala Glu Glu 1 5 10 15 Ala Pro Ala Trp Arg Leu Arg Ser Glu Gln Phe Pro Ser Lys Val Gly 20 25 30 Gly Arg Pro Ala Trp Leu Gly Leu Ala Glu Leu Pro Gly Pro Gly Ala 35 40 45 Leu Ala Cys Ala Arg Cys Gly Arg Pro Leu Ala Phe Leu Leu Gln Val 50 55 60 Tyr Ala Pro Leu Pro Gly Arg Asp Asp Ala Phe His Arg Ser Leu Phe 65 70 75 80 Leu Phe Cys Cys Arg Glu Pro Pro Cys Cys Ala Gly Leu Arg Val Phe 85 90 95 Arg Asn Gln Leu Pro Arg Asn Asn Ala Phe Tyr Ser Tyr Glu Pro Pro 100 105 110 Ser Glu Thr Glu Ala Leu Gly Thr Glu Cys Val Cys Leu Gln Leu Lys 115 120 125 Ser Gly Ala His Leu Cys Arg Val Cys Gly Cys Leu Ala Pro Met Thr 130 135 140 Cys Ser Arg Cys Lys Gln Ala His Tyr Cys Ser Lys Glu His Gln Thr 145 150 155 160 Leu Asp Trp Arg Leu Gly His Lys Gln Ala Cys Thr Gln Ser Asp Lys 165 170 175 Ile Asp His Met Val Pro Asp His Asn Phe Leu Phe Pro Glu Phe Glu 180 185 190 Ile Val Thr Glu Thr Glu Asp Glu Ile Leu Pro Glu Val Val Glu Met 195 200 205 Glu Asp Tyr Ser Glu Val Thr Gly Ser Met Gly Gly Ile Pro Glu Glu 210 215 220 Glu Leu Asp Ser Met Ala Lys His Glu Ser Lys Glu Asp His Ile Phe 225 230 235 240 Gln Lys Phe Lys Ser Lys Ile Ala Leu Glu Pro Glu Gln Ile Leu Arg 245 250 255 Tyr Gly Arg Gly Ile Lys Pro Ile Trp Ile Ser Gly Glu Asn Ile Pro 260 265 270 Gln Glu Lys Asp Ile Pro Asp Cys Pro Cys Gly Ala Lys Arg Ile Phe 275 280 285 Glu Phe Gln Val Met Pro Gln Leu Leu Asn His Leu Lys Ala Asp Arg 290 295 300 Leu Gly Arg Ser Ile Asp Trp Gly Val Leu Ala Val Phe Thr Cys Ala 305 310 315 320 Glu Ser Cys Ser Leu Gly Ser Gly Tyr Thr Glu Glu Phe Val Trp Lys 325 330 335 Gln Asp Val Thr Asp Thr Pro 340 <210> 2 <211> 1032 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDCD2 cDNA sequence <400> 2 atggctgcag ccgcccctgg tcctgtggag ttgggcttcg ccgaggaggc accggcctgg 60 aggctgcgca gcgagcagtt tcccagcaaa gtgggcgggc ggcccgcgtg gttgggcttg 120 gcggagctgc cggggcccgg ggcgctggcg tgtgcgcgct gcggccgccc gctcgccttc 180 ctgctgcagg tgtacgcacc gctgccgggc cgggacgacg ccttccaccg cagcctcttt 240 ctcttctgct gtcgcgagcc gccgtgctgc gccggcctgc gagtttttcg taatcagcta 300 ccaaggaaca acgcattcta ctcctatgag cccccttctg aaacagaagc tttgggtacg 360 gaatgtgtgt gcctccagct caagtctgga gcccatctct gtcgggtttg tggttgcttg 420 gcccctatga catgctctag gtgcaaacag gcacattact gcagcaagga gcatcagaca 480 ttagactggc ggctgggaca caagcaggct tgtacacagt cagacaaaat agaccatatg 540 gttccagacc acaacttcct gtttccagaa tttgaaattg taacagaaac agaagatgaa 600 attttgcctg aggttgtgga aatggaggat tattctgaag ttacaggaag catgggggga 660 attcctgagg aagaactaga ttccatggca aagcacgaat ccaaggaaga tcacatattc 720 caaaagttta aatctaaaat agcccttgaa ccagagcaga ttctcaggta tggaagaggg 780 attaaaccca tctggatttc tggtgaaaat attcctcaag aaaaagatat tccagattgc 840 ccgtgtggtg ccaagagaat atttgaattc caggtcatgc ctcagctgtt gaaccacctg 900 aaggcagaca gactcggcag aagcatcgac tggggtgtct tggctgtctt cacctgtgct 960 gagagctgta gcctgggtag cggctacaca gaagaatttg tgtggaagca ggatgtgaca 1020 gatacacctt aa 1032 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDCD2 F primer <400> 3 caacttagcc ttaccgtctc tg 22 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDCD2 R primer <400> 4 gggatgcatg aatgtgattg 20 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Vav-iCre F primer <400> 5 agatgccagg acatcaggaa cctg 24 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Vav-iCre R primer <400> 6 atcagccaca ccagacacag agatc 25

Claims (14)

  1. PDCD2(programmed cell death 2) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는, 조혈모세포의 분화 또는 자가증식 촉진용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 PDCD2(programmed cell death 2) 단백질은 서열번호 1의 아미노산으로 이루어진 것이고, 상기 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 조혈모세포의 분화 또는 자가증식 촉진용 조성물.
  3. PDCD2(programmed cell death 2) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는, 혈액 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 PDCD2(programmed cell death 2) 단백질은 서열번호 1의 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 하는, 혈액 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것이며, PDCD2(programmed cell death 2) 유전자가 작동가능하게 연결된 발현 벡터 내에 함유되어 있는 것을 특징으로 하는, 혈액 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제3항에 있어서,
    상기 혈액 관련 질환은 급성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 골수이형성 증후군, 림프종, 다발성 골수종, 재생불량성 빈혈, 적혈구병증, 고셔씨병, 헌터 증후군, ADA 효소결핍증 및 Wiskot-Aldrich 증후군으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 혈액 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 분리된 조혈모세포에 PDCD2(programmed cell death 2) 유전자의 발현 또는 PDCD2 단백질의 활성을 촉진시키는 제제를 처리하는 단계를 포함하는,
    분화능 또는 자가증식능이 증가된 조혈모세포의 생산방법.
  8. 제7항의 방법으로 제조된 분화능 또는 자가증식능이 증가된 조혈모세포.
  9. 제8항의 분화능 또는 자가증식능이 증가된 조혈모세포를 유효성분으로 포함하는, 혈액 관련 질환의 예방 또는 치료용 세포치료제.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 혈액 관련 질환은 급성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 골수이형성 증후군, 림프종, 다발성 골수종, 재생불량성 빈혈, 적혈구병증, 고셔씨병, 헌터 증후군, ADA 효소결핍증 및 Wiskot-Aldrich 증후군으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 혈액 관련 질환의 예방 또는 치료용 세포치료제.
  11. PDCD2(programmed cell death 2) 유전자 또는 PDCD2 단백질을 포함하는 세포에 후보물질을 처리하는 단계; 및
    PDCD 유전자의 발현양 또는 PDCD 단백질의 양 또는 PDCD 단백질의 활성을 측정하는 단계를 포함하는, 혈액 관련 질환의 치료제 스크리닝 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 PDCD2 단백질은 서열번호 1의 아미노산으로 이루어진 것이고, 상기 PDCD 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 혈액 관련 질환의 치료제 스크리닝 방법.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 PDCD 유전자의 발현양 또는 PDCD 단백질의 양 또는 PDCD 단백질의 활성 이 후보물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 증가되는 경우, 상기 후보물질을 혈액 관련 질환의 예방 또는 치료용 물질로 판정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 혈액 관련 질환의 치료제 스크리닝 방법.
  14. 제11항에 있어서,
    상기 혈액 관련 질환은 급성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 골수이형성 증후군, 림프종, 다발성 골수종, 재생불량성 빈혈, 적혈구병증, 고셔씨병, 헌터 증후군, ADA 효소결핍증 및 Wiskot-Aldrich 증후군으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 혈액 관련 질환의 치료제 스크리닝 방법.
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KR20160131569A (ko) 2015-05-08 2016-11-16 주식회사 케이씨텍 웨이퍼 처리 시스템

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