KR101625952B1 - 피마자유 정제 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 (i) 열 에너지 주사 불활성화 단계; (ii) 등온성 수증기 증류 단계; (iii) 염기 반응 불활성 여과 단계를 포함하고, 필요에 따라 (iv) 진공 건조 단계를 포함하는 피마자유 정제 방법 및 상기 정제 방법에 의하여 얻을 수 있는 정제된 피마자유에 관한 것이다.

Description

피마자유 정제 방법 {Method for purifying castor oil}

본 발명은 (i) 열 에너지 주사 불활성화 단계; (ii) 등온성 수증기 증류 단계; (iii) 염기 반응 불활성 여과 단계를 포함하고, 필요에 따라 (iv) 진공 건조 단계를 포함하는 피마자유 정제 방법 및 상기 정제 방법에 의하여 얻을 수 있는 정제된 피마자유에 관한 것이다.

인도·아시아·북아프리카 원산지인 피마자는, 버들옻과에 속하는 일년생 풀 풀이지만 열대지방에서는 다년생으로 자란다. 인도, 중국, 브라질이 주 생산지이며 씨앗의 기름인 피마자유는 윤활제, 코팅제, 화장품, 세제 등 다양하게 산업적 용도로 쓰이며 전통적 민간요법 또는 변비 등 다양한 내외용 치료제로도 사용되고 피마자박은 비료나 연료로 쓰인다.

그러나 피마자의 씨에는 리신 (ricin) 등의 매우 유독한 성분이 들어있기 때문에 씨앗 자체를 복용하는 것은 위험한 것으로 알려져 있다.

씨에는 지질이 30-50%, 단백질 (약 26%) 글로불린, 누클레오알부민, 글리코르포테인, 독성 알부민인 리신, 리파제 그리고 독성이 있는 알칼로이드인 리시닌 0.2%, 등이 있으며, 지질의 85%는 리시놀산의 글리세리드로 되어있고, 소량의 9, 10-디히드록시스테아린산의 글리세리드, 올레인산, 리놀레인산의 글리세리드가 섞여 있다.

피마자는 설사 작용이 있는 바, 이 작용은 씨기름이 알카리성 장액에 의해서 리시놀산과 글리세린으로 물분해되는 과정에서 생기며, 피마자를 생으로 먹으면 중독 작용이 나타나고 독성알부민 리신은 매우 강한 독작용이 있는 것으로 알려져 있다. 일반적으로 100℃ 이상의 온도로 열을 가하여 피마자의 독성 성분인 리신을 변성시키고 압착하여 피마자유로 제조하여 사용한다. 이러한 독성 물질은 피마자 씨앗의 껍질에 대부분 존재하므로 피마자 씨앗을 압착하여 얻은 피마자유를 약용으로 복용함이 일반적이다.

일반적으로 피마자유의 효율적 분리를 위해 열처리를 거친 피마자를 압착하는 방법으로 피마자유를 제조하고 있다. 처리된 피마자 종자에 독성 물질이 남아 있더라도 압착 후 피마자 박에 독성 물질이 주로 남게 되고 피마자유에는 극소량의 리신이 존재하리라 예측하고 있다.

KR20-0311169, KR10-2003-0024368에는 피마자유 독성을 제거하기 위하여 피마자 씨앗을 3-10 중량%의 소금이 혼합된 물에 넣어 피마자 씨앗의 표면이 터질 때까지 삶는 단계와, 표면이 터진 피마자 씨앗을 상온의 물에 넣어 3-5 일간 방치하거나 물로 수회 (3회 이상) 반복하여 삶는 단계와 피마자를 건조 후 볶아서 피마자유를 유출하는 단계를 거쳐 제조하는 방법이 제시되어 있다.

KR10-0615111에는 위의 방법에서 소금 대신 연옥이 함유된 물을 이용하여 피마자를 찌고, 또 연옥물에 세척하는 방법을 이용하고 있다.

CN 101709245에는 초벌 여과한 피마자유를 무기 세라믹 멤브레인 튜브를 이용하여 여과하여 degumming 하고 활성탄으로 탈색 후 다시 여과하여 의약용으로 정제하는 방법이 제시되어 있다.

그러나, 피마자를 특히 약용 등 그 독성 제거가 보장된 상태로 사용하여야 할 경우에 있어서는 부작용 없이 안전하고 간편하게 복용할 수 있도록 더 높은 수준으로 독성을 제거함이 요구되며, 이러한 약제학적 수준의 고급 정제 방법은 현재까지 전무한 실정이다. 또한, 기존 어떠한 방법으로도 정밀한 수준의 리신의 직접적인 함유량 측정은 제시되지 못하였다. 따라서, 피마자유에 포함된 리신 등의 독성 물질을 보다 안전한 수준으로 제거하고 이를 정밀하게 확인할 수 있는 고급 정제 방법에 대한 요구가 있다.

본 발명의 목적은 (i) 열 에너지 주사 불활성화 단계; (ii) 등온성 수증기 증류 단계; (iii) 염기 반응 불활성 여과 단계를 포함하고, 필요에 따라 (iv) 진공 건조 단계를 포함하는 피마자유 정제 방법 및 상기 정제 방법에 의하여 얻을 수 있는 정제된 피마자유를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 (i) 열 에너지 주사 불활성화 단계; (ii) 등온성 수증기 증류 단계; (iii) 염기 반응 불활성 여과 단계를 포함하는 피마자유 정제 방법을 제공한다.

상기 피마자유 정제 방법은 (iv) 진공 건조 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 피마자유 정제 방법에 있어서, 상기 단계 (i)은 80 내지 140℃에서 이루어지는 가열 공정을 1회 이상 포함할 수 있다.

상기 가열 공정은 80 내지 100℃에서 이루어지는 제1 가열 공정, 120 내지 140℃에서 이루어지는 제2 가열 공정 및 110 내지 제130 ℃에서 이루어지는 제3 가열 공정을 포함할 수 있다.

상기 피마자유 정제 방법에 있어서, 상기 단계 (ii)는 100 내지 120℃에서 이루어지는 수증기 증류 공정을 1회 이상 포함할 수 있다.

상기 수증기 증류 공정은 110 내지 120℃에서 이루어지는 제1 수증기 증류 공정 및 100 내지 110℃에서 이루어지는 제2 수증기 증류 공정을 포함할 수 있다. 상기 피마자유 정제 방법에 있어서, 상기 단계 (iii)은 염기성 필터를 이용하여 이루어질 수 있다.

상기 염기성 필터는 알칼리 금속, 알칼리 토금속으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 금속을 포함할 수 있다.

상기 염기성 필터는 활성화된 분쇄 패각 분말 또는 중탄산나트륨을 포함할 수 있다.

상기 피마자유 정제 방법에 있어서, 상기 단계 (iv)는 60 내지 100℃에서 이루어지는 진공 건조 공정을 1회 이상 포함할 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 피마자유 정제 방법에 의하여 정제된 피마자유로서, 리신 (ricin) 및/또는 리시닌 (ricinine)을 10 ppm 이하로 함유하는 피마자유를 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 (i) 열 에너지 주사 불활성화 단계; (ii) 등온성 수증기 증류 단계; (iii) 염기 반응 불활성 여과 단계를 포함하는 피마자유 정제 방법을 제공한다.

종래 여러 가지 정제 방법에서는 리신 정량을 통해 제조된 피마자유에 리신이 제거됨을 보여주지 못하고 있는 바, 본 발명에서는 리신 항체를 이용한 효소면역분석법 (ELISA)을 통하여 리신을 정량하여 확인함으로써 리신이 거의 완전히 제거될 수 있는 새로운 피마자유 정제 방법을 제시하고 있다.

리신은 66 kDa 크기의 식물성 렉틴으로, A 사슬과 B 사슬이 아미노산 시스틴 사이의 이황화 결합으로 연결된 구조 (도 2)를 가지고 있다. 리신이 독성을 나타내기 위해서는 두 사슬이 모두 필요하다. 리보솜을 이루고 있는 리보솜 RNA의 특정 염기 사슬을 인식해 잘라 단백질 합성을 못하게 만드는 건 활성 부위를 가진 34 kDa의 267개 아미노산으로 구성된 N-글리코시드 가수분해효소인 A 사슬이다. 그러나 그 이전에 리신이 세포 안으로 들어갈 수 있게 세포 표면의 당 (갈락토오스) 잔기에 달라붙는 작용을 하는 건 34 kDa의 262개 아미노산을 가진 B 사슬이다. 리신이 세포 표면에 달라붙으면 세포 표면이 안으로 꺼지며 세포질로 들어가는 내포작용이 일어난다. 세포가 단백질을 만들지 못하면 결국은 대사가 제대로 일어나지 못해 죽게 된다.

이런 리신은 알칼리에 용해성이 있으며 단백질로 구성된 활성 부위 (active site)를 갖고 있으므로 알칼리 용액으로의 세척이나 열처리에 의한 단백질 변성으로 인한 활성 부위 손상으로 활성을 잃게 할 수 있도록 본 발명에서는 최초로 열 에너지 주사 불활성화, 등온성 수증기 증류, 염기 반응 불활성 여과 등의 복합 과정을 통한 리신 제거 방법을 실험을 통해 정립하였다.

리신의 분석 방법으로 ELISA 분석 (Enzyme Link Immuno Sorbent Assay)이나 LC/MS/MS를 이용 할 수 있겠고, LC/MS 방법은 면역 친화력을 이용하여 LC/MS로 리신을 검출하거나 리신 A 사슬에 의해 합성 RNA 기질로부터 분리된 아데닌을 LC/MS로 검출하는 방법들이 있겠으나 본 발명에서는 리신 항체를 이용한 분석법으로 매우 미량도 정량분석 할 수 있는 장점이 있는 ELISA 분석법을 사용하였다.

따라서, 일 구현예에 있어서 본 발명은 (i) 열 에너지 주사 불활성화 단계; (ii) 등온성 수증기 증류 단계; (iii) 염기 반응 불활성 여과 단계를 포함하는 피마자유로부터 리신을 제거하는 방법일 수 있다.

상기 피마자유 정제 방법은 (iv) 진공 건조 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 피마자유 정제 방법에 있어서, 원료 물질인 피마자유는 피마자 고유의 독성을 제거하기 위하여 피마자 씨앗을 소금물, 좋기로는 3 내지 10 중량%의 소금이 혼합된 물에 넣어 피마자 씨앗의 표면이 터질 때까지 삶고, 표면이 터진 피마자 씨앗을 상온의 물에 넣어 3-5 일간 방치한 후, 껍질을 제거한 후 건조된 피마자를 볶아서 피마자유를 유출하는 과정을 거쳐 얻어진 것일 수 있다. 소금물에 피마자를 넣어 삶는 단계에서 소금이 포함되지 않은 맑은 물에 넣어 삶는 단계를 수회 반복하여도 좋다. 상기와 같이 피마자를 삶는 과정을 거침으로써, 피마자유의 독성이 열변성을 일으켜 약화되므로 일정 수준으로는 제독될 수 있다. 또한, 삶은 피마자를 상온의 물에 넣어 3-5 일간 방치하는 과정에 있어서도 남아있는 독성이 우려나오기 때문에 또 한차례 제독이 가능할 수 있다. 이어서, 건조된 피마자를 볶은 후 압출하여 본 발명의 정제 방법의 원료 물질인 피마자유를 얻을 수 있다.

한편, 상기 원료 물질이 되는 피마자유는 시판되는 것을 사용하여도 무방하다.

종래 기술에 나타나 있는 주지의 기법들 역시 리신이 가열에 의하여 변성되어 제독될 수 있다는 점을 주장하고 있다. 피마자를 이용함에 있어서 상기 종래 기술들은 피마자 종자를 가열 (물에 넣어서 삶거나, 여기에 각종 보조 성분을 더하는 공정이 추가될 수 있다)하거나 직접 볶는 방법을 통하여 열을 가하여 독성을 저감한다고 주장하고 있다.

본 발명은 약제학적 수준의 피마자유의 정밀 정제 (제독)방법인 것으로, 특정 구현예에 있어서는 피마자유로부터 리신을 거의 완전하게 제독하는 정제 방법이다. 이러한 리신의 완전 제독을, 리신 항체를 이용하여 ELISA와 같은 극미량 검출 실험으로 입증하였고, 이하 실시예로 입증되는 바 본 발명의 피마자유 정제 방법에 의한 리신 제독의 효율은 리신 불검출 수준의 제독으로서 매우 우수하다.

본 발명의 피마자유 정제 방법에 포함되는 상기 (i) 열 에너지 주사 불활성화 단계는, 본 발명에서 목적하고 있는 피마자유의 약제학적 수준의 고급 정제 방법에 있어서 시판 또는 전술한 바와 같이 일정 수준으로 제독된 피마자유 원료 물질에 잔존하고 있는 단백질계 독성 물질들을 열 변성시켜 제독하기 위한 단계이다.

피마자유에는 리신 (ricin), 리시닌 (ricinine) 등의 단백질계 산성 독성 물질들이 존재한다.

특히, 리신은 강력한 단백질 독소로서, 이러한 단백질을 가열하게 되면 그 2-4차 구조가 변화하면서 응고 또는 겔화되게 되므로 열처리를 통하여 이를 변성시키고 이는 추후 변성된 단백질을 제거하는 분리 과정에 대한 선수 전처리 과정일 수 있다. 단백질의 열 변성, 즉 열 불활성화를 일으키는 온도는 단백질에 따라서 다르고, 실온에서부터 100℃ 이상까지 폭넓은 범위에서 가능하지만 일반적으로 65 내지 100℃에서 단백질과 같은 고분자 구조가 변화하게 되며, 대부분 단백질의 경우 열 불활성화는 비가역적인 것일 수 있다.

따라서, 상기 피마자유 정제 방법에 있어서, 상기 단계 (i)은 리신 또는 리시닌과 같은 피마자유에 함유되어 있는 단백질계 독성 물질을 열 불활성화 시키기 위하여 80 내지 140℃에서 이루어지는 가열 공정을 1회 이상 포함할 수 있다.

일 구현예에 있어서, 상기 가열 공정은 80 내지 100℃에서 이루어지는 제1 가열 공정, 120 내지 140℃에서 이루어지는 제2 가열 공정 및 110 내지 제130 ℃에서 이루어지는 제3 가열 공정을 포함할 수 있다. 상기 온도는 리신의 변성 불용화 에너지의 효율성을 증대시키고 연속적으로 차기 공정을 진행하기 위하여 선택되는 것이다. 또한, 상기 가열 공정은 약 0.5 내지 2 시간 동안 행한다. 반응 시간이 0.5 시간 미만이면 열 불활성화 효과가 충분하지 않으며, 2 시간 정도 반응시키면 단백질 변성이 충분히 진행되어 더 이상 반응이 진행되지 않음으로 그 이상 반응시키는 것은 비경제적일 수 있다. 이러한 본 발명의 특이적인 반복적 가열 공정을 통하여 리신 또는 리시닌의 약 95-99.9% 이상이 제독될 수 있다.

또한, 본 발명에서 이루어지는 상기 열 불활성화는 종래 기술들에서 사용하고 있는 피마자 종자를 대상으로 한 가열 주사 과정이 아니라 1차 압착 추출된 피마자유를 대상으로 이루어진다는 점에 있어서 열 에너지의 전달 수준 및 그로부터 결과하는 리신 등의 독성 단백질에 대한 변성 효과가 상이한 것일 수 있고, 열 불활성화 이전의 피마자유 대비 열 에너지 주사 불활성화 단계 수행 후의 제독 효율 약 95% 이상으로서 비록 본 단계에서 사용되는 피마자유가 1차 압착 추출시 이미 가열 과정을 거쳐 얻어진 피마자유인 경우에도 그로부터의 제독 효율이 매우 우수하다는 장점이 있다.

피마자유는 313℃에 이를 정도로 끓는점이 높고, 물에 거의 녹지 않는 유기 화합물이기 때문에 여기에 수증기를 불어넣어, 그 물질의 끓는점보다 낮은 온도에서 수증기와 함께 유출되어 나오는 물질의 증기를 냉각하여, 물과의 혼합물로서 응축시키고 그것을 분리시키는 수증기 증류 공정을 통하여 1차적인 독성 성분의 분리가 개시될 수 있다.

따라서, 상기 피마자유 정제 방법에 있어서, 상기 단계 (i)의 열 에너지 주사 불활성화 단계와 더불어 또는 그 이후에 단계 (ii)로서 수증기 증류 단계가 수행될 수 있고, 상기 단계 (ii)는 100 내지 120℃에서 이루어지는 수증기 증류 공정을 1회 이상 포함할 수 있다.

일 구현예에 있어서, 상기 (i) 열 에너지 주사 불활성화 단계를 거친 피마자유에 물을 가하고 가열함으로써 수증기 증류 공정이 수행될 수 있다. 물과 피마자유는 서로 섞이지 않으므로, 이들의 혼합물을 가열하면, 각 물질은 각각 단독으로 가열되었을 때와 동일한 증기압을 보이므로, 수증기와 피마자유의 증기압의 합이 대기압과 같아지면 외부로 유출되게 되고, 피마자유의 끓는점보다 낮은 온도에서 물과 함께 유출시킬 수가 있다. 수증기 증류를 통하여 보통의 증류법을 이용하는 경우 피마자유가 분해되어 변질될 염려를 불식시키고, 수증기 증류를 이용하는 경우 끓는점보다 저온의 환경에서도 상당히 높은 증기압을 갖기 때문에 이를 피마자유의 분리, 정제 과정 중에 포함시키는 경우 정제 효율상 유리한 장점이 될 수 있다. 또한, 수증기 증류법을 이용하게 되면 피마자유는 물과 섞이지 않아 응축 후에 두 액층으로 분리되게 되므로 이후의 정제 단계에 있어서의 편리성 또한 제공할 수 있다.

일 구현예에 있어서, 상기 수증기 증류 공정은 110 내지 120℃에서 이루어지는 제1 수증기 증류 공정 및 100 내지 110℃에서 이루어지는 제2 수증기 증류 공정을 포함할 수 있다. 상기 온도 범위의 수증기 증류 공정을 통하면 물층에서 대기압보다 높은 분자 활성도를 유지함으로 피마자유 내의 수분 축적을 조절하고 리신 등 독성 물질의 용해 불용화 및 제거 효율을 증대시킬 수 있다. 또한 수증기 증류 공정은 분자량에 상관없이 효능이 유지되는 추출 특징을 갖는다. 상기 수증기 증류 공정은 약 0.5 시간 정도 행한다. 반응 시간이 10 분 미만이면 증류 분별이 충분히 진행되지 않기 때문이다. 상기 본 발명의 특이적인 반복적 수증기 증류 공정을 통하여 수증기 증류 공정에 유입된 리신 또는 리시닌의 약 65-95% 이상이 더 제거될 수 있다.

이러한 수증기 증류 단계는 물질 특성상, 액상인 피마자유를 대상으로 하는 경우에만 이루어질 수 있고, 종래 이 기술 분야에서 피마자를 제독하는 방법인 고상의 피마자 종자를 대상으로 하는 방법에 있어서는 상기의 과정을 원천적으로 거칠 수 없다. 따라서 피마자유를 정제 대상으로 하고 있는 본 발명은 액상 조건이라는 장점을 활용하여 증류 수행이 가능하므로 리신 등의 제독 효율을 더욱 높일 수 있는 것이다.

상기 피마자유 정제 방법에 있어서, 상기 단계 (ii)의 수증기 증류 단계 이후에 단계 (iii)인 염기 반응 불활성 여과 단계 수행될 수 있다. 이러한 여과 단계를 통하여 증류 단계 이후 추가적인 독성 성분의 제거가 이루어질 수 있다.

일 구현예에 있어서, 수증기 증류 공정 후 정제 과정 중의 피마자유를 함유한 혼합물은 약 80 내지 110℃의 온도에서 염기 반응 불활성 여과 단계로 바로 투입될 수 있다. 이러한 염기성 여과를 통하여 리신 또는 리시닌은 여과 단계에 유입된 리신 또는 리시닌의 약 80% 이상이 더 제거될 수 있다.

상기 단계 (iii)은 염기성 필터를 이용하여 이루어질 수 있고, 단백질 정제에 사용되는 필터로서 pH 8.5 이상의 염기성 충진 물질을 포함하는 것이면 어떠한 필터라도 무방하다.

일 구현예에 있어서, 상기 염기성 필터는 알칼리 금속, 알칼리 토금속으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 금속을 포함할 수 있다. 따라서, 상기 염기성 필터는 주기율표 1족에 속하는 알칼리 금속인 리튬, 나트륨, 칼륨, 루비듐, 세슘, 주기율표 2족에 속하는 알칼리 토금속인 베릴륨, 마그네슘, 칼슘, 스트론튬, 바륨으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 금속을 포함할 수 있다.

또한, 상기 염기성 필터는 활성화된 분쇄 패각 분말 또는 중탄산나트륨을 포함할 수 있다.

탄산칼슘을 그 구성성분으로 하고 있는 굴껍질, 꼬막, 바지락, 제첩, 조개 등의 패각류는 탄산 칼슘을 그 구성 성분으로 하고 있기 때문에 이를 소성하여 산화칼슘 분말로 제조, 필터에 충진하면 본 발명의 염기 반응 불활성 여과 단계에 적합한 염기성 필터로 사용할 수 있다. 이러한 분쇄 패각 분말은 굴껍질, 꼬막, 바지락, 제첩, 조개 등의 패각류를 세척하고 건조하여 분쇄하는 분쇄공정과; 세척 분쇄된 패각을 열처리하는 소성공정과; 소성된 패각분을 미세 분말로 분말화하는 공정을 거쳐 제조될 수 있다.

상기 염기 반응 불활성 여과 단계 역시 상기 증류 단계와 마찬가지로 물질 특성상, 액상인 피마자유를 대상으로 하는 경우에 그 수행이 비로소 가능하므로, 종래 이 기술 분야에서 피마자를 제독하는 방법인 고상의 피마자 종자를 대상으로 하는 방법에 있어서는 상기의 과정을 원천적으로 거칠 수 없다. 따라서 피마자유를 정제 대상으로 하는 본 발명과 같은 경우에만 상기 두 가지 단계 수행이 가능하므로 리신의 제독 효율을 더욱 높일 수 있다.

수분을 포함하지 않는 순수 고급 정제된 피마자유를 얻기 위하여, 상기 피마자유 정제 방법은 필요에 따라 상기 단계 (i) 내지 (iii)을 거친 피마자유를 함유한 혼합물을 탈수시키는 단계로서 (iv) 진공 건조 단계를 더 포함할 수 있고, 상기 단계 (iv)는 60 내지 100℃에서 이루어지는 진공 건조 공정을 1회 이상 포함할 수 있다. 상기 진공 건조 공정은 약 0.5 내지 2 시간 동안 행하여 정제 단계 중 포함된 수분이 80% 이상 제거될 수 있도록 하는 것이 좋다.

상기 진공 건조 공정은 0.6 기압 이하의 감압하에서 이루어질 수 있고, 상술한 바와 같이 피마자유는 끓는점이 높기 때문에 감압하에서 끓는점을 저하시키고 저온도로 계속 유지하면서 수분을 증발시키면 고체와 마찬가지로 탈수가 가능하기 때문에 이러한 진공 건조 방식으로 본 발명에서 목적하는 고급 피마자유 정제 방법을 완성할 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 피마자유 정제 방법에 의하여 정제된 피마자유로서, 리신 (ricin) 및/또는 리시닌 (ricinine)을 10 ppm (0.001 중량%) 이하로 함유하는 피마자유를 제공한다.

본 발명은 (i) 열 에너지 주사 불활성화 단계; (ii) 등온성 수증기 증류 단계; (iii) 염기 반응 불활성 여과 단계를 포함하고, 필요에 따라 (iv) 진공 건조 단계를 포함하는 피마자유 정제 방법 및 상기 정제 방법에 의하여 얻을 수 있는 정제된 피마자유를 제공하고자 한 것으로서, 특히 약제학적 분야에서 요구되고 있는 단백질계 독성 물질인 리신, 리시닌이 10 ppm 이하로 함유된 고순도 피마자유를 제공할 수 있다.

본 발명에서 제공하는 고급 피마자유 정제 방법에 기초하면 피마자를 부작용 없이 안전하고 간편하게 복용할 수 있도록, 약제학적 수준의 초 고순도 피마자유를 제공할 수 있게 되며, 피마자유에 포함된 리신 등의 독성 물질을 보다 안전한 수준으로 제거하는 고급 정제 방법에 대한 수요를 충족시킬 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 피마자유 정제 공정을 설명하기 위한 공정도이다.
도 2는 리신 단백질의 구조를 보여준다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

실시예 1: 피마자유의 정제

1. 원료 물질 피마자유 제조

피마자 씨앗을 5 중량%의 소금물에 넣어 피마자 씨앗의 표면이 터질 때까지 삶고, 표면이 터진 피마자 씨앗을 상온의 물에 넣어 5 일간 방치한 후, 껍질을 제거하였다. 그 후 건조된 피마자를 볶아서 압출하여 정제 대상이 되는 원료 물질인 피마자유를 얻었다.

2. 열 에너지 주사 불활성화 후 시료 내 리신의 정량

상기 원료 물질 피마자유를 50 ml 튜브에 30 ml로 채워 각각 85±5℃, 130±5℃, 120±5℃에서 2 시간씩 가열하여 본 발명의 열 에너지 주사 불활성화 단계를 거친 시료를 얻었다.

피마자유에서 수용성 용제의 추출을 통하여 리신 함유량을 측정하기 위하여 하기와 같이 시료를 추가 처리하였다.

분획 플라스크에 pH 4.0 증류수 (아세트산으로 pH조절)와 상기 시료를 1:5로 넣어 뚜껑을 닫고 흔들어 잘 섞어주었다. 약 하루 동안 정치하여 오일층과 버퍼층이 나뉘도록 하고 층이 나뉘면 코크를 열어 버퍼층만 분리하였다. 이때, 처음, 중간, 끝 세 번에 나누어 분리하며 중간 분리액을 시험에 사용하였다. 얻어진 시료를 제1 시료로 칭하였다.

ELISA 플레이트에 capture antibody (Anti-Ricin toxin A chain antibody ab27169 (rabbit, polyclonal)) 100 μl를 첨가하고 4℃에서 하루 방치하여 Capture antibody coating을 수행하였다. Capture antibody를 희석할 때는 PBS를 사용하였고, 플레이트에서 액을 강하게 털어 제거하고 well당 300 μl의 PBS로 3회 세척하였다. Well 당 blocking buffer (1 % BSA in PBS, BSA (Sigma, A7030-10G)) 300 μl를 첨가하고 1 시간 동안 실온에 방치하여 블로킹하였다. 플레이트에서 액을 강하게 털어 제거하고 상기 제1 시료를 well 당 100 μl로 첨가하였다. 플레이트에서 액을 강하게 털어 제거하고 well 당 300 μl washing buffer (0.05% Tween®20 in PBS, Tween®20 (Fisher Scientific, BP337-100))로 3회 세척하였다. 각 웰에 detection antibody (Ricin alpha Antibody RA999 (mouse, monoclonal)) 100 μl를 첨가하고 1시간 30분 동안 실온에 방치하였다. 플레이트에서 액을 강하게 털어 제거하고 well당 300 μl washing buffer로 3회 세척하였다. Secondary antibody (α-Mouse: Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody) 100 μl를 첨가하고 1시간 30분 동안 실온에 방치하였다. 플레이트에서 액을 강하게 털어 제거하고 well당 300 μl washing buffer로 3회 세척하였다. 기질 시액 (TMB, KPL) 100 μl를 첨가하고 20 분 동안 실온에 방치하였다. 0.1 N H₂SO₄ 100 μl를 첨가한 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도 측정 결과 제1 시료의 흡광도는 리신이 전혀 함유되지 않은 대조군 blank 값과 차이를 나타내지 않았다 (ND).

3. 등온성 수증기 증류 후 시료 내 리신의 정량

상기 원료물질 피마자유를 110℃로 유지하면서 30 분간, 100℃로 유지하면서 30 분간 두 차례에 걸쳐 수증기 증류 공정을 실시하여 시료를 얻었다.

Micro centrifuge tube에 상기 원료물질 피마자유 500 μl, pH 4.0 증류수 (아세트산으로 pH조절) 100 μl를 넣고 혼합하였다. 상기 혼합물을 110℃로 유지하면서 30 분간, 100℃로 유지하면서 30 분간 두 차례에 걸쳐 수증기 증류 공정을 실시하고 14,000 rpm에서 10 분 원심 분리한 후 버퍼층을 분리하여 새 microcentrifuge tube에 넣었다. 남은 오일에 다시 pH 4.0 증류수 100 μl를 넣고 혼합하였다. 14,000 rpm에서 10 분 원심 분리한 후 버퍼층을 분리하여 새 microcentrifuge tube에 넣었다. 남은 오일로부터 버퍼층을 분리하는 상기 과정을 한 번 더 반복하여 제2 시료를 얻었다. 분리한 제2 시료를 대상으로, 상기 2. 에서와 같이 ELISA 과정을 수행하고 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도 측정 결과 제2 시료의 리신 제거 효율은 82.8%였다.

4. 염기 반응 불활성 여과 후 시료 내 리신의 정량

컬럼을 준비하여 sodium bicarbonate (Sigma, 792519-500G) 1 g을 채운 뒤 상기 원료물질 피마자유 10 ml을 넣고, 감압하여 여과하여 시료를 얻었다.

상기 시료에서 수용성 용제의 추출을 통하여 리신 함유량을 측정하기 위하여 2. 에서와 같이 시료를 추가 처리하였다. 얻어진 시료를 제3 시료로 칭하였다.

제3 시료를 대상으로, 상기 2. 에서와 같이 ELISA 과정을 수행하고 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 3 번의 흡광도 측정 결과 흡광도 측정 결과 제3 시료의 흡광도는 리신이 전혀 함유되지 않은 대조군 blank 값과 차이를 나타내지 않았다 (ND).

시험예 : 리신 정량을 위한 ELISA 분석의 신뢰성 검증

상기 실시예 1에서 열 에너지 주사 불활성화 후 시료 또는 염기 반응 불활성 여과 후 시료에 대하여 시행한 ELISA 분석 결과는 리신이 미검출 수준이었기 때문에 (원료 물질 피마자유에 함유된 리신의 초기 농도가 높지 않아 각 과정 수행 후 리신의 함유량이 검출 한계 미만인 것으로 보임), 리신 조단백 spiking을 통하여 본 발명의 ELISA 분석을 시행함으로써 본 ELISA 분석의 신뢰성을 검증하였다.

리신 조단백은 하기와 같이 제조하였다. 피마자 씨앗의 속을 분리하고, 피마자 속을 믹서기로 분쇄, 비커에 분쇄한 피마자 속과 ether를 동량으로 넣고 5 분 동안 잘 섞어준 후 50 ml conical tube에 넣고 4,800 rpm 에서 10 분 동안 원심 분리하였다. 상등액을 유리 bottle에 모으고 펠렛은 비커에 다시 모아 분쇄 및 ether 혼합 추출 과정을 3번 더 반복하였다 (총 4번). 최종적으로 남은 펠렛은 상온에서 공기 중에서 건조시켜, 상기 과정에 걸쳐 피마자 지질을 제거하였다. 50 ml tube에 시료 (지질을 제거한 피마자 속) 2 g과 pH 4.0 증류수 (아세트산으로 pH조절) 10 ml를 넣었다. Tube를 얼음에 박아 차가운 상태로 homogenizer를 최대 속도로 하여 "분 분쇄 후 30분 4℃ 보관" 10번 반복하였다. 4℃에서 밤새 방치하고 4,800 rpm에서 10 분 동안 원심 분리하여 상등액을 취하였다. 상등액을 0.45 μm filter로 filtering하였다. 제조된 리신 조단백은 4℃에서 보관하였다.

1. 열 에너지 주사 불활성화 후 spiking 시료 내 리신의 정량

50 ml tube에 피마자유 30 ml와 리신 조단백을 넣고 실시예 1에서와 같이 각각 85±5℃, 130±5℃, 120±5℃에서 2 시간씩 가열하였다. 가열된 시료를 실온으로 식혀 실시예 1에서와 같이 ELISA 과정을 수행하고 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도 측정 결과 계산된 가열 전 시료의 초기 리신 농도와 가열 후 농도를 하기 표 1에 나타내었다.

초기 리신 농도 (μg/ml)	240	200	24	20	2.4	2.0	0.24	0.2
가열 후 리신 농도 (μg/ml)	1.87	1.69	0.09	0.03	ND	ND	ND	ND

상기의 실험 결과로부터, 본 발명 열 에너지 주사 불활성화 단계를 거친 후

잔류 리신의 농도는 리신 초기 농도 20 μg/ml 이하의 경우 ELISA 분석에 의하여 불검출되는 수준으로 완전히 제거됨을 확인하였다.

2. 등온성 수증기 증류 후 spiking 시료 내 리신의 정량

Micro centrifuge tube에 상기 피마자유 500 μl 4.0 증류수 (아세트산으로 pH조절) 100 μl, 리신 조단백 10 μl를 넣고 혼합하였다. 상기 혼합 시료를 110℃로 유지하면서 30 분간, 100℃로 유지하면서 30 분간 두 차례에 걸쳐 수증기 증류 공정을 실시한 후 식혀 14,000 rpm에서 10 분 원심 분리한 후 버퍼층을 분리하여 새 microcentrifuge tube에 넣었다. 남은 오일에 다시 pH 4.0 증류수 100 μl를 넣고 혼합하였다. 14,000 rpm에서 10 분 원심 분리한 후 버퍼층을 분리하여 새 microcentrifuge tube에 넣었다. 남은 오일로부터 버퍼층을 분리하는 상기 과정을 한 번 더 반복하였다. 분리한 완충 용액을 대상으로, 상기 실시예 1에서와 같이 ELISA 과정을 수행하고 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료의 리신 제거 효율을 하기 표 2에 나타내었다.

초기 리신 농도 (μg/ml)	120	60	30
증류 후 리신 농도 (μg/ml)	39.4	6.88	2.47

상기의 실험 결과로부터, 본 발명 등온성 수증기 증류 단계를 거친 후 리신의 제거 효율은 각각 68.2%, 88.5%, 91.8%에 이르는 것으로 확인되었다. 초기 리신 농도가 낮을수록 제거 효율이 더욱 증가하는 유의성을 나타내었다.

3. 염기 반응 불활성 여과 후 spiking 시료 내 리신의 정량

상기 실시예 1에서와 같이 컬럼을 준비하여 sodium bicarbonate 1 g을 채운 뒤 피마자유 10 ml 및 기지량의 리신 조단백을 넣고 혼합하였다. 혼합물을 감압 여과하여 시료를 얻었다. 실시예에서와 같이 ELISA 과정을 수행하고 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

초기 리신 농도 (μg/ml)	240	24	2.4	0.24
여과 후 리신 농도 (μg/ml)	ND	ND	ND	ND

상기의 실험 결과로부터, 본 발명 염기 반응 불활성 여과 단계를 거친 후

잔류 리신의 농도는, 리신 초기 농도가 240 μg/ml 수준으로 높은 경우에도 염기성 여과 후 ELISA 분석에 의하여 불검출되는 수준으로 완전히 제거됨을 확인하였다.

이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

Claims (11)

1. 압착 피마자유를 대상으로,
   (i) 열 에너지를 주사하여 단백질을 불활성화하는 단계;
   (ii) 등온성 수증기 증류 단계; 및
   (iii) 염기 반응을 통하여 단백질을 불활성화하는 여과 단계
   를 포함하고, 상기 단계 (i)은 80 내지 140℃에서 이루어지는 가열 공정을 1회 이상 포함하는 것인 피마자유 정제 방법.
2. 제1항에 있어서, (iv) 진공 건조 단계를 더 포함하는 것인 피마자유 정제 방법.
3. 삭제
4. 제1항에 있어서, 상기 가열 공정은 80 내지 100℃에서 이루어지는 제1 가열 공정, 120 내지 140℃에서 이루어지는 제2 가열 공정 및 110 내지 제130 ℃에서 이루어지는 제3 가열 공정을 포함하는 것인 방법.
5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 단계 (ii)는 100 내지 120℃에서 이루어지는 수증기 증류 공정을 1회 이상 포함하는 것인 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 수증기 증류 공정은 110 내지 120℃에서 이루어지는 제1 수증기 증류 공정 및 100 내지 110℃에서 이루어지는 제2 수증기 증류 공정을 포함하는 것인 방법.
7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 단계 (iii)은 염기성 필터를 이용하여 이루어지는 것인 방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 염기성 필터는 알칼리 금속, 알칼리 토금속으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 금속을 포함하는 것인 방법.
9. 제7항에 있어서, 상기 염기성 필터는 활성화된 분쇄 패각 분말 또는 중탄산나트륨을 포함하는 것인 방법.
10. 제2항에 있어서, 상기 단계 (iv)는 60 내지 100℃에서 이루어지는 진공 건조 공정을 1회 이상 포함하는 것인 방법.
11. 제1항 또는 제2항에 기재된 방법에 의하여 정제된 피마자유로서, 리신 (ricin) 및/또는 리시닌 (ricinine)을 10 ppm 이하로 함유하는 피마자유.

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