KR101617863B1 - 종양 억제 효능을 갖는 안정화된 알파-헬릭스 구조를 포함하는 자기조립 나노구조체 및 이의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 안정화된 다중 알파-나선 구조를 포함하는 자기조립 나노구조체에 관한 것으로서 열적 안정성과 단백질가수분해효소에 대한 저항성이 우수하여 생체 내에서 분해가 쉽게 이루어지지 않으므로 장기간 활성을 유지할 수 있다. 또한, 상기 나노구조체의 알파-헬릭스 형성단편은 p53 단백질에서 유래된 아미노산 서열을 포함하므로 p53과 MDM2간의 상호작용을 저해하며 이로 인해 종양 억제 효과를 나타낸다. 이러한, 상기 자기조립 나노구조체는 단백질과 관련된 생명공학 및 의학 연구에 상당히 기여될 것이며, 유용한 치료제 및 억제제로의 응용 가능성이 높을 것으로 예상된다.

Description

종양 억제 효능을 갖는 안정화된 알파-헬릭스 구조를 포함하는 자기조립 나노구조체 및 이의 제조방법{self-assembled nanostructure having Stabilized alpha-helical that can inhibit tumor and method for preparing the thereof}
본 발명은 안정화된 알파-헬릭스 구조를 포함하는 자기조립 나노구조체에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 알파-헬릭스 형성단편, 베타-시트 형성단편을 포함하는 다수의 고리형 펩타이드가 자기조립하여 이루어진 나노구조체와 이를 제조하는 방법에 관한 것이다.
최근 나노입자를 이용한 약물 전달 담체의 유용성이 대두되면서, 생체 내 치료 부위에 약물 혹은 생물학적 활성분자를 전달하기 위하여 다양한 인지질 소재 및 고분자의 합성을 통해 리포좀, 나노캡슐, 나노입자, 나노 에멀젼 등과 같은 보다 효과적인 나노구조체를 제조하려는 연구들이 주목 받고 있다. 특히, 고분자 나노입자가 생체세포에 점착하는 효율을 향상시키기 위하여 나노입자의 표면에 세포를 인식할 수 있는 점착분자를 접목시키고자하는 연구가 활발히 이루어지고 있다. 예를 들어, 난용성 약물을 가용화시킨 뒤 그 생체이용율을 증진시키기 위한 것이나, 단백질이나 유전자와 같은 거대 분자량의 약물의 생체내 흡수를 용이하게 하기 위한 것이나, 암 등의 난치성 질환에 사용하는 약물을 표적 세포에 특이적으로 전달하기 위해 세포인식 또는 세포점착 분자가 도입된 고분자 나노입자 혹은 리포좀에 대한 연구가 진행되고 있다.
그러나 상기 생물학적 활성분자로 생리활성 폴리펩타이드를 사용할 경우, 상기 폴리펩타이드의 구조 및 생물학적 활성이 환경변화에 취약하여 쉽게 변성되고, 혈액 내 단백질 가수분해효소에 의해 분해되어 쉽게 제거된다. 따라서, 약리성분으로 상기 폴리펩타이드를 이용하는 단백질 의약품은 혈중 농도 및 역가를 유지하기 위해서 상기 단백질 약물을 환자에게 자주 투여해야 한다는 문제가 존재한다.
이러한, 상기 문제를 해결하여 상기 단백질 약물이 생명체의 다양한 상호작용을 조절 또는 저해할 수 있는 약물로 사용되기 위해 장시간 생체 내에서 구조 및 활성을 유지할 수 있는 방안을 마련하는 것이 시급하다.
(특허 문헌 1) 미국등록특허 제5,859,184호
따라서, 본 발명의 목적은, 열적 안정성과 단백질가수분해효소에 대한 저항성이 우수하여 생체 내에서 분해가 쉽게 이루어지지 않으므로 장기간 활성을 유지할 수 있고, MDM2 단백질에 특이적으로 결합하여 p53 단백질에서 유래된 알파-헬릭스 형성단편과 상기 알파-헬릭스 구조를 안정화시키는 베타-시트 형성단편을 융합한 다수의 고리형 펩타이드를 포함하는 자기조립 나노구조체 및 이의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, 알파-헬릭스 형성단편, 베타-시트 형성단편을 포함하는 다수의 고리형 펩타이드가 자기조립하여 형성되는 자기조립 나노구조체를 제공한다.
또한, 상기 알파-헬릭스 형성단편은 종양 억제 단백질 p53의 아미노산 서열 17 번째 내지 28 번째인 것을 특징으로 하며, 하기 [서열번호 1] 또는 [서열번호 2]로 표시되는 것을 특징으로 한다.
[서열번호 1]
ETFSDLWKLLPE
[서열번호 2]
ETASDLWKLLPE
또한, 상기 베타-시트 형성단편은 하기 [서열번호 3]로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
[서열번호 3]
WKWEWYWKWEW
또한, 상기 고리형 펩타이드는 링커부를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 링커부는 하기 [화학식 4] 또는 [화학식 5]의 화합물 또는 세린-글리신-세린-글리신으로 이루어진 아미노산 서열인 것을 특징으로 한다.
[화학식 4]
Figure 112013059462396-pat00001
[화학식 5]
Figure 112013059462396-pat00002
또한, 상기 링커부은 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 고리형 펩타이드는 하기 [화학식 1] 내지 [화학식 3]로 표시되는 것으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 한다.
[화학식 1]
Figure 112013059462396-pat00003
[화학식 2]
Figure 112013059462396-pat00004
[화학식 3]
Figure 112013059462396-pat00005
또한, 본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, 하기 단계를 포함하는 자기조립 나노구조체의 제조방법을 제공한다.
ⅰ) 알파-나선 형성 단편을 포함하는 선형 펩타이드를 제조하는 단계,
ⅱ) 상기 선형 펩타이드를 고리형 펩타이드로 자기조립하는 단계, 및
ⅲ) 다수의 상기 고리형 펩타이드가 자기조립하여 상기 자기조립 나노구조체를 형성하는 단계.
또한, 본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, 상기 자기조립 나노구조체를 이용한 종양 억제 효과를 갖는 약물 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 알파-헬릭스 형성단편을 포함하는 다수의 고리형 펩타이드가 자기조립되어 나노구조체를 형성함으로써, 열적 안정성과 단백질가수분해효소에 대한 저항성이 우수하여 생체 내에서 분해가 쉽게 이루어지지 않으므로 장기간 활성을 유지할 수 있다. 또한, 상기 나노구조체의 알파-헬릭스 형성단편은 p53 단백질에서 유래된 아미노산 서열을 포함하므로 p53과 MDM2간의 상호작용을 저해하며 이로 인해 종양 억제 효과를 나타낸다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노구조체의 조합/자기조립의 반응 경로를 보여주는 개념도로서, 펩티드의 적색 부분은 생체활성을 나타내는 알파-헬릭스 형성단편이고, 청색 부분은 베타-시트 형성단편이다.
도 2a는 본 발명의 다른 실시예에 따른 나노구조체의 조합/자기조립 반응 경로를 보여주는 개념도이다.
도 2b는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 친수성 작용기가 결합된 고리형 펩타이드와 상기 고리형 펩타이드가 자기조립하여 형성된 나노구조체의 조합/자기조립 반응 경로를 보여주는 개념도이다.
도 3a은 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 알파-헬릭스 형성단편과 MDM2 단백질의 결합체 구조를 나타내는 모식도이다.
도 3b은 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 나노구조체와 MDM2 단백질간의 결합체가 형성되는 기작을 보여주는 개념도이다.
도 4는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 각기 다른 사슬길이의 링커부를 포함하는 고리형 펩타이드 구조를 나타내는 모식도이다.
도 5는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 링커부의 사슬길이가 고리형 펩타이드 내 알파/베타 구조의 안정화에 미치는 영향을 확인하기 위해 이색성 원편광 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6a는 본 발명의 실시예에 따른 폴리에틸렌글리콜(PEG)이 결합된 나노구조체을 인큐베이션할 경우, 반응 시간이 알파-, 베타- 구조의 안정도에 미치는 영향을 확인하기 위해 원편광이색성 분광 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6b는 온도가 p5317 -28 펩타이드를 포함하는 나노구조체의 알파-헬릭스 구조에 미치는 영향을 확인하기 위해 측정한 원편광이색성 분광분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6c는 본 발명에 따른 나노구조체의 알파-헬릭스 또는 베타-시트의 배열을 확인하기 위해 FR-IR 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6d는 본 발명에 따른 나노구조체의 동적 광산란에 의해 측정한 그래프이다.
도 7은 본 발명에 따른 나노구조체를 원자힘 현미경으로 측정한 사진이다
도 8은 본 발명에 따른 나노구조체와 MDM2 단백질과의 경쟁적 결합을 측정하기 위해 현광편광분석을 이용하여 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 단백질 분해효소에 대한 저항성과 민감성을 확인하기 위하여 HPLC로 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도10은 본 발명의 실시예에 따라 제조된 펩타이드 또는 나노구조체를 MALDI-TOF 질량분석기로 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 His6 태그된 MDM2 단백질의 과대발현 및 정제 과정에 따라 제조된 MDM2 단백질을 확인하기 위하여 측정한 결과를 나타내는 HPLC 분석 그래프와 SDS-PAGE 사진이다.
이하, 첨부된 도면들을 참조하여 본 발명을 상세히 설명한다.
우선, p53 단백질은 세포성장과 아폽토시스(apoptosis)에 관여하는 단백질로서 세포의 사멸에 관여하는 유전자의 발현을 조절하여 암 세포와 같은 비정상적인 세포의 발생을 효과적으로 차단한다. 세포 내에 p53 단백질이 많을 경우, MDM2 단백질의 발현이 증가되어 p53의 전이활성(transactivation) 부위에 결합하여 활성화 능력을 차단시키고, p53의 유비키틴화를 촉진하여 분해시킨다. 이와 같이 p53과 MDM2는 자동조절경로를 통하여 세포내에서 서로의 농도를 조절하는데, MDM2-p53의 세포내 밸런스가 무너지면 세포의 비정상화 또는 암을 유발하는 것으로 알려져 있으며 실제로 암세포에서 MDM2의 발현이 높다고 보고되었다. 이러한 p53 단백질은 MDM2(단백질 분해 유도 효소)과 HAUSP(단백질 분해 억제 효소)에 의한 유비키틴/프로테아좀(ubiquitin/proteasome) 경로를 통해 조절되므로 상기 MDM2의 기능을 억제하여 p53을 안정화하면 암 발생을 억제시킬 수 있다.
따라서, 본 발명은 알파-헬릭스 형성단편(a-helix segment)과 베타-시트 형성단편(β-sheet segment)을 포함하는 다수의 고리형 펩타이드가 자기조립하여 이루어진 자기조립 나노구조체에 관한 것으로서, 상기 알파-헬릭스 형성단편은 종양 억제 단백질인 p53의 전사 촉진 도메인(TAD)에 해당하는 부위의 아미노산 서열 또는 이에 상응하는 활성을 가지는 아미노산 서열을 가지므로 MDM2와 결합하는 p53 단백질 등의 경쟁적 기질로 작용할 수 있다. 따라서, 상기 나노구조체는 p53과 MDM2간의 결합체 형성을 저해하므로 종양 억제 효과를 나타낸다.
보다 상세하게, 상기 알파-헬릭스 형성단편은 p53 단백질에서 유래된 펩타이드로서, MDM2와 특이적 결합을 형성하며, 하기 [서열번호 1]로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
[서열번호 1]
ETFSDLWKLLPE
본 발명에 있어서, 상기 알파-헬릭스 형성단편은 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하며, 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상의 상동성을 가지면 본 발명의 종양 억제 활성을 나타낼 수 있으며, 또한, 본 발명의 실시예에서 상기 서열번호 1의 12개의 아미노산 서열 중 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 서열을 치환한 변이체도 종양 억제 활성이 있다. 또한, 상기 알파-헬릭스 변이체는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
[서열번호 2]
ETASDLWKLLPE
또한, 상기 베타-시트 형성단편은 서열번호 3로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
[서열번호 3]
WKWEWYWKWEW
본 발명에 있어서, 상기 알파-나선 형성 단편, 상기 베타-시트 형성단편을 포함하는 고리형 펩타이드(macrocyclic peptide)의 경우, 고리형 구조 내에서 분자가 속박(constrain)되므로 알파-나선 구조는 부분적으로 안정화되고, 나아가서, 상기 다수의 고리형 펩타이드가 자기조립하여 나노구조체를 형성하면, 고리형 펩타이드 내의 베타-시트 형성단편 간의 결합으로 유연한 코일형태에서 단단한 로드 형태로 전환되어 분자가 더욱 속박되므로 알파-나선 구조가 더욱 안정화된다. 이는, 전체적인 알파-나선 구조 부분의 구조 엔트로피(conformational entropy)와 분자배열의 이질성을 최소화하여 펩타이드 전체 구조가 안정화되었기 때문에 알파-나선 구조를 포함하는 다수의 고리형 펩타이드로 이루어진 자기조립 나노구조체의 제조가 가능하다.
또한, 본 발명에 따른 나노구조체의 고리형 펩타이드는 링커부 없이 결합될 수도 있지만, 바람직하게는 알파-헬릭스 형성단편의 종양 억제 활성에 방해가 되지 않을 정도 길이의 아미노산 서열을 갖는 링커에 의해 연결될 수도 있다. 상기 링커부로는 당업계에 공지된 다양한 링커를 이용할 수 있다. 본 발명에 적합한 링커부는 주로 글리신 또는 세린 아미노산과 기타 아미노산들로 구성되며, 그 길이는 1-6 개의 아미노산이 바람직하며, 보다 구체적으로 세린-글리신-세린-글리신으로 이루어진 아미노산 서열일 수 있다.
또한, 상기 링커부는 하기 [화학식 4] 또는 [화학식 5]의 화합물일 수 있다.
Figure 112013059462396-pat00006
Figure 112013059462396-pat00007
또한, 본 발명에 있어서, 상기 링커부는 폴리에틸렌글리콜(PEG, polyethylene glycol)을 더 포함할 수 있으며, 이를 통해 상기 자기조립 나노구조체가 혈액 내에서 순환될 경우, 안정성 향상과 면역원성의 감소 효과를 가질 수 있다.
또한, 상기 고리형 펩타이드는 하기 [화학식 1] 내지 [화학식 3]으로 표시되는 군으로부터 선택된 어느 하나의 것일 수 있다.
Figure 112013059462396-pat00008
Figure 112013059462396-pat00009
Figure 112013059462396-pat00010
본 발명의 다른 측면은 아래 단계들을 포함하는 상기 자기조립 나노구조체의 제조방법에 관한 것이다.
ⅰ) 알파-나선 형성 단편을 포함하는 선형 펩타이드를 제조하는 단계,
ⅱ) 상기 선형 펩타이드를 상기 고리형 펩타이드로 자기조립하는 단계, 및
ⅲ) 다수의 상기 고리형 펩타이드가 자기조립하여 제1항에 따른 나노구조체를 형성하는 단계를 포함하는 나노구조체의 제조방법.
도 1, 도 2 및 도 3b를 참조하면, MDM2를 인식할 수 있는 p53 종양 억제 단백질에서 유래된 아미노산 서열을 포함하고, 알파-헬릭스 구조를 갖는 펩타이드로서, 상기 알파-헬릭스 형성단편이 포함된 선형 펩타이드가 베타-시트 형성단편에 의한 고리화반응을 통해 고리형 펩타이드로 자기조립된다.
다음으로, 상기 고리형 펩타이드에서 소수성 부분인 베타-시트 형성단편의 자기조립에 의해 나노구조체를 형성한다.
이때, 가희석 효과(pseudo-dilution effect)와 분자내 고리화로 인한 엔트로피상의 불이익 감소를 위해 펩타이드가 수지에 결합된 상태에서 고리화 반응을 진행할 수 있다.
본 발명에 있어서, 자기조립 나노구조체는 암세포 치료에 사용되는 것을 특징으로 하고, 약제학적 분야에서 공지의 방법에 의해 제조될 수 있다. 융합 단백질 그자체 또는 약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 등과 혼합하여 분말, 과립, 정제, 캡슐제 또는 주사제 등의 제형으로 제조되어 사용될 수 있으며, 이들은 비경구로도 투여가 가능하다. 이러한 의약적 조성물을 투여하는 투여량은 환자의 연령, 성별, 상태 및 질병의 진행 정도에 따라 적절히 선택될 수 있다.
이하, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
< 제조예 >
Tribute 펩타이드 합성기(Protein Technologies, Inc)를 사용하여 표준 Fmoc 프로토콜에 따라 링크(Rink) 아미드 MBHA 수지 LL(Novabiochem) 상에서 펩타이드를 합성하였다. 시스테인과 리신을 제외하고는 표준 아미노산 보호기로 사용하고, 상기 시스테인과 리신은 각각 산에 불안정한 메톡시트리틸(Mmt)기와 N-[1-(4,4-디에틸-2,6-디옥소사이클로헥-1-일리덴)에틸](Dde)기로 보호하여 선형 펩타이드를 제조하였다.
상기 선형 펩타이드를 고리화(cyclization)하기 위하여, 상기 선형 펩타이드가 부착된 수지(20 μmol의 N-말단 아민기)를 N-메틸-2-피롤리돈(NMP) 내에서 30 분 동안 팽윤시키고, 수지에 고정된 펩타이드의 N-말단부에 브로모아세트산을 결합시켰다. 그 후, 수지에 첨가하기 전에, 브로모아세트산(28 mg, 200 μmol)과 N,N-디이소프로필카르보이미드(15.5 μL, 100 μmol)를 N-메틸-2-피롤리돈에서 혼합한 용액을 10 분 동안 인큐베이션(incubation)하여 카르복실기를 활성화한 후, 수지에 첨가한 후, 프릿(Restek)이 담긴 6 mL 폴리프로필렌 튜브에 넣고 1 시간 동안 실온에서 반응을 진행하였다. 그 다음, N-메틸-2-피롤리돈과 디클로로메탄(DCM)으로 세척하였다. 시스테인으로부터 Mmt 보호기를 제거하기 위하여, 상기 수지를 디클로로메탄 중의 1% 트리플루오로아세트산(TFA)으로 7차례 이상 각각 1분 동안 처리하였다. 그 후, N-메틸-2-피롤리돈 중의 1% 디이소프로필에틸아민(DIPEA) 3 mL에서 실온에서 밤새 교반하여 분자 내 고리화반응을 진행하였다. 리신으로부터 Dde 보호기를 제거하기 위하여, 디메틸포름아미드(DMF) 중의 2% 히드라진으로 처리한다. 다음으로 표준 Fmoc 프로토콜에 따라 Fmoc-Ebes-OH와 가용화제를 결합하였다.
최종적으로 분리 및 탈보호를 하기 위하여, 상기 건조된 수지를 3 시간 동안 분리용(cleavage) 혼합물(TFA:1,2-에탄디티올:티오아니솔; 95:2.5:2.5)로 처리한 후 tert-부틸 메틸 에테르(TBME)로 침전하여 얻어진 펩타이드를 역상 HPLC(0.1% TFA를 포함하는 물-아세토니트릴 혼합액)로 정제하였다. 분자량은 MALDI-TOF 질량분석으로 확인했다. HPLC 분석 결과를 통해 펩타이드의 순도가 95% 이상임을 확인하였다. 한편, 280 nm에서 트립토판의 흡광계수(5,500 M-1cm-1)로부터 펩타이드의 농도를 8 M 우레아 중에서 분광학적으로 결정하였다.
<실험예>
(1) 원편광 이색성(CD)
펠티에 온도조절기(Peltier applied photophysics, Ltd)가 구비된 Chirascan circular Dichroism 분광계를 사용하여 CD 스펙트럼을 측정하였다. 스펙트럼은 경로길이가 2 mm인 큐벳을 사용하여 260 nm에서 190 nm까지 기록하였다. 5회 반복 측정하여 평균값을 기록하였다. 각 아미노산 잔기에 대하여 몰 타원율을 계산하였다.
(2) 동적 광산란(DLS)
DLS 실험은 632.8 nm의 He-Ne 레이저가 구비된 ALV/CGS-3 Compact Goniometer System을 사용하여 실온에서 수행하였다. 검출에는 광섬유가 연결된 ALV/SO-SIPD/DUAL, 검출장치, EMI PM-28B 전원장치 및 ALV/PM-PD 프리앰프/판별장치를 사용하였다. 신호 분석 장치로는 지수적으로 배치된 288 개의 채널을 구비한 ALV-5000/E/WIN 멀티플타우 디지털 코릴레이터를 사용하였다. 산란각은 90°였다. 크기분포는 강제조정법(constrained-regularization method)으로 결정하였다.
(3) 원자힘 현미경 측정(AFM)
2 μL 고리형 펩타이드/AuNP 복합 나노구조체를 절단된 운모의 표면에 위치시킨 후, 완전히 건조하였다. Nanoscope 장비(Digital Instruments)는 태핑모드(tapping mode) 운전하여 이미지를 얻었으며, 0.8-1 V에서 스캔속도(scanning rate)는 1-2 Hz로 분석하였다.
(4) 투과전자현미경 분석(TEM)
2 μL 시료를 탄소 코팅한 구리격자 상에서 완전히 건조시켰다. 이어 2 μL의 2% 우라닐 아세테이트 용액을 1분간 가하여 결합되지 않은 펩티드를 용해시키고 여과지를 이용하여 제거하였고, 제거 후 시료의 농도는 약 5-20 μM이였다. JEOL-JEM 2010 기기를 사용하여 120 kV에서 시료를 관찰하였다. 얻어진 데이터를 Digital Micrograph™ 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.
(5) 단백질 과발현 및 정제
His6로 태그된 재조합 human MDM2(hMDM2) 단백질을 E. coli에서 과대발현시켰다. 사용된 플라스미드는 pET28a-hMDM2(17-125)[Kanamycin-resistance (KanR), kindly provided by Dr. Gregory Verdine, Harvard]이고, 상기 E. coli에서 과대발현된 절단형 human hMDM2 (17-125)의 N-말단은 His6으로 태그되었다.
E. coil strain BL-21-Codon Plus (DE3)-RIPL [chloramphenicol-resistance (CmR), Agilent Technologies]에 소개되어 있는 표준 화학적 형질변환 방법을 사용하였다.
상기 형질변환된 세포를 Cm(25 μg/mL)와 Kan (20 μg/mL)이 첨가된 LB 배지에 접종하여 흡광도가 0.5 정도가 될 때까지 30 ℃에서 배양한 후, 단백질 발현을 유도하기 위해 0.1 mM의 IPTG(isopropyl β-D-thiogalactoside)를 첨가하여 16 ℃에서 18 시간 동안 배양하였다. 상기 E . coil을 6000 rpm으로 4 ℃에서 10분간 원심분리하여 수득한 후, 프로테아제 억제제 혼합액(1 mM PMSF, 10 μg/ml aprotinin, 5 μg/ml papstatin, 5 μg/ml leupeptin)이 첨가된 라이시스(lysis) 완충액(20 mM Tris·HCl pH 8.0, 500 mM NaCl, 10% 글리세롤, 20 mM 이미다졸, 0.1%(v/v) NP-40, 5 mM β-머캡토에탄올)에 현탁시킨 후, 리소자임(lysozyme, 1 mg/ml)을 첨가하여 45 분간 반응시키고, 분쇄하였다. 상기 세포 분쇄액을 14,000×g로 10 분간 원심분리한 후, 히스티딘-태그를 이용하여 정제하기 위해서 니켈-친화성 아가로즈(Ni-NTA agarose beads, Qiagen) 비드을 사용하여 표준 단백질 정제 프로토콜에 따라서 단백질을 수득하였다. 이때, 용출 용액은 250 mM 이미다졸 용액으로 용출시켰다. 최종적으로, 재조합 human MDM2 단백질에서 히스티딘-태그(His6-tag)를 제거하기 위해서, 0.5 U의 트롬빈(thrombin)과 hMDM2 단백질 20 μg을 혼합하고, 상기 혼합액을 4 ℃에서 하루 동안 배양하였다. 상기 반응과정은 SDS-PAGE를 이용하여 확인하였다.
(6) 단백질-단백질 상호작용 및 경합적 저해현상을 이용한 분석.
단백질-단백질 상호작용 분석은 형광 편광(FP) 분석을 사용한다. 이때, 완충액[50mM Tris pH 8.0, 140 mM NaCl]을 사용하며 상온에서 이루어진다. 형광 이방성 측정은 VictorX5 multi label pate reader(Perkin Elmer)을 사용하여 384 웰 플래이트를 이용하여 측정하였다.
(7) 프로테아즈 저항 실험.
펩타이드 분해를 위해 펩타이드와 chymotrypsin의 전체 중량을 기준으로 5 : 1 중량비가 되도록 혼합한 후, 37 ℃에서 반응시킨다. 이때, 반응시간에 따른 펩타이드 분해정도를 측정하기 위하여 0, 1, 5, 15, 30, 60 및 120 분의 반응시간일 때 시료를 채취하고, 즉시 0.1 %(v/v) 농도의 TFA 용액으로 처리하여 반응을 종료시킨다. 측정하기 전에 자기조립화된 펩타이드 나노구조체의 구조의 풀어짐을 유도하기 위해 최종 농도가 50%(v/v)가 되도록 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로판올(HFIP)과 강한 β-breaker을 첨가하여 30 분간 반응시킨다. 역상 HPLC(물-아세토니트릴, 0.1% TFA)로 측정하고, 280 nm의 적분에 의한 계산을 통해 분석하였다. MALDI-TOF 질량분석기로 분자량을 확인하였다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 상기 고리형 펩타이드 내 링커부의 길이가 알파-, 베타- 구조의 안정도에 미치는 영향을 확인하기 위해 원편광이색성 분광을 측정한 결과를 나타낸 그래프로서, 링커부의 길이가 짧을수록 [θ]222/[θ]208비가 증가함을 확인하였다. 따라서, 상기 고리형 펩타이드가 25 ℃에서 제조되었다는 점을 감안하면, 상기 4개의 아미노산 서열로 이루어진 링커부를 포함하는 펩타이드를 골격(scaffold)으로 사용한 고리형 펩타이드의 알파-헬릭스 구조가 더욱 안정화되었을 뿐만 아니라 열적 안정성도 증가하였음을 확인 할 수 있다.
다음, 도 6a는 본 발명의 실시예에 따른 PEG가 결합된 나노구조체을 인큐베이션할 경우, 반응 시간이 알파-, 베타- 구조의 안정도에 미치는 영향을 확인하기 위해 원편광이색성 분광 결과를 나타낸 그래프로서, 적색선은 하루동안 반응시킨 PEG가 결합된 나노구조체이며, 청색선은 3시간 동안 반응시킨 PEG가 결합된 나노구조체이다. 이를 통해 본 발명의 나노구조체는 선형 펩타이드에 비해 인큐베이션 시간이 증가할수록 [θ]222 수치가 증가하였으며, 이는 알파-헬릭스 구조가 견고하고 안정적이라는 것을 나타낸다. 또한, 반응 시간이 24 시간 이상일 경우에는 더 이상의 변화가 나타나지 않았으며, 24 시간 내에 [θ]222 수치가 평형에 도달하였음을 알 수 있다.
도 6b는 온도가 p5317 -28 펩타이드를 포함하는 나노구조체의 알파-헬릭스 구조에 미치는 영향을 확인하기 위해 측정한 원편광이색성 분광분석 결과를 나타낸 그래프로서, 몰 타원율이 65 ℃ 이상부터 증가되는 것을 확인하였으며, 이는 상기 나노구조체 내 알파-헬릭스 구조의 안정화는 온도의존적이라는 것을 나타낸다.
도 6c는 본 발명에 따른 나노구조체의 알파-헬릭스 또는 베타-시트의 배열을 확인하기 위해 FR-IR 측정 결과를 나타낸 그래프로서, 베타-시트 피크 1625 cm-1에서 아미드(amide Ⅰ)의 존재는 베타-시트 구조가 역팽행(antiparallel)구조인 것을 보여준다. 또 피크는 1652 cm-1은 알파-헬릭스 구조를 보여준다.
도 6d는 본 발명에 따른 나노구조체의 동적 광산란에 의해 측정한 그래프로서 11 nm의 입경을 가지는 나노구조체의 형태임을 확인하였다.
도 7은 본 발명에 따른 나노구조체를 원자힘 현미경으로 측정한 사진으로, 구형의 형상과 균질성이 입증되었다.
이러한, 상기의 결과들를 종합하여 보면, 본 발명에 따른 알파-헬릭스 형성단편을 포함하는 자기조립 나노구조체는 매우 우수한 열적 안정성 및 구조적 안정성을 가지는 규칙적인 구체인 것을 알 수 있다.
도 8은 본 발명에 따른 나노구조체와 MDM2 단백질과의 경쟁적 결합을 측정하기 위해 현광편광분석을 이용하여 분석한 결과를 나타낸 그래프이다. 실험에 들어가기 전, 본 발명의 나노구조체가 형광편광분석에 용이하도록 하기위해, 알파-헬릭스 형성단편의 아미노산 서열 말단에 형광 염료를 첨가하여 분석에 용이하도록 하였으며, 상기 실험예에서 사용된 상기 형광 염료는 Fluorescein이다.
여기서, 도 8a는 MDM2 단백질의 농도에 따라 형광 표지된 고리형 펩타이드의 경쟁적 결합를 사용하여 FP를 측정한 결과를 나타낸 그래프이며, 단일 결합부위를 가지는 상기 반응에서는 해리상수가 0.99 μM이라는 것을 확인하였다. 도 8b는 상기 실험을 근거로 하여 경쟁적 기질인 MDM2 단백질의 양을 해리상수의 두배이상을 첨가한 조건하에서 실시하였으며, hill slope의 sigmoidal 용량의존도에 적용하면, 고리형 펩타이드와 나노구조체의 EC50 값이 각각 2.4 μM, 0.4 μM인 것을 확인 할 수 있다. 상기 결과를 통해, 고리형 펩타이드에 비하여 상기 나노구조체는 낮은 경쟁적 결합성을 나타내며, 이는 상기 나노구조체의 알파-헬릭스 구조의 안정화와는 다른 요소가 영향을 미친다는 것을 나타낸다.
따라서, 상기 요소를 확인하기 위하여 p53과 MDM2간의 상호작용을 억제하는 억제제로 사용되는 Nutlin-3을 대조군으로 하여 측정하였으며, 도 8c에 나타내었다. 그 결과, 본 발명에 따른 나노구조체의 경쟁적 결합력이 1.7배 낮다는 것을 확인하였다. 이는 본 발명의 나노구조체 상에 포함되는 다중 알파-헬릭스 형성단편의 공간적 복잡성 및 기하학적인 대열로 이루어진 형태학적 구조로 설명이 가능하며 특히, 거대한 MDM2 단백질의 크기로인해 나노구조체의 표면에 4개 중 1개의 알파-헬릭스 형성단편과 MDM2간의 결합이 이루어지고 있음을 확인 할 수 있다. 이로인해, 몰당 경쟁적 결합력이 낮게 측정됨을 알 수 있으며, 본 발명의 나노구조체에서 결합하지 않은 형태학적인 결함으로 인해 MDM2 단백질과 결합하지 않은 알파-헬릭스 형성단편을 제외한다면 몰당 경쟁적 결합력은 우수할 것으로 예상된다.
도 9는 단백질 분해효소에 대한 저항성과 민감성을 확인하기 위하여 HPLC로 측정한 결과를 나타낸 그래프로서, chymotrypsin으로 처리하여 이에 대한 저항성을 확인하였다. 상기 chymotrypsin은 우선적으로 본 발명에 따른 나노구조체에서 방향족 아미노산의 아미노 결합에 엉겨붙는다. 고리형 펩타이드의 경우, 5분 내외로 완전히 분해되었으나, 본 발명의 나노구조체의 경우, 온전한 형태로 120 분간 유지하였다. 이러한 상기 단백질 가수분해의 저항성은 고리형 펩타이드의 고리화와 자기조립에 의한 안정화된 구조에 의한 것이라고 예상된다.
도10은 본 발명의 실시예에 따라 제조된 펩타이드 또는 나노구조체를 MALDI-TOF 질량분석기로 측정한 결과를 나타낸 그래프로서, a는 선형 펩타이드, b는 형광 표지된 선형 펩타이드, c는 링커부의 사슬길이가 6인 고리형 펩타이드, d는 링커부의 사슬길이가 5인 고리형 펩타이드, e는 링커부의 사슬길이가 4인 고리형 펩타이드, f는 고리형 펩타이드, g는 PEG가 결합된 고리형 펩타이드, h는 PEG가 결합된 고리형 펩타이드 변이체이다.
도 11은 His6 태그된 MDM2 단백질의 과대발현 및 정제 과정에 따라 제조된 MDM2 단백질을 확인하기 위하여 측정한 결과로서, a는 과대발현된 His6 태그된 MDM2 단백질로부터 His6를 제거하기 위해 트롬빈 절단과정의 시간에 따른 영향을 확인한 SDS-PAGE 사진이고, b는 His6이 제거된 MDM2 단백질 혼합액을 정제하기 위해 겔 크로마토그래피한 결과를 나타내는 그래프이며, c는 상기 과정을 통해 정제된 MDM2 단백질의 SDS-PAGE 사진이며, d는 정제된 MDM2 단백질을 MALDI-TOF로 질량분석한 결과를 나타낸 그래프이다.

Claims (9)

  1. 알파-헬릭스 형성단편, 베타-시트 형성단편 및 링커부를 포함하는 다수의 고리형 펩타이드가 자기조립하여 형성되고,
    상기 알파-헬릭스 형성단편은 하기 [서열번호 1] 또는 [서열번호 2]로 표시되는 것을 특징으로 하며,
    상기 링커부는 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 포함하고,
    상기 폴리에틸렌글리콜(PEG)은 상기 링커부의 어느 한 지점에 결합되어, 상기 고리형 펩타이드로부터 외부로 돌출되어 있는 것을 특징으로 하는 자기조립 나노구조체.
    [서열번호 1]
    ETFSDLWKLLPE
    [서열번호 2]
    ETASDLWKLLPE
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 베타-시트 형성단편은 하기 [서열번호 3]으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 자기조립 나노구조체.
    [서열번호 3]
    WKWEWYWKWEW
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 링커부는 하기 [화학식 4] 또는 [화학식 5]의 화합물 또는 세린-글리신-세린-글리신으로 이루어진 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 자기조립 나노구조체.
    [화학식 4]
    Figure 112015035271020-pat00011

    [화학식 5]
    Figure 112015035271020-pat00012

  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서,
    상기 고리형 펩타이드는 하기 [화학식 2] 내지 [화학식 3]로 표시되는 것으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 자기조립 나노구조체.
    [화학식 2]
    Figure 112015124872194-pat00014

    [화학식 3]
    Figure 112015124872194-pat00015

  8. 삭제
  9. 삭제
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