KR101608562B1

KR101608562B1 - 신규한 항균성 화합물 및 이를 포함하는 항균 조성물

Info

Publication number: KR101608562B1
Application number: KR1020130118146A
Authority: KR
Inventors: 오기봉; 신종헌
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2013-10-02
Filing date: 2013-10-02
Publication date: 2016-04-01
Also published as: KR20150039502A

Abstract

본 발명에서는 소르타제 (sortase)에 대하여 우수한 저해활성을 가져서 유해 세균의 감염을 방지할 수 있는 신규한 구조의 화합물 및 이를 유효성분으로 함유하는 항균 조성물이 제공된다. 이들 신규한 화합물은 소르타제에 대하여 우수한 저해활성을 통하여 항균효과가 있는 새로운 항균 조성물로 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 다양한 항균물질 유도체의 선도물질로도 이용될 수 있다.
또한 본 발명에 따른 항균 조성물은 유해 세균의 감염증 치료 및 예방에 효과적이어서, 항균성 약제학적 조성물이나, 구강청정제, 치약 등과 같은 항균성 구강 조성물, 로션, 크림 등과 같은 항균성 화장용 조성물, 손 세정제, 비누, 바스, 주방용 세제 등의 항균성 세정 조성물 등으로 사용될 수 있다.

Description

신규한 항균성 화합물 및 이를 포함하는 항균 조성물 {Novel antimicrobial compounds and an antimicrobial composition containing the same}

본 발명은 신규한 항균성 화합물 및 이를 유효성분으로 함유하는 항균 조성물에 관한 것이다. 더 상세하게는 소르타제 (sortase)에 대하여 우수한 저해활성을 가져서 유해 세균의 감염을 방지할 수 있는 신규한 구조의 화합물 및 이를 유효성분으로 함유하는 항균 조성물에 관한 것이다.

항생물질(antibiotic)의 개발은 인류로부터 감염증의 위협을 제거해 인류의 복지에 다대한 공헌을 이루어 왔다. 그러나 현재의 화학요법에서도 그람양성세균(Gram positive)에서의 약제 내성이 특히 문제가 되어왔다 (Gold, S. H., N. Engl. J. Med ., 335, pp14-45, 1996). 메티실린 내성 스타필로코커스 아우레우스(MRSA)와 메틸실린-내성 응고효소-음성 스타필로코커스(MRSE)로 대표되는 내성 균주들은 이들의 감염증에 유일하게 사용되는 반코마이신에 대해서도 내성을 나타내고 있다 (Sieradzki, K. et al., N. Engl . J. Med ., 340, p517, 1999). 그람양성세균에 대한 약제로는, 옥사졸리디논 유도체, 스트레프트그라민 유도체, 마크로라이드 유도체, 당펩티드 유도체가 개발되어 있지만, 약제 내성 그람양성세균에 대해서도 효과를 나타내는 신규한 구조를 갖는 약제의 개발이 절실히 요구되고 있다.

새로운 접근도 여러가지로 진행되고 있다. 칸디다 프로테아제 억제에 의한 감염능 저하(Nee ly AN, et al., Infect .Immun., 58:1527-1531, 1990) 등, 반드시 살균적으로 작용하지 않아도 감염 성립에서 중요한 역할을 담당하고 있는 병원성 인자를 억제하는 것으로 감염 방어 효과를 기대할 수 있는 것이 분명해지고 있다. 병원성 인자 중에서도 미생물 세포 표층에 국재하는 부착 인자는 감염증 성립의 제1 단계인 숙주로의 부착에 필수이며, 그 후 코로니제이션의 진전에도 관여하고 있기 때문에 감염의 성립진전의 방지에는 부착을 저해하는 것이 가장 효과적이다.

그람양성세균은 펩티도글리칸(peptidoglycan) 이라는 세포벽으로 둘러싸여 있는데, 이 세포벽에는 표면으로 발현되는 여러 종류의 표면단백질(surface protein)이 있는 것으로 알려져 있다. 이 표면단백질들은 이들 병원균이 인체에 감염될 때 필수적인 역할을 하는데, 인체 세포와의 접촉을 도와주며 면역계를 피할 수 있게 함으로써 감염이 쉽도록 하여 발병을 일으킨다고 한다 (Navarre WW, Schneewind O, Microbial. Mol . Biol . Rev ., 63, pp174-229, 1999).

세균의 세포벽 표면단백질 부착전이효소로 알려진 소르타제(sortase)는 그람양성세균에 공통적으로 존재하는 효소로서, 세균의 세포내에서 합성되어 외부로 수송되는 표면단백질의 소팅 시그널(sorting signal)을 절단하여 세포벽의 펩티도글리칸 사이에 아미드 결합 형성을 촉매하는 효소이다 (Hendrickx APA, Budzik JM, Oh SY, Schneewind O, Nat. Rev. Microbiol., 9, pp166-176, 2011). 소르타제는 세균의 생장에 필수적이지는 않지만, 숙주 세포에 부착 및 침입, 숙주 면역 반응의 억제와 회피, 필수 영양소의 획득 등에 중요한 역할을 하는 표면 단백질들의 결합 및 배열에 필수적 기능을 맡고 있는 병원성 인자이다. 따라서 소르타제는 그람양성세균 감염증 전반에 대한 새로운 약제 개발의 표적이 된다.

소르타제는 206개의 아미노산으로 이루어진 단백질로 이미 그 기능과 속성은 여러 실험을 통해 밝혀지고 확인되었다 (Schneewind, O., P. N. A. S., 96, p12424, 1999; Schneewind, O., J. B. C., 275, p9876, 2000). 소르타제는 데이터베이스 검색을 통해 스타필로코커스 외에 스트렙토코커스(Streptococcus), 엔테로코커스(Enterococcus) 등 대부분의 그람양성세균에서 유사 시퀀스가 발견되었다 (Cossart, P. and Jonquieres, R., P. N. A. S., 97, p5013, 2000). 생물정보학 분석에 따르면 그람양성세균에 존재하는 소르타제는 아미노산 서열을 기반으로 6개 클래스(class)로 분류할 수 있으며, 소르타제 A 및 소르타제 B는 모두 감염과 그 지속성에 관여하는 결정적인 효소이며, 이들 중 소르타제 A가 가장 중요한 역할을 하고 있다. 현재까지 소르타제 효소작용 메커니즘은 황색포도상구균인 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 소르타제 A에서 가장 잘 연구되어 있다 (Spirig T, Weiner EM, Clubb RT, Mol. Microbiol., 82, pp1044-1059, 2011). 세포질 내에서 합성되어 막을 통과하는 세포 표면단백질들은 N말단의 시그널 펩티드와 C 말단의 LPXTG 모티프(motif)를 갖는 소팅 시그널을 가지고 있으며 이 LPXTG 모티프는 소르타제 A에 의해 잘리면서 트레오닌(threonine)의 카복실 말단이 형성된다. 이 카복실 말단이 펩티도글리칸을 구성하는 펜타글리신의 아미노 그룹과 결합함으로써 세균의 세포벽에 연결된다. 소르타제 A를 저해하면 표면단백질 결합이 차단되어 세균이 숙주세포나 재질표면에 부착 혹은 침입이 억제되어 그람양성세균의 감염을 저해할 수 있다. 따라서 소르타제에 대한 선택적 저해는 그람양성세균 자체를 없애기보다 이들의 병원성을 제거한다는 점에서 항생제 분야의 새로운 방법으로 주목받고 있다.

소르타제 저해제들이 다수 개발되었고 이들 저해제가 그람양성세균의 감염의 억제 및 치료에 유효하다는 것이 보고되어 왔다 (WO 2009/023160 A2, WO 201 1/028492 A2, Biochemical and Biophysical Research Communications 396 (2010) 440-444). 그러나 전술된 바와 같이, 약제 내성 그람양성세균의 출현으로 신규한 구조를 갖는 소르타제 저해제의 개발이 계속 요구되고 있다.

상기와 같은 종래 기술에서의 요구에 부응하기 위해, 본 발명자들은 재조합한 스트렙토코커스 뮤탄스의 소르타제 A를 이용하여 연구를 계속한 결과, 백두옹(Pulsatilla radix)으로부터 소르타제에 대한 우수한 저해활성을 갖는 신규한 화합물을 분리하게 되어 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 소르타제에 대해 저해활성을 갖는 항균성 화합물 및 이를 유효성분으로 포함하는 항균 조성물을 제공하는 것이다.

상기 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 소르타제에 대하여 저해활성을 갖는 하기 식 (Ⅰ)의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 제공한다:

(I)

상기 식에서, A는

또는

이고,

R 은 Glc (글루코스)이며; R¹ 및 R²는 각각 Glc 또는 H 이다.

본 발명의 식 (I)의 화합물은 (7에스, 8에스)-다이히드로디히드로다이코니페릴 알콜 9'-오르토-베타-디-글루코피라노사이드 ((7S, 8S)-Dihydrodehydrodiconiferyl alcohol 9-O -β-D-glucopyranoside), (7에스, 8에스)-다이히드로디히드로다이코니페릴 알콜 9-오르토-베타-디-글루코피라노사이드 ((7S, 8S)-Dihydrodehydrodiconiferyl alcohol 9-O-β-D-glucopyranoside), 및 (8에스, 8'알)-노트라첼로게닌 8-오르토-베타-디-글루코피라노사이드 ((8S, 8'R)-Nortrachelogenin 8-O -β-D-glucopyranoside) 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 화합물들은 당해 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 약제학적으로 허용가능한 염으로 제조될 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 염으로는 약제학적으로 허용가능한 유리산 (free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 또한, 염기를 사용하여 약제학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 상기 식 (I)의 화합물의 약제학적으로 허용가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 식 (I)의 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성 기의 염을 포함한다. 식 (I)의 화합물의 약제학적으로 허용가능한 염은 당업계에서 알려진 염의 제조방법이나 제조과정을 통하여 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 식 (I)의 화합물은 비대칭 중심을 가지므로 상이한 거울상 이성질체 형태로 존재할 수 있으며, 식 (I)의 화합물의 모든 광학 이성질체 및 R 또는 S형 입체 이성질체 및 이들의 혼합물도 본 발명의 범주 내에 포함되는 것으로 한다. 본 발명은 라세미체, 하나 이상의 거울상 이성질체 형태, 하나 이상의 부분 입체 이성질체 형태 또는 이들의 혼합물의 용도를 포함하며, 당업계에서 알려진 이성질체의 분리 방법이나 제조과정을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 소르타제에 대하여 저해활성을 갖는 하기 식 (I)의 화합물은, 실시예에서 예시된 바와 같이, 백두옹(Pulsatilla radix)으로부터 추출/분리하여 제조될 수 있다. 또한 본 발명의 화합물은 백두옹에 함유되어 있는 것에 한정되지 않으며, 다른 식물로부터도 또한 분리된 것도 포함하며, 화학적으로도 합성될 수 있다. 백두옹은 미나리아재비과 (Ranunculaceae)에 속하는 할미꽃 (Pulsatilla koreana)의 뿌리를 건조한 것으로, 한약제로 사용되어 왔으므로 상업적으로 용이하게 입수할 수 있다. 백두옹으로부터 본 발명의 화합물이 분리되었다는 보고는 된바 없다.

본 발명의 화합물을 제조하기 위한 추출 및 분리는 통상의 방법으로 행해질 수 있다. 예를들면 본 발명의 화합물은 백두옹의 유기용매 추출물이나 이를 압착하여 얻은 오일로부터 분리 정제할 수 있다. 유효성분을 추출할 수 있는 용매로는 정제수, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 아세톤, 에테르, 벤젠, 디클로로메탄, 클로로포름, 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드, 헥산, 시클로헥산, 석유에테르 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있다. 추출물로부터 화합물의 분리 및 정제는 역상 크로마토그래피, 컬럼 크로마토그라피 및 고속액체 크로마토그라피 (HPLC) 등을 단독으로 혹은 병행하여 사용할 수 있다. 그러나 추출 및 분리/정제 방법은 반드시 상기한 방법에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 일면으로, 본 발명은 활성성분으로서 상기 식 (I)의 화합물을 포함하는 항균 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 일면으로, 활성성분으로서 하기 화합물들 중 하나 이상을 포함하는 항균 조성물을 제공한다:

하기 식 (Ⅰ)에서

(I)

A 가

또는

인 화합물; 및

하기 식 (Ⅱ)에서

(Ⅱ)

B 가

,

, 또는

인 화합물.

본 발명의 항균 조성물의 유효성분으로 포함되는 상기 화합물들은 피노레시놀(pinoresinol), (7에스, 8에스)-다이히드로 디히드로다이코니페릴 알콜 ((7S, 8S)-dihydrodehydrodiconiferyl alcohol), 로스마리릭 에시드(rosmarinic acid), 취코릭 에시드(chicoric acid), 카페익 에시드(caffeic acid) 등을 포함한다. 이들 화합물의 구조는 기존에 알려져 있었으나, 이들 화합물들이 소르타제에 대해 우수한 활성을 가짐에 의해 항균 작용을 할 수 있다는 것은 종래에 보고된바 없다. 이들 화합물들은 또한 백두옹에서 추출될 수 있으며, 본 발명의 식 (I)의 화합물과 같이 리그난계의 폴리페놀성 물질이다.

본 발명에서, "항균"이란 살균 뿐만아니라, 성장저해 또는 감염 저해를 의미한다. 본 발명의 항균 조성물이 항균활성을 나타내는 균은 세균, 바람직하게는 그람양성세균이며, 더 바람직하게는 스타필로코거스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 스트렙토코커스 뉴모니아에 (Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코커스 표게스 (Streptococcus pyogenes), 코르네박테리움 디프테리아 (Corynebacterium diphtheriae), 바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 스트렙코코커스 뮤탄스 (Streptococcus mutans), 엔테로코커스 파칼리스 (Enterococcus facalis), 클로스트리디움 디피실레 (Clostridium difficile) 등이다.

본 발명에 따른 항균 조성물은 스트렙토코커스 뮤탄스 (Streptococcus mutans) 소르타제 A에 대한 저해활성에 의한 항균 시험에서 우수한 활성을 나타냈다 (실시예 참조). 따라서 본 발명의 항균 조성물은 항균성 약제학적 조성물이나, 구강청정제, 치약 등과 같은 항균성 구강 조성물, 로션, 크림 등과 같은 항균성 화장용 조성물, 손 세정제, 비누, 바스, 주방용 세제 등의 항균성 세정 조성물 등으로 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 일면으로, 상기 식 (I)의 화합물 또는 상기 식 (Ⅱ)의 화합물을 유효성분으로 포함하는 소르타제 저해활성을 통한 세균 감염증의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 봉와직염, 장염, 위염, 충치, 치주 질환, 폐렴, 화농증, 탄저병, 파상풍, 항생제 내성균증, 여드름과 같은 피부 염증 질환 등과 같은 세균성 감염 질환의 치료 및 예방에 사용이 가능하다.

본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있으며, 정제, 캅셀제, 액제, 환제, 주사제, 연고, 크림 및 패취 등과 같은 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 항균용 조성물의 유효성분인 화합물들은 천연약제로 사용되어 온 백두옹에서 추출/분리될 수 있는 것이므로, 독성 여부에는 문제가 없다.

본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있으며, 예를들면 본 발명의 약제학적 조성물의 유효성분을 1 ~ 500 mg/체중kg으로 투여하는 것이 바람직하다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다.

본 발명은 일례로서 상기 식 (I)의 화합물 또는 상기 식 (Ⅱ)의 화합물을 유효성분으로 포함하는 소르타제 저해활성을 통한 스트렙토코커스 뮤턴스에 대해 항균활성을 갖는 충치 및 치주염의 예방 또는 치료용 구강 조성물을 제공한다. 본 발명의 구강 조성물은 치약, 구강청정제, 츄잉검 또는 잇몸 맛사지 크림의 형태로 제조될 수 있다.

또한 본 발명은 일례로서 상기 식 (I)의 화합물 또는 상기 식 (Ⅱ)의 화합물을 유효성분으로 포함하는 소르타제 저해활성을 통한 세균 감염증의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 일례로서 상기 식 (I)의 화합물 또는 상기 식 (Ⅱ)의 화합물을 유효성분으로 포함하는 로션, 크림 등과 같은 항균성 화장용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 일례로서 상기 식 (I)의 화합물 또는 상기 식 (Ⅱ)의 화합물을 유효성분으로 포함하는 손 세정제, 비누, 바스, 주방용 세제 등의 항균성 세정 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 신규한 구조의 식 (I)의 화합물은 소르타제에 대하여 우수한 저해활성을 통하여 항균효과가 있는 새로운 항균 조성물로 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 다양한 항균물질 유도체의 선도물질(lead compound)로도 이용될 수 있다.

또한 본 발명에 따른 식 (I)의 화합물 또는 식 (Ⅱ)의 화합물을 포함하는 항균 조성물은 유해 세균의 감염증 치료 및 예방에 효과적이어서, 항균성 약제학적 조성물이나, 구강청정제, 치약 등과 같은 항균성 구강 조성물, 로션, 크림 등과 같은 항균성 화장용 조성물, 손 세정제, 비누, 바스, 주방용 세제 등의 항균성 세정 조성물 등으로 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예 는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예

제조예 : 화합물 제조

<추출 및 분리>

백두옹을 2010년 가을 경동시장에서 구매하여 서울대학교 천연물과학연구소에서 표본 검증을 받았다. 백두옹 1.2kg를 분말로 만들고 메탄올(1.0L × 3) 및 디클로로메탄(1.0L × 3)으로 반복 추출하여 추출물을 여과 후 감압 농축하여 141.7g의 조추출물을 얻었고, 그 조추출물을 물에 현탁하고 부탄올로 분획하여 부탄올 층에서 52.3g의 용해된 물질 (부탄올 층 추출물)을 확보하였다. 부탄올 층 추출물을 15% 물/메탄올에 녹인 후, 헥산으로 분획하여 15% 물/메탄올 층에서 41g의 용해된 물질 (물/메탄올 층 추출물)을 확보하였다.

15% 물/메탄올층 추출물 41g중 24.8g을 따로 덜어 메탄올과 물의 혼합비(메탄올을 50% 부터 100% 까지)를 점차적으로 증가시키는 방법을 사용하여 C₁₈역상 플래쉬 크로마토그래피 (YMC Co. Ltd., ODS-A resin, 입자 직경 5μm)를 시행하였고, 각 분획에 대한 소르타제 A 저해활성 측정 결과를 토대로 50% 메탄올에서 추출해낸 2.09g과 60% 메탄올에서 추출해낸 1.03g을 분리 분획으로 선택하였다.

50% 메탄올 분획을 감압건조한 후 45% 물/메탄올 (5 ml)에 녹인 후 이 용액을 동일한 용리용체를 이용하여 역상 반-분취 HPLC 컬럼 (Reversed-phase semi-preparative HPLC column, Agilent Technologies) (Zorbax Eclipse Plus C18 , 입자 직경 5μm, 250 x 9.4 mm(길이 x 내경), 용출속도 2 ml/min, UV 검출기) 상에서 크로마토그래피하여 하기 화합물 9, 8, 3, 4의 순서대로 분리하였으며 각각 24.6mg, 55.1mg, 6.4mg, 4.4mg얻었다.

60% 메탄올 분획은 감압건조한 후 55% 물/메탄올 (5 ml)에 녹인 후 이 용액을 동일한 용리용체를 이용하여 역상 반-분취 HPLC 컬럼 (상동) 상에서 크로마토그래피하여 하기 표 1에 나타낸 화합물 6, 7, 2, 1의 순서로 분리하였으며 각각 8.4mg, 20.1mg, 6.3mg, 14.0mg 얻었다.

화합물	구조식
1
	(+)-피노레시놀
2
	(7에스, 8에스)-다이히드로 디히드로다이코니페릴알콜
3
	(7에스, 8에스)-다이히드로 디히드로다이코니페릴알콜 9'-오르토-베타-디-글루코피라노사이드
4
	(7에스, 8에스)-다이히드로 디히드로다이코니페릴 알콜 9-오르토-베타-디-글루코피라노사이드
6
	(8에스, 8알)-노트라첼로게닌 8-오르토-베타-디-글루코피라노사이드
7
	(-)-로스마리닉 에시드
8
	(+)-취코릭 에시드
9
	카페익 에시드

Glu = 글루코스

<화합물 구조 결정>

화합물 구조 결정에는 핵자기 공명 (nuclear magnetic resonance) 스펙트럼 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR (Bruker, Avance-400 및 Avance-500)을 사용하였고, 용매는 CDCl₃, DMSO-d₆와 MeOH-d₄를 사용하였다. 짝지음(Coupling) 상수(J)는 Hz로 표시하였다. 질량(Mass) 스펙트럼은 Jeol 사의 JMS-700 고해상 질량분석기를 사용하였으며 m/z 형태로 표시하였다. 적외선(IR) 분광은 Mattson 사의 GALAXY 분광기를 사용하였으며 NaCl 판에 흡착하여 사용하였다. 자외선(UV) 분광은 Hitachi 사의 U-3210 분광기에서, 용매로는 메탄올을 사용하였다.

상기 추출 및 분리된 화합물들에 대한 ¹H 와 ¹³C NMR 스펙트럼, Mass 스펙트럼의 해석 결과, 화합물 3, 4, 6은 신규 물질로 확인되었다. 이들 화합물의 구조는 이 물질들의 구조는 핵자기 공명 스펙트럼, 적외선 및 자외선 분광자료와 고해상 질량분석 데이터에 의하여 결정되었으며, 핵자기 공명 스펙트럼에서 1H-NMR 시그날과 13C-NMR 시그날에 대한 위치지정(assignment)은 COSY, gradient HSQC, gradient HMBC 등의 다차원 핵자기 공명 실험을 통해 행하였으며, 그 결과는 다음과 같다:

화합물 3: ( 7에스 , 8에스 )- 다이히드로디히드로다이코니페릴 알콜 9'- 오르토 -베타-디- 글루코피라노사이드 ((7 S , 8 S )- Dihydrodehydrodiconiferyl alcohol 9- O -β-D- glucopyranoside )

(1) 분자식 : C₂₆H₃₄O₁₁

(2) 분자량 : 545

(3) 색 : 흰색

(4) 녹는점 : 상온에서 무정형 고체

(5) 적외선흡수대 (KBr) : 3385 (br), 2936, 1605, 1518, 1498 cm^-1

(6) ¹H-NMR (MeOH-d₄, 500 MHz) 및 ¹³C NMR (MeOH-d₄, 125 MHz)

위치	(7에스 8에스)-다이히드로디히드로다이코니페릴 알콜 9'-오르토-베타-디-글루코피라노사이드
위치	¹H	¹³C
1		134.9, C
2	6.94, s	110.7, CH
3		149.1, C
4		147.5, C
5	6.75, d(8.0)	116.2, C
6	6.82, d(8.0)	119.8, CH
7	5.48, d(6.0)	89.0, CH
8	3.46, m	55.4, CH
9	3.82, m; 3.77, dd(11.0, 7.0)	65.1, CH₂
1'		136.9, C
2'	6.74, s	114.4, CH
3'		145.2, C
4'		147.5, C
5'		130.0, C
6'	6.74, s	118.1, CH
7'	2.67, t(7.0)	32.9, CH₂
8'	1.91, m	32.9, CH₂
9'	3.92, m; 3.52, m	70.0, CH₂
3-OCH₃	3.81, s	56.4, CH₃
3'-OCH₃	3.85, s	56.9, CH₃
1"	4.25, d(7.7)	104.5, CH₃
2"	3.19, dd(7.7, 8.5)	75.2, CH
3"	3.35, dd(8.5, 8.5)	78.2, CH
4"	3.33, m	71.8, CH
5"	3.27, m	77.9, CH
6"	3.82, m; 3.66, dd(12.0, 5.5)	62.8, CH₂

화합물 4: ( 7에스 , 8에스 )- 다이히드로디히드로다이코니페릴 알콜 9- 오르토 -베타-디- 글루코피라노사이드 ((7 S , 8 S )- Dihydrodehydrodiconiferyl alcohol 9- O -β-D- glucopyranoside )

(1) 분자식 : C₂₆H₃₄O₁₁

(2) 분자량 : 545

(3) 색 : 흰색

(4) 녹는점 : 상온에서 무정형 고체

(5) 적외선흡수대 (KBr) : 3394 (br), 2926, 1602 cm^-1

(6) ¹H-NMR (MeOH-d₄, 400 MHz) 및 ¹³C NMR (MeOH-d₄, 125 MHz)

위치	(7에스, 8에스)-다이히드로디히드로다이코니페릴 알콜 9-오르토-베타-디-글루코피라노사이드
위치	¹H	¹³C
1		134.8, C
2	6.98, d(1.5)	110.9, CH
3		149.0, C
4		147.5, C
5	6.7s, d(8.2)	116.1, CH
6	6.85, dd(8.2, 1.5)	119.8, CH
7	5.58, d(6.2)	89.0, CH
8	3.63, m	53.3, CH
9	4.20, dd (9.5, 5.4);3.77, dd(9.5, 7.7)	72.4, CH₂
1'		137.0, C
2'	6.77, br s	114.4, CH
3'		145.3, C
4'		147.5, C
5'		129.7, C
6'	6.77, br s	118.3, CH
7'	2.62, t(7.5)	35.8, CH₂
8'	1.82, quin(7.5)	32.9, CH₂
9'	3.56, t(6.5)	62.3, CH₂
3-OCH₃	3.81, s	56.5, CH₃
3'-OCH₃	3.85, s	56.8, CH₃
1"	4.34, d(7.7)	104.6, CH
2"	3.22, dd(7.7, 8.5)	75.2, CH
3"	3.35, m	78.3, CH
4"	3.34, m	71.7, CH
5"	3.27, m	78.0, CH
6"	3.82, m; 3.66, m	62.9, CH₂

화합물 6: ( 8에스 , 8'알)- 노트라첼로게닌 8- 오르토 -베타-디- 글루코피라노사이드 ((8 S , 8' R )- Nortrachelogenin 8- O -β-D- glucopyranoside )

(1) 분자식 : C₂₆H₃₂O₁₂

(2) 분자량 : 559

(3) 색 : 흰색

(4) 녹는점 : 상온에서 무정형 고체

(5) 적외선흡수대 (KBr) : 3389 (br), 2929, 1768, 1517, 1277 cm^-1

(6) ¹H-NMR (DMSO-d₆, 500 MHz) 및 ¹³C NMR (DMSO-d₆, 125 MHz)

위치	(8에스, 8'알)-노트라첼로게닌 8-오르토-베타-디-글루코피라노사이드
위치	¹H	¹³C
1		126.0, C
2	7.05, d(1.5)	114.5, CH
3		145.2, C
4		146.9, C
5	6.66, d(7.5)	114.7, C
6	6.68, dd(7.5, 1.5)	122.7, CH
7	3.12, m; 2.95, d(14.5)	35.8, CH₂
8		82.5, C
9		175.1, C
1'		129.3, C
2'	6.68, d(1.5)	112.6, CH
3'		147.5, C
4'		144.9, C
5'	6.64, d(7.5)	115.4, CH
6'	6.58, dd(7.5, 1.5)	120.7, CH
7'	2.95, dd(13.1, 3.5); 2.54(13.1. 12.5)	30.6, CH₂
8'	3.04, m	45.1, CH
9'	4.05, dd(8.0, 8.0); 4.00, dd(8.5, 8.0)	68.9, CH₂
3-OCH₃	3.72, s	55.5, CH₃
3'-OCH₃	3.74, s	55.4, CH₃
1"	4.52, d(7.6)	98.3, CH
2"	3.14, m	73.7, CH
3"	3.15, m	76.6, CH
4"	3.17, m	69.5, CH
5"	3.16, m	76.6, CH
6"	3.64, dd(11.5, 2.5); 3.50, dd(11.5, 5.0)	60.8, CH₂

상기 추출 및 분리된 화합물들에 대한 ¹H와 ¹³C NMR 스펙트럼, Mass 스펙트럼의 해석 결과, 화합물 1, 2, 7, 8 및 9의 스펙트럼 데이터들은 보고된 결과 (Xie LH, Akao T, Hamasaki K, Deyama T, Hattori M, Chem. Pharm. Bull., 51, pp508-515, 2003; Lundgren LN, Popoff T, Theander O, Phytochemistry, 20, pp1967-1969, 1981; Bogucki DE, Charlton JL, Can. J. Chem., 75, pp1783-1794, 1997; Veit M, Strack D, Czygan FC, Wray V, Witte L, Phytochemistry, 30, pp527-529, 1991; Lee GT, Duan CH, Lee JN, Lee KS, Hong JT, Lee KK, Nat. Prod. Sci., 16, pp207-210, 2010)와 일치하였으며, 각각 기지물질인 리그난(lignan) 계열의 (+)-피노레시놀 ((+)-pinoresinol); (7에스, 8에스)-다이히드로 디히드로다이코니페릴 알콜 ((7S, 8S)-dihydrodehydrodiconiferyl alcohol); (-)-로스마리닉 에시드 ((-)-rosmarinic acid); (+)-취코릭 에시드 ((+)-chicoric acid), 또한 페닐 프로파노이드 (phenyl propanoid) 계열의 카페익 에시드 (caffeic acid)로 확인되었다.

시험예: 소르타제 A에 대한 저해활성 시험

<재조합 단백질 소르타제 A의 제조>

소르타제 A (SrtA)의 저해활성 평가를 위해 유전자 조작 방법으로 재조합 단백질을 제조하여 사용하였다 (Lee KY, Shin DS, Yoon JM, Kang H, Oh KB, J. Microbiol. Biotechnol., 12, pp530-533, 2002).

구체적으로는 서울대학교 치과대학에서 환자의 구강에서 분리해 낸 스트렙토코커스 뮤탄스 (Streptococcus mutans) OMZ65 균주를 분양받아 사용하였다. 브레인-하트 인퓨젼 (Brain-Heart Infusion) 배지에 접종하여 37℃에서 24시간 진탕배양 한 후 상법에 따라 게놈성 DNA(genomic DNA)를 추출하여 준비하고, SrtA 유전자 증폭용 프라이머(primer)를 사용하여 (forward: 5'-GGCGAATTCGCTTGGAATACCAATAGA-3'; reverse: 5'-GAAGTCGACTTAAAATGATATTTGATTATAGGACTG-3') PCR (polymerase chain reaction) 방법으로 유전자를 증폭하였다. PCR에서 증폭된 유전자를 아가로스 젤 전기영동을 실시하여 DNA 밴드를 회수한 후, EcoRI 과 Sal 제한효소로 처리하고 pET-32a 발현벡터 (Novagen, 영국)에 삽입한 후 이를 대장균(Escherichia coli strain BL21 (DE3)) (Novagen, 영국)에 도입하여 형질전환시켰다.

스트렙토코커스 뮤탄스 OMZ65 균주의 SrtA 유전자 염기서열을 확인한 결과 아미노산 서열 수준에서 이미 보고된 균주인 스트렙토코커스 뮤탄스 NG8 균주 (GenBank 등록번호: AAN28729.1)와 99% 일치함을 확인하였다. 형질전환된 대장균을 100μg/mL 농도의 암피실린(ampicillin) 및 0.05 mM의 IPTG (Sigma, 미국)가 첨가된 루리아-베르타니 (Luria-Bertani) 액체배지에 접종시킨 뒤, 28℃, 200 rpm으로 6시간 배양하였다. 배양액을 6,000 xg에서 10분간 원심분리하여 균체를 모은 후 10ml의 증류수에 현탁한 뒤 초음파 파쇄기로 세포를 파쇄하였다. 이를 10,000 xg에서 30분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 상등액을 프로본드 정제 시스템 (ProBond purification system) (Invitrogen, 미국)을 사용하여 최종 정제된 소르타제 A (SrtA)를 수득하였다.

<소르타제 A 저해활성 측정>

상기 제조예에서 얻은 화합물들의 소르타제 A 저해활성 측정 시험을 수행하였다 (Ton-That H, Liu G, Mazmanian SK, Faull KF, Schneewind O, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 96, pp12424-12429, 1999; Lee KY, Shin DS, Yoon JM, Kang H, Oh KB, J. Microbiol. Biotechnol., 12, pp530-533, 2002).

구체적으로는 50mM 트리스염산 완충액 (Tris-HCl, pH 7.5), 150mM 소듐클로라이드, 5mM 칼슘클로라이드, 0.75μg 합성기질 (Dabcyl-QALPETGEE-Edans) 및 55μg 소르타제 A로 구성된 혼합용액을 만들었다. 여기에 상기 화합물들을 각각 디메칠슬폭시드 (DMSO, 최종농도는 0.5%가 되도록 조정)에 녹인 후 측정코자 하는 농도로 혼합용액에 가하여 300 ㎕가 되도록 하고 이를 96웰 마이크로 플레이트에 분주하였다. 37℃에서 1시간 동안 효소반응시킨 후, 바이오텍 (BioTek)의 FLx-800 형광분광광도계 (fluorescence spectrophotometer)에서 350nm를 여기광으로 하여 495mm에서 형광 증가량을 측정하여 그 결과를 하기 표에 나타냈다. 대조물질로는 소르타제 저해물질로 알려진 파라-히드록시머큐리벤조익 에시드 (p-Hydroxymecuribenzoic acid) (Sigma, 미국)를 사용하였다.

화합물	IC₅₀ (μM)
1	67.7 ± 6.2
2	35.9 ± 3.7
3	37.3 ± 3.9
4	82.8 ± 9.1
6	41.2 ± 1.8
7	17.6 ± 0.9
8	60.0 ± 5.8
9	20.2 ± 0.3
파라-히드록시머큐리벤조익 에시드	35.1 ± 4.6

상기 표에 나타난 바와 같이, 본 발명의 화합물들은 우수한 소르타제 A 저해활성을 나타냈다. 따라서 본 발명의 화합물들은 유해세균에 대한 항균 조성물로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.

특히 화합물 3 및 6의 소르타제의 저해활성이 대조물질에 상당할 정도로 우수하므로, 각각 C-9 위치에 히드록시기 및 C-8 위치에 글루코스의 존재가 저해활성에 중요함을 보여주고 있으며, 다양한 항균물질 유도체의 제조시 이와 같은 점이 유익하게 이용될 수 있다.

화합물 7 및 9는 기지의 구조를 가지나, 대조물질인 파라-히드록시머큐리벤조익 에시드보다 각각 2.0배 및 1.7배 정도의 강한 소르타제 저해활성을 보였으므로, 항균 조성물의 유효성분으로 그 활용도가 높다는 것을 알 수 있다.

<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> Novel antimicrobial compounds and an antimicrobial composition containing the same <130> SNU-2013-0642 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 1 ggcgaattcg cttggaatac caataga 27 <210> 2 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 2 gaagtcgact taaaatgata tttgattata ggactg 36

Claims

백두옹(Pulsatilla radix)으로부터 추출 및 분리되어 제조된 하기 식의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염:

상기 식에서, R¹은 Glc (글루코스)이고 R²는 H 이다.
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백두옹(Pulsatilla radix)으로부터 추출 및 분리되어 제조된 하기 식의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 소르타제에 대한 저해활성을 가진 항균 조성물:

또는

상기 식에서 Glc는 글루코스이다.
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제 5항에 있어서, 상기 항균은 그람양성세균에 대한 항균인 것인 항균 조성물.
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제 5항에 있어서, 항균 조성물은 세균 감염증의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물인 것인 항균 조성물.
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제 5항에 있어서, 상기 항균 조성물은 충치 및 치주염의 예방 또는 치료용 구강 조성물인 것인 항균 조성물.
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