KR20230006074A - 병원성 미생물의 생물막 형성 억제용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents
병원성 미생물의 생물막 형성 억제용 조성물 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 병원성 미생물의 생물막 형성 억제용 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 해면으로부터 분리된 포르바케탈 화합물 3 및 5는 항생제 저항성 또는 민감성 황색포도상구균 모두에서 세포 사멸 없이 우수한 생물막 형성 억제 효과를 나타내는 것이 확인됨에 따라, 상기 포르바케탈 화합물을 유효성분으로 함유하는 조성물은 병원성 미생물의 생물막 억제용 조성물 및 병원성 미생물의 생물막에 의한 감염질환 치료제로 제공될 수 있다.
Description
본 발명은 해면으로부터 분리된 포르바케탈 화합물을 유효성분으로 함유하는 병원성 미생물의 생물막 형성 억제용 조성물에 관한 것이다.
자연 상태에서 대부분의 세균은 다당류(polysaccharides) 또는 단백질을 이용하여 표면에 부착하는 고착성 미생물 군집인 생물막을 형성한다. 생물막은 다당류와 폴리펩타이드가 주성분인 폴리머 기질로 된 점액질의 외막이 세균 집락을 둘러싸고 있는 형태이다. 즉, 생물막은 고형의 생물학적 표면인 세균 집락과 비생물학적 표면인 외막으로 구성된 복합체이다.
생물막은 자연계에서 흔하게 발견되는데, 바위나 연못에서 발견되는 점액질이 바로 그것이다. 생물막은 세균으로 이루어진 작은 도시라 할 수 있으며, 그 속에서 세균은 서로 의사소통하고, 외부에 대해서 저항성을 나타내고, 만성 감염에 대한 세균의 내성에 기인한다.
생물막은 일반 자연 환경 외에 세균 감염성 질환과 관련하여서도 자주 발견되는데, 미국 국립보건연구소의 2002년 보고에서 박테리아군의 최대 80%가 이 같은 생물막 형성을 통해 병원균을 퍼트리고 있는 것으로 추산했으며, 별개로 부유하던 세균에 대해 약효를 나타내던 항생제도 세균이 생물막을 형성하면 효능을 상실하는경향이 커진다고 보고하였는데, 세균이 생물막을 형성하면 생물막에 존재하는 외막을 항체 등이 투과할 수 없어 숙주의 면역체계를 무력화시키고, 항생제에 대한 세균의 저항성이 약 1000 배까지 높아질 수 있다고 한다.
이런 생물막 형성에 따른 항생제에 대한 저항성의 증가 원인은 아직 정확하게 밝혀져 있지는 않으나, 생물막이 형성됨으로써, 주위 환경과 교환 작용에 대한 의존성이 낮아지고, 점액성 다당류로 구성된 외막이 항생물질이 개개의 세균까지 전달되는 것을 방해하기 때문이며, 생물막이 형성되면 그 생물막 속에 존재하는 내성이 없던 세균들도 주위의 내성세균으로부터 수평 유전자 전이를 통하여 내성인자 관련 유전자를 획득하여 내성 세균화가 진행되기 때문으로 설명할 수 있다.
따라서, 생물막이 형성되면 이는 항생제 내성 상태가 되었다고 볼 수 있으며, 이러한 경우 세균들의 항생제에 대한 감수성이 낮아져 항생제를 사용해도 거의효과가 없고, 특히 생물막을 형성하고 있는 세균에 의한 감염은 여러 가지 항생제에 대해 내성을 갖는 다제내성균에 의한 경우가 많아 더욱 문제가 심각하다.
본 발명은 해면으로부터 분리된 포르바케탈 화합물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 병원성 미생물인 황색포도상구균의 생물막 형성 억제용 조성물로 제공하고자 한다.
본 발명은 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 병원성 미생물의 생물막 형성 억제용 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
* 는 키이랄센터이다.
본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 병원성 미생물의 생물막에 의해 유발되는 감염성 질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 병원성 미생물의 생물막에 의해 유발되는 감염성 질환 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 해면으로부터 분리된 포르바케탈 화합물 3 및 5는 항생제 저항성 또는 민감성 황색포도상구균 모두에서 세포 사멸 없이 우수한 생물막 형성 억제 효과를 나타내는 것이 확인됨에 따라, 상기 포르바케탈 화합물 3 또는 화합물 5를 유효성분으로 함유하는 조성물은 병원성 미생물의 생물막 억제용 조성물 및 병원성 미생물의 생물막에 의한 감염질환 치료제로 제공될 수 있다.
도 1은 화합물 1 내지 6의 구조이다.
도 2는 포르바케탈의 생물막 형성 억제 효과를 확인한 결과로, 96-웰 플레이트에서 포르바케탈이 존재하거나 존재하지 않는 조건으로 S. aureus MSSA 6538 및 S. aureus MRSA MW2을 인큐베이션한 후 생물막 형성을 확인한 결과로, 도 2A는 S. aureus MSSA 6538의 결과이며, 도 2B는 S. aureus MRSA MW2의 결과이다 (*, p < 0.05 versus untreated controls).
도 3은 포르바케탈 화합물 존재하에서 부유성 세포성장을 확인한 결과이다.
도 4A는 포르바케탈 1, 2 또는 3의 존재하에서 생물막 형성을 확인한 공초점 레이저 스캔 현미경 이미지로, 스케일 바는 100 μm를 나타내며, 도 4B는 생물막 형성의 COMSTAT 정량값이다.
도 5는 포르바케탈 (100 μg/mL)이 S. aureus의 스타필로잔틴 (staphyloxanthin) 생산에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
도 6은 화합물 3 또는 5 처리 후 전사 프로파일 변화를 확인한 결과로, 16s rRNA 발현에 대한 qRT-PCR를 수행하여 상대적 전사 프로파일을 확인한 결과이다 (*, p < 0.05 versus untreated controls).
도 2는 포르바케탈의 생물막 형성 억제 효과를 확인한 결과로, 96-웰 플레이트에서 포르바케탈이 존재하거나 존재하지 않는 조건으로 S. aureus MSSA 6538 및 S. aureus MRSA MW2을 인큐베이션한 후 생물막 형성을 확인한 결과로, 도 2A는 S. aureus MSSA 6538의 결과이며, 도 2B는 S. aureus MRSA MW2의 결과이다 (*, p < 0.05 versus untreated controls).
도 3은 포르바케탈 화합물 존재하에서 부유성 세포성장을 확인한 결과이다.
도 4A는 포르바케탈 1, 2 또는 3의 존재하에서 생물막 형성을 확인한 공초점 레이저 스캔 현미경 이미지로, 스케일 바는 100 μm를 나타내며, 도 4B는 생물막 형성의 COMSTAT 정량값이다.
도 5는 포르바케탈 (100 μg/mL)이 S. aureus의 스타필로잔틴 (staphyloxanthin) 생산에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
도 6은 화합물 3 또는 5 처리 후 전사 프로파일 변화를 확인한 결과로, 16s rRNA 발현에 대한 qRT-PCR를 수행하여 상대적 전사 프로파일을 확인한 결과이다 (*, p < 0.05 versus untreated controls).
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명의 발명자들은 해면으로부터 분리된 포르바케탈 화합물 중 화합물 3 및 5이 항생제 저항성 또는 민감성 황색포도상구균 모두에서 세포 사멸 없이 우수한 생물막 형성 억제 효과를 나타내는 것을 확인함에 따라, 상기 화합물을 병원성 미생물의 생물막 억제용 조성물 및 병원성 미생물의 생물막에 의한 감염 질환 치료제로 제공하기 위해 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 병원성 미생물의 생물막 형성 억제용 조성물을 제공할 수 있다.
[화학식 1]
* 는 키이랄센터이다.
보다 상세하세는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 하기 화학식 1-2 또는 화학식 1-2로 표시되는 화합물일 수 있다.
[화학식 1-1]
[화학식 1-2]
상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 병원성 미생물의 세포사멸 없이 생물막 형성을 억제할 수 있다.
상기 병원성 미생물은 황색포도상구균 (S. aureus)일 수 있으며, 상기 황색포도상구균은 항생제 저항성 및 민감성 균으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으며, 보다 상세하게 황색포도상구균 (S. aureus) MSSA ATCC 6538 및 MRSA ATCC BAA-1707 MW2으로 이루어지는 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 병원성 미생물의 생물막에 의해 유발되는 감염성 질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공할 수 있다.
[화학식 1]
* 는 키이랄센터이다.
상기 감염성 질환은 피부염, 패혈증, 화농성 질환, 식중독, 폐렴, 골수염, 농가진, 균혈증, 심내막염 및 장염으로 이루어진 군에서 선택되는 황색포도상구균 생물막에 의해 유발되는 감염성 질환일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 약학조성물은 통상적인 방법에 따라 주사제, 과립제, 산제, 정제, 환제, 캡슐제, 좌제, 겔, 현탁제, 유제, 점적제 또는 액제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형을 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 약학조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면 상기 약학조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다.
상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 바람직한 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면 이에 제한되는 것은 아니지만 1일 투여량이 0.01 내지 200 mg/kg, 구체적으로는 0.1 내지 200 mg/kg, 보다 구체적으로는 0.1 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 '대상체'는 인간을 포함하는 포유동물일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 병원성 미생물의 생물막에 의해 유발되는 감염성 질환 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공할 수 있다.
[화학식 1]
* 는 키이랄센터이다.
상기 화장료조성물은 유효성분인 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 외에 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.
상기 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 썬 크림, 유연 화장수, 수렴 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
상기 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜,실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
상기 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
상기 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해 화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
상기 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실험예>
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. 일반적인 실험 과정
해면 (Marine Sponge Phorbas sp.) 시료(voucher number 07G-26)를 2007년 대한민국 거제도에서 수집하였다. 선광도는 JASCO P-1010 polarimeter (Jasco, Easton, MD, USA)로 측정되었으며, IR 스펙트럼은 JASCO FT/IR 4100 spectrometer (Jasco, Easton, MD, USA)을 사용하고, 자외선 (UV) 스펙트럼은 Varian Cary 50 UV-Visible spectrophotometer (Agilent, Santa Clara, CA, USA)을 이용하여 기록되었다.
High-resolution (HR)-electrospray ionization (ESI) 질량 스펙트럼은 SCIEX X500R mass spectrometer (Sciex, Framingham, MA, USA)를 이용하여 확인되었다. 자기공명영상 (Nuclear magnetic resonance, NMR) 스펙트럼은 500 MHz (1H) 또는 125 MHz (13C)에서 작동하는 Varian VNMRS 500 NMR spectrometer (Varian, Palo Alto, CA, USA)를 이용하였다.
양성자 및 탄소 스펙트럼의 화학적 이동은 메탄올-d4 용액에서 각각 3.30 ppm 및 49.0 ppm의 잔류 용매 피크에 대하여 확인되었다.
Agilent 1200 pump (Agilent, Santa Clara, CA, USA)와 DAD detector를 이용하여 반준비 액체크로마토그래피 (Prep-LC)를 수행하였다. 컬럼 크로마토그래피는 RP-18 silica gel 60 (Merck, Darmstadt, Germany)을 이용하여 수행되었다.
2. 균주 및 배양 조건
황색포도상구균 (S. aureus) MSSA ATCC 6538 및 MRSA ATCC BAA-1707 MW2를 사용하여 실험을 진행하였다. 모든 실험은 37 ℃에서 수행되었으며, 처음에는 박테리아를 -80 ℃ 글리세롤 스톡 (stocks)으로 LB 플레이트에 도말하고, 신선한 단일 콜로니를 25 mL LB 배지가 포함된 250 mL 플라스크에 접종하고 250 rpm으로 37 ℃에서 교반하여 밤새 배양하였다.
배양 후 1:100으로 희석하여 LB 배지에 재접종하였다. 다양한 농도의 화합물이 존재하는 조건에서 spectrophotometer (UV-160, Shimadzu, Japan)를 이용하여 620 nm (OD620) 흡광도로 세포 성장을 확인하였다.
최소 억제 농도 (Minimum inhibitory concentrations, MICs)는 박테리아 및 효모에 대한 임상실험실 표준 연구소 (CLSI)에서 명시한대로 결정되었다. 모든 실험은 2 번 이상의 독립적인 배양으로 수행되었다.
3. 항생물막 분석
앞서 설명된 방법[Kim, Y.-G., et al., Front. Microbiol. 2018, 9, 1241.]으로 96-웰 폴리스티렌 플레이트 (SPL Life Sciences, Pocheon, Korea)에서 고정된 바이오필름 형성 분석을 수행하였다.
간략하게, LB 배지 (MSSA 균주의 경우) 또는 0.2 % 글루코오스가 포함된 LB 배지 (MRSA 균주의 경우) 총 부피 300 μL에 0.05의 초기 OD600로 세포를 접종하였다.
세포를 24시간 동안 교반 없이 포르바케탈이 존재하거나 존재하지 않는 조건에서 배양하였다. 96-웰 플레이트에서 생물막을 크리스탈 바이올렛으로 염색하고 95% 에탄올로 용해시킨 후 570 nm (OD570)에서 흡광도를 측정하여 전체 생물막 형성을 정량하였다. 세포 성장은 96-웰 플레이트에서 620 nm (OD620) 흡광도를 측정하여 확인하였으며, 최소 12개의 복제 웰의 평균값으로 결과값을 나타내었다.
4. 공초점 레이저 현미경 및 COMSTAT 분석
96-웰 플레이트에서 고정된 생물막을 Ar 레이저 (여기 488 nm, 방출 500-550 nm) 및 20× 대물렌즈를 사용하여 공초점 레이저 현미경으로 시각화하였다.
NIS-Elements C version 3.2 (Nikon Instruments)를 이용하여 컬러 공초점 이미지를 얻었다. 각 실험에 대하여, 현미경 분석을 위해 3번의 독립적인 배양물에서 각각 최소 10개의 위치를 무작위적으로 선택하였다.
collismycin C의 존재 및 비존재 조건에서 생물막 형성을 정량하기 위해, COMSTAT biofilm software (kindly provided by Arne Heydorn, Søborg, Denmark)를 사용하여 바이오매스 (biomasses, μm3/μm2), 평균 두께(μm) 및 기층 범위 (substratum coverage, %)를 확인하였다. 위치 당 최소 4 개의 위치와 20 개의 평면 이미지가 분석되었다.
5. 스타필로잔틴 (Staphyloxanthin) 분석
밝은 황금색의 스타필로잔틴으로 펠렛을 관찰하였다 [Daum, R. S. Removing the golden coat of Staphylococcus aureus. N. Engl. J. Med. 2008, 359, 85-87.]
간략하게, 세포를 LB (2 mL) 배지로 1:100으로 희석하여 접종하고 14 mL 튜브에서 포르바케탈과 함께 16 시간 동안 250 rpm으로 인큐베이션하였다.
16,600×g에서 10 분간 원심분리하여 세포 (1 mL)을 수집하고 세포 펠렛을 촬영하여 스타필로잔틴 생성을 확인하였다.
6. 정량적 실시간 역전사 분석 (qRT-PCR)
앞서 보고된 방법[Lee, J.-H., et al., Sci. Rep. 2016, 6, 19267.]을 약간 변경하여 RNA 추출 및 qRT-PCR을 수행하였다.
간략하게, 전체 RNA를 분리하기 위해, 250 mL 플라스크에 포함된 LB 배지 25 mL에 S. aureus MSSA 6538 세포를 0.05의 OD600로 접종하고 100 μg/mL 농도의 포르바케탈 B (3) 또는 포르바케탈 C (5)가 존재하거나 존재하지 않는 조건에서 37 ℃에서 6 시간 동안 250 rpm으로 교반하여 인큐베이션하였다.
RNase 억제제 (RNAlater, Ambion, TX, United States)를 첨가하고, RNA 분해를 예방하기 위해, 95 % 에탄올이 포함된 드라이 아이스에서 30 초간 즉시 냉각하였다.
16,600 g로 1 분간 원심분리하여 세포를 수집하고, Qiagen RNeasy mini Kit (Valencia, CA, United States)를 이용하여 전체 RNA를 분리하였다. 10 개의 생물막 관련 유전자 (viz agrA, arlS, aur, hla, icaA, nuc1, RNAIII, saeR, sarA, sarZ, seb, sigB 및 spa)의 전사 수준을 qRT-PCR을 이용하여 확인하였다.
표 1과 같은 유전자 특이적 프라이머를 사용하였으며, 16s rRNA를 하우스키핑 대조군으로 사용하였다. SYBR Green master mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, United States) 및 ABI StepOne Real-Time PCR System (Applied Biosystems)을 이용하여 qRT-PCR을 수행하였다.
두 번의 독립적인 배양 및 각 유전자당 6 번의 qRT-PCR 반응을 수행하여 발현 수준을 확인하였다.
| Gene | Name | Primer |
|
16S
rRNA |
A component of ribosomes | Forward 5'-TGT TTG ACG ATG TTT GAG CA-3' |
| Reverse 5'-CCT TCC TCC AGT TCA GAT GC -3' | ||
| agrA | Quorum-sensing regulator A | Forward 5'-TGA TAA TCC TTA TGA GGT GCT T-3' |
| Reverse 5'-CAC TGT GAC TCG TAA CGA AAA-3' | ||
| arlR | Response regulator | Forward 5'-TTA CGG TGC AGG CGA TTA TAT AG-3' |
| Reverse 5'-TAC CGT TGA CAT CGA TAA TAT CC-3' | ||
| aur | Zinc metalloproteinase aureolysin | Forward 5'-ACC GTG TGT TAA TTC GTG TGC TA-3' |
| Reverse 5'-ATG GTC GCA CAT TCA CAA GTT T-3' | ||
| hla | α-Hemolysin | Forward 5'-CGG CAC ATT TGC ACC AAT AAG GC-3' |
| Reverse 5'-GGT TTA GCC TGG CCT TCA GC-3' | ||
| icaA | Intercellular adhesion A | Forward 5’-TGA ACC GCT TGC CAT GTG-3’ |
| Reverse 5’-CAC GCG TTG CTT CCA AAG A-3’ | ||
| nuc1 | Nuclease | Forward 5'-CAC CTG AAA CAA AGC ATC CTA A-3' |
| Reverse 5'-TAT ACG CTA AGC CAC GTC CAT-3' | ||
| RNAⅢ | Transcriptional regulator | Forward 5'-ATC GAC ACA GTG AAC AAA TTC AC-3' |
| Reverse 5'-CTC TAC TAG CAA ATG TTA CTC AC-3' | ||
| saeR | Response regulator | Forward 5'-GCC TTA ACT TTA GGT GCA GAT GAC TAT GTC-3' |
| Reverse 5'-CGA CAG TTG TTC AAC TGG TTG ATG ATG G-3' | ||
| sarA | Transcriptional regulator | Forward 5'-GAG TTG TTA TCA ATG GTC-3' |
| Reverse 5'-GTT TGC TTC AGT GAT TCG-3' | ||
| sarZ | HTH-type transcriptional regulator | Forward 5'-CCT ATA CTG GTT ACA TTG TTT TAA TGG-3' |
| Reverse 5'-TGG TGT CAG TGT TCC AGA ATC-3' | ||
| seb | Enterotoxin B | Forward 5'-TGT TCG GGT ATT TGA AGA TGG -3' |
| Reverse 5'-CGT TTC ATA AGG CGA GTT GTT-3' | ||
| sigB | RNA Polymerase sigma factor | Forward 5'-AAG TGA TTC GTA AGG ACG TCT-3' |
| Reverse 5'-TCG ATA ACT ATA ACC AAA GCC T-3' | ||
| spa | Protein A | Forward 5'-ACC AGA AAC TGG TGA AGA AAA TCC-3' |
| Reverse 5'-TAA CGC TGC ACC TAA GGC TAA TG-3' |
<실시예 1> 포르바케탈 화합물 준비
해면(Phorbas sp.)으로부터 포르바케탈 (phorbaketals)을 분리하기 위해, 수집된 시료를 현장에서 동결하고 드라이아이스를 사용하여 실험실로 운반하였으며, 필요시까지 -25 ℃ 냉장고에서 보관하였다.
동결 건조된 해면을 실온에서 MeOH로 두 번 추출하고 여과하였다.
메탄올 추출물을 디클로로메탄 (DCM)과 증류수 사이에서 분할하고, 메탄올을 감압하에 증발시켜 제거하고, 잔류물은 n-헥산 및 15 % 메탄올 수용액 사이에서 분할하였다.
역상 실리카겔 플레쉬 컬럼 크로마토그래피에 메탄올 수용액 분획 (ca 4.5 g)을 적용하고 용매의 극성이 감소하도록 희석하여 (MeOH / H2O = 5 / 5; 6 / 4; 7 / 3; 8 / 2; 9 / 1; 100% MeOH; 100% acetone) 7개의 분획 (MR1 ~ MR7)을 얻었다.
역상 HPLC (1.4 g, C18, YMC ODS-A column, 250 × 10 mm ID, with MeCN / H2O (65 / 35) as eluant at a flow rate of 2 mL/min)로 분리된 MR5 분획에서 4개의 포르바케탈 화합물(3~6)을 얻었으며, 화합물 1 및 2는 MR6 분획에서 분리되었다.
알려진 화합물 1, 3 및 5는 분광 프로파일 (NMR, UV, IR 및 MS)과 발표된 데이터를 통하여 각각 포르바케탈 A, B 및 C로 확인되었으며, Mosher의 방법을 이용하여 절대 위치배열을 확인하였다.
도 1과 같이 포르바케탈 A (phorbaketal A (1)), 포르바케탈 A 아세테이트 (phorbaketal A acetate (2)), 포르바케탈 B (phorbaketal B (3)), 포르바케탈 B 아세테이트 (phorbaketal B acetate (4)), 포르바케탈 C (phorbaketal C (5)) 및 포르바케탈 C 아세테이트 (phorbaketal C acetate (6)) 와 같은 6 종의 포르바케탈 화합물을 한국 해양 스펀지 Phorbas sp. 에서 성공적으로 분리하였다. 상기 화합물 1, 3 및 5는 각각 포르바케탈 A, B 및 C로 확인되었으며, 상기 화합물의 분광학적 프로파일 (NMR, UV, IR 및 MS)은 앞서 보고된 데이터에서 확인되었다 [Rho, J. R., et al., Org. Lett. 2009, 11, 5590-5593.]
<실시예 2> 포르바케탈의 항미생물 및 항생물막 활성 확인
96-웰 미량정량판 (microtiter plates)에서 0, 10, 20, 50 또는 100 μg/mL 농도로 상기 6 개의 포르바케탈 화합물의 메틸실린 민감성 S. aureus (MSSA) ATCC 6538 생물막 형성 억제를 스크리닝하였다.
그 결과, 도 2A와 같이 모든 6개의 포르바케탈 화합물은 용량의존적으로 생물막 형성을 억제하였으나, 특히 3 및 5 화합물의 억제 효과가 매우 우수한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 2B와 같이 메티실린 저항성 S. aureus (MRSA) MW2 균주에서도 유사한 항생물막 활성이 나타나는 것이 확인되었으나 MSSA 균주에서 더욱 민감한 항생물막 활성이 확인되었다.
박테리아 약물 내성을 유발할 수 있기 때문에 이상적으로 항생물막제는 박테리아를 사멸시키지 않아야 한다. 따라서 최소 억제 농도(MICs)를 측정하여 6종의 포르바케탈의 항미생물 활성을 확인하였다.
S. aureus 6538 균주에 대한 6 가지 화합물의 MIC는 200 μg/mL 초과 시 약한 항균 활성을 나타내었다. 그러나 도 3과 같이 S. aureus의 부유성 세포성장은 포르바케탈의 < 100 μg/mL 에서 상대적으로 영향을 받지 않는 것이 확인되었다.
상기 결과로부터 6 개의 포르바케탈은 MIC 농도 미만에서 항균 활성이 아닌 항생물막 활성을 나타내는 것이 확인되었다. 또한, 화합물 3 및 화합물 5이 가장 우수한 생물막 형성 억제 효과를 나타내었으며, 부유성 세포 성장에 영향을 미치는 않는 것으로 확인됨에 따라, 상기 두 화합물의 기계론적 연구를 추가로 진행하였다.
공초점 레이저 스캔 현미경을 사용하여 생물막 형성 변화를 확인하였다.
도 4A의 형광이미지를 참고하면, 도 2의 정량적 생물막 결과와 일치하게, 100 μg/mL 농도의 화합물 3 및 5 에서 S. aureus MSSA 6538 균주의 생물막 형성을 현저하게 억제시키는 것이 확인되었다. 또한, COMSTAT biofilm software를 사용하여 생물막 형성 변화를 정량적으로 확인한 결과, 도 4B와 같이 화합물 3 및 5는 S. aureus 생물막의 바이오매스, 평균 두께 및 기층 범위를 95% 이상 감소시키는 것이 확인되었다.
또한, 6개의 포르바케탈 화합물이 스타필로잔틴 (staphyloxanthin, STX; 노란색 색소)의 생산에 미치는 영향을 확인하였다.
도 5를 참고하면, 미처리된 S. aureus의 세포 펠렛에서 스타필로잔틴 생성이 시각적으로 확인되었고, 6시간 동안 화합물 3, 4 및 5와 배양한 경우, 스타필로잔틴 생산이 감소되었으나, 24시간 배양 후 화합물 3 만이 계속적으로 스타필로잔틴 생산을 감소시키는 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과로부터 화합물 3은 숙주 면역시스템을 회피하는 S. aureus의 능력을 저해시키는 것으로 제안될 수 있다.
<실시예 3> 포르바케탈의 항생물막 효과에 대한 포르바케탈의 구조 및 관련 유전자 발현 조절이 미치는 영향 확인
S. aureus에 의한 생물막 형성에 대한 포르바케탈의 억제 효과를 담당하는 분자 메커니즘을 확인하기 위해, qRT-PCR을 수행하여 선택된 생물막 및 독성 관련 유전자와 주요 조절 유전자의 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 6과 같이 화합물 3 및 5는 α-hemolysin (hla) 및 뉴클레아제 (nuc1)의 발현을 현저하게 감소시켰으나, 다른 생물막 관련 유전자의 발현에 미치는 영향은 매우 적었다. 또한, 화합물 5는 RNAIII (a regulatory RNA molecule)의 발현을 유의미하게 감소시켰다. 상기 RNAIII는 hla 번역을 자극하는 것으로 알려짐에 따라, hla 억제는 화합물 5에 의한 RNAIII의 하향 조절에 기인한다.
또한, hla는 생물막 형성 과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 보고되어 있으며, S. aureus의 hla 하향조절은 아지트로마이신 (azithromycin), 스틸베노이드 (stilbenoids), 플라보노이드 (flavonoids), norlichexanthone, 또는 알리자린(alizarin)과 같은 다른 항생물막제의 존재하에서 확인되었으며, 오메가 지방산은 최근 hla와 RNAIII의 발현을 억제하고 생물막 형성을 억제하는 것으로 보고되었다.
뉴클레아제가 S. aureus 생물막 형성을 저해하기 때문에 화합물 3 및 5에 의한 nuc1 하향조절은 예상하지 못한 결과로, 뉴클레아제 유전자 (nuc1 및 nuc2)의 돌연변이는 생물막 형성을 향상시키는 것으로 보고되어 있으나, 현재 사용가능한 전사체 데이터를 기반으로 in vitro 조건에서 생물막 형성 동안 S. aureus 뉴클레아제가 수행하는 역할에 대해서는 명확하게 확인되지 않았다.
한편, 콜리스마이신 (collismycin) C, 알리자린 (alizarin), 푸르푸린 (purpurin), 에모딘 (emodin), 피세틴 (fisetin), 루테올린 (luteolin) 및 퀘르세틴 (quercetin)과 같이 하이드록실 비피리딘 (hydroxyl bipyridine), 하이드록실 안트라퀴논 (hydroxyl anthraquinon) 또는 하이드록실 플라보노이드 구조를 포함하는 몇 가지 천연 화합물이 S. aureus에 대한 항생물막 활성을 나타내는 것으로 보고되었다.
흥미롭게도, 콜리스마이신, 안트라퀴논 (anthraquinones) 및 플라보노이드 (flavonoids)의 항생물막 활성은 백본 구조 내 수산기의 수 및 위치와 연관성이 있는 것으로 보고되었으며, 도 3과 같이 6개의 포르바케탈 화합물 중 2개의 하이드록실기를 보유하고 있는 포르바케탈 화합물 3 및 5 (3의 이성질체)가 다른 포르바케탈 화합물보다 S. aureus 생물막 활성을 더욱 강하게 억제시키는 것이 확인되었다.
상기 결과로부터 포르바케탈 화합물에 있는 하이드록실 기의 존재와 위치가 S. aureus에 대한 항생물막 활성에 중요한 역할을 하는 것이 확인되었다.
화합물 3 및 5는 용혈소 (hemolysin) 관련 유전자인 hla 및 nuc1의 발현을 하향 조절함으로써 S. aureus 생물막 형성과 S. aureus에 의한 스타필로잔틴 생산의 강력한 억제 효과를 나타내는 것이 확인되었다.
한편, 앞서 보고된 바에 따르면, 화합물 3 및 5는 인간 상피세포 HT-29에 대한 약한 세포독성(IC50 28 및 212 μg/mL)을 나타내는 것으로 확인됨에 따라, 포르바케탈 3 또는 5는 약물 내성 S. aureus에 대한 항생물막 특성을 가지는 항감염제 개발을 위한 잠재적 화합물로 제공될 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (7)
- 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 병원성 미생물의 생물막 형성 억제용 조성물.
[화학식 1]
* 는 키이랄센터 임. - 청구항 1에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 병원성 미생물의 세포사멸 없이 생물막 형성을 억제하는 것을 특징으로 하는 미생물의 생물막 형성 억제용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 병원성 미생물은 황색포도상구균 (S. aureus)인 것을 특징으로 하는 병원성 미생물의 생물막 형성 억제용 조성물.
- 청구항 3에 있어서, 상기 황색포도상구균은 항생제 저항성 및 민감성 균으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 병원성 미생물의 생물막 형성 억제용 조성물.
- 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 병원성 미생물의 생물막에 의해 유발되는 감염성 질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
[화학식 1]
* 는 키이랄센터 임. - 청구항 5에 있어서, 상기 감염성 질환은 피부염, 패혈증, 화농성 질환, 식중독, 폐렴, 골수염, 농가진, 균혈증, 심내막염 및 장염으로 이루어진 군에서 선택되는 황색포도상구균 생물막에 의해 유발되는 감염성 질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
- 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 병원성 미생물의 생물막에 의해 유발되는 감염성 질환 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
[화학식 1]
* 는 키이랄센터 임.
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|---|---|---|---|---|
| KR20130128166A (ko) | 2012-05-16 | 2013-11-26 | 한국생명공학연구원 | 스트렙토마이세스속 또는 크리벨라속을 포함하는 생물막 형성 방지 또는 억제제 및 이를 이용한 생물막 형성 방지 또는 억제 방법 |
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| Mar. Drugs 2015, 13, pp.7005-7019* * |
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