KR101593595B1 - Ｃｘ－４９４５를 유효성분으로 함유하는 스플라이싱 조절제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 5-[(3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2,6-나프티리딘-8-카르복시산(5-[(3-Chlorophenyl)amino]benzo [c]-2,6-naphthyridine-8-carboxylic acid, 실미타세르티브(Silmitasertib), CX-4945) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 스플라이싱 조절제(splicing regulator)에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명의 CX-4945는 스플라이싱 조절에 관여하며, 상기 스플라이싱 조절은 카제인 키나아제 2(casein kinase 2, CK2) 억제 효과와는 독립적으로 Cdc-2 유사 키나아제(Cdc-2-like kinase, Clk)에 대해 강력한 억제 효과를 나타내고, 세린/알지닌-풍부 단백질(Serin/arginine-rich, SR 단백질)의 감소된 인산화 수준을 나타내므로, 상기 CX-4945 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 스플라이싱 결함에 기인한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 CX-4945 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 스플라이싱과 관련된 생물학적 연구를 위한, 스플라이싱 조절 방법 및 이를 위한 스플라이싱 조절용 키트에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

ＣＸ－４９４５를 유효성분으로 함유하는 스플라이싱 조절제{A splicing regulator comprising CX-4945 as an active ingredient}
본 발명은 5-[(3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2,6-나프티리딘-8-카르복시산(5-[(3-Chlorophenyl)amino]benzo [c]-2,6-naphthyridine-8-carboxylic acid, 실미타세르티브(Silmitasertib), CX-4945) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 스플라이싱(splicing) 결함에 기인한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 스플라이싱과 관련된 생물학적 연구를 위한, CX-4945를 사용하는 스플라이싱 조절 방법 및 이를 위한 스플라이싱 조절용 키트에 관한 것이다.
스플라이싱(splicing)은 전구체-mRNA(Precursor-mRNA, Pre-mRNA)로부터 유전 정보를 가지고 있지 않은 인트론(intron)을 제거하고, 유전 정보를 가지는 엑손(exon) 부분만을 이어 단일 폴리펩티드(polypeptide) 사슬로 번역하기 위한 mRNA의 개조 과정으로, 진핵생물의 유전자 발현조절에 있어서 필수적인 과정이다.
선택적 스플라이싱(alternative splicing)은 m-RNA의 다양한 엑손의 조합으로부터 특이적으로 선택된 엑손만의 조합으로 mRNA를 생성하는 과정으로, 이를 통해 하나의 유전자로부터 다양한 형태의 mRNA의 생성이 가능하게 되어 유전체의 확장 없이 다양한 단백질이 생산되어 세포의 다양성을 제공하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 인간 전사체의 전체적인 조사에 따르면 인트론을 포함한 95%의 유전자가 선택적 스플라이싱을 거치는 것으로 예측하고 있다(Pan Q, et al, Nat . Genet. 40(12):1413-1415, 2008; Wang ET, et al . Nature 456(7221):470-476, 2008). 선택적 스플라이싱을 통해, 발현된 하나의 유전자는 각각 다른 기능을 나타내는 다양한 단백질로 번역될 수 있다.
선택적 스플라이싱은 발달, 조직 또는 세포의 종류에 따라, pre-mRNA 염기 서열상의 시스-작용 요소(cis-acting element) 및 이에 결합하는 트랜스-작용 단백질(trans-acting protein)의 상호 작용에 의하여 조절(regulation)된다(mith CW and Valcarcel J, Trends Biochem . Sci . 25(8):381-388, 2000).
최근 들어, 상기 조절에 관여하는 인자들에 생기는 돌연변이(mutation) 또는 결함(lacking)으로 인한 비정상적인 스플라이싱과 관련된 질병이 보고되었다. 상기 스플라이싱과 관련된 질병의 예는 하기 [표 1]에 나타내었다. 이에 따라, 선택적 스플라이싱 및 이의 조절에 대한 연구에 대한 요구가 증가하고 있으며, 이를 통한 치료제의 연구 및 개발 역시 본격적으로 관심을 받고 있다. 그러나, 선택적 스플라이싱의 조절물질로서 알려진 저분자 물질은 매우 적을 뿐만 아니라, 이들의 효능 또는 선택성 역시 개선이 필요한 상황이다.
스플라이싱 관련 질병의 예
국문 명칭 영문 명칭 관련
유전자		 출처
피브리노겐결여증 Afibrinogenemia FGB Davis RL et. al,
Hum Mutat 2009, 30:221-227.

프로피온산혈증
Propionic acidemia		 PCCA Sanchez-Alcudia R et. al,
Mol Genet Metab 2011, 102:134-138.
PCCB Rincon A et. al,
AmJ Hum Genet 2007, 81:1262-1270
신경섬유종증 Neurofibromatosis NF1 Pros E et. al,
Human Mutat 2009,30:454-462.
눈백색증 제 1형 Ocular albinism type 1 GRP143 Vetrini F et. al,
Hum Mutat 2006,27:420-426.

알츠하이머 병/
FTDP-17
전두측두엽치매
Alzheimer’s
disease/FTDP-17
Taupathies

MAPT		 Rigo F et. al,
Nat ChemBiol 2012, 8:555-561;
Rodriguez-Martin T et. al,
HumMol Genet 2009, 18:3266-3273;
Peacey E et. al,
NucleicAcids Res 2012, 40:9836-9849.


척수성 근위축
Spinal
muscular atrophy
SMN2		 Rigo F et. al,
Nat ChemBiol 2012, 8:555-561;
Fernandez Alanis E et. al,
Hum Mol Genet 2012, 21:2389-2398;
Geib T et.. al, PLoSOne 2009, 4:e8204.
세린/알지닌-풍부 단백질(Serin/arginine-rich, SR 단백질)은 대표적인 트랜스-작용 단백질로, 진행생물에서 매우 잘 보존되어 있다. 상기 단백질은 아미노 말단(N-terminal)에 하나 또는 두 개의 RNA-인식 모티프(RNA-recognition motif)를 포함하며, 카르복실 말단(C-terminal)에 세린 및 알지닌이 풍부한 도메인(Arginine/Serine-rich domain, RS 도메인)을 포함한다(Zahler AM et al Genes Dev. 6(5):837-847, 1992; Caceres JF and Krainer AR, EMBO J. 12(12):4715-4726, 1993). SR 단백질의 생리적 역할은 구체적으로 보고된 바가 없으나, SR 단백질의 인산화(phosphorylation)는 단백질-단백질, 단백질-RNA 상호작용, 세포 내 위치(intercellular localization), 세포 내 이동(intercellular trafficking) 또는 pre-mRNA의 선택적 스플라이싱에 관여하는 것으로 알려져 있다.
SR 단백질의 인산화는 pre-mRNA 및 SR 단백질의 결합을 조절하며, 인산화에 의해 특정 단백질의 상호 작용이 촉진되어 RNA 및 스플라이싱복합체(spliceosome)의 결합이 일어나 스플라이싱이 일어난다. 이러한 과정에서, 상기 인산화의 수준에 이상이 유발되어 저인산화(hypophosphorylation) 또는 과인산화(hyperphosphorylation)되면 비정상적인 스플라이싱이 유도된다(Kanopka A, et al., Nature 393(6681):185-187. 1998).
스플라이싱 과정에서, SR 단백질을 인산화 하는 몇 가지의 인산화효소(kinase)가 존재하며, 상기 인산화효소의 대표적인 예로 Cdc-2 유사 키나아제(Cdc-2-like kinase, Clk) 및 SR 단백질 키나아제(serine/arginine-rich protein kinase, SRPKs)가 있다. Clk는 이중-특이적인 인산화효소(dual-specificity kinase)로서, Clk1, Clk2 및 Clk3를 포함하는 44 개의 동형 단백질(isoform)이 존재하는 것으로 알려져 있으며, 선택적 스플라이싱의 조절에 관여하는 것으로 보고된 바 있으나(Colwill K, et al . EMBO J. 15(2):265-275, 1996), 신호전달 경로(signal pathway)와 같은 다른 생물학적인 기능에 대하여는 많이 알려진 것이 없다.
현재까지 선택적인 스플라이싱을 조절하기 위한 약물로서, (Z)-1-(3-에틸-5-메톡시-2,3-디하이드로벤조티아졸-2-일리덴)프로판-2-원((Z)-1-(3-Ethyl-5-methoxy-2,3-dihydrobenzothiazol-2-ylidene)propan-2-one, TG-003) 및 KH-CB19를 포함하는 Clk 저해제(Muraki M, et al . J. Biol . Chem . 279(23):24246-24254, 2004; Fedorov O, et al . Chem . Biol . 18(1):67-76, 2001) 및 SRPIN340을 포함하는 SRPK 저해제(Fukuhara T, et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . U. S. A. 103(30):11329-11333, 2006)가 연구된 바 있음에도 불구하고, 상기 저해제들은 생물학적 도구 및 스플라이싱 관련 질병의 치료제로서의 효능 및 선택성이 충분히 입증되지 않아, 임상적 적용에 제한을 가진다. 따라서, 보다 선택적 및 효과적인 Clk 및 SRPK 저해제에 대한 개발이 요구된다.
5-[(3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2,6-나프티리딘-8-카르복시산(5-[(3-Chlorophenyl)amino]benzo [c]-2,6-naphthyridine-8-carboxylic acid, 실미타세르티브(Silmitasertib), CX-4945)은 활성도는 인간의 암세포에서 자주 발견되며, 세포의 성장과 자가 사멸과 같은 다양한 세포 활성을 조절하는 단백질인 카제인 키나아제 2(casein kinase 2, CK2)의 억제제로서 알려져 있다. Adam Siddiqui-Jain 등은 CX-4945가 경구 투여로 생체 이용 가능한 선택적 억제제로서의 활성을 나타내며, CK2의 촉매 서브유닛(catalytic subunit)인 CK2α의 발현 수준을 억제함으로서 암세포의 증식을 억제하는 것을 보고한 바 있다(Siddiqui-Jain A, et al . Cancer Res. 70(24):10288-10298, 2010). 현재 CX-4945를 CK2 억제제로 사용하기 위하여 임상 연구가 진행되고 있으며, 1차 임상에서 안전성 및 약물학적 효과(pharmacodynamic property)를 확인하였고, 2차 임상을 통한 임의 약물 혼합(randomized drug combination)에 대한 추가적 평가에 대한 연구가 진행 중에 있다(Sean E, Cylene Pharmaceuticals. Accessed 22 Mar 2011). 그러나, CX-4945의 스플라이싱 조절 효과에 관하여는 알려진 바가 없다.
따라서, 본 발명자들은 효과적인 스플라이싱 조절 물질을 개발하기 위해 노력한 결과, 암에서 과발현되는 단백질인 카제인 키나아제 2(casein kinase 2, CK2)의 억제제로 알려져 있는 CX-4945가 스플라이싱 조절에 관여하며, CK2 억제 효과와는 독립적으로 Clk에 대해 강력한 억제 효과를 나타내고, SR 단백질의 감소된 인산화 수준을 나타내므로, 상기 CX-4945는 스플라이싱 결함에 기인한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다. 또한, 본 발명의 CX-4945는 기존에 Clk 억제물질로 사용되고 있는 TG-003보다 전반적으로 효능이 높은 것을 확인함으로써, 상기 CX-4945를 스플라이싱 관련 생물학적 연구에 유용하게 활용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 5-[(3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2,6-나프티리딘-8-카르복시산(5-[(3-Chlorophenyl)amino]benzo [c]-2,6-naphthyridine-8-carboxylic acid, 실미타세르티브(Silmitasertib), CX-4945) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 스플라이싱(splicing) 결함에 기인한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 5-[(3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2,6-나프티리딘-8-카르복시산(5-[(3-Chlorophenyl)amino]benzo [c]-2,6-naphthyridine-8-carboxylic acid, 실미타세르티브(Silmitasertib), CX-4945) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 스플라이싱(splicing) 결함에 기인한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 CX-4945 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 스플라이싱 조절제(splicing regulator)를 제공한다.
또한, 본 발명은 CX-4945 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 스플라이싱 결함에 기인한 질환의 예방 및 개선용 건강식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 분리된 세포에 CX-4945 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 처리하는 단계를 포함하는, 스플라이싱 조절 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 CX-4945 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 스플라이싱 조절용 키트를 제공한다.
본 발명의 5-[(3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2,6-나프티리딘-8-카르복시산(5-[(3-Chlorophenyl)amino]benzo [c]-2,6-naphthyridine-8-carboxylic acid, 실미타세르티브(Silmitasertib), CX-4945)는 스플라이싱(splicing) 조절에 관여하며, 상기 스플라이싱 조절은 카제인 키나아제 2(casein kinase 2, CK2) 억제 효과와는 독립적으로 Cdc-2 유사 키나아제(Cdc-2-like kinase, Clk)에 대해 강력한 억제 효과를 나타내고, 세린/알지닌-풍부 단백질(Serin/arginine-rich, SR 단백질)의 감소된 인산화 수준을 나타내므로, 상기 CX-4945 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 스플라이싱 관련 질병의 치료 및 예방용 약학적 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 CX-4945 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 스플라이싱과 관련된 생물학적 연구를 위한, 스플라이싱 조절 방법 및 이를 위한 스플라이싱 조절용 키트에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 5-[(3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2,6-나프티리딘-8-카르복시산(5-[(3-Chlorophenyl)amino]benzo [c]-2,6-naphthyridine-8-carboxylic acid, 실미타세르티브(Silmitasertib), CX-4945)의 처리 농도에 따른 카제인 키나아제 2(casein kinase 2, CK2) mRNA에 대한 CX-4945의 스플라이싱(splicing) 조절 효과의 확인을 나타낸다.
도 2는 CX-4945의 처리 시간에 따른 CK2 mRNA에 대한 CX-4945의 스플라이싱 조절 효과의 확인을 나타낸다.
도 3은 CK2 mRNA에 대한 CX-4945의 스플라이싱 조절의 모식도를 나타낸다.
도 4는 엑손 어레이(exon array)를 통해 선별된 mRNA에 대한 CX-4945의 스플라이싱 조절 효과를 나타낸다.
도 5는 다양한 CK2 억제제의 CK2 억제 효과를 나타낸다.
도 6은 다양한 CK2 억제제의 CK2 mRNA에 대한 스플라이싱 패턴의 비교를 나타낸다.
도 7은 CX-4945의 SR 단백질 인산화 조절 효과를 나타낸다.
도 8은 CX-4945의 SR 단백질 인산화 조절 효과에 대한 정량적 분석을 나타낸다.
도 9는 인산화효소 프로파일링(kinase profiling) 분석을 통한 CX-4945의 Cdc-2 유사 키나아제(Cdc-2-like kinase, Clk) 및 SR 단백질 키나아제(serine/arginine-rich protein kinase, SRPKs) 억제 효과를 나타낸다.
도 10은 Clk1, Clk2, Clk3 및 Clk4에 대한 CX-4945 및 기존의 스플라이싱 억제제인 TG-003의 활성 억제효과를 나타낸다.
도 11은 다양한 ATP 농도 하에서 Clk에 대하여 CX-4945의 활성 억제효과를 나타낸다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 5-[(3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2,6-나프티리딘-8-카르복시산(5-[(3-Chlorophenyl)amino]benzo [c]-2,6-naphthyridine-8-carboxylic acid, 실미타세르티브(Silmitasertib), CX-4945) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 스플라이싱(splicing) 결함에 기인한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 CX-4945는 하기 [화학식 1]로 표기되는 구조를 가지는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다;
Figure 112014028815137-pat00001
상기 CX-4945는 mRNA의 선택적 스플라이싱(alternative splicing)을 조절하며, 구체적으로는 스플라이싱 조절 키나아제(splicing regulation kinase)를 저해하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 스플라이싱 조절 키나아제는 Cdc-2 유사 키나아제(Cdc-2-like kinase, Clk) 또는 세린-알지닌-풍부 단백질 키나아제(serine/arginine-rich protein kinase, SRPKs) 중 어느 하나 또는 둘 다인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 CX-4945는 세린-알지닌-풍부 단백질(Serin-arginine-rich, SR 단백질)의 인산화(phosphorylation)를 조절하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 질환은 피브리노겐결여증(Afibrinogenemia), 프로피온산혈증(Propionic acidemia), 신경섬유종증(Neurofibromatosis), 눈백색증 제 1형(Ocular albinism type 1), 알츠하이머 병/FTDP-17 전두측두엽치매(Alzheimer’s disease/FTDP-17 Taupathies) 및 척수성 근위축(Spinal muscular atrophy)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 구체적으로 상기 질환은 각각 DMD, CFTR, FGB, PCCA, NF1, GRP143, MAPT 및 SMN 유전자에 대한 스플라이싱 결함에 의해 발생한다.
상기 CX-4945는 1 μM 이상의 농도로 포함되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 1 μM 이하의 농도에서는 스플라이싱 조절 효과를 유의적으로 나타내지 않으므로 효과가 없다.
본 발명의 구체적인 실시예에 있어서, 본 발명자들은 CK2 억제제로서 알려져 있는 CX-4945가 스플라이싱을 조절하는 효과를 확인하기 위해서, 인간 배아 신장 세포주(Human embryonic kidney cell line, HEK293T)에서 CX-4945가 CK2의 α＇서브유닛(subunit) 유전자 발현에 미치는 영향을 확인한 결과, CX-4945에 의해서 CK2 mRNA이 스플라이싱 조절을 받아(도 1 및 도 2 참조), CK2 α＇ mRNA의 6번 엑손(exon)이 제거된 형태를 나타내는 것임을 확인하였다(도 3).
또한, 본 발명자들은 세포 내에서 CX-4945가 CK2 α＇외의 다른 전구체-mRNA(Precursor-mRNA, Pre-mRNA)의 스플라이싱 조절에 영향을 미치는지 확인하기 위하여, 엑손 어레이(exon array) 분석을 수행하여 CX-4945에 의해 스플라이싱 조절을 받는 엑손을 선별한 결과, 총 39,001의 엑손이 CX-4945에 의해 스플라이싱 조절을 받는 정도가 2 배 이상으로 나타나는 것을 확인하였다. 이에 따라, 상기 선별한 엑손 중 일부에 대한 CX-4945의 스플라이싱 조절 효과를 확인한 결과, CX-4945로 인해 ELL2, SPAST, CTDSPL2, PRPSAP2, CPEB1, QRSL1, USP38, TRIP4, WDFY1 및 ZCCHC2 유전자의 mRNA의 스플라이싱이 조절되어 mRNA의 크기가 감소하는 것을 확인하였다(도 4 참조).
또한, 본 발명자들은 CX-4945에 의한 세포 내 스플라이싱 조절 효과가 CX-4945의 CK2 억제에 의한 결과인지의 여부를 확인하기 위해서 CX-4945에 의해 스플라이싱 조절을 받는 것으로 선별된 유전자에 대한 다른 CK2 억제제의 스플라이싱 조절 효과를 확인한 결과, CK2 억제제로 알려져 있는 CX-4945, 4,5,6,7-테트라브로모벤조트리아졸(4,5,6,7-tetrabromobenzotriazole, TBB) 및 테트라브로모신남 산(Tetrabromocinnamic acid, TBCA) 모두 CK2의 기질인 AKT의 S129에 대하여 탈인산화를 나타내지 않아 유의적으로 CK2의 활성을 억제하나(도 5 참조), TBB 및 TBCA는 상기 유전자에 대한 스플라이싱 조절 효과를 나타내지 않으므로, CX-4945의 스플라이싱 조절 효과는 CK2에 비의존적인 효과인 것을 확인하였다(도 6 참조).
아울러, 본 발명자들은 CX-4945의 구체적인 스플라이싱 조절 기작을 확인하기 위하여, Clk에 의해 인산화되는 SR 단백질의 인산화 및 인산화효소 프로파일링(kinase profiling) 분석을 통해 Cdc-2 유사 키나아제(Cdc-2-like kinase, Clk) 및 SR 단백질 키나아제(serine/arginine-rich protein kinase, SRPKs)에 대한 CX-4945의 억제 효과를 확인한 결과, Clk의 억제제로 알려져 있는 (Z)-1-(3-에틸-5-메톡시-2,3-디하이드로벤조티아졸-2-일리덴)프로판-2-원((Z)-1-(3-Ethyl-5-methoxy-2,3-dihydrobenzothiazol-2-ylidene)propan-2-one, TG-003)과 동일한 양상으로 CX-4945에 의해 SRSF4, SRSF6, SRSF5 및 SRSF1의 과인산화(hyperphosphorylation)가 나타나 Clk를 억제하며(도 7 및 도 8 참조), Clk1, Clk2 및 Clk3 인산화효소에 대하여 3 내지 90 nM의 IC50 농도를 나타내어 상기 인산화효소를 유의적으로 억제하는 것을 확인하였다(도 9 및 표 4 참조).
아울러, 본 발명자들은 CX-4945 또는 TG-003이 나타내는 Clk1, Clk2, Clk3 및 Cl4k에 대한 억제 효과를 확인한 결과, 본 발명의 CX-4945는 기존에 스플라이싱 저해제로 사용되고 있는 TG-003에 비해 5 내지 30 배 높은 Clk 억제능을 나타내는 것을 확인하였다(도 10 및 표 5 참조). 또한, CX-4945가 Clk에 대하여 나타내는 억제능은 ATP 경쟁적인 방식인 것을 확인하였다(도 11).
따라서, 본 발명의 CX-4945는 스플라이싱 조절에 관여하며, 상기 스플라이싱 조절은 CK2 억제 효과와는 독립적으로 Clk에 대해 강력한 억제 효과를 나타내고, SR 단백질의 감소된 인산화 수준을 나타낼 뿐만 아니라, 기존 스플라이싱 저해제와 비교하였을 때 현저하게 증가한 스플라이싱 조절 효과를 나타내므로, 본 발명의 CX-4945 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 스플라이싱 결함에 기인한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 CX-4945는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함한다.
본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면, CX-4945를 과량의 산 수용액 중에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 동량의 CX-4945 및 물 중의 산 또는 알코올을 가열하고, 이어서 이 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나 또는 석출된 염을 흡입 여과시켜 제조할 수도 있다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 은 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.
또한, 본 발명의 CX-4945는 약학적으로 허용되는 염뿐만 아니라, 통상의 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 염, 수화물 및 용매화물을 모두 포함한다.
본 발명에 따른 부가염은 통상의 방법으로 제조할 수 있으며, 예를 들면 CX-4945를 수혼화성 유기용매, 예를 들면 아세톤, 메탄올, 에탄올, 또는 아세토니트릴 등에 녹이고 과량의 유기산을 가하거나 무기산의 산 수용액을 가한 후 침전시키거나 결정화시켜서 제조할 수 있다. 이어서 이 혼합물에서 용매나 과량의 산을 증발시킨 후 건조시켜서 부가염을 얻거나 또는 석출된 염을 흡인 여과시켜 제조할 수 있다.
본 발명의 조성물을 의약품으로 사용하는 경우, CX-4945 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 임상투여 시에 다양한 하기의 경구 또는 비경구 투여 형태로 제제화되어 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경/연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭시르제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/ 또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유하고 있다. 정제는 또한 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제를 함유할 수 있다.
본 발명의 CX-4945 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사를 주입하는 방법에 의한다. 이때, 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여 CX-4945 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알 단위 투여형으로 제조할 수 있다. 상기 조성물은 멸균되고/되거나 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 60 ㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.001 ~ 1,000 ㎎/일이며, 바람직하게는 0.01 ~ 500 ㎎/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.
또한, 본 발명은 CX-4945 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 스플라이싱 조절제(splicing regulator)를 제공한다.
본 발명의 CX-4945는 스플라이싱 조절에 관여하며, 상기 스플라이싱 조절은 CK2 억제 효과와는 독립적으로 Clk에 대해 강력한 억제 효과를 나타내고, SR 단백질의 감소된 인산화 수준을 나타낼 뿐만 아니라, 기존 스플라이싱 저해제와 비교하였을 때 현저하게 증가한 스플라이싱 조절 효과를 나타내므로, 본 발명의 CX-4945 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 스플라이싱 조절제의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
아울러, 본 발명은 CX-4945를 유효성분으로 함유하는 스플라이싱 결함에 기인한 질환의 예방 및 개선용 건강식품을 제공한다.
상기 질환은 피브리노겐결여증, 프로피온산혈증, 신경섬유종증, 눈백색증 제 1형, 알츠하이머 병/FTDP-17 전두측두엽치매 및 척수성 근위축으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 CX-4945는 스플라이싱 조절에 관여하며, 상기 스플라이싱 조절은 CK2 억제 효과와는 독립적으로 Clk에 대해 강력한 억제 효과를 나타내고, SR 단백질의 감소된 인산화 수준을 나타낼 뿐만 아니라, 기존 스플라이싱 저해제와 비교하였을 때 현저하게 증가한 스플라이싱 조절 효과를 나타내므로, 본 발명의 CX-4945 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 스플라이싱 결함에 기인한 질환의 예방 및 개선용 건강식품의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소시지, 빵, 비스킷, 떡, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제, 유제품 및 유가공 제품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명의 CX-4945 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강식품 중의 상기 화합물의 양은 전체 식품 중량의 0.1 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 본 발명의 화합물을 함유하는 것 외에는 다른 성분에 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.
상기 외에 본 발명의 CX-4945 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 CX-4945 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 CX-4945 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 100 중량부 당 0.1 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
또한, 본 발명은 분리된 세포에 CX-4945 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염를 처리하는 단계를 포함하는, 스플라이싱 조절 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 CX-4945 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 스플라이싱 조절용 키트를 제공한다.
상기 CX-4945는 상기 [화학식 1]로 표기되는 구조를 가지는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 CX-4945는 mRNA의 선택적 스플라이싱을 조절하며, 구체적으로는 스플라이싱 조절 키나아제를 저해하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 스플라이싱 조절 키나아제는 Clk 또는 SRPKs 중 어느 하나 또는 둘 다인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 CX-4945는 SR 단백질의 인산화를 조절하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 CX-4945는 1 μM 이상의 농도로 처리되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 1 μM 이하의 농도에서는 스플라이싱 조절 효과를 유의적으로 나타내지 않으므로 효과가 없다.
본 발명의 CX-4945는 스플라이싱 조절에 관여하며, 상기 스플라이싱 조절은 CK2 억제 효과와는 독립적으로 Clk에 대해 강력한 억제 효과를 나타내고, SR 단백질의 감소된 인산화 수준을 나타낼 뿐만 아니라, 기존 스플라이싱 저해제와 비교하였을 때 현저하게 증가한 스플라이싱 조절 효과를 나타내므로, 본 발명의 CX-4945 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 스플라이싱과 관련된 생물학적 연구를 위한, 스플라이싱 조절 방법 및 이를 위한 스플라이싱 조절용 키트에 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 카제인 키나아제 2( casein kinase 2, CK2 ) 유전자에 대한 CX -4945의 스플라이싱( splicing ) 조절 효과 확인
<1-1> 농도에 따른 CK2 mRNA 에 대한 CX -4945의 스플라이싱 조절 효과 확인
CK2 억제제로서 알려져 있는 CX-4945(5-[(3-Chlorophenyl)amino]benzo [c]-2,6-naphthyridine-8-carboxylic acid, Silmitasertib)가 스플라이싱을 조절하는 효과를 확인하기 위해서, HEK293T 세포에서 CX-4945가 CK2의 α＇서브유닛(subunit) 유전자 발현에 미치는 영향을 확인하였다.
구체적으로, 6 웰 배양 플레이트(SPL 사)에 웰 당 5×105의 인간 배아 신장 세포주(Human embryonic kidney cell line, HEK293T; 미국 세포주 은행(American Type Culture Collection; ATCC))를 우태아혈청(fetal bovine serum; FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)을 포함하는 DMEM 배지(Dulbecco`s modified Eagle`s medhium; 하이클론 사, 미국)에 접종하여 24 시간 동안 배양하였다. 세포가 90% 자랐을 때, 각 웰의 배지를 제거하고 인산완충식염수(phosphate buffered saline; PBS) 용액으로 1 회 세척한 후, 1 또는 10 μM의 CX-4945(셀렉 화학 사, 미국)를 포함하는 DMEM 배지 1 ㎖를 각각 첨가하여, 37℃ 및 5% 이산화탄소의 조건으로 CO2 배양기(VS-9108MS, Vision, Korea)에서 3 시간 동안 배양하여 CX-4945를 처리하였다. 그런 다음, 트리졸 시약(Trizol reagent, 인비트로젠 사, 미국)을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 상기 세포의 RNA를 추출하여 정량한 후, 옴니스크립트 키트(omniscript Kit; 퀴아젠 사, 미국)룰 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA를 시료로 사용하여 그린 마스터 믹스 PCR(green master mix PCR; 프로메가 사, 미국) 25 ㎕, 10 pM의 정방향 프라이머(서열 번호: 1) 1 ㎕, 역방향 프라이머(서열 번호: 2) 1 ㎕, 상기 합성한 cDNA 2 ㎕을 혼합하여 증류수로 최종 부피가 50 ㎕이 되도록 적정한 후, 94℃에서 3 분 동안 전-변성하고, 94℃ 30 초, 55℃ 30초 및 72℃ 45초를 35 회 반복한 다음, 72℃에서 7 분 동안 반응하여 cDNA를 증폭한 후, 전기영동을 수행하여 CK2 α＇ mRNA의 발현 여부를 확인하였다. 상기 프라이머의 서열은 하기 [표 2]에 나타내었다. 음성대조군으로 다이메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)를 사용하여 상기와 동일한 방법을 수행하였고, 발현량을 비교하기 위한 대조군으로는 글리세르알데하이드 3-인산 탈수소효소(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, GAPDH) mRNA를 증폭하여 상기와 동일한 방법으로 RNA 발현 여부를 확인하였다.
CK2 α＇cDNA 증폭을 위한 프라이머 서열
프라이머 명칭 서열 서열 번호
CK2 A’정방향 5‘-CAACTCTACCAGATCCTGACAGACTTTGATA-3’ 서열 번호: 1
CK2 A’역방향 5‘-CTGATAGTCCACGAGGAGCTCTGGT-3’ 서열 번호: 2
그 결과, 도 1에서 나타내는 바와 같이 HEK293T 세포에 10 μM의 CX-4945를 처리하였을 때 CK2 α＇의 mRNA 보다 짧은 길이를 나타내는 mRNA인 CK2 α＇△ 밴드를 나타내는 것을 확인하였다(도 1).
<1-2> 시간에 따른 CX -4945의 스플라이싱 조절 효과 확인
CX-4945가 CK2 α＇ mRNA의 스플라이싱을 조절하는 효과를 구체적으로 확인하기 위하여, 시간에 따라 CX-4945가 CK2 α＇ mRNA의 스플라이싱을 조절하는 효과를 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <1-1>과 동일한 방법을 수행하여 HEK293T 세포를 배양하여 10 μM의 CX-4945를 처리하고, 처리 후 0, 1, 2, 3, 6, 12 및 24 시간에 상기 세포를 수득하였다. 그런 다음, 상기 실시예 <1-1>과 동일한 방법으로 HEK293T 세포의 RNA를 추출하고 cDNA를 제작하여 CK2 α＇ mRNA의 발현 여부를 확인한 후, 염기 서열 분석을 수행하여 상기 제작된 CK2 α＇ 및 CK2 α＇△의 염기 서열을 확인하였다. 음성대조군으로 DMSO를 사용하여 상기와 동일한 방법을 수행하였고, 발현량을 비교하기 위한 대조군으로는 GAPDH mRNA를 증폭하여 상기와 동일한 방법으로 RNA 발현 여부를 확인하였다.
그 결과, 도 2 및 도 3에서 나타난 바와 같이 CX-4945 처리 초기의 CK2 α＇ mRNA가 매우 빠르게 CK2 α＇△ mRNA로 분리되어 처리 시간에 따라 CK2 α＇△ 밴드가 정량적으로 증가하는 것을 확인하였으며(도 2), 이는 CK2 α＇△ 밴드가 CX-4945의 스플라이싱 효과로 인해 CK2 α＇ mRNA의 6번 엑손(exon)이 제거된 형태를 나타내는 것임을 확인하였다(도 3).
< 실시예 2> 세포 내 CX -4945의 스플라이싱 조절 효과 확인
<2-1> CX -4945에 의한 스플라이싱 조절 유전자의 선별( screening )
세포 내에서 CX-4945가 CK2 α＇외의 다른 전구체-mRNA(Precursor-mRNA, Pre-mRNA)의 스플라이싱 조절에 영향을 미치는지 확인하기 위하여, 엑손 어레이(exon array) 분석을 수행하여 CX-4945에 의해 스플라이싱 조절을 받는 유전자를 선별하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <1-1>과 동일한 방법을 수행하여 HEK293T 세포를 배양하여 10 μM의 CX-4945를 처리하고 RNA를 추출하여 정량한 다음, 상기 추출한 RNA 1 ㎍을 제조사의 프로토콜을 따라 아피메트릭스 시약(Affymetrix reagent; 아피메트릭스 사, 미국)으로 표지하였다. 표지 후, 상기 실시예 <1-1>과 동일한 방법을 수행하여 상기 표지된 RNA를 끝 부분이 표지된 단편의 단일-가닥 cDNA(fragmented, end-labeled single-stranded cDNA)로 합성하고, 이를 아피메트릭스-유전자칩 인간 엑손 1.0 ST 분석(Affymetrix-GeneChip Human Exon 1.0 ST arrays; 아피메트릭스 사, 미국)에 혼성화(hybridization)하여, 아피메트릭스 익스프레션 콘솔 소프트웨어(Affymetrix Expression Console Software) 프로그램으로 품질 평가(quality assessment)하여 엑손 어레이를 수행하였다. 엑손 어레이의 결과는 GX를 포함하는 진스프링 12.6(GeneSpring 12.6; 애질런트 사, 미국)을 사용하여 분석하였다. HEK293T 세포의 전사 상의 수준을 비교하기 위한 음성 대조군으로는 CX-4945를 처리하지 않은 HEK293T 세포를 12 시간 배양한 후, 상기의 방법과 동일한 방법을 수행하여 엑손 어레이 분석을 수행하였다.
그 결과, CX-4945를 처리하였을 때, mRNA의 안정성을 나타내는 전사(transcript)상의 변화의 수준에 비하여 선택적 스플라이싱(alternative splicing)으로 인한 변화의 수준이 4 배 높게 나타나는 것을 확인하였다. CX-4945에 의해 스플라이싱 조절을 받는 정도가 2 배 이상으로 나타난 엑손의 수는 총 39,001 개로, 이 중 7,277 개의 엑손은 엑손의 추가로 유전자 크기가 증가하며, 31,724 개의 엑손은 엑손의 제거로 유전자의 크기가 감소하는 것을 확인하였다.
<2-2> CX -4945에 의한 스플라이싱 조절 유전자의 확인
엑손 어레이 분석에서 선별된 유전자들에 대한 CX-4945의 스플라이싱 조절 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 <2-1>에서 선별된 유전자 중 일부에 대한 CX-4945의 스플라이싱 조절 효과를 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <1-1>과 동일한 방법을 수행하여 HEK293T 세포를 배양하여 10 μM의 CX-4945를 처리하여 RNA를 추출하고 cDNA를 제작한 다음, 하기 [표 3]의 서열로 이루어진 프라이머를 사용한 PCR을 상기 실시예 <1-1>과 동일한 방법으로 수행하여 ELL2, SPAST, CTDSPL2, PRPSAP2, CPEB1, QRSL1, USP38, TRIP4, WDFY1 및 ZCCHC2 유전자의 mRNA 발현 여부를 통해 스플라이싱 패턴을 각각 확인하였다. 음성대조군으로 DMSO를 사용하여 상기와 동일한 방법을 수행하였다.
ELL2, SPAST, CTDSPL2, PRPSAP2, CPEB1, QRSL1, USP38, TRIP4, WDFY1 및 ZCCHC2 cDNA 증폭을 위한 프라이머 서열
프라이머 명칭 서열 서열 번호
ELL2
정방향 5`- CTAAATCCGTCTCAGAATGCTGCAG-3` 서열 번호: 3
역방향 5`- TAATCTGGGAGTTCAATTGCTGAAGG-3` 서열 번호: 4
SPAST
 정방향 5`- CCCCTTAACACACACTAGTAATTCACTGC-3` 서열 번호: 5
역방향 5`- CTCAGGCCTCAGAGAAGGAAGAATAAC-3` 서열 번호: 6
CTDSPL2
 정방향 5`- CCTTCAAAACGGAGTAGAATTGAACG-3` 서열 번호: 7
역방향 5`- CTGTAAGGGGTGGGATATCACGATT-3` 서열 번호: 8
PRPSAP2
 정방향 5`- GGACGTGAACACCACCATCATG-3` 서열 번호: 9
역방향 5`- TTCGCCGAGGCTGGAGACTT-3` 서열 번호: 10
CPEB1
 정방향 5`- CCTTCCTGTCTCTGTCAGGGGG-3` 서열 번호: 11
역방향 5`- TAATCTGGGAGTTCAATTGCTGAAGG-3` 서열 번호: 12
QRSL1
 정방향 5`- CCAGGGACTCTACCACAGTACATGAA-3` 서열 번호: 13
역방향 5`- GTTTCCTGAGAGAATTCTTCCTCTCACC-3` 서열 번호: 14
TRIP4
 정방향 5`- TCGAAGGACCCAAGTCATTGATG-3` 서열 번호: 15
역방향 5`- CTTTTAATCCCTCTGACAAGCAGAGAAG-3` 서열 번호: 16
WDFY1
 정방향 5`- GCTCCTCAGTGGTTGGAAAGTGAT-3` 서열 번호: 17
역방향 5`- CTTTACAATGCGGTCGGTCCC-3` 서열 번호: 18
USP38
 정방향 5`- CAGTGTTATACAAGCCTTGTTTATGGCC-3` 서열 번호: 19
역방향 5`- GCGAAAGATCTGTAAAGGCTTCCAC-3` 서열 번호: 20
ZCCHC2
 정방향 5`- GCAGCTATTTTCAAGTTCATCACAAGCT-3` 서열 번호: 21
역방향 5`-TTCACAATGGGACTTTTCCCAGTATG-3` 서열 번호: 22
그 결과, 도 4에서 나타난 바와 같이 CX-4945로 인해 ELL2, SPAST, CTDSPL2, PRPSAP2, CPEB1, QRSL1, USP38, TRIP4, WDFY1 및 ZCCHC2 유전자의 mRNA가 스플라이싱 조절되어 유전자 크기가 감소하는 것을 확인하였으며, 이는 엑손 어레이 분석과 동일한 양상을 나타내었다(도 4).
< 실시예 3> 세포 내 CX -4945의 CK2 비의존적 스플라이싱 조절 효과 확인
<3-1> 다양한 CK2 억제제의 CK2 억제 효과 확인
CX-4945에 의한 세포 내 스플라이싱 조절 효과가 CX-4945의 CK2 억제에 의한 결과인지의 여부를 확인하기 위해서, CK2의 또다른 억제제를 세포에 처리한 후 CK2의 기질인 AKT의 29 번째 아미노산인 세린(serine), S129의 탈인산화(dephosphorylation) 여부를 통해 CK2의 억제 효과를 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <1-1>과 동일한 방법으로 10 μM CX-4945, 100 μM 4,5,6,7-테트라브로모벤조트리아졸(4,5,6,7-tetrabromobenzotriazole, TBB; 시그마 사, 미국) 또는 100 μM 테트라브로모신남 산(Tetrabromocinnamic acid, TBCA; 캘바이오켐 사, 미국)을 HEK293T 세포에 처리하여 배양한 후, 세포를 수득하고 파쇄하여 HEK293T 세포의 전체 단백질을 포함하는 세포 추출물을 수득하였다. 그런 다음, SDS-PAGE로 상기 전체 단백질을 전개하고, 0.45 ㎛의 폴리비닐이딘 플루오라이드 이동 막(Polyvinylidene fluoride transfer membrane; GE 헬스케어 사, 미국)에 이동하여 5 % 스킴 밀크(skim milk)로 차단한 후, 1차 항체로 항-AKT 항체(셀 시그널링 사, 미국) 및 항-pAKT(s129) 항체(아브캠 사, 미국)를 5% 스킴 밀크를 포함하는 트리스완충식염수 트윈-20(tris buffered saline tween-20, TBST)로 1:1000 희석하고, 상기 차단한 이동 막에 처리하여 밤새 반응시켰다. 그런 다음, TBST로 각각 10 분간 4 회 씻어준 뒤, 2차 항체로 염소(goat)로부터 유래한 겨자무과산화효소(horseradish peroxidase)가 결합된 항-토끼 항체(goat anti-rabbit IgG-HRP; 제품 번호: sc-2004; 산타 크루즈 사, 미국) 및 항-마우스 항체(goat anti-mouse IgG-HRP; 제품 번호: sc-2005; 산타 크루즈 사, 미국)를 1:2000으로 희석하고 첨가하여 반응시켰다. 반응 후, TBST로 각각 10 분간 4 회 씻어준 뒤, 상기 이동 막 위의 단백질을 WEST-ZOL 플러스 웨스턴블럿팅 검출 시스템(WEST-ZOL plus western blotting detection system; 인트론 생명공학 사, 미국) 및 LAS-4000 영상화 분석기(LAS-4000 Image analyzer; 후지필름 사, 일본)을 사용해 단백질의 인산화 수준을 검출하였다. 음성대조군으로 DMSO를 사용하여 상기와 동일한 방법을 수행하였다. 발현량을 비교하기 위한 대조군으로는 1차 항체로 항-hnRNP A1(anti-hnRNA A1, Gideon Dreyfuss, 펜실베니아대, 미국으부터 제공)을 사용하여 상기와 동일한 방법으로 hnRNPA1 발현 여부를 확인하였다.
그 결과, 도 5에서 나타난 바와 같이 CX-4945, TBB 및 TBCA에 의하여 CK2의 활성이 유의적으로 억제되어 AKT의 S129에 탈인산화가 나타나지 않는 것을 확인하였다(도 5).
<3-2> CX -4945의 CK2 비의존적 스플라이싱 조절 효과 확인
CX-4945에 의한 세포 내 스플라이싱 조절 효과가 CX-4945의 CK2 억제에 의한 결과인지의 여부를 확인하기 위해서, CX-4945에 의해 스플라이싱 조절을 받는 것으로 선별된 유전자에 대한 다른 CK2 억제제의 스플라이싱 조절 효과를 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <1-1>과 동일한 방법으로 세포에 CX-4945, TBB 및 TBCA를 처리한 후, 상기 실시예 <2-2>과 동일한 방법으로 ELL2, CPEB1, PRPSAP2 및 QRSL1 유전자의 mRNA 발현 여부를 통해 스플라이싱 패턴을 각각 확인하였다. 음성대조군으로 DMSO를 사용하여 상기와 동일한 방법을 수행하였다.
그 결과, 도 6에서 나타난 바와 같이 CX-4945에 의하여 ELL2, CPEB1, PRPSAP2 및 QRSL1 유전자가 조절되어 스플라이싱 패턴을 나타내는 것에 비해, TBB 및 TBCA는 상기 유전자에 대한 스플라이싱 조절 효과를 나타내지 않아, CX-4945의 스플라이싱 조절 효과는 CK2에 비의존적인 효과인 것을 확인하였다(도 6).
< 실시예 4> Cdc -2 유사 키나아제 ( Cdc -2- like kinase , Clk ) 및 SR 단백질 키나아제( serine / arginine - rich protein kinase , SRPKs )에 대한 CX -4945의 스플라이싱 조절 기작 확인
<4-1> CX -4945의 SR 단백질 인산화 조절 효과 확인
CX-4945의 구체적인 스플라이싱 조절 기작을 확인하기 위하여, Clk에 의해 인산화되는 SR 단백질의 인산화를 통해 CX-4945의 Clk 억제 효과를 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <1-1>과 동일한 방법을 수행하여 HEK293T 세포에 1 또는 10 μM의 CX-4945를 1 시간 동안 처리하고, 상기 실시예 <3-1>과 동일한 방법으로 웨스턴블럿팅을 수행하여 SR 단백질의 인산화 수준을 사용하였다. 1차 항체로는 항-인산-SR 단백질(anti-phospho-SR protein antibody, 1H4; 밀리포어 사, 미국) 을 사용하여 SR 단백질의 인산화 수준을 확인하였다. 발현량을 비교하기 위한 대조군으로는 1차 항체로 항-SRSF1, SRSF4, SRSF9(산타 크루즈 생명공학사, 미국) 및 항-hnRNP A1(anti-hnRNA A1, Gideon Dreyfuss, 펜실베니아대, 미국으부터 제공)을 사용하여 상기와 동일한 방법으로 발현 여부를 확인하였다. 이를 기반으로 영상화 분석 소프트웨어인 ImageJ(NIA, 미국)를 사용하여 SRSF4, SRSF6, SRSF5, SRSF1 및 SRSF3의 인산화 수준을 정량하였다. 양성 대조군으로는 Clk의 억제제로 알려져 있는 (Z)-1-(3-에틸-5-메톡시-2,3-디하이드로벤조티아졸-2-일리덴)프로판-2-원((Z)-1-(3-Ethyl-5-methoxy-2,3-dihydrobenzothiazol-2-ylidene)propan-2-one, TG-003; 시그마 사, 미국)을 10 또는 50 μM 처리하였고, 음성 대조군으로는 DMSO를 처리하여 상기와 동일한 방법을 수행하였다.
그 결과, 도 7 및 도 8에서 나타난 바와 같이 CX-4945에 의해 SSRSF4, SRSF6, SRSF5 및 SRSF1의 탈인산화, 및 SRSF6의 과인산화(hyperphosphorylation)가 나타나는 것을 확인하였으며, 이는 Clk의 억제제로 알려져 있는 TG-003와 동일한 양상을 나타내어 CX-4945가 Clk 억제 효과를 나타내는 것을 확인하였다(도 7 및 도 8).
<4-2> CX -4945의 Clk 및 SRPKs 억제 효과 확인
CX-4945의 구체적인 스플라이싱 조절 기작을 확인하기 위하여, 인산화효소 프로파일링(kinase profiling) 분석을 수행하여 CX-4945의 Clk 및 SRPKs 억제 효과를 직접적으로 확인하였다.
구체적으로, 여러 가지 농도의 CX-4945를 분리정제된 인간 Clk1, Clk2, Clk3, Clk4, SRPK1 및 SRPK2 단백질과 반응시킨 다음, 형광-기반의 면역분석법(fluorescence-based immunoassay) 및 방사능 기반 필터 결합 분석법(radiometric filter-binding assay)을 사용하는 인산화효소 프로파일러 서비스(Kinase Profiler service; 인비트로젠, 밀리포어 사 제공)를 사용하여 인산화효소 프로파일링(kinase profiling) 분석을 수행하여 Clk1, Clk2, Clk3, SRPK1 및 SRPK2에 대한 CX-4945의 억제 효과를 0.001, 0.01, 0.1, 1 및 10 μM의 CX-4945 농도, 및 각각 단백질의 인산화 효소활성에 적합한 ATP 농도(ATP에 대한 Km값과 동일한 ATP 농도)에서 측정하고 프리즘 프로그램을 이용해서 IC50 값을 결정하여 각각의 인산화효소에 대한 CX-4945의 억제효과를 비교하였다. 대조군으로 CK2α에 대한 CX-4945의 억제 효과를 상기와 동일한 방법으로 확인하였다.
그 결과, 도 9 및 하기 [표 4]에서 나타난 바와 같이 CX-4945는 Clk1, Clk2, Clk3 인산화효소에 대하여 3 내지 90 nM의 IC50 농도를 나타내어, 상기 인산화효소에 대하여 억제효과를 나타내는 것을 확인하였으며, Clk2에 대하여 3.8 nM의 IC50을 나타내므로 억제 효과가 가장 높으며, 이는 기존에 알려진 CK2α 억제 효과(IC50= 14.7 nM)와 비교하였을 때보다도 훨씬 현저한 효과인 것을 확인하였다(도 9 및 표 4).
CX-4945의 Clk1, Clk2, Clk3, SRPK1 및 SRPK2 인산화효소 억제 효과의 확인
인산화효소 명 IC50 (nM)
Clk1 82.3
Clk2 3.8
Clk3 90.0
SRPK1 1229.0
SRPK2 1111.0
CL2α 14.7
<4-3> 기존 Clk 억제제 및 CX -4945의 SR 단백질 인산화 조절 효과의 비교
본 발명의 CX-4945의 스플라이싱 조절 효과를 비교하기 위하여, 기존 Clk 억제제로 사용되고 있는 약물인 TG-003과, CS-4945의 Clk 억제 효과를 비교하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <1-1>과 동일한 방법을 수행하여 여러 가지 농도의 CX-4945를 분리정제된 인간 Clk1, Clk2, Clk3, Clk4 단백질과 반응시킨 다음, 형광-기반의 면역분석법(fluorescence-based immunoassay)을 사용하는 인산화효소 프로파일러 서비스(Kinase Profiler service; 밀리포어 사 제공)를 사용하여 인산화효소 프로파일링(kinase profiling) 분석을 수행하여 Clk1, Clk2, Clk3 및 Cl4k에 대한 CX-4945 또는 TG-003의 억제 효과를 확인하였다. 그런 다음, 각각의 인산화효소가 나타내는 IC50 값을 측정하여 각각의 인산화효소에 대하여 CX-4945 또는 TG-003가 나타내는 억제효과를 비교하였다.
그 결과, 도 10 및 하기 [표 5]에서 나타난 바와 같이 TG-003은 Clk1, Clk2, Clk3 및 Cl4k에 대하여 IC50 값을 각각 18.3 nM, 91.6 nM, 2000 nM 및 16.6 nM을 나타내었으나(도 10 및 [표 5]), CX-4945는 3.3 nM, 2.9 nM, 66.8 nM 및 23.0 nM의 IC50을 나타내는 것을 확인하였다(도 10 및 [표 5]). 이러한 결과는 본 발명의 CX-4945는 기존에 스플라이싱 저해제로 사용되고 있는 TG-003에 비하여, 5 내지 30 배 높은 Clk 억제능을 나타내는 것을 확인하였다(도 10 및 [표 5]).
CX-4943 및 TG-003의 Clk1, Clk2, Clk3 및 SRPK1 및 SRPK2 인산화효소 억제 효과의 확인
인산화효소 명 IC50 (nM)
CX -4945 TG-003
Clk1 3.3 18.3
Clk2 2.9 91.6
Clk3 66.8 >2000.0
Clk4 23.0 16.6
<4-4> CX -4945의 Clk 효소에 대한 ATP 경쟁적 억제 효과 확인
CX-4945가 CK2에 대하여 나타내는 억제 효과는 ATP 경쟁적 방식으로 나타나므로, CX-4945가 Clk에 대하여도 ATP 경쟁적인 방법으로 억제 효과를 나타내는지 여부를 확인하기 위해 다양한 ATP 농도조건 하에서 CX-4945가 Clk2에 대하여 나타내는 IC50 값을 측정하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <4-3>과 동일한 방법을 수행하여 여러 가지 농도의 ATP(5, 15, 45 및 135 μM)와 CX-4945를 분리정제된 인간 Clk2 단백질과 반응시킨 다음, 상기 실시예 <4-3>과 동일한 방법으로 Clk2에 대한 CX-4945의 억제 효과를 IC50 값으로 확인하였다.
그 결과, 도 11에서 나타난 바와 같이 CX-4945는 ATP 경쟁적인 방식으로 Clk2 효소를 억제하는 것을 확인하였다(도 11).
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> A splicing regulator comprising CX-4945 as an active ingredient <130> 14P-03-003 <150> 10-2013-0120022 <151> 2013-10-08 <160> 22 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CK2A'_F <400> 1 caactctacc agatcctgac agactttgat a 31 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CK2A'_R <400> 2 ctgatagtcc acgaggagct ctggt 25 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ELL2_F <400> 3 ctaaatccgt ctcagaatgc tgcag 25 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ELL2_R <400> 4 taatctggga gttcaattgc tgaagg 26 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPAST_F <400> 5 ccccttaaca cacactagta attcactgc 29 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPAST_R <400> 6 ctcaggcctc agagaaggaa gaataac 27 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTDSPL2_F <400> 7 ccttcaaaac ggagtagaat tgaacg 26 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTDSPL2_R <400> 8 ctgtaagggg tgggatatca cgatt 25 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRPSAP2_F <400> 9 ggacgtgaac accaccatca tg 22 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRPSAP2_R <400> 10 ttcgccgagg ctggagactt 20 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CPEB1_F <400> 11 ccttcctgtc tctgtcaggg gg 22 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CPEB1_R <400> 12 taatctggga gttcaattgc tgaagg 26 <210> 13 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> QRSL1_F <400> 13 ccagggactc taccacagta catgaa 26 <210> 14 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> QRSL1_R <400> 14 gtttcctgag agaattcttc ctctcacc 28 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRIP4_F <400> 15 tcgaaggacc caagtcattg atg 23 <210> 16 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRIP4_R <400> 16 cttttaatcc ctctgacaag cagagaag 28 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WDFY1_F <400> 17 gctcctcagt ggttggaaag tgat 24 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WDFY1_R <400> 18 ctttacaatg cggtcggtcc c 21 <210> 19 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP38_F <400> 19 cagtgttata caagccttgt ttatggcc 28 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP38_R <400> 20 gcgaaagatc tgtaaaggct tccac 25 <210> 21 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZCCHC2_F <400> 21 gcagctattt tcaagttcat cacaagct 28 <210> 22 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZCCHC2_R <400> 22 ttcacaatgg gacttttccc agtatg 26

Claims (16)

  1. 5-[(3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2,6-나프티리딘-8-카르복시산(5-[(3-Chlorophenyl)amino]benzo [c]-2,6-naphthyridine-8-carboxylic acid, 실미타세르티브(Silmitasertib), CX-4945) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 신경섬유종증(Neurofibromatosis) 또는 척수성 근위축(Spinal muscular atrophy)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 5-[(3-클로로페닐)아미노]벤조[c]-2,6-나프티리딘-8-카르복시산(CX-4945)는 mRNA의 선택적 스플라이싱(alternative splicing)을 조절하는 것을 특징으로 하는 신경섬유종증 또는 척수성 근위축의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 5-[(3-클로로페닐)아미노]벤조[c]-2,6-나프티리딘-8-카르복시산(CX-4945)는 스플라이싱 조절 키나아제(splicing regulation kinase)를 저해하는 것을 특징으로 하는 신경섬유종증 또는 척수성 근위축의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 5-[(3-클로로페닐)아미노]벤조[c]-2,6-나프티리딘-8-카르복시산(CX-4945)는 세린-알지닌-풍부 단백질(Serin-arginine-rich, SR 단백질)의 인산화(phosphorylation)를 조절하는 것을 특징으로 하는 신경섬유종증 또는 척수성 근위축의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 5-[(3-클로로페닐)아미노]벤조[c]-2,6-나프티리딘-8-카르복시산(CX-4945)는 ATP 경쟁적으로 Clk의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 신경섬유종증 또는 척수성 근위축의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 5-[(3-클로로페닐)아미노]벤조[c]-2,6-나프티리딘-8-카르복시산(CX-4945) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 신경섬유종증 또는 척수성 근위축의 예방 및 치료용 스플라이싱 조절제(splicing regulator).
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 분리된 세포, 무세포(cell-free) 또는 시험관 내(in vitro)에서 5-[(3-클로로페닐)아미노]벤조[c]-2,6-나프티리딘-8-카르복시산(CX-4945) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염를 처리하여 mRNA의 선택적 스플라이싱을 조절하거나, 스플라이싱 조절 키나아제를 저해하거나, 또는 세린-알지닌-풍부 단백질(Serin-arginine-rich, SR 단백질)의 인산화(phosphorylation)를 조절하는 것을 포함하는, 신경섬유종증 또는 척수성 근위축의 예방 또는 치료를 위한 스플라이싱 조절 방법.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 5-[(3-클로로페닐)아미노]벤조[c]-2,6-나프티리딘-8-카르복시산(CX-4945) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 신경섬유종증 또는 척수성 근위축의 예방 또는 치료용 스플라이싱 조절용 키트.
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
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