KR101590588B1 - 들기름 내 리놀렌산의 분리정제방법 - Google Patents

들기름 내 리놀렌산의 분리정제방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 들기름 내 리놀렌산을 분리정제하는 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 비극성용매를 이용한 다단계 추출을 수행하여 리놀렌산의 순도를 80%까지 향상시키는 리놀렌산 분리정제기술에 관한 것이다.
본 발명에 따른 리놀렌산의 분리정제방법은 메탄올, 수산화칼륨, 요소 용액 등 각종 시료 처리를 통해 들기름에서 추출할 수 있는 리놀렌산의 순도를 최대 80%까지 향상시킴으로써 종래기술보다 효율적으로 리놀렌산을 추출할 수 있고, 이를 이용하여 리놀렌산을 다량 함유하는 건강 기능성 식품 개발이 가능하다.

Description

들기름 내 리놀렌산의 분리정제방법{Method of isolating and purifying linolenic acid from perilla oil}
본 발명은 들기름 내 리놀렌산을 분리정제하는 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 비극성용매를 이용한 다단계 추출을 수행하여 리놀렌산의 순도를 80%까지 향상시키는 리놀렌산 분리정제기술에 관한 것이다.
리놀렌산(linolenic acid)은 3개의 이중결합과 카르복실산을 가진 불포화지방산으로 식물성 기름에 많이 함유되어 있는 성분이다. 리놀렌산은 3개의 이성질체를 갖고 있으며 알파-리놀렌산(ω-3 지방산, α-linolenic acid)과 감마-리놀렌산(ω-6 지방산, γ-linolenic acid)이 가장 잘 알려져있다. 보통 특별한 언급이 없으면 리놀렌산은 알파-리놀렌산을 의미한다. 알파-리놀렌산은 체내에서 합성되지 않는 필수지방산으로 식품으로 섭취해야하며, 아마씨유(flexed seed oil)나 호두 기름과 같은 식물성 유지 등에 많이 들어있다. 또한, 생선에 많이 들어있는 EPA(eicosapentaenoic acid)와 DHA(docosahexaenoic acid)로 전환되는 전구물질이기도 하다. 알파- 리놀렌산과 감마-리놀렌산이 부족할 경우, 두뇌와 망막에 필요한 DHA가 부족해 학습능력과 시각 기능이 떨어지게 된다. 알파-리놀렌산은 인체 안에서 세포를 보호하고, 세포구조를 유지시키며 원활한 신진대사를 돕는다. 또한, 혈액의 피막형성을 억제하고, 뼈의 형성을 촉진 및 강화하는 효과가 있다. 알파-리놀렌산을 섭취하면 혈중 콜레스테롤이 저하되고 심혈관계 질환 발생 위험성을 감소시켜주며 동맥의 기능이 보호되는 효과 등을 얻을 수 있다.
일반적으로 리놀렌산을 추출하기 위한 가장 편리한 방법으로는 리놀렌산함량이 풍부한 들깨에서 들기름을 추출하여 리놀렌산을 분리정제하는 방법이 있다. 들깨에서 리놀렌산의 함량을 최대로 추출하기 위해서는 적절한 시기에 들깨를 생육하고, 들깨를 수확한 후에 처리 과정이 적절히 이루어져야 한다. 들깨는 초여름에 파종하여 10월에 수확을 한다. 수확한 들깨를 건조시킨 후에 깨알을 짜내면 들기름이 만들어지게 된다. 기존의 들기름에서 알파-리놀렌산을 추출하는 방법으로는 들기름에 수산화나트륨 촉매와 요소, 에탄올 등의 시료를 처리하고 박막증류법을 통하여 알파-리놀렌산을 정제하거나(중국 특허등록 제102993011호), 효소공법을 이용하여 들기름 내의 알파-리놀렌산의 함량을 고농도로 농축하는 방법이 있었다(이기택 et al., 효소공법을 이용한 공액알파리놀렌산의 농축 및 고농도 함유 기능성 oil 및 fat 소재 개발. 10-15, 2013). 하지만 종래의 방법으로 추출할 수 있는 알파-리놀렌산의 함량은 60%에서 최대 73%로 머무르는 것에 그쳤다.
이에 본 발명자들은, 들기름에 포함된 리놀렌산을 높은 순도로 분리정제하기 위하여, 비극성용매를 이용하여 들기름을 다단계 추출하고 각종 시료를 처리한 결과, 들기름에서 추출할 수 있는 리놀렌산의 순도를 최대 80%까지 향상시키는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 들기름을 다단계 추출하여 들기름에서 추출할 수 있는 리놀렌산의 순도를 80%까지 향상시킬 수 있는 리놀렌산의 분리정제방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 들깨추출물에서 리놀렌산을 추출하는 리놀렌산의 분리정제방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 들기름을 n-헥산으로 용출하여 용출되는 분획을 제거한 후, 나머지 분획을 디클로로메탄(CH2Cl2)으로 용출하여 수득된 기름성분을 진공 농축하는 단계; (b) 상기 농축된 분획에 메탄올과 수산화칼륨 혼합용매를 첨가하여 반응시키는 단계; (c) 상기 (b) 단계의 반응물을 요소 용액에 첨가하여 침전을 유도하는 단계; (d) 상기 (c) 단계의 침전물을 제거한 다음, 기름성분에 n-헥산과 에틸에테르를 첨가하여 상 분리를 유도하는 단계; (e) 상기 (d) 단계의 상등액에 무수소듐설페이트를 첨가하여 불순물을 제거하는 단계; 및 (f) 상기 (e) 단계의 무수소듐설페이트와 남아있는 유기용매를 제거하여, 리놀렌산을 수득하는 단계를 포함하는 리놀렌산의 분리정제방법을 제공한다.
본 발명에 따른 리놀렌산의 분리정제방법은 메탄올, 수산화칼륨, 요소 용액 등 각종 시료 처리를 통해 들기름에서 추출할 수 있는 리놀렌산의 순도를 최대 80%까지 향상시킴으로써 종래기술보다 효율적으로 리놀렌산을 추출할 수 있고, 이를 이용하여 리놀렌산을 다량 함유하는 건강 기능성 식품 개발이 가능하다.
도 1은 들기름에서 추출된 리놀렌산의 함량을 확인하기 위해 GC-FID로 측정한 크로마토그램 이미지이다.
도 2는 용매에 따른 들기름과 들깨추출물에서 추출된 리놀렌산의 함량을 확인하기 위해 GC-FID로 측정한 크로마토그램 이미지이다.
본 발명에서는, 들깨추출물에 포함된 리놀렌산을 높은 순도로 분리정제하기 위해, 비극성 용매와 요소 용액 등의 각종 시료 처리를 통해 들기름과 들깨추출물에서 리놀렌산을 추출하고 성분을 분석한 결과, 들기름에서 추출할 수 있는 리놀렌산의 순도를 최대 80%까지 향상시킴으로써 종래기술보다 효율적으로 리놀렌산을 추출할 수 있음을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 들깨추출물에서 리놀렌산을 추출하는 리놀렌산의 분리정제방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 들깨추출물은 들기름인 것을 특징으로 하지만 이에 국한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 들깨(Perilla frutescens)는 쌍떡잎식물 통화식물목 꿀풀과의 한해살이풀로 인도의 고지(高地)와 중국 중남부 등이 원산지이며, 한국에는 통일신라시대에 참깨와 함께 들깨를 재배한 기록이 있는 것으로 보아 옛날부터 전국적으로 재배된 것으로 보인다. 낮은 지대의 인가 근처에 야생으로 자란다. 유료작물로 재배하며, 잎에 특이한 냄새가 있으며 식용하고 종자에서 짜낸 기름은 용도가 많다. 높이는 60∼90cm이다. 줄기는 네모지고 곧게 서며 긴 털이 있다. 잎은 마주나고 달걀 모양 원형으로 뾰족하며 밑부분은 둥글다. 잎은 길이 7∼12cm, 너비 5∼8cm로 톱니가 있고 앞면은 녹색이지만 뒷면에는 자줏빛이 돈다. 확정된 품종은 없으나 열매의 형태적 특성에 따라 몇 종으로 나누는데, 한국에서는 거의 갈색종을 재배하고 있다. 기름 이외에도 페인트, 니스, 리놀륨, 인쇄용잉크, 방수용구칠과의 혼용, 포마드, 비누 등의 원료로 쓰인다.
본 발명의 일 실시예에서는, 들깨에서 추출한 들기름에서 리놀렌산을 분리정제하였다. 들기름을 중압액체크로마토그래피(MPLC)를 통해 n-헥산으로 용출된 부분을 제거한 후, 나머지 분획을 디클로로메탄(CH2Cl2) 으로 용출하여 진공 농축하였다. 농축된 디클로로메탄 분획에 메탄올과 수산화칼륨 혼합용매를 20 ml : 10 ml : 2 g의 비율로 첨가한 후, 항온수조(water bath)에서 65℃ 내지 70℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 메탄올을 용매로 한 요소 용액을 상기 반응물에 첨가하여 침전시켰다. 침전물을 제거한 후, pH를 2 ~ 3으로 조정했고, 여기에 n-헥산과 에틸에테르를 첨가하여 층 분리를 유도하였다. 분리된 상층액에 무수소듐설페이트를 처리하여 불순물을 제거하고, 남아있는 무수소듐설페이트와 유기용매를 제거하여 리놀렌산을 수득하였다.
본 발명은 다른 관점에서, (a) 들기름을 n-헥산으로 용출하여 용출되는 분획을 제거한 후, 나머지 분획을 디클로로메탄(CH2Cl2)으로 용출하여 수득된 기름성분을 진공 농축하는 단계; (b) 상기 농축된 분획에 메탄올과 수산화칼륨 혼합용매를 첨가하여 반응시키는 단계; (c) 상기 (b) 단계의 반응물을 요소 용액에 첨가하여 침전을 유도하는 단계; (d) 상기 (c) 단계의 침전물을 제거한 다음, 기름성분에 n-헥산과 에틸에테르를 첨가하여 상 분리를 유도하는 단계; (e) 상기 (d) 단계의 상등액에 무수소듐설페이트를 첨가하여 불순물을 제거하는 단계; 및 (f) 상기 (e) 단계의 무수소듐설페이트와 남아있는 유기용매를 제거하여, 리놀렌산을 수득하는 단계를 포함하는 리놀렌산의 분리정제방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는 중압액체크로마토그래피(MPLC)를 이용하여 용출하는 리놀렌산의 분리정제방법인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계에서 농축된 분획과 메탄올 및 수산화칼륨 혼합용매의 첨가비율은 각각 5 ~ 40 ml : 5 ~ 20 ml : 0.5 ~ 5 g 인 것을 특징으로 하고, 바람직하게는 20 ml : 10 ml : 2 g의 비율로 첨가하는 것을 특징으로 하지만 이에 국한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 반응온도는 65 ~ 70℃인 리놀렌산 분리정제방법인 것을 특징으로 한다.
본 발명에서, 중압액체크로마토그래피(medium pressure liquid chromatography, MPLC)는 액체크로마토그래피 분석기술 중 하나로, 고정상으로 고체를 사용하고 고정상에 시료를 가한 다음 높은 압력 조건에서 액체 이동상을 사용하는 크로마토그래피 기술이다. 중압액체크로마토그래피의 압력조건 보다 더 높은 압력에서 이동상을 흘려 보내는 기술은 고압액체크로마토그래피(high pressure liquid chromatography, HPLC)라고 한다. 압력이 셀수록 분리 속도가 빨라지기 때문에 고속LC(high speed liquid chromatography) 또는 고성능LC(high performance liquid chromatography)라고도 한다.
본 발명의 다른 실시예에서는, 용매를 달리 처리하고 요소를 처리했을 때 추출되는 리놀렌산의 함량을 비교하고자 하였다. 들깨추출물의 n-Hexane, CH2Cl2, CHCl3 분획물과 들기름을 MPLC를 통해 n-Hexane, CH2Cl2, CHCl3로 용출한 들기름성분의 샘플에 2 g의 요소를 처리하였다. 그 결과, Treatment 2, 3 및 4에서 80%에 준하는 수준의 리놀렌산을 수득할 수 있었다(표 3, 도 2). 이를 통해, 리놀렌산을 최대 함량으로 분리정제하기 위해 필요한 요소의 함량은 용매에 무관하게 거의 유사한 양상을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계의 요소 용액과 (b) 단계의 반응물은 1 : 0.1 ~ 1 : 0.7의 비율로 반응하는 것을 특징으로 하고, 자세하게는 1 : 0.1 ~ 1 : 0.3의 비율로 반응하고, 더욱 자세하게는 1 : 0.15의 비율로 반응하는 것이 바람직하지만 이에 국한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계의 요소는 메탄올 용매에 200 g/L로 첨가되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 (d) 단계는 침전물 제거 후에 pH를 2 ~ 3으로 조정하는 리놀렌산 분리정제방법인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 (f) 단계의 유기용매는 질소를 이용하여 제거하는 리놀렌산 분리정제방법인 것을 특징으로 한다.
본 발명에서, 요소(urea, H2NCONH2)는 아미노산의 탈아미노에 의해 형성된 암모니아와 이산화탄소로부터 간에서 합성되는 유기화합물이다. 무색무취의 결정체이며, 물에 잘 녹아 20℃, 100 mL의　물에서 108 g의 요소가 녹을 수 있다. 요소의 결정 구조에는, 소분자가 들어가기 적합한 크기의 구멍이 있다. 때문에 핵산 등 다양한 화합물과 반응하여 안정상태가 된다. 요소는 세포 내외로 쉽게 출입할 수 있고, 혈액 중의 비단백태 질소의 큰 부분을 차지하며, 신장을 통해서 소변으로 나간다. 포름알데히드(HCHO)와 반응하여　요소 수지를 만드는데 사용할 수 있다. 또한 고농도의 수용액은 단백질과 핵산을 변형시키는데 사용된다. 또한 이뇨제와 바르비투르산계의 최면제 등의 의약품 제조 원료로도 사용된다.
본 발명에서, 용매는 용액의 매체가 되어 용질을 녹이는 물질로, 주로 액체나 기체상을 띤다. 용매가 액체상태에 있는 경우에는 무기용매와 유기용매로 구분할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용매는 무기용매인 물, 유기용매 또는 이들의 혼합물로부터 선택되는 용매일 수 있다. 물을 용매로 사용할 경우, 열수추출법을 통하여 용매 추출물을 제조할 수 있다. 유기용매는 탄소수 1 내지 5의 알코올, 에틸아세테이트, 아세톤 등의 극성용매와 에테르, 클로로포름, 벤젠, 헥산, 디클로로메탄 등의 비극성용매일 수 있다. 예를 들어, 상기 탄소수 1 내지 5의 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 이소프로판올 등으로부터 선택될 수 있다. 용매는 2종 이상 사용할 수 있으며,　용매의 극성에 따라 순차적으로 사용하거나 혼합하여 사용하여, 각　용매　추출물을 제조할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 들기름에서 추출한 리놀렌산의 함량을 확인하기 위해 가스크로마토그래피-불꽃이온화검출기(gas chromatography-flame ionization detector, GC-FID)를 이용하여 리놀렌산의 함량을 측정한 결과, 약 80%의 알파-리놀렌산이 함유되어 있는 것을 확인할 수 있었다(도 1).
본 발명에 있어서, 상기 리놀렌산의 순도는 약 70 ~ 90% 인 것을 특징으로 할 수 있지만, 바람직하게는 80%인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 리놀렌산은 알파 리놀렌산(α-linolenic acid)인 것을 특징으로 한다.
본 발명에서, 리놀렌산(linolenic acid)은 3개의 이중결합과 카르복실산을 가진 불포화지방산으로 식물성 기름에 많이 함유되어 있는 성분이다. 리놀렌산은 3개의 이성질체를 갖고 있으며 알파-리놀렌산(ω-3 지방산, α-linolenic acid)과 감마-리놀렌산(ω-6 지방산, γ-linolenic acid)이 가장 잘 알려져있다. 보통 특별한 언급이 없으면 리놀렌산은 알파-리놀렌산을 의미한다. 알파-리놀렌산은 체내에서 합성되지 않는 필수지방산으로 식품으로 섭취해야하며, 아마씨유(flexed seed oil)나 호두 기름과 같은 식물성 유지 등에 많이 들어있다. 또한, 생선에 많이 들어있는 EPA(eicosapentaenoic acid)와 DHA(docosahexaenoic acid)로 전환되는 전구물질이기도 하다. 알파- 리놀렌산과 감마-리놀렌산이 부족할 경우, 두뇌와 망막에 필요한 DHA가 부족해 학습능력과 시각 기능이 떨어지게 된다. 알파-리놀렌산은 인체 안에서 세포를 보호하고, 세포구조를 유지시키며 원활한 신진대사를 돕는다. 또한, 혈액의 피막형성을 억제하고, 뼈의 형성을 촉진 및 강화하는 효과가 있다. 알파-리놀렌산을 섭취하면 혈중 콜레스테롤이 저하되고 심혈관계 질환 발생 위험성을 감소시켜주며 동맥의 기능이 보호되는 효과 등을 얻을 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 리놀렌산 분리정제 기술
리놀렌산을 분리하기 위한 들깨는 농촌진흥청에서 제공받았다. 들깨에서 추출한 들기름을 중압액체크로마토그래피(MPLC)를 이용하여 n-헥산(Hexane) 100% 조건으로 n-헥산에 용출되는 부분을 완전히 제거한 후, 이어서 디클로로메탄(CH2Cl2) 100% 조건으로 용출하여 디클로로메탄 100%의 기름성분만을 모두 합쳐 진공 농축하였다. 농축한 디클로로메탄의 기름성분에 메탄올(MeOH)과 수산화칼륨(KOH)을 20 ml : 10 ml : 2 g의 비율로 첨가하여, 항온수조(water bath)에서 65℃ - 70℃의 온도로 약 1시간 반응시켰다. 메탄올 10 ml에 요소 2 g을 첨가하여 용해한 뒤, 상기 반응물(2 g)을 첨가하여 냉장고에 약 24시간 동안 유지하였다. 24시간 후, 침전물을 여과지를 이용하여 걸러낸 뒤, 기름성분에 염산(HCl)을 첨가하여 pH 2-3 정도로 맞췄다. pH를 맞춘 기름성분에 n-헥산 10 ml와 에틸 에테르(ethyl ether) 5 ml를 첨가하여 층이 분리된 후, 상층액만을 취하고, 여기에 무수소듐설페이트(anhydrous sodium sulfate)를 이용하여 약 10 - 15분간 유지하여 불순물(수분)을 제거하였다. 무수소듐설페이트를 걷어낸 뒤, 질소를 이용하여 나머지 남아 있는 유기용매를 완전히 제거하였다. 수득한 리놀렌산의 함량을 확인하기 위해 가스크로마토그래피-불꽃이온화검출기(gas chromatography-flame ionization detector, GC-FID)를 통해 리놀렌산의 함량을 분석하였다. 그 결과, 약 80%의 알파-리놀렌산이 함유되어 있는 것을 확인할 수 있었다(도 1).
GC-FID 조건
GC Agilent 7890A(Agilent, CA, USA)
Column DB-Wax (Agilent, 30mm × 0.25mm × 0.25μm)
Injector 250℃
Detector FID (280℃, H2 35ml/min, Air 350ml/min, He 35ml/min)
Oven 50℃ 1min Hold,
200℃ 25℃/min, 5min Hold,
230℃ 3℃/min, 20min Hold.
Injection 1 μl (spilt ratio 20)
실시예 2: 용매에 따른 리놀렌산의 함량 비교
실시예 1에서 요소 2 g을 첨가했을 때 80%의 리놀렌산이 추출되는 것을 확인하였으므로, 본 실시예에서는 용매를 달리 처리하고 요소를 처리했을 때 추출되는 리놀렌산의 함량을 비교하고자 하였다. 들깨추출물의 n-Hexane, CH2Cl2, CHCl3 분획물과 들기름을 MPLC를 통해 n-Hexane, CH2Cl2, CHCl3로 용출한 들기름성분의 샘플에 2 g의 요소를 처리하였다. 그 결과, Treatment 2, 3 및 4에서 80%에 준하는 수준의 리놀렌산을 수득할 수 있었다(표 2, 도 2). 이를 통해, 리놀렌산을 최대 함량으로 분리정제하기 위해 필요한 요소 함량은 용매에 무관하게 거의 유사한 양상을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
제조예: 용매에 따른 리놀렌산 함량 비교를 위한 샘플의 조제
Treatment 1 : 들기름을 n-Hexane 100%로 용출하여 요소 2 g 처리
Treatment 2 : 들기름을 CHCl3 100%로 용출하여 요소 2 g 처리
Treatment 3 : 들기름을 CH2Cl2 100%로 용출하여 요소 2 g 처리
Treatment 4 : 들깨추출물의 n-Hexane 분획물에 요소 2 g 처리
Treatment 5 : 들깨추출물의 CHCl3 분획물에 요소 2 g 처리
Treatment 6 : 들깨추출물의 CH2Cl2 분획물에 요소 2 g 처리
각 샘플의 요소 함유량에 따른 리놀렌산의 함량
Treatment α-linolenic acid (%) γ-linolenic acid (%)
Treatment 1 61.354 % 0 %
Treatment 2 80.502 % 0 %
Treatment 3 81.751 % 0 %
Treatment 4 77.410 % 0 %
Treatment 5 52.562 % 0 %
Treatment 6 39.334 % 0 %
이상으로, 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (12)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 다음의 단계를 포함하는 리놀렌산의 분리정제방법:
    (a) 들기름을 n-헥산으로 용출하여 용출되는 분획을 제거한 후, 나머지 분획을 디클로로메탄(CH2Cl2)으로 용출하여 수득된 기름성분을 진공 농축하는 단계;
    (b) 상기 농축된 분획에 메탄올과 수산화칼륨 혼합용매를 첨가하여 65 ~ 70℃에서 반응시키는 단계;
    (c) 상기 (b) 단계의 반응물을 요소 용액에 첨가하여 침전을 유도하는 단계;
    (d) 상기 (c) 단계의 침전물을 제거한 다음, 기름성분에 n-헥산과 에틸에테르를 첨가하여 상 분리를 유도하는 단계;
    (e) 상기 (d) 단계의 상등액에 무수소듐설페이트를 첨가하여 불순물을 제거하는 단계; 및
    (f) 상기 (e) 단계의 무수소듐설페이트와 남아있는 유기용매를 제거하여, 리놀렌산을 수득하는 단계.
  4. 제3항에 있어서, 상기 (a) 단계는 중압액체크로마토그래피(MPLC)를 이용하여 용출하는 것을 특징으로 하는 리놀렌산의 분리정제방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 농축된 분획과 메탄올 및 수산화칼륨혼합용매의 첨가비율은 각각 5 ~ 40 ml : 5 ~ 20 ml : 0.5 ~ 5 g 인 것을 특징으로 하는 리놀렌산의 분리정제방법.
  6. 삭제
  7. 제3항에 있어서, 상기 (c) 단계의 요소 용액과 (b) 단계의 반응물은 1 : 0.1 ~ 1 : 0.7의 비율로 반응하는 것을 특징으로 하는 리놀렌산의 분리정제방법.
  8. 제3항에 있어서, 상기 (c) 단계의 요소는 메탄올 용매에 200 g/L로 첨가되는 것을 특징으로 하는 리놀렌산의 분리정제방법.
  9. 제3항에 있어서, 상기 (d) 단계는 침전물 제거 후에 pH를 2 ~ 3으로 조정하는 것을 특징으로 하는 리놀렌산의 분리정제방법.
  10. 제3항에 있어서, 상기 (f) 단계의 유기용매는 질소를 이용하여 제거하는 것을 특징으로 하는 리놀렌산의 분리정제방법.
  11. 제3항에 있어서, 상기 리놀렌산의 순도는 70 ~ 90% 인 것을 특징으로 하는 리놀렌산의 분리정제방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 리놀렌산은 알파 리놀렌산(α-linolenic acid)인 것을 특징으로 하는 리놀렌산의 분리정제방법.
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