KR101588354B1 - 저질량 이온 대사체를 이용한 모야모야병 진단용 조성물 및 이의 이용 - Google Patents

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KR101588354B1
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이지연
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Abstract

본 발명은 우리딘(Uridine) 및 슈도우리딘(Pseudouridine)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 대사체를 검출 내지 정량함으로써, 모야모야병을 진단하기 위한 조성물, 키트 및 방법에 관한 것이다.

Description

저질량 이온 대사체를 이용한 모야모야병 진단용 조성물 및 이의 이용{Composition for diagnosing moyamoya disease using low-mass-ion metabolites and uses thereof}
본 발명은 우리딘(Uridine) 및 슈도우리딘(Pseudouridine)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 대사체를 검출 내지 정량함으로써, 모야모야병을 진단하기 위한 조성물, 키트 및 방법에 관한 것이다.
모야모야병은 특별한 원인 없이 대뇌에 혈액을 공급하는 내경동맥의 말단부나 그 분지부위에 협착과 폐색이 일어나고 뇌기저부에 이상 혈관들이 관찰되는 만성 뇌혈관 질환을 말한다. 어린이의 경우 주로 반복적인 일과성 뇌허혈 발작의 형태로 나타나고, 성인에서는 뇌출혈이 흔히 나타난다. 모야모야병은 대부분 소아기에 발생하여 발달 과정에 있는 소아의 뇌에 지속적이며 심각한 손상을 야기하여, 지능저하, 인지기능저하 및 정서적 발달에 악영향을 미친다. 따라서, 장기적인 학업과 사회생활에 장애를 초래한다. 모야모야병은 발병 기전이나 병인이 명확히 알려져 있지 않아 근본적인 치료법은 없으나, 뇌 허혈에 대한 수술적 치료 효과는 여러 보고를 통해 입증되어 있다.
현재 모야모야병 진단에 사용되고 있는 뇌혈관 조영술은 침습적인 진단기술이라 반복적으로 행해지는 검사에 부적절하다. 또한, MRI(magnetic resonance image)/MRA(magnetic resonance angiography)는 비침습적인 진단 방법이기는 하나, 고가의 장비를 사용하므로 스크리닝을 목적으로 하기에는 경제성이 떨어지는 단점이 있다.
따라서, 보다 간편하고 정확하고 안정적으로 모야모야병을 진단할 수 있는 기술의 개발이 필요하다.
미국특허공개 제2011-0028331호(2011. 2. 3)
본 발명의 목적은 우리딘(Uridine) 및 슈도우리딘(Pseudouridine)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 대사체를 검출 내지 정량함으로써, 모야모야병을 진단하기 위한 조성물, 키트 및 방법을 제공하는 것이다.
보다 상세하게, 본 발명의 하나의 목적은 우리딘 및 슈도우리딘으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 대사체의 정량 수단을 포함하는, 모야모야병의 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 우리딘 및 슈도우리딘으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 대사체의 정량 수단을 포함하는, 모야모야병의 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 개체의 시료로부터 우리딘 및 슈도우리딘으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 대사체를 정량하는 단계를 포함하는, 모야모야병 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 개체의 시료로부터 우리딘 및 슈도우리딘으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 대사체를 정량하는 단계를 포함하는, 모야모야병을 진단하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 저질량 이온 대사체인 우리딘(Uridine) 및 슈도우리딘(Pseudouridine)이 모야모야병 환자의 시료에서 특이적으로 증가한다는 발견에 기초한 것으로, 상기 저질량 이온 대사체를 바이오 마커로 이용하여 모야모야병을 진단하는 기술을 제공한다.
저질량 이온(Low mass ion) 대사체는 약 1,200 m/z 이하의 영역에서 검출되는 저분자량의 물질을 말하는데, 종래 단백체 연구에서 이용된 질량 분석은 주로 1,200 내지 2,500 m/z 의 질량값 범위에서 이루어졌고, 약 1,200 m/z 이하의 저질량 영역에 대한 연구가 활발하지 못했다.
이에, 본 발명의 구체적인 실시예에서는, 모야모야병 환자 10명과 정상인 대조군 10명의 소변의 Triple-TOF 질량 스펙트럼에서 모야모야병 환자군과 대조군 간에 유의성 있는 차이를 나타내는 피크를 선별하였다. 선별된 피크를 MS 와 MS/MS 패턴 및 인간 대사체 데이터베이스를 이용하여 탐색한 결과, 저질량 이온 대사체인 우리딘 및 슈도우리딘이 동정되었으며, 이들은 정상인의 소변 시료에 비해 모야모야병 환자군의 소변에서 현저히 증가되어 있음이 확인되었다.
따라서, 모야모야병 환자군의 시료에서 특이적인 발현 변화를 나타내는 우리딘 및/또는 슈도우리딘을 모야모야병을 진단하는 진단 마커로 활용할 수 있다.
따라서 하나의 양태로서, 본 발명은 우리딘 및 슈도우리딘으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 대사체의 정량 수단을 포함하는, 모야모야병의 진단용 조성물 및 키트에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 모야모야병 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 모야모야병이 의심되는 환자의 생물학적 시료로부터 우리딘 및 슈도우리딘으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 대사체를 검출하는 방법에 관한 것이다.
일예로, 본 발명은 개체의 시료로부터 우리딘 및 슈도우리딘으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 대사체를 정량하는 단계를 포함하는, 모야모야병 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
다른 예로, 본 발명은 개체의 시료로부터 우리딘 및 슈도우리딘으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 대사체를 정량하는 단계를 포함하는, 모야모야병을 진단하는 방법에 관한 것이다.
이러한 방법에 있어서, 개체의 시료에서의 우리딘 및 슈도우리딘으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 대사체의 정량 결과 상기 대사체가 정상 대조군보다 증가한 경우 모야모야병이라고 판정할 수 있다.
본 발명에서 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 모야모야병 발병 여부를 확인하거나, 나아가 질환의 진행 여부 또는 심화 여부를 확인하는 것이다.
일 구현예로, 우리딘 및 슈도우리딘으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 대사체의 정량 수단은, 상기 대사체에 특이적인 항체, 화합물, 단백질, 펩타이드, 핵산 또는 고분자를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 우리딘 및/또는 슈도우리딘에 특이적으로 결합하거나 화학반응을 일으켜 이들 대사체를 검출할 수 있는 기타의 제제들이 본 발명의 범위에 포함될 수 있다.
예를 들어, 상기 대사체를 특이적으로 인지하는 항체를 이용하여 항원-항체 복합체의 양을 측정함으로써 우리딘 및/또는 슈도우리딘을 정량할 수 있다. 여기에서, "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 대사체 마커에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함될 수 있다. 나아가, 본 발명의 항체에는 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체 등의 특수항체도 포함된다. 본 발명에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태 뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
또한, 항원-항체 반응을 이용한 대사체의 정량에는, ELISA(enzyme linked immunosorbent asay), 웨스턴 블랏, 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법(Complement Fixation Assay), FACS(Fluorescence activated cell sorter) 또는 마이크로어레이(microarray) 등의 분석을 이용할 수 있다.
다른 구현예로, 우리딘 및 슈도우리딘으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 대사체의 정량 수단은, 질량분석기(Mass Spectrometer), 크로마토그래피(Chromatography) 기기, 크로마토그래피가 결합된 질량분석기(Chromatography- mass spectrometer), 핵자기공명분광분석기(Nuclear Magnetic Resonance spectrometer), 라만 분광기(Raman spectroscopy), 광흡수분석(light absorption analysis)기 또는 유동주입분석(flow injection analysis)기일 수 있다.
본 발명의 조성물 또는 키트는, 우리딘 및/또는 슈도우리딘의 정량 수단뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다. 또한, 상기 키트는 항체를 이용하는 ELISA 키트, flow-through 키트, 마이크로어레이, 비드, 스트립 또는 칩 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, ELISA 키트의 경우 항원-항체 복합체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 및 발색 기질 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 "시료" 또는 "생물학적 시료"란 모야모야병에 의해 우리딘 및/또는 슈도우리딘의 수준이 차이 나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 또는 소변 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 바람직한 예로는, 소변 시료일 수 있다.
일 구현예로, 본 발명은 개체의 시료로부터 우리딘 및 슈도우리딘으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 대사체를 정량하는 단계, 상기 정량 결과와 정상 대조군의 시료에서의 정량 결과를 비교하는 단계, 및 상기 개체의 시료에서의 우리딘 및 슈도우리딘으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 대사체의 정량 결과 상기 대사체가 정상 대조군 증가한 경우 또는 임계값(cut-off)보다 높은 경우 모야모야병이라고 판정하는 단계를 포함하는, 모야모야병 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
여기에서, 대사체의 정량은 항원-항체 반응을 이용하여 수행될 수 있으며, 예를 들어, ELISA(enzyme linked immunosorbent asay), 웨스턴 블랏, 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법(Complement Fixation Assay), FACS(Fluorescence activated cell sorter) 또는 마이크로어레이 칩(microarray chip) 등의 분석을 이용할 수 있다.
또한, 대사체의 정량은 질량분석법, 크로마토그래피법, 크로마토그래피가 결합된 질량분석법, 핵자기공명분광분석법, 라만 분광기법, 광흡수분석법 또는 유동주입분석법 등을 이용하여 수행될 수 있다.
예를 들어, 고속액체크로마토그래피(HPLC), 액체 크로마토그래피-질량분석(LC-MS), 가스 크로마토그래피-질량분석(GC-MS), 모세관 전기영동-질량분석(CE-MS), 직접 분사(direct infusion) 질량분석(DIMS), 액체 크로마토그래피-이온트랩 질량분석, 적외선 분광분석(FT-IR), 핵자기공명분광분석(NMR), 라만 분광분석, 말디토프 질량분석(MALDI-TOF MS), Triple-토프 질량분석(Triple TOF MS), Quadrupole-토프 질량분석(Q-TOF MS) 또는 이들의 조합을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 당업계에 통상적으로 사용되는 대사체 분석 방법을 사용할 수 있다.
본 발명은 모야모야병 환자의 시료에서 특이적으로 변화하는 저질량 이온의 양을 측정하여 진단하는 대사체 진단법으로서, 간편하고 비침습적이며 정확도가 높고 경제적인 장점을 가지고 있다.
도 1은 Markerview 프로그램을 통한 모야모야병 환자군와 대조군의 Volcano Plot 분석 결과를 나타낸다.
도 2는 저질량 이온 후보물질의 모야모야병 환자군(MMD)과 대조군(Control)에 대한 유의성 평가 박스 플롯(Box plot)을 나타낸다. 세로축은 질량강도(intensity)를 나타낸다.
도 3은 저질량 이온 후보물질의 모야모야병 환자군과 대조군에 대한 유의성 평가 박스 플롯(Box plot)을 나타낸다. 세로축은 질량강도(intensity)를 나타낸다.
도 4는 모야모야병 환자와 대조군에서의 Tiple-TOF MS(mass spectrum) 분석결과를 나타낸다.
도 5는 모야모야병 환자 시료에서의 Tiple-TOF 질량 분석 결과를 나타낸다. 위의 그림은 MS 분석 결과이고, 아래 그림은 MS/MS 분석 결과를 나타낸다.
도 6은 우리딘 및 슈도우리딘의 화학구조를 나타낸다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 모야모야병 환자의 소변 수집 및 전처리
10명의 모야모야병(MMD) 환자 및 10명의 정상인(Control)의 소변을 수집하였다. 분석에 사용한 환자의 정보는 표 1 및 표 2와 같다.
대조군: 10명
연령(세) 6.74 ± 5.14
성별 남성 8명
여성 2명
모야모야병 환자군: 10명
연령(세) 7.90 ± 1.79
성별 남성 6명
여성 4명
시료에서 단백질을 제거하고 대사체를 효과적으로 추출해내기 위하여 Bligh and Dyer method(Bligh,E.G. and Dyer,W.J., Can.J.Biochem.Physiol. 37:911-917, 1959)를 일관적으로 적용하였다. 모든 시료는 수집 후 6시간 내에 전처리하였으며 전처리 전까지 4℃ 에서 보관하였다. 전처리된 시료는 분석 시까지 -80℃에 보관하였다.
실시예 2. 소변 시료에서 Triple - TOF 분석
모야모야병 환자와 정상인 대조군의 소변 시료에 대한 LC-MS/MS(Liquid chromatography-tandem mass spectrometry) 분석을 위하여, DuoSpray ion source를 전단에 부착한 Triple TOF 5600+ system과 접합한 Eksigent ultra LC 110-XL system(AB Sciex)을 이용하였다. ultra LC separation을 위해 시료를 Atlantis T3 sentry guard cartridge(3 m, 2.1 mm x 10 mm; Waters)에 주입하여, two-step linear gradient(solvent A, 0.1% FA in water; solvent B, 100% acetonitrile(ACN); with 1% solvent B for 2min, 1 to 30% B for 6 min, 30 to 90% B for 8 min, 90% B for 4 min, 90 to 1% B for 1 min and 9 min in 1% B)로 Atlantis T3 column(3 m, 2.1 mm x 100 mm; Waters) 에서 수행하였다. MS system은 질량값 구간을 one full scan(50 to 1,200 m/z range) 으로 설정하였고 MS/MS는 10개의 주 parent ion의 mass tolerance를 50 mDa, collision energy를 35%로 최적화 하였다.
실시예 3. 모야모야병 특이적 저질량 이온의 선별
MarkerView software 프로그램을 이용해 모야모야병 환자군과 대조군을 구분하여 Volcano plot을 도출한 후 모야모야병 특이적인 저질량 이온의 후보군(|Log(Fold change)| > 1.0, p-values < 0.05)을 선별하였다. .
실시예 4. 모야모야병 특이적 저질량 이온의 동정
모야모야병 환자의 소변에서 대조군과 비교하여 특이적인 패턴을 보이는 저질량 이온을 동정하기 위하여 인간 대사체 데이터베이스(Human Metabolome Database: HMDB) 와 Triple-TOF MS/MS 분석을 이용하였다. Peakview software를 이용하여 mass-to-charge ratio의 특정 mass tolerance 범위 내에 예상 가능한 elemental composition을 제시해주는 formula finder tool에 MS와 MS/MS 패턴을 적용하였다. 인간 대사체 데이터베이스 HMDB를 이용하여 주어진 m/z에 대한 특정 물질을 찾고 MS, MS/MS 데이터를 토대로 순위별로 리스트를 작성하였다
실시예 5. 통계분석
대조군과 모야모야병 환자군 사이의 상이성은 student's t-test로 평가하였으며, p값이 0.05 미만인 경우를 통계적으로 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
실험 결과
1. 모야모야병 환자와 대조군을 구분하는 저질량 이온 후보값 선정
모야모야병 환자와 대조군의 소변시료를 Plate에 spotting 후 Triple-TOF 분석을 시행하였다. 각 시료에 해당하는 질량 정보를 *.wiff file로 변환 후 MarkerView software를 이용하여 분석하였다. 모야모야병 환자군과 대조군을 총 2개의 그룹으로 나누어 분석한 후 환자군과 대조군을 구분하여 Volcano plot을 도출하였다(도 1). Volcano plot 분석을 통해 p-value < 0.05, |Log(Fold Change)| > 1.0 인 값으로 확인된 저질량 이온 후보를 선별하였다(표 3). 선별된 저질량 이온 후보물질의 판별 유의성을 평가한 결과, 피크값 기준 245.0756 m/z 및 245.0778 m/z 을 가지는 저질량 이온의 발현이 모야모야병 환자군에서 유의적으로 증가한 것으로 나타났다(도 2 및 도 3).
Markerview 프로그램을 통한 모야모야병 환자군과 대조군을 구분하는 저질량 이온값 선별 결과
저질량 이온의 관측 m/z(Exact m/z) Retention Time(min) 모야모야병 환자의 소변 시료 내 발현 정도
245.0756 13.14 High
245.0778 13.31 High
2. 245. 0756 m /z 및 245. 0778 m / z 의 저질량 이온 동정
MS 와 MS/MS 패턴 분석을 이용하여, 245.0756 에서 245.0778 m/z 범위에서 거의 유사한 retention time을 나타내는 대사체를 인간대사체 데이터베이스 HMDB(the Human Metabolome Database)에서 검색하였다. 그 결과, 245.0768 m/z 값을 갖는 두 개의 대사체, 우리딘(uridine) 과 슈도우리딘(pseudouridine)이 동정되었다(표 4, 도 5 및 6). 이 두 대사체는 모야모야병 환자군에서 대조군에 비해 현저히 발현이 증가되어 있었다(도 4).
화학식 m/z RDB ppm MS Rank MSMS
ppm		 MSMS
Rank		 Found HMDB No.
C9H12N2O6 245.0768
 5.0 3.6 1 20.0 1 2 HMDB00296(Uridine)
HMDB00767(Pseudouridine)

Claims (10)

  1. 우리딘(Uridine) 및 슈도우리딘(Pseudouridine)에 특이적인 항체를 포함하는, 모야모야병의 진단용 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 우리딘(Uridine) 및 슈도우리딘(Pseudouridine)에 특이적인 항체를 포함하는, 모야모야병의 진단용 키트.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 개체의 시료로부터 우리딘(Uridine) 및 슈도우리딘(Pseudouridine)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 대사체를 정량하는 단계를 포함하는,
    모야모야병 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 개체의 시료에서의 우리딘 및 슈도우리딘으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 대사체의 정량 결과 상기 대사체가 정상 대조군보다 증가한 경우 모야모야병이라고 판정하는 단계를 더욱 포함하는, 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 대사체를 정량하는 단계는 항원-항체 반응을 이용하는 것인 방법.
  10. 제7항에 있어서, 상기 대사체를 정량하는 단계는 질량분석법, 크로마토그래피법, 크로마토그래피가 결합된 질량분석법, 핵자기공명분광분석법, 라만 분광기법, 광흡수분석법 또는 유동주입분석법을 이용한 것인, 방법.
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