KR101086352B1 - Ｈｓｑｃ ｎｍｒ을 이용한 대사물질 정량 분석 방법 - Google Patents

Ｈｓｑｃ ｎｍｒ을 이용한 대사물질 정량 분석 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 대사물질의 정량 분석 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 내부 기준 물질 및 대사물질(metabolites)을 포함하는 표준 시료에 대해 NMR 분광기를 사용하여 2-차원의 1H-13C HSQC 스펙트럼을 수득하여 대사물질의 농도 대 1H-13C HSQC 피크 강도의 관계식을 수득하여 표준 곡선을 작성하여 상기 표준 곡선을 이용하여 피검 시료에 포함된 대사물질을 정량분석하는 것을 포함하는, 1H-13C HSQC NMR을 이용한 대사물질 정량 분석 방법에 관한 것이다.
대사물질, 정량 분석, 표준 곡선, 핵자기공명 분광법, HSQC

Description

ＨＳＱＣ ＮＭＲ을 이용한 대사물질 정량 분석 방법{Quantitative Analysis Method Of Metabolites Using HSQC NMR}
본원은 대사물질의 정량 분석 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 1H-13C HSQC NMR을 이용하여 대사물질들 각각의 표준 곡선(standard curve)을 수득하고, 상기 표준 곡선을 이용하여 신속하고 용이하고 정확하게 피검시료에 포함된 대사물질의 농도를 정량적으로 분석하는 방법에 관한 것이다.
대사체학은 "특정한 세포의 공정이 남기는 특정한 화학적인 지문의 체계적인 연구"이며, 보다 상세하게는, 작은-분자 대사물질의 프로파일에 대한 연구이다. 대사물총체(metabolome)는 생물학적인 유기체에서 유전자 표현의 모든 최종 생산물의 집합을 나타낸다. 그리하여, 물질 대사의 프로파일링은 체계적인 생리학의 스냅샷을 제공할 수 있다.
다시 말해서, 대사체학은 질병의 발병 및 진행과 관련 있는 대사의 변화를 반영하는 독특한 화학적인 지문을 연구하는 혁신적인 분야로서, 대사체 분야에서 대사물질의 프로파일을 확인함으로써, 일차 및 중간 대사에 참여하는 인간 세포, 조직 또는 장기에 함유된, 소형 분자 또는 대사물질을 측정한다. 대사물질의 분석 결과로 수득되는 생화학적 정보는 유전적 소인 및 영양, 운동 또는 약물과 같은 환경 인자에 의해 영향을 받는, 생리적 및 병태생리적 과정이 관련된 기능적 종말점을 밝혀준다[Harrigan, G. G. & Goodacre, R. (2003) Metabolic profiling: Its role in biomarker discovery and gene function analysis. Kluwer Academic Publishers, Boston/Dordrecht/London; Schmidt, C. (2004), Journal of the National Cancer Institute, 96, 732-734 ; Raudys, S. (2001) Statistical and neural classifiers. Springer-Verlag, London; Daviss, B. (2005) The Scientist, 19, 25-28]. 데이터 확보 방법과 조합하여 대사물질의 프로파일을 확인하는 방법은 임상 진단 및 약물 개발에 혁명을 일으킬 가능성이 있다. 특히, 대형 제약 회사들은 새로운 표적물과 보다 효과적이고 안전한 새로운 화합물의 발견, 바이오 마커 개발 및 약물 개발 진척, 일반적으로 약물의 개발 단가 절감에 대해 지속적인 압력을 받고 있다. 따라서, 이러한 혁신적인 갭을 메우고 향후 장래를 위해 점점 바이오텍 회사에 의존하고 있다. 이와 관련하여, 혁신적인 생물 분석 기법과 데이터 확보 방법은 시장 출시 기간 및 약물 소모율을 감소시킴으로써 비용 절약에 근본적인 역할을 할 것이다.
1-차원(1D) 1H 핵자기공명(NMR) 분광법이 소형 분자들을 확인하고 정량하는 분석적인 도구로 널리 사용되어 왔다. 최소 피크 오버랩을 보이는 샘플들에 대하여, 피크 강도와 농도가 선형 관계를 유지하기 때문에 1D 1H NMR은 채용될 수 있다.
최근에는 대사 수준으로 복잡한 생물학적 과정들에 대해 NMR을 사용한 고-효율 분석이 큰 관심을 받아 왔다. 그러나, 이러한 연구는 1D 1H NMR에 의존하며, 불가피하게 넓은 피크 오버랩을 나타낸다. 통계적 기술들이 스펙트럼 데이터를 생물학적 정보로 해석하기 위해 발전되어 왔는데, 상기 통계적 방법은 전체로서 스펙트럼 밀도를 사용하므로, 각각의 대사물질의 정확한 정량화를 제공하지는 못하였다. 여러 방법들이 이 문제를 해결하기 위해 발전되었으나, 공개된 출원들의 대부분은 정성 분석에 머물러 있다. 따라서, 대사물질들의 신속하고 정확한 정량 분석 방법의 개발이 필요하다.
상기한 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은, 1H-13C HSQC NMR을 이용하여 대사물질들 각각의 표준 곡선을 수득하고, 상기 표준 곡선을 이용하여 신속하고 용이하고 정확하게 피검시료에 포함된 대사물질을 정량적으로 분석하는 방법을 제공하고자 한다.
그러나, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은, 내부 기준 물질 (HEPES) 및 대사물질을 포함하는 표준 시료를 준비하는 단계; 상기 표준 시료에 포함된 내부 기준 물질 및 대사물질에 대해 NMR (Nuclear Magnetic Resonance, 핵자기공명) 분광기를 사용하여 2-차원의 1H-13C HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence, 이종핵 단일 양자 코히어런스) 스펙트럼을 수득하는 단계; 상기 표준 시료에 포함된 대사물질의 농도에 대한 1H-13C HSQC 피크 강도를 나타내는 그래프를 작성하여 최소자승법(least square method)으로 상기 대사물질에 대한 농도 대 1H-13C HSQC 피크 강도의 관계식을 수득하여 표준 곡선을 작성하는 단계; 대사물질을 포함하는 피검 시료에 대해 NMR 분광기를 사용하여 2-차원의 1H-13C HSQC 스펙트럼을 수득하는 단계; 및 상기 수득된 피검 시료의 1H-13C HSQC 스펙트럼의 피크 위치 및 피크 강도 값을 이용하여 상기 표준 곡선으로부터 상기 피검 시료에 포함된 대사물질의 종류 및 농도를 계산하는 단계를 포함하는, 1H-13C HSQC NMR을 이용한 대사물질 정량 분석 방법을 제공한다.
상기 본 발명에 따르면, 1H-13C HSQC NMR을 이용하여 대사물질들 각각의 표준 곡선을 수득하고 상기 표준 곡선을 이용하여 피검 시료 내 대사물질의 농도를 신속하면서 용이하고 정확하게 정량화할 수 있다.
이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 구현예 및 실시예를 상세히 설명한다.
그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 구현예 및 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.
상기 본 발명의 일 측면에 있어서, 1H-13C HSQC NMR을 이용한 대사물질 정량 분석 방법은 하기를 포함할 수 있다:
내부 기준 물질 및 대사물질을 포함하는 표준 시료를 준비하는 단계,
상기 표준 시료에 포함된 내부 기준 물질 및 대사물질에 대해 NMR 분광기를 사용하여 2-차원의 1H-13C HSQC 스펙트럼을 수득하는 단계,
상기 표준 시료에 포함된 대사물질의 농도에 대한 1H-13C HSQC 피크 강도를 나타내는 그래프를 작성하여 최소자승법으로 상기 대사물질에 대한 농도 대 1H-13C HSQC 피크 강도의 관계식을 수득하여 표준 곡선을 작성하는 단계,
대사물질을 포함하는 피검 시료에 대해 NMR 분광기를 사용하여 2-차원의 1H-13C HSQC 스펙트럼을 수득하는 단계, 및
상기 수득된 피검 시료의 1H-13C HSQC 스펙트럼의 피크 위치 및 피크 강도 값을 이용하여 상기 표준 곡선으로부터 상기 피검 시료에 포함된 대사물질의 종류 및 농도를 계산하는 단계.
상기 본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 1H-13C HSQC NMR을 이용한 대사물질 정량 분석 방법은, 상기 표준 시료는 하기 대사물질들의 4 개 그룹의 각각을 포함하는 4 개의 시료로서 준비되며, 상기 4 개의 표준 시료 각각에 대하여 NMR 분광 기를 사용하여 2-차원의 1H-13C HSQC 스펙트럼을 수득하여 상기 4 개의 표준 시료에 포함된 대사물질들 각각에 대하여 표준 곡선을 작성하는 것을 포함할 수 있다:
제 1 그룹: 4-아미노부티레이트, 아데노신, 알라닌, AMP (Adenosine monophosphate), 아스라파진, 아스파르테이트, 베타인, 콜린, 시트레이트, 시트룰린, 크리에이틴, 에타놀아민, 과당, 글루타민산염, 산화된-글루타티온, 히스티딘, 호모세린, 이소루신, 유산염, 루신, 라이신, 말산염, 메티오닌, 미오-이노시톨, NAD, 페닌알라닌, 프롤린, 세린, 타르타레이트, 트랜스-4-히드록시프롤린, 트레할로스, 트립토판 및 발린 포함;
제 2 그룹: ADP(Adenosine diphosphate), 아르기닌, 카나바닌, 카르니틴, 시스테인, 갈락토즈, 환원된-글루타티온, 글리신, 마노즈, 숙신산염, 자당, 타우린 및 트레오닌 포함;
제 3 그룹: 글리세롤, 글루타민, 글루코스, 푸트리신(1,4 디아미노부탄), 아세트산, 우리딘 및 베타인 포함;
제 4 그룹: MES, 오리니틴, 트레할로스 및 말토오스 포함.
상기 본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 내부 기준 물질이 HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)이며 상기 HEPES의 1H-13C HSQC NMR 스펙트럼의 피크들 중 시료의 pH 및 농도 변화 등에 대하여 영향을 받지 않는 피크를 대사물질 각각의 농도 계산 시 내부 기준 물질로 사용할 수 있다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 표준 시료로서 서로 다른 농 도의 3 개 이상의 표준 시료를 사용할 수 있다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 표준 시료 및 피검 시료가 중성 상태로 pH가 조절된 것일 수 있다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 대사물질들은 그룹별로 나뉘어지며, 상기 그룹별로 특정 피크를 정하는 단계를 포함할 수 있다
상기 본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 표준시료 및 피검시료는 100% D2O 용매를 포함하며, DSS 및 아지드화 나트륨을 추가 포함할 수 있다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 표준 곡선은 상기 각 대사물질의 농도 대 1H-13C HSQC NMR 스펙트럼의 피크 강도에 대한 상관 관계를 나타내는 것이다.
상기 표준 곡선 작성 시 사용되는 상기 각 대사물질의 1H-13C HSQC NMR 스펙트럼의 피크로서 상기 표준시료에 포함된 대사물질 각각에 대하여, 1H-13C HSQC NMR 스펙트럼 수득 시 사용되는 NMR 분광기, 대사물질의 농도, 상기 표준 시료의 pH 등에 대하여 피크 강도의 편차가 최소이고, 각 대사물질의 농도와 피크 강도의 상관관계가 선형 관계인 피크를 선택할 수 있다.
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 좀더 자세히 설명하지만, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다.
(1) 표준 시료의 준비
대사물질의 4 개의 그룹을 이용하여 각 그룹을 포함하는 표준 시료를 준비하여 상기 표준시료에 포함된 각 대사물질에 대하여 1H-13C HSQC NMR 스펙트럼을 측정하였다. 상기 각 그룹을 포함하는 표준시료는 3가지의 서로 다른 농도, 즉, 각각 2, 5, 및 10 mM 농도를 포함하는 것으로 준비되었다. 대사물질의 4 개의 그룹은 다음과 같다. 제 1 그룹은 4-아미노부티레이트, 아데노신, 알라닌, 아데노신1이산(AMP), 아스라파진, 아스파르테이트, 베타인, 콜린, 시트레이트, 시트룰린, 크리에이틴, 에타놀아민, 과당, 글루타민산염, 산화된- 글루타티온, 히스티딘, 호모세린, 이소루신, 유산염, 루신, 라이신, 말산염, 메티오닌, 미오-이노시톨, NAD(nicotinamide adenine dinucleotide), 페닌알라닌, 프롤린, 세린, 타르타레이트, 트랜스-4-히드록시프롤린, 트레할로스, 트립토판 및 발린을 포함하였다. 제 2 그룹은 아데노신2인산(ADP), 아르기닌, 카나바닌, 카르니틴, 시스테인, 칼락토즈, 환원된-글루타티온, 글리신, 마노즈, 숙신산염, 자당, 타우린 및 트레오닌을 포함하였다. 제 3 그룹은 글리세롤, 글루타민, 글루코스, 푸트리신(1,4 디아미노부탄), 아세트산, 우리딘 및 베타인을 포함하였다. 제 4 그룹은 MES(2-[N-morpholino]ethanesulfonic acid), 오리니틴, 트레할로스 및 말토오스를 포함하였 다.
각 표준 시료는 상기 합성 대사물질의 혼합물 외에도 100% D2O 내에 5 mM HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid), 0.5 mM DSS (2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate) 및 0.5 mM 아지드화 나트륨을 포함하였다. 상기 표준 시료 용액의 pH는 NaOD 또는 DCl을 사용하여 상기 혼합물에 대해 7.4로 조절하였다.
(2) NMR 스펙트럼 측정 및 데이터 처리
NMR은 Bruker DMX 600 (이하, '제조사 A'라 함) 또는 Varian Unity Inova 600 ((이하, '제조사 B'라 함) 의 NMR 분광기를 이용하여 수행되었다. 상기 두 개의 분광기는 트리플-공명[1H, 13C, 15N, 2H 락(lock)] 극저온의 프로브를 갖추었다. 감도가 향상된 1H-13C HSQC 스펙트럼은 제조사 A(또는 제조사 B) 의 기기에 대해 4 스캔, 128(또는 512) 증가분, 및 GARP 디커플링을 사용하여 수집되었다. 스펙트럼 폭은 1H 에 대해 13 ppm과 13C에 대해 100ppm이었다. 탄소 캐리어 주파수는 55 ppm에서 설정되었다.
모든 스펙트럼은 nmrPipe [J. Biomol. NMR 6, 277-293, 1995]과 Sparky 소프트웨어[T. D, Goddard, and D. G. Kneller, SPARKY 3, University of California, San Francisco]를 각각 사용하여 프로세스되고 시각화되었다. 선택된 피크는 무료 통계 소프트웨어 패키지(http://www.r-project.org)인 R로 쓰여진 FMQ 스크립트(Ian Lewis, personal communication)를 사용하여, 대사물질을 확인하기 위해 MMCD(http://mmcd.nmrfam.wisc.edu)에 대한 적절한 포맷으로 전환되었다. 상기 스크립트, FMQ는 MMCD와 Sparky 사이에 적절한 인터페이스)을 제공하였고, FMQ는 Sparky에 대한 프로젝트를 생성했고, 스펙트럼 비교는 오버랩 기능에 의해 촉진되었다. 합성 대사물질의 공명의 강도는 Sparky를 사용하여 측정되어 실제 농도와 비교되었다. 표준 곡선은 마이크로소프트 엑셀을 사용하여 생성되었다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 HEPES에 대한 제조사 A, B로부터 측정된 1H-13C HSQC 스펙트럼을 나타내는 그래프이다.
HEPES의 동일한 농도(5 mM)를 포함하므로, HEPES 공명의 강도는 서로 유사하게 나타나야 할 것이다. 많은 대사물질들이 이온화 되어 시료의 이온 세기 (ionic strength)가 증가한다는 것을 고려한다면, 어느 정도의 오차를 또한 예상할 수 있다. 도면 1은 내부 일관성에 대한 HEPES 공명을 보여 준다. 1-결합 커플링을 보여주는 피크를 외에, 2-결합 커플링으로부터 나오는 인위 구조(artifacts)를 또한 확인할 수 있었다.
하기 표 1은 도 1에 있어서 HEPES가 보이는 4개의 피크에 대한 농도 대 피크 강도를 보여 준다.
Figure 112009035673210-pat00001
HEPES의 농도 대 피크 강도: 상대 편차(relative variation)는 평균 강도(상대적 임의의 단위)에 대한 표준 편차(standard deviation)의 퍼센트로 정의됨.
상기 표 1을 참조하면, 더 작은 편차(variation)을 보여 주는 공명은 제조사 A에 대해서는 피크 #2와 #3이고, 제조사 B 분광기에 대해서는 피크 #3이다. 피크 #1과 #4는 pH에 의존하기 때문에 더 큰 편차를 보여 준다. HEPES 공명의 pH 의존성은 까다로운 문제일 수 있으나, 그것은 시료가 잘 적정되었는지를 보여주는 지표이기 때문에 실제적으로는 유용하다.
상기 피크 강도에 관해 가장 일관성 있는 피크는 피크 #3이다. 따라서, 제조사 A 또는 제조사 B 분광기로부터 대사물질의 농도를 계산할 때, 내부 기준 물질들(internal standards)에 대하여 HEPES 공명 중 상기 피크 #3을 사용할 수 있다. 표 1을 참조하면, 제조사 A 분광기로부터의 피크들은 제조사 B에서의 피크들과 유사하거나 그보다 작은 편차를 보여 주는데, 특히, 제조사 B로부터의 피크 #2의 피크 강도 편차는 제조사 A로부터의 피크의 거의 6배임을 알 수 있다.
(3) 대사물질 ADP 의 표준 곡선
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 ADP에 대한 제조사 A, B로부터 1H-13C HSQC 스펙트럼을 나타내는 그래프이다. ADP가 보이는 피크는 6개 이다.
도 2를 참조하면, ADP로부터의 공명들(resonances)을 포함하는 확장된 영역을 보여 준다. t1의 증가분들이 두 분광기에서 다르기 때문에, 제조사 B 데이터의 피크 형태가 수직 방향으로 더 단단해(tighter) 보인다. 두 스펙트럼은 피크 형태를 제외하면 매우 유사하나, 피크 강도를 분석해 보면 현격한 차이를 확인할 수 있다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 ADP에 대한 제조사 A, B로부터 피크 강도 대 농도 그래프이다.
도 3을 참조하면, 제조사 B 데이터가 보다 덜 정렬된 반면, 제조사 A 데이터는 원점을 향하여 좋은 선형 회귀 라인(linear regression line)을 보여 주고 있다. 실제로 제조사 B 데이터로부터의 6개 공명들의 평균 상관값이 0.9978인 반면, 제조사 A 데이터로부터 6개 공명들의 평균 상관값(R2)은 0.9995보다 큰 값이었다.
농도가 0으로 갈 때, 피크 강도가 0으로 수렴해야 한다는 것을 고려한다면, 현재 실시예에서 제조사 A 분광기가 더 좋은 데이터를 제공했다는 것을 알 수 있다.
그럼에도 불구하고, 표준 곡선을 선택하기 위해 제조사 A와 제조사 B 분광기 모두에서 0.999보다 큰 R2 값과 0에 가까운 y-절편을 보여주는 그래프를 선택한다면, 실제 추출물에서 ADP의 농도를 결정하기 위해 어느 하나의 분광기로부터의 데이터를 사용할 수 있다. 상기 기준으로 판단할 때, 정량화를 위한 가장 신뢰성이 있는 후보는 공명 #3이라고 결론지을 수 있다.
이에, 상기 ADP의 피크 #3을 사용하여 ADP의 농도 대 피크 강도의 표준 곡선을 작성하였으며, 상기 표준 곡선을 이용하여 피검 시료에 포함된 ADP의 농도를 신속하고 용이하게 정량할 수 있다.
또한, 상기와 같은 과정에 의하여, 다른 대사물질들 각각의 결정적(critical) 공명 시그널을 동정하고, 각 대사물질의 표준 곡선을 작성할 수 있으며, 이러한 각 대사물질의 표준 곡선을 이용하여 피검 시료에 포함된 대사물질의 농도를 신속하고 용이하게 정량할 수 있다.
이와 관련하여, 하기 표 2는 본 발명의 실시예에 따라, 다양한 대사물질 각각에 대해 2-차원의 1H-13C HSQC 스펙트럼을 측정한 후, 상기 스펙트럼을 분석하여 각 대사물질의 결정적(critical) 공명 시그널을 나타내는 표이다.
Figure 112009035673210-pat00002
Figure 112009035673210-pat00003
도 4 내지 도 56는 본 발명의 실시예에 따라, 각 대사물질에 대해 1H-13C HSQC 스펙트럼 및 이를 이용하여 수득된 결정적 피크에 대해 표준 곡선을 작성한 그래프이다. 여기서, 도 4 내지 도 35는 제 1 그룹에 대한 1H-13C HSQC 스펙트럼 및 그의 표준 곡선이고, 도 36 내지 도 46는 제 2 그룹에 대한 1H-13C HSQC 스펙트럼 및 그의 표준 곡선이고, 도 47 내지 도 53는 제 3 그룹에 대한 1H-13C HSQC 스펙트럼 및 그의 표준 곡선이고, 도 54 내지 도 56은 제 4 그룹에 대한 1H-13C HSQC 스펙트럼 및 그의 표준 곡선이다.
도 4 내지 도 56의 상단에 위치한 도면은 각 시료에 대한 1H-13C HSQC 스펙트럼이며, 이를 분석하여 상기 HEPES 또는 ADP 시료에서 설명한 바와 같이, 각 대사물질 시료에 대해 1H-13C HSQC 스펙트럼에서 결정적 피크를 정하였다. 그리고, 각 그룹 내 각 대사물질의 상기 결정적 피크 값은 상기 표 2에서 나타내었다.
이후, 상기 ADP의 표준 곡선을 작성하는 과정과 동일하게, 각 대사물질의 결정적 피크에 대하여 농도 대 피크 강도의 표준 곡선을 작성한다.
상기와 같은 과정에 의하여 수득된 각 대사물질의 표준 곡선을 이용하여 피검 시료에 포함된 대사물질의 농도를 신속하고 용이하게 정량할 수 있다.
이상, 실시예를 들어 본 발명을 상세하게 설명하였으나, 본 발명은 상기 실시예들에 한정되지 않으며, 여러 가지 다양한 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 기술적 사상 내에서 당 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의하여 여러 가지 많은 변형이 가능함이 명백하다.
도 1은 본 발명의 실시예에 있어서 제조사 A, B의 NMR 분광기로부터 측정된 HEPES의 1H-13C HSQC 스펙트럼이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 있어서 제조사 A, B의 NMR 분광기로부터 측정된 ADP의 1H-13C HSQC 스펙트럼이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 있어서 제조사 A, B의 NMR 분광기로부터 측정된 1H-13C HSQC 스펙트럼의 피크 강도 대 농도를 나타내는 그래프이다.
도 4 내지 도 56은 본 발명의 실시예에 따라, 각 대사물질에 대한 1H-13C HSQC 스펙트럼 및 이를 이용하여 작성된 표준 곡선이다.

Claims (5)

  1. 하기를 포함하는, 1H-13C HSQC NMR을 이용한 대사물질 정량 분석 방법:
    내부 기준 물질(internal standard) 및 대사물질(metabolites)을 포함하는 표준 시료를 준비하는 단계,
    상기 표준 시료에 포함된 내부 기준 물질 및 대사물질에 대해 NMR (Nuclear Magnetic Resonance, 핵자기공명) 분광기를 사용하여 2-차원의 1H-13C HSQC 스펙트럼을 수득하는 단계,
    상기 표준 시료에 포함된 대사물질의 농도에 대한 1H-13C HSQC 피크 강도를 나타내는 그래프를 작성하여 최소자승법 (least square method)으로 상기 대사물질에 대한 농도 대 1H-13C HSQC 피크 강도의 관계식을 수득하여 표준 곡선을 작성하는 단계,
    대사물질을 포함하는 피검 시료에 대해 NMR 분광기를 사용하여 2-차원의 1H-13C HSQC 스펙트럼을 수득하는 단계, 및
    상기 수득된 피검 시료의 1H-13C HSQC 스펙트럼의 피크 위치 및 피크 강도 값을 이용하여 상기 표준 곡선으로부터 상기 피검 시료에 포함된 대사물질의 종류 및 농도를 계산하는 단계:
    여기에서, 상기 내부 기준 물질은 HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)이며,
    상기 대사물질은 하기 4개 그룹의 각각을 포함하는 것임:
    제 1 그룹: 4-아미노부티레이트, 아데노신, 알라닌, AMP, 아스라파진, 아스파르테이트, 베타인, 콜린, 시트레이트, 시트룰린, 크리에이틴, 에타놀아민, 과당, 글루타민산염, 산화된-글루타티온, 히스티딘, 호모세린, 이소루신, 유산염, 루신, 라이신, 말산염, 메티오닌, 미오-이노시톨, NAD, 페닌알라닌, 프롤린, 세린, 타르타레이트, 트랜스-4-히드록시프롤린, 트레할로스, 트립토판 및 발린 포함;
    제 2 그룹: ADP, 아르기닌, 카나바닌, 카르니틴, 시스테인, 갈락토즈, 환원된-글루타티온, 글리신, 마노즈, 숙신산염, 자당, 타우린 및 트레오닌 포함;
    제 3 그룹: 글리세롤, 글루타민, 글루코스, 푸트리신(1,4 디아미노부탄), 아세트산, 우리딘 및 베타인 포함;
    제 4 그룹: MES, 오리니틴, 트레할로스 및 말토오스 포함.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 표준 시료는 상기 대사물질들의 4개 그룹의 각각을 포함하는 4개의 시료로서 준비되며, 상기 4개의 표준 시료 각각에 대하여 NMR 분광기를 사용하여 2-차원의 1H-13C HSQC 스펙트럼을 수득하여 상기 4개의 표준 시료에 포함된 대사물질들 각각에 대하여 표준 곡선을 작성하는 것인, 1H-13C HSQC NMR을 이용한 대사물질 정량 분석 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 내부 기준 물질인 상기 HEPES의 1H-13C HSQC NMR 스펙트럼의 피크들 중 시료의 pH 및 농도 변화에 대하여 영향을 받지 않는 피크를 대사물질 각각의 농도 계산 시 내부 표준으로서 사용하는 것인, 1H-13C HSQC NMR을 이용한 대사물질 정량 분석 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 표준 시료로서 서로 다른 농도의 3개 이상의 표준 시료를 사용하는 것인, 1H-13C HSQC NMR을 이용한 대사물질 정량 분석 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 표준 시료 및 피검 시료가 중성 상태로 pH가 조절된 것인, 1H-13C HSQC NMR을 이용한 대사물질 정량 분석 방법.
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