KR101694267B1 - 핵자기공명 분광법을 이용한 스테로이드의 감식 및 정량방법 - Google Patents

핵자기공명 분광법을 이용한 스테로이드의 감식 및 정량방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 핵자기공명 분광법을 이용한 스테로이드의 감식 및 정량방법으로서, 기준물질, 희석액 및 감별대상 물질을 혼합하여 감별용 시료를 준비하는 단계(1); 핵자기공명 분광법(NMR)을 이용하여 상기 감별용 시료의 스펙트럼을 측정하여 검색키 데이터로 사용할 화학적 이동(Chemical shift, δ)값 및 그 강도(peak intensity)를 얻는 단계(2); 표준품 스테로이드 검색키 데이터 중에서 상기 감별용 시료의 검색키 데이터와 중첩되는 화학적 이동값을 마커(marker)로 정하는 단계(3); 및 상기 정해진 마커의 수를 통해 상기 감별대상 물질이 스테로이드를 포함하는지 여부를 결정하는 단계(4);를 포함한다. 상기 표준품 스테로이드 검색키 데이터는 표준품 스테로이드의 NMR 스펙트럼을 측정하여 얻은 스테로이드 화합물 고유의 화학적 이동값 및 그 강도이다.

Description

핵자기공명 분광법을 이용한 스테로이드의 감식 및 정량방법 {A METHOD FOR IDENTIFYING AND QUANTITATING STEROIDS USING NUCLEAR MAGNETIC RESONANCE SPECTROSCOPY}
본 발명은 핵자기공명 분광법(Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, NMR)을 이용한 스테로이드의 감식 및 정량방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 스테로이드류 화합물의 1H NMR 스펙트럼으로부터 스테로이드 고유의 화학적 이동(chemical shift, δ)값들을 데이터화하여 스테로이드를 식별할 수 있는 마커로 활용함으로써, 시중에 유통되고 있는 화장품 및 의약품 등에 첨가되어 있을 수 있는 스테로이드의 존재여부를 감식하고, 더 나아가 스테로이드 성분의 함량을 측정할 수 있는 기술에 관한 것이다.
스테로이드(steroid) 또는, 코르티코스테로이드(corticosteroid)는 탁월한 항염증 작용과 면역억제 작용 때문에 치료용 피부 의약품으로 사용되고 있으며, 많은 관심을 얻고 있다. 임상학적 치료약으로서 스테로이드는 환자의 건선이나 습진과 같은 피부질환, 류마티스성 관절염, 특히 소아나 어린이등에서 많이 발병되는 아토피 피부염 등과 같은 질환을 아주 효과적으로 치료할 수 있다.
그러나, 이러한 긍정적인 치료 효과와 함께 무분별한 사용으로 인한 부작용 또한 심각한 수준이라 할 수 있다. 스테로이드는 혈당치 상승, 근육축소, 고지혈증, 면역력 약화, 혈압상승, 의인성 쿠싱 증후군 및 부신피질 기능 저하 등과 같은 여러가지 문제들을 야기할 수 있다. 따라서, 의사의 처방과 감독 하에 적정량을 사용해야 한다.
하지만, 스테로이드류를 화장품이나 의약품류에 불법적으로 첨가하는 사례가 계속해서 증가하고 있어, 스테로이드를 신속하고 정확하게 감식하는 기술의 개발이 요구되고 있는 실정이다.
현재의 분석기술로는 60 여종의 스테로이드류를 분석하고 정량하는데 많은 시간과 경비가 소요된다. 스테로이드류의 분석방법에는 HPLC(High Performance Liquid Chromatography), LC/MS(Liquid Chromatography-MS Spectrometry), GC(Gas Chromatography), GC/MS(Gas Chromatography-Mass Spectrometry) 등 다양한 분석 장비가 이용되고 있으며, 질량 분석기(Mass Spectrometry)가 장착된 장비들은 분석의 정확성과 정밀성은 우수하나, 시료의 전처리와 분석 전문가를 필요로 하며, 분석 시간을 상당히 필요로 하는 단점이 있다.
본 발명의 목적은 스테로이드의 감식방법을 제공하는 것으로, 핵자기공명 분광기(NMR)를 이용하여 스테로이드 및 코르티코스테로이드 첨가가 의심되는 시료나 제품에서 스테로이드의 함유여부 및 종류를 감식하고 정량하는 기술을 제공하는 것이다.
본 발명은 이러한 목적을 달성하여, 기준물질, 희석액 및 감별대상 물질을 혼합하여 감별용 시료를 준비하는 단계(1);
핵자기공명 분광법(NMR)을 이용하여 상기 감별용 시료의 스펙트럼을 측정하여 검색키 데이터로 사용할 화학적 이동(Chemical shift, δ)값 및 그 강도(peak intensity)를 얻는 단계(2);
표준품 스테로이드 검색키 데이터 중에서 상기 감별용 시료의 검색키 데이터와 중첩되는 화학적 이동값을 마커(marker)로 정하는 단계(3); 및
상기 정해진 마커의 수를 통해 상기 감별대상 물질이 스테로이드를 포함하는지 여부를 결정하는 단계(4);를 포함하는 스테로이드의 감식방법을 제공한다.
상기 표준품 스테로이드 검색키 데이터는 표준품 스테로이드의 NMR 스펙트럼을 측정하여 얻은 스테로이드 화합물 고유의 화학적 이동값 및 그 강도이다.
핵자기공명 분광기(NMR)를 이용한 분석법은 자기장 속에 놓인 원자핵이 특정 주파수의 전자기파와 공명할 때 나타나는 현상을 이용하여 분자 내에서 화학구조적 및 자기환경적으로 서로 다른 수소의 종류와 수소의 갯수에 대한 정보를 알 수 있는 분석 방법이다. 따라서, 핵자기공명 분광기를 이용하면, 시료 내의 수소가 존재하는 주변의 화학적, 자기적 환경에 대한 정보를 제공하므로, 알려져 있지 않은 분자의 성분 및 구조를 규명하는데 충분한 정보를 줄 수도 있는 분석 방법이다.
스테로이드는 하기 구조식 1에 나타낸 바와 같이 사이크로헥실 고리 셋에 사이클로펜틸 고리 하나가 붙은 통칭 스테로이드 핵구조를 갖는 화합물의 총칭으로, 코로티코스테로이드, 성호르몬, 아나볼릭 스테로이드 등의 유형으로 분류될 수 있다.
[구조식 1]
Figure 112015100380079-pat00001
상기 표준품 스테로이드 검색키 데이터는 이러한 스테로이드 고유의 골격구조를 식별할 수 있는 화학적 이동값 및 그 강도를 의미하는 것으로, 이를 감별대상 물질의 데이터와 비교함으로써 감별대상 물질 내 스테로이드의 존재여부를 식별할 수 있는 것이다. 즉, 상기 단계(2)에서 얻은 감별용 시료의 검색키 데이터와 표준품 스테로이드 검색키 데이터를 비교하여, 피크가 중첩되는 위치의 화학적 이동값을 마커로 정하고, 정해진 마커의 개수가 4개 이상, 좋기로는 6개 이상, 더욱 좋기로는 8개 이상일 경우 스테로이드가 함유된 것으로 인정한다. 검색키 데이터 추출, 데이터 비교를 통한 마커 선정, 및 스테로이드 함유 여부 결정은 모두 컴퓨터 프로그램에 의해 자동으로 수행될 수 있다.
스테로이드 검색키 데이터 중에서 어떤 값들은 치환기(-R)에 의해서 영향을 받지 않으므로 유형과 관계없이 고정되나, 치환기(-R) 근처에 있는 수소의 경우, 스테로이드 유형에 따라 화학적 이동값이 다르다. 따라서, 60여종의 서로 다른 스테로이드에 대하여 공통되는 화학적 이동값들이 존재하지만, 각 유형별로 구별되는 화학적 이동값도 존재한다. 그러므로, 각 유형의 스테로이드 검색키 데이터는 서로 다른 조합의 화학적 이동값을 갖는다.
이러한 특성을 고려하여, 본 발명에서는 예를 들어 하나의 감별용 시료에 대하여 어떤 표준품 스테로이드의 검색키 데이터와 비교해서 마커의 개수가 4개 내지 8개이면, 일단 스테로이드가 존재하는 것으로 인정한다. 나아가, 구체적인 스테로이드의 유형을 알고자 하면, 또다른 유형의 표준품 스테로이드 검색키 데이터와 비교해 보고, 마커의 수가 더 커지는 경우 해당 스테로이드는 구조가 더욱 유사한 스테로이드임을 알 수 있게 되며, 특히 마커의 수가 8개 이상인 경우에는 해당 유형의 스테로이드라고 인정한다. 이러한 방식으로 본 발명에 따른 감식방법은 스테로이드의 함유여부뿐만 아니라 종류까지 감식해 낼 수 있다.
상기 기준물질은 메틸수소를 분자 내에 포함하는 테트라메틸실란(Tetramethylsilane: TMS)일 수 있으며, 이 경우 상기 감별용 시료 및 표준품 스테로이드의 스펙트럼에 나타나는 화학적 이동값은 TMS의 메틸수소에 대한 화학적 이동값을 0 ppm으로 하여 나타낸 것이다.
상기 희석액은 메탄올-d4, 에탄올-d6, 산화중수소(Deuterium oxide), 아세토니트릴-d3, 아세톤-d6 중에서 선택된 것이며, 상기 감별용 시료의 스펙트럼 및 표준품 스테로이드의 스펙트럼은 감별대상 물질 및 스테로이드를 각각 0.001 내지 100 중량%로 희석한 용액을 사용하여 측정된다.
상기 기준물질이 테트라메틸실란인 경우, 즉 테트라메틸실란의 메틸수소에 대한 화학적 이동값을 기준(0 ppm)으로 할 때, 검색키 데이터는 NMR 스펙트럼 중 0.5 내지 8.0 ppm 범위에 존재하는 데이터이다.
기준물질이 테트라메틸실란인 경우, 상기 표준품 스테로이드 검색키 데이터는 스테로이드 고유의 화학적 이동값인 7.37 ppm, 6.29 ppm, 6.09 ppm, 4.20 ppm, 1.60 ppm, 1.58 ppm, 1.22 ppm 및 0.89 ppm을 포함할 수 있다. 이는 각각 2번 수소, 1번 수소, 4번 수소, 11번 수소, 12번 수소, 19번 수소, 16번 수소, 18번 수소의 화학적 이동값에 해당한다.
상기 단계(4)에서 감별대상 물질이 스테로이드를 포함한다고 결정되는 경우, 단계(4)에 이어서 스테로이드 함량을 결정하는 단계(5)을 더 포함할 수 있다. 단계(5)에서는 마커 중에서 선택된 하나의 화학적 이동값에 대한 감별용 시료의 피크 강도를 사전에 정해진 정량곡선에 대입하여 스테로이드의 함량을 얻을 수 있다. 여기서, 정량곡선은 스테로이드 함량에 따른 피크 강도의 상관관계를 함수로 나타낸 것으로, 각 화학적 이동값에 따라 서로 다른 함수로 얻어질 수 있다. 상기 정량곡선은 내부표준물질인 0.05% TMS의 피크 강도에 대한 해당 마커의 피크 강도의 비(ratio)를 이용하는 내부표준 분석법에 의하여 만들어지는 것이다. 감별용 시료의 데이터에서 내부표준물질의 피크 강도와 선택된 화학적 이동에 대한 피크 강도의 비를 대입하면 감별용 시료 내의 스테로이드 함량을 알 수 있다.
예를 들어, 기준물질 및 내부표준물질이 테트라메틸실란인 경우, 상기 정량곡선은 마커 중의 화학적 이동값 1.11 ppm에 대하여 y = 0.0002x + 0.00032 이며, 감별용 시료의 데이터에서 내부표준물질의 피크 강도와 1.11 ppm에서의 피크 강도의 비를 y에 대입하면 x ppm(μg/ml)로 스테로이드 함량을 얻을 수 있다. 또한, 마커 중의 화학적 이동값 1.13 ppm에 대하여 y = 0.0002x - 0.00027 이며, 감별용 시료의 데이터에서 내부표준물질의 피크 강도와 1.13 ppm에서의 피크 강도의 비를 y에 대입하면 x ppm(μg/ml)로 스테로이드 함량을 얻을 수 있다.
또는, 감별용 시료 내의 스테로이드 함량은 다음과 같은 식을 통해 구할 수도 있다.
미지의 농도(μg/ml)= 표준품의 농도(μg/ml) x [(시료의 해당 마커와 용매내 포함된 TMS 피크 면적비)/ (표준품 해당 마커와 용매내 포함된 TMS 피크 면적비)] x [용매의 부피(ml)/시료의 무게(g)]
상술한 바와 같은 본 발명에 따른 핵자기공명분광기를 이용한 스테로이드의 감식방법을 이용하면, 의약품이나 화장품과 같은 감별대상 물질에 스테로이드가 함유되어 있는지 여부 및 함량뿐만 아니라, 함유된 스테로이드의 종류를 알 수 있으며, 복잡한 전처리 과정을 거치지 않고 신속하면서 정확하게 감식할 수 있는 장점이 있다.
도 1은 실시예 1에서 표준품 클로베타솔 프로피오네이트(clobetasol propionate)의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 2는 실시예 1에서 표준품 클로베타솔 프로피오네이트[A] 및 시료 1[B]의 1H NMR 스펙트럼을 비교하여 나타낸 도면이다.
도 3은 실시예 1에서 클로베타솔 프로피오네이트의 H25에 해당하는 화학적 이동에 있어서 클로베타솔 프로피오네이트 함량에 따른 상관관계를 나타낸 그래프이다.
도 4는 실시예 2에서 표준품 트리암실론 아세토니드(triamcinolone acetonide)의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 5는 실시예 2에서 표준품 트리암실론 아세토니드[A] 및 시료 2[B]의 1H NMR 스펙트럼을 비교하여 나타낸 도면이다.
도 6은 실시예 2에서 트리암실론 아세토니드의 H19에 해당하는 화학적 이동에 있어서 트리암실론 아세토니드 함량에 따른 상관관계를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
실시예 1: 클로베타솔 프로피오네이트의 감식
코르티코스테로이드의 일종인 클로베타솔 프로피오네이트(Sigma-aldrich, clobetasol propionate)를 0.05% TMS의 메탄올-d4(δ, 4.76 ppm) 용액에 용해시켜 각각 10, 50, 100, 500 및 1000 ppm의 농도로 표준품 클로베타솔 프로피오네이트 용액을 제조하였다.
감별대상 물질(이하, '시료 1'이라 함)로서 시중에 유통되고 있는 화장품 약 1 g을 0.05% TMS의 메탄올-d4 용액에 용해시킨 다음, 원심 분리하고 상층액을 취하여 감별용 시료로 사용하였다.
상기 준비한 표준품 클로베타솔 프로피오네이트 용액 및 시료 1에 대하여 각각 핵자기공명 분광기 FT-NMR 600 MHz (Agilent사 제품)를 이용하여 25℃의 온도에서 1H NMR을 측정하였다. 측정 횟수는 32회였고, TMS의 메틸수소 피크의 화학적 이동(δ)을 0 ppm으로 정하여 표준품 클로베타솔 프로피오네이트 용액과 시료 1에서 각 피크들의 화학적 이동 파라미터를 얻었다.
도 1은 클로베타솔 프로피오네이트의 분자구조 및 1H NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다. 도 1에서 별표와 함께 번호가 기재된 피크들은 클로베타솔 프로피오네이트의 특징적 피크들 중의 일부를 예로 들어 표시한 것이다. 여기서, 각 번호는 도면의 분자구조에 표시된 수소원자(proton, 1H)의 위치를 의미한다. 도 1에 표시된 검색키 데이터는 다음과 같다: H2번(δ, 7.37 ppm), H1번(δ, 6.29 ppm), H4번(δ, 6.09 ppm), 메탄올-d4, H11번(δ, 4.20 ppm), H21번(δ, 4.01 ppm), H24번(δ, 2.10 ppm), H12번(δ, 1.60 ppm), H19번(δ, 1.58 ppm), H22번(δ, 1.35 ppm), H16번(δ, 1.22 ppm), H25번(δ, 1.11 ppm), H18번(δ, 0.89 ppm).
도 2는 클로베타솔 프로피오네이트[A] 및 시료 1[B]의 1H NMR 스펙트럼을 비교하여 나타내었다. 도 2를 보면, 마커로 선정될 수 있는 화학적 이동값이 전혀 없음을 알 수 있다. 즉, 예시적으로 표시한 4개의 클로베타솔 프로피오네이트의 화학적 이동값은 모두 시료 1의 화학적 이동값과 일치하지 않았다. 이와 같이, 시료 1의 검색키 데이터 중에는 클로베타솔 프로피이오네이트의 검색키 데이터와 중첩되는 부분이 없으므로, 정해진 마커의 수는 0이며, 이를 통해 시료 1 내에 클로베타솔 프로피오네이트가 함유되어 있지 않음을 알 수 있다.
본 실시예에서는 시료 1에 대하여 마커가 정해지지 않았지만, 예를 들어 만일 마커들이 정해진다면 그 중에서도 H21번, H22번, H25번 및 H18번은 정량곡선을 얻기에 적합하다. 도 3은 클로베타솔 프로피오네이트의 H25번(δ, 1.11 ppm)에서의 농도에 따른 정량그래프를 작성한 것이다. 25번 피크에 대한 농도 변화에 따른 피크강도의 상관관계는 y = 0.0002x + 0.00032 (r2 = 0.976)으로 매우 높은 상관관계를 갖고 있음을 확인할 수 있다.
실시예 2: 트리암실론 아세토니드니드의 감식
코르티코스테로이드의 일종인 트리암실론 아세토니드(Sigma-aldrich, Triamicinolone acetonide)를 0.05% TMS의 메탄올-d4(δ, 4.76 ppm) 용액에 용해시켜 각각 10, 50, 100, 500 및 1000 ppm의 농도로 표준품 트리암실론 아세토니드 용액을 제조하였다.
감별대상 물질(이하, '시료 2'이라 함)로서 시중에 유통되고 있는 피부용 연고제 약 1 g을 0.05% TMS의 메탄올-d4 용액에 용해시킨 다음, 원심 분리하고 상층액을 취하여 감별용 시료로 사용하였다.
상기 준비한 표준품 트리암실론 아세토니드 용액 및 시료 2에 대하여 각각 핵자기공명 분광기 FT-NMR 600 MHz (Agilent사 제품)를 이용하여 25℃의 온도에서 1H NMR을 측정하였다. 측정 횟수는 32회였고, TMS의 메틸수소 피크의 화학적 이동(δ)을 0 ppm으로 정하여 표준품 트리암실론 아세토니드 용액과 시료 2에서 각 피크들의 화학적 이동 파라미터를 얻었다.
도 4는 표준품 트리암실론 아세토니드의 1H NMR 스펙트럼으로서, 트리암실론 아세토니드의 검색키 데이터 중 일부의 번호를 표시하였다. 도 4에 표시된 검색키 데이터는 다음과 같다: H2번(δ, 7.37 ppm), H1번(δ, 6.29 ppm), H4번(δ, 6.09 ppm), H16번(δ, 5.10 ppm), Methonol-d4, H11번(δ, 4.20 ppm), H23번(δ, 1.38 ppm), H19번(δ, 1.13 ppm), H18번(δ, 0.89 ppm).
도 5는 트리암실론 아세토니드[A]와 시료 2[B]의 1H NMR 스펙트럼을 비교하여 나타낸 것이다. 도 5를 보면, 시료 2의 검색키 데이터 중에는 트리암실론 아세토니드의 검색키 데이터와 8개의 화학적 이동값에서 중첩되므로, 정해진 마커의 수는 8이며, 이를 통해 시료 2 내에 트리암실론 아세토니드가 함유되어 있음을 알 수 있다. 마커로 선정된 화학적 이동은 H2번, H1번, H4번, H16번, H11번, H23번, H19번, H18번이었다.
상기 마커 중에서 특히 H23번, H19번, H18번은 정량곡선을 위한 마커로 사용될 수 있다. 도 6은 트리암실론 아세토니드의 H19번(δ, 1.13 ppm)에서의 농도에 따른 정량그래프를 작성한 것이다. 19번 피크에 대한 농도 변화에 따른 피크강도의 상관관계는 y = 0.0002x + 0.00027 (r2 = 0.9992)으로 매우 높은 상관관계를 갖고 있음을 확인할 수 있다.
도 5에서 화학적 이동값 1.13 ppm (H19번)에 해당하는 시료 2의 피크 강도를 도 6의 정량곡선에 대입한 결과, 트리암실론 아세토니드의 함량을 10 ppm으로 얻었다.
도 5에서 H23번은 트리암실론 아세토니드 특유의 화학적 이동으로, 이는 또다른 코르티코스테로이드인 클로베타솔 프로피오네이트에는 나타나지 않는 화학적 이동이다 (도 1 참조). 이는 트리암실론 아세토니드가 코르티코스테로이드 기본구조는 공유하지만 트리암실론 아세토니드의 고유 치환기에 따른 구별되는 화학적 이동값을 갖기 때문이다. 따라서, 시료 2에 포함된 스테로이드는 트리암실론 아세토니드임을 확인할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

Claims (10)

  1. 기준물질, 희석액 및 감별대상 물질을 혼합하여 감별용 시료를 준비하는 단계(1);
    핵자기공명 분광법(NMR)을 이용하여 상기 감별용 시료의 스펙트럼을 측정하여 검색키 데이터로 사용할 화학적 이동(Chemical shift, δ)값 및 그 강도(peak intensity)를 얻는 단계(2);
    표준품 스테로이드 검색키 데이터 중에서 상기 감별용 시료의 검색키 데이터와 피크가 중첩되는 위치의 화학적 이동값을 마커(marker)로 정하는 단계(3); 및
    상기 정해진 마커의 수를 통해 상기 감별대상 물질이 스테로이드를 포함하는지 여부를 결정하는 단계(4);를 포함하고,
    상기 표준품 스테로이드 검색키 데이터는 표준품 스테로이드의 NMR 스펙트럼을 측정하여 얻은 스테로이드 화합물 고유의 화학적 이동값 및 그 강도이고,
    상기 단계(4)는 마커가 4개 이상 존재할 경우 감별대상 물질이 스테로이드를 포함한다고 결정하는 것인 스테로이드의 감식방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 기준물질은 메틸수소를 분자 내에 포함하는 테트라메틸실란(Tetramethylsilane, TMS)인 것인 스테로이드의 감식방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 희석액은 메탄올-d4, 에탄올-d6, 산화중수소(Deuterium oxide), 아세토니트릴-d3, 아세톤-d6 중에서 선택된 것이며, 상기 감별용 시료의 스펙트럼 및 표준품 스테로이드의 스펙트럼은 감별대상 물질 및 스테로이드를 각각 0.001 내지 100 중량%로 희석한 용액을 사용하여 측정된 것인, 스테로이드의 감식방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 기준물질이 테트라메틸실란인 경우, 상기 표준품 스테로이드 검색키 데이터는 스테로이드 고유의 화학적 이동값인 7.37 ppm, 6.29 ppm, 6.09 ppm, 4.20 ppm, 1.60 ppm, 1.58 ppm, 1.22 ppm 및 0.89 ppm을 포함하는 것인 스테로이드의 감식방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 단계(4)에서 감별대상 물질이 스테로이드를 포함한다고 결정되는 경우, 마커 중에서 선택된 하나의 화학적 이동값에 대한 감별용 시료의 피크 강도를 사전에 정해진 정량곡선에 대입하여 스테로이드의 함량을 얻는 단계(5)를 더 포함하는 것인 스테로이드의 감식방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 기준물질은 메틸수소를 분자 내에 포함하는 테트라메틸실란이고, 상기 정량곡선은 내부표준물질의 피크 강도에 대한 마커의 피크 강도의 비를 이용하는 내부표준 분석법으로 만들어진 것인 스테로이드의 감식방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 기준물질 및 내부표준물질이 테트라메틸실란인 경우, 상기 정량곡선은 마커의 화학적 이동값 1.11 ppm에 대하여 y = 0.0002x + 0.00032 이며, 감별용 시료의 데이터에서 내부표준물질의 피크 강도와 1.11 ppm에서의 피크 강도의 비를 y에 대입하면 x ppm(μg/ml)로 스테로이드 함량을 얻는 것인 스테로이드의 감식방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 기준물질 및 내부표준물질이 테트라메틸실란인 경우, 상기 정량곡선은 마커의 화학적 이동값 1.13 ppm에 대하여 y = 0.0002x - 0.00027 이며, 감별용 시료의 데이터에서 내부표준물질의 피크 강도와 1.13 ppm에서의 피크 강도의 비를 y에 대입하면 x ppm(μg/ml)로 스테로이드 함량을 얻는 것인 스테로이드의 감식방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 스테로이드는 성호르몬, 아나볼릭 스테로이드 및 코르티코스테로이드를 포함하는 것인 스테로이드의 감식방법.
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