KR101587612B1

KR101587612B1 - 피노카베올을 유효성분으로 포함하는 탈모 예방 또는 치료용, 또는 발모 또는 육모 촉진용 조성물

Info

Publication number: KR101587612B1
Application number: KR1020150144036A
Authority: KR
Inventors: 박태선
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2015-10-15
Filing date: 2015-10-15
Publication date: 2016-01-21

Abstract

본 발명은 탈모 예방 또는 치료용, 또는 발모 또는 육모 촉진용 약제학적 조성물; 탈모 개선, 또는 발모 또는 육모 촉진용 화장료 조성물, 기능성 식품 조성물 또는 식품 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 조성물은 만성질환인 탈모에 있어서 장기 투여시에도 부작용이 없는 천연 화합물을 유효성분으로 하고 있을 뿐만 아니라, 발모 및 육모에 뛰어나고 안정적인 효능을 보여 효율적인 탈모 예방 또는 치료제, 또는 발모 또는 육모 촉진용 화장료/기능성 식품/식품 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

피노카베올을 유효성분으로 포함하는 탈모 예방 또는 치료용, 또는 발모 또는 육모 촉진용 조성물{Composition for Preventing or Treating Hair Loss or Stimulating Hair Sprouting or Hair Growth Comprising Pinocarveol as Active Ingredients}

본 발명은 피노카베올(pinocarveol)을 유효성분으로 포함하는 탈모 예방 또는 치료용, 또는 발모 또는 육모 촉진용 조성물에 관한 것이다.

국민건강보험공단 건강보험정책연구원이 2001년부터 2008년까지 건강보험 진료비 지급자료를 분석한 내용에 따르면‘탈모질환’의 실진료 환자수가 2001년 10만3천명에서 2005년 14만2천명, 그리고 2008년 16만5천명으로 나타나, 최근 7년 동안 60% 증가하였다. 연령별로는 20~40대 실진료 환자수가 11만4천명으로 환자의 69.5%를 차지하였으며, 10대 이하 환자도 2만2천명 이상인 것으로 나타났다. 성별 실진료 환자수는 2008년 기준으로 남성이 8만 4천명이고 여성은 8만명으로 나타나 남성이 여성보다 약간 더 많은 실정이며,‘탈모’ 질환의 상병별 국내 건강보험 실진료 환자수는 2008년 기준으로 원형탈모증(13만명), 흉터성탈모증(2만명), 안드로젠성탈모증(9천명), 기타 비흉터성모발손실(8천명) 순으로 나타났다.

해외의 탈모환자 유병율을 살펴보면, 2003년 6월 국제 모발 및 성형미용 연구토론회 자료에 따르면 전세계적으로 2.5억명이 탈모환자이며, 24-50세에서 탈모 발병율이 30-65% 정도로 나타났다. 2008년 기준으로 중국의 탈모인구는 약 3억 명에 이르며, 30대 남성인구의 30%, 그리고 50대 남성인구의 50%정도가 탈모 증세를 나타내고 있으며 매년 탈모 환자수는 10-15%정도 증가하고 있다. 일본인의 경우 탈모 발병율이 26.5%이며, 추정 탈모환자 인구수는 1,293만명 정도로 예상되었다.

현재 탈모치료를 위한 제제는 크게 의약품과 의약외품, 그리고 화장품으로 분류된다. 의사의 처방이 있어야 구입이 가능한 전문의약품에는 미국 Merck사에서 개발 판매하고 있는‘프로페시아’가 있으며, 이의 주성분인 피나스테라이드(Finasteride)는 1997년 12월 미국 FDA로부터 탈모치료제 승인을 받았다. 피나스테라이드는 테스토스테론을 디하이드로테스토스테론(dihydrotestosterone, DHT)로 전환하는 5-α-리덕테이즈 효소를 억제하는 약제로서 연모를 굵고 긴 모발로 성장하게 하는 역할을 한다. 이는 단기적으로 탈모개선에 효과가 있으나 발기부전, 성기능 감퇴, 남성의 유방비대 등과 같은 부작용이 보고되고 있다. 안전성과 유효성이 인정되어 의사의 처방 없이도 구입이 가능한 약품으로 미녹시딜(Minoxidil)이 있으며, 1997년 12월 미국 FDA로부터 최초의 바르는 탈모 치료제로 승인되었다. 이 약품은 혈액순환을 개선시키고 칼륨 채널을 개방시킴으로써 모발성장을 촉진시키는 효과가 있으나 가려움, 발진 등 국소반응이 올 수 있으며, 빈맥 등이 나타날 수 있다.

식약청에서 탈모 방지와 육모 기능을 허가 받은 의약외품 제품에는 대표적으로 CJ 라이온의‘모발력 컴피턴트’, 모라클의 ‘헤어토닉’, LG생활건강의 ‘모앤모아’등이 있으며, 화장품류로는 샴푸류 또는 피부, 모발의 건강을 유지 또는 증진하기 위해 두피나 모발에 사용되는 제품이 판매되고 있다.

사람의 탈모주기는 크게 성장기(anagen), 퇴행기(catagen) 및 휴지기 (telogen)로 구분된다. 성장기는 모유도의 활동이 활발하면서 세포분열이 왕성하게 일어나 모발이 빠른 속도로 자라는 시기이다. 성장기의 수명은 털의 종류마다 다르지만 머리카락의 경우, 3-6년 정도이다. 성장기 모발은 전체모발의 80-90%를 차지하며, 탈모가 진행되고 있는 사람은 성장기가 짧아지고 휴지기가 긴 모발주기를 가지게 되어 전체모발에서 성장기 모발의 비중이 감소하게 된다. 퇴행기는 모발의 성장기가 끝나고 모발 생성이 점차 느려져 결국 세포분열 및 성장이 멈추는 시기로 퇴행기의 수명은 1-1.5개월 정도이며 전체 모발의 1% 정도가 이 단계에 속한다. 휴지기는 성장의 마지막 단계로서 모낭과 모유두가 완전히 분리되어 모낭은 위축되고 모근은 더욱 위쪽으로 올라가 머리카락이 빠지는 단계이다. 휴지기는 3-4개월간 지속되고 전체모발의 4-14%가 이 단계에 해당된다. 휴지기가 끝나고 다시 모유두의 활동이 활발해지면, 새로운 모발의 모유두가 만들어지면서 휴지기에 있던 모발은 밀려나서 완전히 두피 밖으로 빠져나오게 된다.

피노카베올은 바이사이클릭 모노터핀계 화합물로서 IUPAC 명칭은 6,6-디메틸-2-메틸렌바이사이클로[3,1,1]헵탄-3-올(6,6-dimethyl-2-methylenebicyclo[3,1,1]heptan-3-ol)이다. 구조식은 C₁₀H₁₆O이고, 분자량은 152.2 g/mol이다. 투명한 연노랑색의 액체이며 물에는 녹지 않고 기름과 에탄올에 용해된다. 피노카베올은 착향료로 사용되며 나무향(woody), 시원한 민트향(cooling minty), 소나무향(pine-like)을 내고, 식용가능한 안전한 물질로 알려져 있으며, FEMA(Flavor and Extract Manufacturers’Association), FDA(Food and Drug Administration), KFDA(Korea Food and Drug Administration), EC(European Community), JECFA(Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives)에 착향료(flavor and fragrance agents) 성분으로 승인되어 있고, 산업적으로 맛과 향을 내기 위한 목적으로 이용되어 왔다. 그러나 피노카베올의 탈모 방지 또는 발모 촉진 활성에 대한 보고는 전무한 상태이다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자는 부작용 없이 탈모를 방지하거나 발모 또는 육모를 촉진시킬 수 있는 천연유래 화합물을 발굴하기 위하여 예의 연구노력하였다. 그 결과, 피노카베올이 효과적으로 발모 및 육모를 증진하고 탈모를 방지한다는 사실을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 피노카베올을 유효성분으로 포함하는 탈모 예방 또는 치료용, 또는 발모 또는 육모 촉진용 약제학적 조성물; 탈모 개선용, 또는 발모 또는 육모 촉진용 화장료 조성물; 및 탈모 개선용, 또는 발모 또는 육모 촉진용 기능성 식품 조성물 또는 식품 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 피노카베올을 유효성분으로 포함하는 탈모 예방 또는 치료용, 또는 발모 또는 육모 촉진용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명자는 부작용 없이 탈모를 방지하거나 발모 또는 육모를 촉진시킬 수 있는 천연유래 화합물을 발굴하기 위하여 예의 연구노력하였다. 그 결과, 피노카베올이 효과적으로 발모 및 육모를 증진하고 탈모를 방지한다는 사실을 확인하였다.

본 명세서의 용어 “탈모”는 모발이 완전히 두피 밖으로 빠져나오게 되는 현상을 의미한다. 탈모가 진행되고 있는 사람은 성장기가 짧아지고 휴지기가 긴 모발주기를 가지게 되는데, 하기 실시예에서 입증한 바와 같이 피노카베올은 모발을 휴지기에서 성장기로 전환시키고(도 1), 피부조직에서 발모 및 양모와 관련된 성장인자의 발현을 증가시키는바(도 4a, 4b 및 5a 내지 5c) 탈모를 예방, 개선 또는 치료 효과가 있음을 확인하였다.

본 명세서의 용어 “발모”는 두피에서 모발이 나는 것을 의미하고, 본 명세서의 용어 “육모”는 모발의 길이가 길어지는 것(즉, 모발 성장)을 의미하며 당업계에서 이용하는 또 다른 용어인 “양모”와 동일한 의미로 사용된다. 하기 실시예에서 입증한 바와 같이 피노카베올은 음성대조군에 비하여 털의 성장을 촉진하고(도 1), 털 길이가 55% 증가하였으며(도 2), 모낭의 수 및 직경을 증가시키고(도 3a 내지 3c), 피부조직에서 발모 및 양모와 관련된 성장인자의 발현을 증가시키는바(도 4a, 4b 및 5a 내지 5c) 발모 또는 육모 촉진 효과가 있음을 확인하였다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 피노카베올은 트랜스-피노카베올이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 피노카베올은 (-)-트랜스-피노카베올이다.

본 발명의 피노카베올은 약제학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있다.

구체적으로는, 본 발명의 피노카베올의 약제학적 허용 가능한 염은 염산염, 브롬산염, 황산염, 인산염, 구연산염, 아세트산염, 트리플루오로아세트산염, 젖산염, 주석산염, 말레인산염, 푸마린산염, 글루콘산염, 메탄설폰산염, 글리콘산염, 숙신산염, 4-톨루엔설폰산염, 글루투론산염, 엠본산염, 글루탐산염, 또는 아스파트산염으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당업계에서 통상적으로 사용되는 다양한 무기산 및 유기산을 이용하여 형성되는 염이 모두 포함된다. 또한, 본 발명의 화합물은 용매화물(예를 들면 수화물)의 형태로도 존재할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 Wnt10b(Wigless related MMTV integration site 10b), FZD1(Frizzled receptor 1), LRP5(Low-density lipoprotein receptor-related protein 5), IGF1(Insulin-like growth factor 1), β-카테닌, VEGF(vascular endothelial growth factor), HGF(hepatocyte growth factor) 및 KGF(keratocyte growth facfor)로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질의 발현을 증가시킨다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 GSK3β(glycogen synthase kinase 3β) 또는 Axin의 발현을 감소시킨다. 본 발명자들은 본 발명의 조성물이 피부조직에서 발모 및 양모에 영향을 주는 성장인자인 IGF1, VEGF, HGF 및 KGF의 발현을 증가시킬 뿐만 아니라, Wnt/β-카테닌 신호전달물질인 Wnt10b, FZD1, LRP5 및 β-카테닌 발현 역시 증가시키며, Wnt10b에 의해 발현이 억제되는 GSK3β와 Axin의 발현은 감소시킴을 확인함으로써 모낭의발생및모발성장에중추적역할을하는것으로밝혀진Wnt/β-카테닌신호전달계를활성화시킴을 확인하여 본 발명의 조성물이 발모 및 양모를 촉진함을 분자적 수준에서 확인하였다(도 5a 내지 5c). 따라서, 본 발명의 조성물은 다각적이고 안정적인 발모 및 양모 촉진 효능을 보이는 효율적인 발모 또는 양모제 조성물로 적용될 수 있다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 조성물은 탈모 예방 또는 치료용, 또는 발모 또는 육모 촉진용 약제학적 조성물로 제조될 수 있다. 본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 본 발명의 일 구현예에 따르면 비경구 방식으로 투여되고, 본 발명의 다른 구현예에 따르면 경피투여방식으로 투여된다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 성인 기준으로 0.0001-100 ㎎/kg 범위 내이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 피노카베올을 유효성분으로 포함하는 탈모 개선용, 또는 발모 또는 육모 촉진용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 피노카베올 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 피노카베올을 유효성분으로 포함하는 탈모 개선용, 또는 발모 또는 육모 촉진용 기능성 식품 조성물 또는 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물이 기능성 식품 조성물 또는 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로서 피노카베올 뿐만 아니라, 기능성 식품 또는 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라 이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트 린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제[타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스 파르탐 등)를 사용할 수 있다.

본 발명의 기능성 식품 또는 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 유효성분인 세코이리도이드 글루코사이드 유도체 또는 이의 가수분해 산물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액 또는 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

본 발명의 화장료, 기능성 식품 및 식품 조성물은 상술한 약제학적 조성물과 유효성분 및 용도를 공통으로 하기 때문에, 상기 약제학적 조성물과의 관계에서 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 탈모 예방 또는 치료용, 또는 발모 또는 육모 촉진용 약제학적 조성물; 탈모 개선, 또는 발모 또는 육모 촉진용 화장료 조성물, 기능성 식품 조성물 또는 식품 조성물을 제공한다.

(b) 본 발명의 조성물은 만성질환인 탈모에 있어서 장기 투여시에도 부작용이 없는 천연 화합물을 유효성분으로 하고 있을 뿐만 아니라, 발모 및 육모에 뛰어나고 안정적인 효능을 보여 효율적인 탈모 예방 또는 치료제, 또는 발모 또는 육모 촉진용 화장료/기능성 식품/식품 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 제모를 한 마우스 모델에서 각 시료의 투여일 수가 경과함에 따른 모발의 재성장을 관찰한 결과를 나타낸 그림이다.
도 2는 각 시료를 도포한 마우스에서 실험기간 동안에 성장한 털 길이를 표시한 그래프이다. 각 값들은 8마리 마우스의 평균±표준오차이다. * = p < 0.05, ** = p < 0.01[일원 분산분석(one-way ANOVA), Tukey's 시험].
도 3은 각 시료를 4주 간 도포한 마우스 등 피부를 조직학적으로 관찰한 결과를 나타낸다. 도 3a는 모낭 수 증가를 확인한 결과이고, 도 3b는 모낭 직경을 평가한 결과이며, 도 3c는 모낭의 피부 표출 현상을 나타낸 사진이다. 각 값들은 8마리 마우스의 평균±표준오차이다. ns = p > 0.05, ** = p < 0.01[일원 분산분석(one-way ANOVA), Tukey's 시험].
도 4는 각 시료를 도포한 마우스 등 피부조직의 단백질 발현변화를 나타낸다. 도 4a는 면역조직학적 결과이고, 도 4b는 웨스턴 블롯 결과이다. 웨스턴 블롯 결과는 각 군에서 독립된 3번의 실험의 평균±표준오차이다(각 실험에 대하여 n=2 또는 3). ns = p > 0.05, ** = p < 0.01[일원 분산분석(one-way ANOVA), Tukey's 시험].
도 5는 각 시료를 도포한 마우스 등 피부조직의 유전자 발현변화를 나타낸 그림이다. 웨스턴 블롯 결과는 각 군에서 독립된 3번의 실험의 평균±표준오차이다(각 실험에 대하여 n=2 또는 3). ns = p > 0.05, ** = p < 0.01, *** = p < 0.001[일원 분산분석(one-way ANOVA), Tukey's 시험].

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 피노카베올의 발모촉진 효능

1-1. 실험동물의 사육 및 시료의 도포

시료의 준비

비이클(Vehichle)(에탄올:물:프로필렌 글리콜=5:3:2), 대조약물인 미녹시딜(MXD), 시험물질인 피노카베올은 시그마알드리치(주)에서 구입하였다.

실험동물의 사육

생후 6주령 된 수컷 C57BL/6N 마우스 12마리를 오리엔트바이오(주)로부터 구입하여 2주간 사육실 환경에 적응시킨 후, 음성대조군(Con군), 양성대조군(MXD군) 및 피노카베올군(PNC군)의 총 3개의 군으로 나누어 실험에 사용하였다. 동물사육실은 온도 21±2.0℃, 상대습도 50±5%로, 12시간씩 밤낮 주기 환경으로 유지하였다. 실험기간 동안 상기 마우스에 일반 고형사료(chow) 및 물을 자유로이 공급하였다.

시료의 피부 도포 및 육안적 관찰 방법

탈모 방지, 발모 또는 양모 효과를 살펴보기 위해, 등쪽 피부의 색이 핑크색을 보이는 휴지기 체모의 8주령 마우스를 사용하였다. 마우스용 클리퍼(clipper)를 사용하여 마우스 등판의 털을 제거한 후, 매일 오후 4시에 1회씩 4주간 각 시료를 도포하였다. 실험물질인 피노카베올(3 mg/마우스/일)과 대조약물로 사용된 미녹시딜(3 mgmg/마우스/일)은 비이클(에탄올:물:프로필렌 글리콜=5:3:2)에 용해시켜 도포하였고, 음성대조군에는 비이클만을 도포하였다.

털이 자라는 상태를 육안적으로 확인하기 위하여 도포를 시작하고 1주, 2주, 3주 및 4주가 경과한 시점에 에테르로 실험동물을 가볍게 마취한 후 등 부분을 사진 촬영하였다. 털이 자란 정도를 평가하기 위해 눈금자를 이용하여 털 길이를 측정하였다.

1-2. 체중 변화의 측정

시료 도포 직전부터 도포가 종료되는 시점까지 실험동물의 체중을 매주 측정하였다. 음성대조군(Con군)과 시험군(PNC군) 및 양성대조군(MXD군)의 초기 체중은 군 간에 모두 유의적인 차이가 없었으며, 도포 4주 후에 측정된 체중 역시 실험군 간에 유의한 차이가 없었다.

1-3. 발모 상태 및 헤어길이의 변화 측정

발모의 육안적 특징

마우스의 등 부위에 시료를 4주간 도포하면서 매주 털이 자라는 양상을 사진을 찍어 확인하였다. 휴지기(Telogen)에 들어간 마우스는 제모를 하였을 때 체표면의 색이 분홍색을 띄었다. 음성대조군(Con군)의 경우, 3주 후에도 거의 털이 자라지 않았으나, PNC군에서는 도포 3주차부터 털이 자라기 시작하여 체표면 색이 검정색으로 변해 모발 주기가 휴지기에서 성장기(anagen)로 진입하였으며, 4주 후에는 음성대조군에 비해 더 많은 개체 수에서 고르고 왕성하게 털이 자라나는 것을 관찰할 수 있었다(도 1).

털 길이의 변화

실험기간(4주) 동안에 매주 털의 길이를 측정하였다. PNC군의 털 길이는 3주차부터 음성대조군에 비해 유의적으로 증가하였으며, 4주 후에는 음성대조군에 비해 55% 증가하였다(도 2). 따라서 피노카베올은 모발의 성장을 촉진하는 효과가 탁월한 것을 알 수 있다.

1-4. 등 피부의 조직학적 분석

각 시료의 도포 4주 후 실험동물을 희생시키고, 시험물질을 도포한 부위를 중심으로 등 피부조직 시료를 가위와 포셉을 이용하여 적출한 후 포르말린(formalin)으로 고정하였다. 단계별로 알코올과 자일렌으로 탈수처리한 후 파라핀으로 포매하고, 마이크로톰을 이용하여 5 μm의 절편을 만들어 다시 알코올과 자일렌으로 파라핀을 제거하였다. 헤마톡실린-에오신(H&E: Hematoxylin-Eosin) 염색을 실시한 후 광학현미경으로 모낭조직의 조직학적 변화를 관찰하였다. 병리검경 담당자가 검경하여 발모주기를 평가하였고, 광학현미경 상에서 모낭(hair follicle)의 수량 및 직경을 측정하였다.

각 시험군의 모낭수를 40 배율의 광학현미경 하에서 측정한 결과는 도 3에 나타내었다. PNC군과 MXD군의 경우 음성대조군에 비하여 모낭의 수가 유의적으로 증가하였다(도 3a). 이미지 분석을 통하여 각 시험군의 모낭 직경을 평가한 결과, 음성대조군에 비하여 PNC군과 MXD군에서 유의적으로 증가하였다(도 3b). 또한, PNC군과 MXD군에서는 모낭이 길어져서 피부로 표출되어 있는 현상이 관찰되어 피노카베올 및 미녹시딜의 발모 촉진효과를 확인할 수 있었다(도 3c).

실시예 2: 피노카베올에 의한 마우스 피부조직의 단백질 및 유전자 발현 조절

2-1. 피부조직에서의 모발 관련 단백질 발현 변화

면역조직학적 분석방법

최근 Wnt/β-카테닌 등과같은세포내신호전달활성인자등이모발 성장및탈락에역할을하는 것이 밝혀지면서 상기 인자가 탈모억제및모발성장촉진용약물의 새로운 타겟으로주목을 받고 있다. 따라서 4주간의 시료 도포에 의해 등 피부조직에서 탈모 방지 및 발모(또는 육모)를 촉진시키는데 관여하는 Wnt/β-카테닌신호전달체계가 활성화되었는지 확인하기 위하여 면역조직화학적 방법으로 조사하였다.

피부조직에서 모발 성장과 관련된 IGF1과 β-카테닌의 발현양을 관찰하기 위하여, IGF1과 β-카테닌에 대한 1차 항체를 각각 1:50으로 희석한 후 조직절편에 가하고 실온에서 12시간 동안 반응시켰다. 1차 항체의 희석은 0.1M 포스페이트 완충액(PB)에 1% 정상 고트 혈청(Vector Laboratories Inc.)과 0.3% Triton X-100(Sigma)을 혼합하여 사용하였다. 조직절편을 실온에서 15분간 2회 0.1M PB로 세척하고, 다시 1:200으로 희석된 2차 항체[비오틴화 항-래빗 IgG(Vector Laboratories Inc.)]와 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 다시 0.1M PB로 15분간 2회의 수세과정을 거친 후 퍼옥시다아제가 표지된 ABC(avidin-biotin complexex) 용액에 담가 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후 다시 0.1M PB로 15분간 2회 수세하고 30 mg의 3-3′디아미노벤지딘(diaminobenzidine)을 150 ml의 0.1M PB에 녹인 용액에서 5분간 반응시킨 후 과산화수소를 0.005% 농도로 첨가하여 약 5분간 갈색 발색반응을 시행하였다. 반응이 끝난 조직들은 다시 0.1M PB로 여러 차례 수세하고 헤마톡실린으로 20초간 대조염색 한 후, 통상적인 방법에 따라 탈수와 투명화를 거친 후 봉입하여 광학현미경으로 관찰하였다.

그 결과, PNC군의 경우 음성대조군에 비해 β-카테닌 및 IGF1이 더 많이 검출되었다. 이와 같은 피노카베올에 의한 등 피부조직의 β-카테닌 및 IGF1 발현증가 효과는 미녹시딜에 비해 더 탁월한 것으로 관찰되었다(도 4a).

웨스턴 블롯 분석법

막자사발에 일정량의 피부조직을 액체질소 및 용해 완충액과 함께 균질화 시킨 후, 13,000×g, 4℃에서 20분간 원심분리한 후 가운데 층을 취하고 Bradford 법에 의해 단백질을 정량하였다. 50 μg의 단백질을 SDS 폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel)에 전기 영동시킨 후 PVDF 하이퍼 필름에 전기 블롯팅(electroblotting)하고 해당 항체, β-카테닌, β-액틴(모두 Cell-signaling Technology 사, 미국)와 각기 반응시켰다. 각 단백질의 신호를 화학발광 검출 시스템(chemiluminescent detection system, Amersham)으로 가시화한 후 밴드의 두께를 Quantity One Analysis Software(Bo-Rad Laboratories)를 사용하여 정량화하였다.

그 결과, PNC군의 경우 음성대조군에 비해 β-카테닌 단백질 발현이 유의하게 증가하였음이 관찰되었다(도 4b).

2-1. 피부조직에서 모발 관련 유전자 발현 분석

트리졸 방법(Trizol method)를 이용한 RNA 분리

실험동물의 피부조직에서 총 RNA를 분석 정량하기 위하여 피부조직 50-100 mg에 트리졸 용액 1 mL을 넣고 균질화한 다음 4℃, 12,000×g에서 10분간 원심분리하였다. 상층액을 새 튜브로 옮긴 후 클로로포름 200 μL를 첨가하고, 볼텍싱하였다. 이 과정을 두 번 반복한 다음, 상층액을 새 튜브로 옮긴 후 이소프로판올과 상층액을 1:1 비율로 첨가하였다. 10회 세게 흔든 다음 실온에서 10분 동안 방치한 후, 12,000×g, 4℃에서 10분 간 원심분리시킨 후 상층액을 제거하고, 남은 침전물에 70% 에탄올 1 ml을 가하여 7,500×g, 4℃에서 5분 동안 원심분리하였다. 에탄올을 제거한 후 RNA 침전물이 담긴 튜브를 실온에서 5분 동안 건조시키고, 핵산가수분해효소가 없는 물(nuclease free water)을 사용하여 RNA 침전물을 용해시켰다. UV/VIS 분광광도계(Beckman coulter, DU730)를 이용하여 260 nm 및 280 nm 파장에서 추출된 RNA 시료의 농도를 측정하고, 아가로스겔 전기영동를 실시하여 RNA 시료의 보전(integrity)을 확인하였다.

RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) 방법

RNA를 분리한 후 올리고 dT 프라이머와 Superscript 역전사 효소(GIBCOBRL, Gaithersburg, 미국)를 이용하여 역전사를 수행함으로써 cDNA를 합성하였다. 역전사를 통해 얻은 cDNA를 주형으로 하고, 증폭하고자 하는 유전자의 cDNA의 5’과 3’측면 서열(flanking sequence)을 프라이머로 사용하여 PCR을 수행하였다. 이때 필요한 프라이머는 (주)바이오니아에 합성을 의뢰하여 사용하였고, 이들 프라이머 서열은 하기의 표 1에 표시하였다. 10X 반응 완충액[100 mM KCL, 20 mM Tris-HCL(pH 8.0), 2.5 mM MgCl₂] 5 μL, 10 mM dNTP 4 μL, 0.2 μM 센스 및 안티센스 프라이머를 각각 1 μL를 넣은 혼합물에 2 μL의 반응시킨 cDNA 반응 혼합액과 2.5 유닛(unit)의 Taq 중합효소(Takara, 일본)를 넣은 후 증류수로 50 μL로 용량을 맞추고 PCR 기기를 사용하여 PCR을 시행하였다. PCR 조건은 94℃(4분), 94℃(30초), 30 싸이클의 [52℃(30초), 72℃(45초)], 그리고 72℃(10분)로 설정하였다. 증폭된 산물 1 μL를 1% 아가로스겔에 전기영동하여 DNA 밴드를 확인함으로써 유전자발현량을 평가하였다.

발모 관련 유전자의 발현조절 결과

4주 동안 실험물질을 도포한 마우스의 등 피부조직에서 탈모 방지, 발모(또는 육모) 촉진 메카니즘으로 알려져 있는 Wnt/β-카테닌 신호전달물질의 발현 변화를 RT-PCR 분석법에 의해 분석한 결과, Wnt10b와 Wnt10b의 수용체인 FZD1(frizzled receptor 1), 그리고 LRP5(low-density lipoprotein receptor-related protein 5)의 발현이 PNC군에서 음성대조군에 비해 유의적으로 증가하였다. 이에 따라 Wnt10b에 의해 발현이 억제되는 GSK3β(glycogen synthase kinase 3β)와 Axin은 PNC군에서 음성대조군에 비해 유의적으로 감소하였다. Wnt/β-카테닌 신호전달체계의 활성화에 따라 β-카테닌의 발현이 PNC군에서 음성대조군에 비해 유의적으로 증가하였다(도 5a 및 5c).

또한, 피노카베올의 탈모 방지, 발모 또는 육모 촉진 작용기작을 알아보기 위하여 모발 성장에 영향을 미치는 내분비계 인자의 발현변화를 평가하였다. 등 피부조직에서 발모 및 양모에 영향을 주는 성장인자인 IGF1(insulin-like growth factor 1), VEGF(vascular endothelial growth factor), HGF(hepatocyte growth factor), 그리고 KGF (keratocyte growth facfor)의 유전자 발현량을 평가한 결과, 네가지 유전자 모두 PNC군에서 음성대조군에 비해 발현이 유의적으로 증가하였다(도 5b 및 5c).

따라서 피노카베올은 모낭의 길이 성장을 가속화함으로써 모낭이 성장기로 돌아가도록 활성화시키며, 아울러 피부조직에서 IGF1, HGF, VEGF 및 KGF의 발현을 증가시킴으로써 모발의 재성장을 촉진하여 탈모를 방지하고, 발모 및 육모를 촉진함을 알 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

피노카베올을 유효성분으로 포함하는 탈모 예방 또는 치료용, 또는 발모 또는 육모 촉진용 약제학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 Wnt10b(Wigless related MMTV integration site 10b), FZD1(Frizzled receptor 1), LRP5(Low-density lipoprotein receptor-related protein 5), IGF1(Insulin-like growth factor 1), β-카테닌, VEGF(vascular endothelial growth factor), HGF(hepatocyte growth factor) 및 KGF(keratocyte growth facfor)로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 GSK3β(glycogen synthase kinase 3β) 또는 Axin의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
피노카베올을 유효성분으로 포함하는 탈모 개선용, 또는 발모 또는 육모 촉진용 화장료 조성물.
피노카베올을 유효성분으로 포함하는 탈모 개선용, 또는 발모 또는 육모 촉진용 기능성 식품 조성물.
피노카베올을 유효성분으로 포함하는 탈모 개선용, 또는 발모 또는 육모 촉진용 식품 조성물.