KR101586882B1 - 진세노사이드 에프4를 함유하는 사포닌 혼합물을 포함하는 피부보호용 화장료 조성물 및 이것의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 진세노사이드 에프4를 함유하는 사포닌 혼합물을 포함하는 피부보호용 화장료 조성물 및 이것의 제조방법에 대한 것으로, 더욱 상세하게는 진세노사이드 F4 42.1~36.6 중량부, Rh1 18.3~17.4 중량부, Rg5 13.8~9.9 중량부, Rk1 9.7~7.1 중량부, Rh4 7.5~4.8 중량부, Rk3 5.1~3.3 중량부, Rg6 2.1~2.4 중량부를 포함하는 피부보호용 화장료 조성물은, 세포 독성이 없을 뿐만 아니라, 콜라겐 합성 촉진, 세포 내 human matrix metalloproteinase 1(MMP1) 양 감소, MMP1 생성 억제, 및/또는 콜라겐 분해 억제 기능을 가지고, 우수한 피부주름 개선작용을 가지며, 피부자극이 없는 효과를 가지고 있다.

Description

진세노사이드 에프4를 함유하는 사포닌 혼합물을 포함하는 피부보호용 화장료 조성물 및 이것의 제조방법{A cosmetic composition for skin protection by ginsenoside F4 containing saponin compound and preparing method thereof}

본 발명은 피부보호용 화장료 조성물에 대한 것으로, 더욱 구체적으로는 세포 독성이 없을 뿐만 아니라, 콜라겐 합성 촉진, 세포 내 human matrix metalloproteinase 1(MMP1) 양 감소, MMP1 생성 억제, 및/또는 콜라겐 분해 억제 기능을 가지고, 우수한 피부주름 개선작용을 가지며, 피부자극이 없는 효과를 가지는 것을 특징으로 하는 진세노사이드 에프4를 함유하는 초음파 가공 인삼 사포닌 혼합물을 포함하는 피부보호용 화장료 조성물 및 이것의 제조방법에 대한 것이다.

일반적으로, 피부는 표피, 진피, 피하조직으로 구성되어 있으며 외부로부터 보호 및 장벽기능, 온도조절기능, 호흡기능, 배설기능 등 중요한 역할을 담당하고 있다. 그러나, 노화현상이 일어나면서 피부는 그 구조가 변화하고 기능이 급격하게 저하된다. 피부 노화는 성장과 마찬가지로 유전자에 미리 프로그램화되어 있다는 설(Genetic Clock)과, 환경에 의하여 유전자 손상이 축적됨으로써 피부항상성(Homeostasis)이 파괴된다는 설(Damage to genes)로 설명된다.

특히, 후자의 경우 피부손상에 가장 큰 영향을 미치는 환경요인은 자외선(ultraviolet, UV)으로 알려져 있다. 자외선은 피부세포의 사멸을 유발하고 DNA를 손상시킴으로써 노화에 관여하며, 그 병변은 구체적으로 피부의 구성성분인 표피, 진피, 피하조직의 두께가 얇아지는 현상, 표피와 진피 사이의 굴곡이 감소되어 편평해지는 현상, 피부의 수분함량이 손실되어 피부가 건조되는 현상 및 멜라닌 색소의 증가로 인한 기미, 주근깨, 색소침착 등이 있다.

따라서, 자외선에 의한 피부 손상을 방지할 수 있는 화장료 조성물들에 대한 연구가 이루어지고 있다. 그 중 가장 널리 사용되는 물질로 레티놀(Retinol, 비타민 A) 및 레티놀 유도체(Vitamin A Palmitate)를 들 수 있다. 그러나 레티놀은 공기 중에 노출되면 산화되어 변질되기 쉬운 매우 불안정한 물질이므로, 그 효과가 지속적이지 못하며 오히려 피부자극을 유발할우려가 있어 사용범위가 제한되고 있다.

따라서, 피부 주름완화 및 개선, 피부건조 개선 등의 화장료로서의 효능은 현저하게 향상시키면서도 종래의 피부 주름개선 물질의 문제점인 피부 자극 문제도 효과적으로 완화시킬 수 있는 조성물에 대한 발명이 요구되고 있다.

한편, 인삼 재배 부산물인 인삼 지상부(화뢰, 열매, 씨, 잎, 줄기)는 다량의 인삼사포닌과 다양한 약리효과를 나타내며, 특히 항산화 및 항노화 기전에 관여하는 것으로 알려져 있어 화장료 분야에서 응용하기에 좋은 물질이다.

이와 관련하여, 대한민국 등록특허 제10-0296430호에서는 다양한 진세노이드계 사포닌 성분으로 이루어진 화장용 조성물을 개시한 바 있다. 그러나 상기 조성물은 피부보다는 모발 치료에 중점을 둔 것으로, 일부 피부미용효과 상승작용을 나타내긴 하나 자외선에 의한 피부 손상 및 노화를 방지하는 효과는 개시되어 있지 않다.

또한, 대한민국 등록특허 제10-0568601호에서는 알지2를 함유하는 다양한 진세노이드계 사포닌 성분으로 이루어진 화장료 조성물을 개시하고 있다. 그러나, 상기 조성물은 인삼 및 홍삼으로부터 추출한 진세노사이드 알지2를 주성분으로 하는 것이고, 주름개선 및 보습효과가 소비자의 요구를 충족시킬 수 있을 만큼 만족스럽지 못하다는 단점을 가지고 있다.

본 발명은 상기한 문제점을 해결하기 위한 것으로, 세포 독성이 없을 뿐만 아니라, 콜라겐 합성 촉진, 세포 내 human matrix metalloproteinase 1(MMP1) 양 감소, MMP1 생성 억제, 및/또는 콜라겐 분해 억제 기능을 가지고, 우수한 피부주름 개선작용과 피부자극이 없는 효과를 가지는 피부보호용 조성물을 제공하는 것이 목적이다.

또한, 본 발명은 진세노사이드 에프4를 주요성분으로 함유하여 우수한 피부보호 및/또는 주름개선 효과를 가지는 조성물을 제공하기 위한 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 피부보호용 화장료 조성물은, 진세노사이드 F4 42.1~36.6 중량부, Rh1 18.3~17.4 중량부, Rg5 13.8~9.9 중량부, Rk1 9.7~7.1 중량부, Rh4 7.5~4.8 중량부, Rk3 5.1~3.3 중량부, Rg6 2.1~2.4 중량부를 포함하는 것이 특징이다.

여기서, 본 발명은 상기 진세노사이드를 총 중량에 대하여 0.000001 ~ 1 중량%의 양으로 함유하는 것이 바람직하고, 그 중에서도 0.025 ~ 0.05 중량%의 양으로 함유하는 것이 더욱 바람직하다.

그리고, 본 발명에 따른 피부보호용 화장료 조성물은, 콜라겐 합성 촉진, 세포 내 human matrix metalloproteinase 1(MMP1) 양 감소, MMP1 생성 억제, 및 콜라겐 분해 억제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 활성을 가지는 것이 가능하다.

또한, 본 발명은 상기 피부보호용이 피부 주름개선용인 것을 특징으로 하는 피부 주름개선용 화장료 조성물일 수 있다.

또한, 상기 피부보호용 화장료 조성물은 유연화장수, 영양화장수, 에센스, 영양크림, 마사지크림 또는 팩의 제형을 가지는 것이 바람직하다.

한편, 본 발명의 다른 실시형태는, 인삼 지상부를 알코올 용매로 추출하고 여과한 후 감압농축하여 인삼 엑스를 얻는 단계; 상기 얻은 인삼 엑스를 초음파 처리하는 단계; 상기 초음파 처리한 제제를 탈지하고 원심분리하여 조사포닌을 얻은 단계; 및 상기 얻은 조사포닌을 아세톤, 에칠아세테이트 및 이소프로필알코올로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 용매로 분획하는 단계;를 포함하는 피부보호용 화장료 조성물의 제조방법이다.

더욱 구체적으로, 본 발명은 인삼 화뢰를 에칠알코올 용매로 환류 추출하고 여과한 후 감압농축하여 인삼 엑스를 얻는 단계; 상기 얻은 인삼 엑스를 증류수 또는 식초에 넣고 초음파 처리하는 단계; 상기 초음파 처리한 제제에 디에칠에테르를 가하고 초음파 세정기로 탈지한 후 원심분리하여 상등액을 제거한 잔사를 얻은 다음, 상기 얻은 잔사에 부탄올을 가하여 추출한 후 원심분리한 상등액을 여과하고 감압농축하여 조사포닌을 얻은 단계; 상기 얻은 조사포닌을 아세톤, 에칠아세테이트 및 이소프로필알코올로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 용매로 분획하는 단계; 및 상기 분획한 분획물을 오디에스가 충진된 컬럼에 통과시켜서 정제하는 단계;를 포함하는 피부보호용 화장료 조성물의 제조방법일 수 있다..

이와 함께, 본 발명은 상술한 제조방법에 의해 제조되어, 진세노사이드 F4, Rh1, Rg5, Rk1, Rh4, Rk3, Rg6를 포함하는 피부보호용 화장료 조성물인 것도 가능하다.

기타 실시예들의 구체적인 사항들은 상세한 설명 및 도면들에 포함되어 있다.

이러한 본 발명은, 진세노사이드 F4를 주요성분으로 포함하고, 이외에 Rh1, Rg5, Rk1, Rh4, Rk3, Rg6를 포함하는 것을 특징으로 하여, 세포 독성이 없을 뿐만 아니라, 콜라겐 합성 촉진, 세포 내 human matrix metalloproteinase 1(MMP1) 양 감소, MMP1 생성 억제, 및/또는 콜라겐 분해 억제 기능을 가지고, 우수한 피부주름 개선작용과 피부자극이 없는 효과를 가지고 있다.

또한, 본 발명은 인삼 엑스를 초음파 처리하여 얻은 조사포닌을 아세톤, 에칠아세테이트 및/또는 이소프로필알코올로 분획함으로서, 상기와 같이 진세노사이드 에프4를 주요성분으로 함유하여 우수한 피부보호 및/또는 주름개선 효과를 가지는 조성물을 제공할 수 있다.

도 1은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따라 아세톤 분획으로 얻은 조성물에 대한 고속액체크로마토그래피(HPLC) 분석 결과 그래프이고,
도 2는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따라 클로로포름 분획으로 얻은 조성물에 대한 고속액체크로마토그래피(HPLC) 분석 결과 그래프이고,
도 3은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따라 에칠아세테이트 분획으로 얻은 조성물에 대한 고속액체크로마토그래피(HPLC) 분석 결과 그래프이고,
도 4는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따라 이소프로필알콜 분획으로 얻은 조성물에 대한 고속액체크로마토그래피(HPLC) 분석 결과 그래프이고,
도 5는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 피부보호용 화장료 조성물(GFBA-1)의 세포 독성 실험 결과를 나타내는 그래프이고,
도 6은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 피부보호용 화장료 조성물(GFBA-1)에 의한 human fibroblast 콜라겐 생성양의 변화를 나타내는 실험 결과 그래프이고,
도 7은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 피부보호용 화장료 조성물(GFBA-1)에 의한 Hs68 cell에서의 MMP1 양의 변화를 나타내는 실험 결과 그래프이고,
도 8은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 피부보호용 화장료 조성물(GFBA-1, 시험제품)과 비교예에 따른 대조제품의 육안 평가 결과를 나타내는 그래프이고,
도 9는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 피부보호용 화장료 조성물(GFBA-1)을 이용한 모사판 제조 과정을 나타내는 사진이고,
도 10 내지 도 12는 각각 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 피부보호용 화장료 조성물(GFBA-1, 시험제품)과 비교예에 따른 대조제품의 사용 4주후(도 10), 8주후(도 11), 12주후(도 12)의 모사판 화상 분석 변화 결과를 나타내는 그래프이다.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시 예를 가질 수 있는 바, 특정 실시 예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에서 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다.

본 발명은 진세노사이드(Ginsenoside) 에프4를 함유하는 초음파 가공 인삼 사포닌 혼합물을 포함하는 피부보호용 화장료 조성물 및 이것의 제조방법에 대한 것이다.

본 발명에 따른 피부보호용 화장료 조성물은, 진세노사이드 F4를 주요성분으로 하면서 이외에 Rh1, Rg5, Rk1, Rh4, Rk3, Rg6를 포함하는 것이 특징이다. 상기 주요성분이라 함은 진세노사이드를 함유하는 사포닌 혼합물에서, 상기 진세노사이드 중 특정성분의 함량이 가장 많이 포함되거나 30~90 중량% 범위 내로 포함된 것을 의미한다.

구체적으로, 본 발명에 따른 피부보호용 화장료 조성물은 진세노사이드 F4 42.1~36.6 중량부, Rh1 18.3~17.4 중량부, Rg5 13.8~9.9 중량부, Rk1 9.7~7.1 중량부, Rh4 7.5~4.8 중량부, Rk3 5.1~3.3 중량부, Rg6 2.1~2.4 중량부를 함유하는 인삼 사포닌 혼합물을 포함하여 이루어진 것이다. 본 발명에 따른 조성물은 상기 진세노사이드 또는 사포닌 혼합물을 총 중량에 대하여 0.000001 ~ 1 중량%의 양으로 함유하는 것이 바람직하고, 그 중에서도 0.025 ~ 0.05 중량%의 양으로 함유하는 것이 세포독성이 없으면서 콜라겐 생성 효율과 MMP1 생성 억제 효과가 우수하여(후술하는 실험예 1~3 참조) 더욱 바람직하다.

본 발명자들은 다양한 실험을 통해 인삼 지상부의 진세노사이드 성분 중 진세노사이드 F4를 주성분으로 함유된 인삼사포닌 조성물이 세포독성이 없고, 콜라겐 합성을 촉진하는 효과와 human MMP1의 양을 유의하게 감소시켜서 콜라겐 분해를 억제하며, 주름개선 인체적용시험에서 육안 평가 및 안전성 평가, 사진촬영, 기기평가(SV600), 및 설문평가를 통하여 우수한 피부주름 개선작용 및 피부자극감이 없는 탁월한 효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

이에 따라, 본 발명에 따른 피부보호용 화장료 조성물은, 콜라겐 합성 촉진, 세포 내 human matrix metalloproteinase 1(MMP1) 양 감소, MMP1 생성 억제, 및 콜라겐 분해 억제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 활성을 가지는 것이 가능하다.

한편, 본 발명의 다른 실시형태는 피부보호용 화장료 조성물의 제조방법이다.

즉, 본 발명의 화장료 조성물이 포함하는 사포닌 혼합물(GFBA-1)은 인삼 또는 홍삼으로부터 직접 추출하여 얻거나, 또는 각각 분리되어 정제된 여러 종류의 사포닌을 혼합함으로써 제조할 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 인삼으로부터 사포닌 혼합물을 직접 추출하여 얻는 것이 가능하다. 즉, 본 발명에 따른 피부보호용 화장료 조성물의 제조방법은 인삼 지상부를 알코올 용매로 추출하고 여과한 후 감압농축하여 인삼 엑스를 얻는 단계(S10); 상기 얻은 인삼 엑스를 초음파 처리하는 단계(S20); 상기 초음파 처리한 제제를 탈지하고 원심분리하여 조사포닌을 얻은 단계(S30); 및 상기 얻은 조사포닌을 아세톤, 에칠아세테이트 및 이소프로필알코올로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 용매로 분획하는 단계(S40);를 포함하는 것이 가능하다.

즉, 본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 사포닌 혼합물(GFBA-1)은 인삼 지상부(화뢰, 열매, 씨, 잎, 줄기)를 초음파 처리하고, 특정 용매(아세톤, 이소프로필알코올)로 분획한 후 정제된 여러 종류의 사포닌을 혼합함으로써 제조할 수 있다.

더욱 구체적으로, 본 발명에 따른 방법은 인삼 화뢰를 에칠알코올 용매로 환류 추출하고 여과한 후 감압농축하여 인삼 엑스를 얻는 단계(S100)를 거친다. 예를 들어, 인삼을 증류수 알코올 등의 용매를 이용하여 열환류추출하거나 초음파 추출 후, 감압 농축하여 인삼 지상부 엑스를 얻을 수 있다. 그리고, 상기 얻은 인삼 엑스를 증류수 또는 식초에 넣고 초음파 처리하는 단계(S200)를 거친다. 예를 들어, 인삼 지상부 엑스(1g)에 증류수 또는 식초(pH 2 ～ 4) 200㎖ 를 넣고, 발진기 600W, 진동부 600W, 100℃ 규격의 울트라소니케이터(초음파 세척기)에 넣고, 초음파를 1~60분간 처리하는 것이 가능하다. 이어서, 상기 초음파 처리한 제제에 디에칠에테르를 가하고 초음파 세정기로 탈지한 후 원심분리하여 상등액을 제거한 잔사를 얻은 다음, 상기 얻은 잔사에 부탄올을 가하여 추출한 후 원심분리한 상등액을 여과하고 감압농축하여 조사포닌을 얻은 단계(S300)를 거친다. 예를 들어, 상기 얻은 초음파 처리 인삼 지상부 조성물에 디에칠에테르 분획으로 탈지한 후, 수포화 부탄올 처리를 통하여 조사포닌 분획을 얻을 수 있다. 계속해서, 상기 얻은 조사포닌을 아세톤, 에칠아세테이트 및 이소프로필알코올로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 용매로 분획하는 단계(S400)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 얻은 조사포닌을 아세톤, 에칠아세테이트, 및/또는 이소프로필알코올로 분획하여 진세노사이드 F4가 고농도로 함유된 조성물을 얻을 수 있다. 일반적으로, 분획시 사용하는 용매는 핵산이나 클로로에탄올, 부탄올 등이 많이 사용되지만, 본 발명자들은 아세톤, 에칠아세테이트, 클로르포름, 이소프로필알코올을 분획 용매로 사용하였고, 이 중에서 아세톤, 에칠아세테이트, 또는 이소프로필알코올로 분획하는 경우에는, 진세노사이드 F4가 고농도로 함유되고 이외에 Rh1, Rg5, Rk1, Rh4, Rk3, Rg6 가 다량 함유되어 있는 조성물을 얻을 수 있었다. 그런 다음에는 상기 분획한 분획물을 오디에스가 충진된 컬럼에 통과시켜서 정제하는 단계(S500);를 포함하는 것도 가능하다. 즉, 상기 분획에 대해 성분분석 및 확인과정을 거친 후, 동결 건조시켜 분말화하고, 일정한 농도를 수득하기 위하여 다시 용해시킨 후 건조과정을 거쳐, 원하는 농도의 사포닌 혼합물을 얻을 수 있다.

이러한 본 발명은 인삼 지상부 엑스를 초음파 처리하여 얻은 조사포닌을 아세톤, 에칠아세테이트 및/또는 이소프로필알코올로 분획하는 것이 특징이고, 이를 통해 진세노사이드 에프4를 주요성분으로 함유하여 우수한 피부보호 및/또는 주름개선 효과를 가지는 조성물을 제공할 수 있다.

이에 따라, 본 발명은 상기 피부 보호용 및/또는 피부 주름개선용인 것을 특징으로 하는 피부 주름개선용 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

이와 함께, 본 발명은 상술한 제조방법에 의해 제조되어, 진세노사이드 F4, Rh1, Rg5, Rk1, Rh4, Rk3, Rg6를 포함하는 피부보호용 화장료 조성물인 것도 가능하다. 상술한 방법으로 얻어진 사포닌 혼합물(GFBA-1)은 진세노사이드 F4 42~36 중량부, Rh1 18.3~17.4 중량부, Rg5 13.8~9.9 중량부, Rk1 9.7~7.1 중량부, Rh4 7.5~4.8 중량부, Rk3 5.1~3.3 중량부, 및 Rg6 2.1~2.4 중량부를 포함하여 이루어진다.

본 발명의 화장료 조성물은 상기 성분 이외에도 필요에 따라 추가로 점증제, 피부보호제, 보습제, 중화제, pH 조절제, 가용화제, 방부제, 용제를 포함할 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물은 화장품의 통상적인 제형으로 제조될 수 있으며, 구체적으로 유액, 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 아이크림, 영양크림, 마사지크림, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 에센스 또는 팩 등의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 조성물은 세포독성이 없고, 콜라겐 합성을 촉진하는 효과와 human MMP1의 양을 유의하게 감소시켜서 콜라겐 분해를 억제하며, 주름개선 인체적용시험에서 육안 평가 및 안전성 평가, 사진촬영, 기기평가(SV600), 및 설문평가를 통하여 우수한 효과가 있다. 또한 본 발명의 조성물은 우수한 피부주름 개선효과를 나타내면서도, 피부자극감이 없고 안정성이 우수하여 화장료로 사용되기에 적합하다. 따라서, 본 발명의 조성물은 햇빛 등 외부자극에 의한 피부 손상 및 노화를 방지하여 피부미용 효과를 향상시키기 위한 화장료로서 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 더 잘 이해 될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명의 예시 목적을 위한 것이며, 첨부된 특허청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1: 인산 사포닌 혼합물의 제조

본 실시예에서는, 인삼 화뢰로부터 사포닌 혼합물을 제조하였다.

즉, 인삼 화뢰 200g에 에칠알코올 2,000㎖를 가하여 2회 환류 추출하고, 여과한 후 감압농축하여 에칠알코올 엑스를 얻었다.

그리고, 상기 얻은 에칠에탄올 엑스 1g에 2배식초 200ml를 가한 후 초음파 세척기(고도기연, 한국)에 넣고, 100℃에서 40분간 초음파 처리를 각각 1회씩 시행하였다.

이어서, 상기 초음파 처리를 통하여 얻은 초음파 처리 제제 2g에 디에칠에테르 50㎖를 가하고 1시간씩 3회 초음파 세정기(고도기업, 4020P, 한국)로 추출한 후, 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 이렇게 얻은 잔사에 수포화 부탄올 50㎖를 가하여 2시간씩 3회 추출하고, 원심분리한 후 상등액을 취하여 여과하였으며, 이것을 감압농축을 하여 조사포닌을 얻었다.

계속해서, 상기 얻은 조사포닌을 아세톤, 에칠아세테이트, 클로르포름, 및 이소프로필알코올로 각각 분획한 다음, 감압 건조하여 분획물을 얻었다.

또한, 상기 얻은 분획물 각각을 오디에스(C-18)를 충진시킨 컬럼에 통과시켜서 정제함으로서, 진세노사이드 F4의 양이 증가된 분획물을 얻었다.

그리고는, 상기 각각의 분획에 대해 고속액체크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 성분을 분석하였고, 그 결과는 도 1 내지도 도 4 및 하기 표 1에 나타내었다.

도 1 내지 도 4는 각각 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따라 아세톤 분획(도 1), 클로로포름 분획(도 2), 에칠아세테이트 분획(도 3), 이소프로필알콜 분획(도 4)으로 얻은 조성물에 대한 고속액체크로마토그래피(HPLC) 분석 결과 그래프이다.

상기 표 1에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 분획물은 진세노사이드 F4 42~36 중량부, Rh1 18.3~17.4 중량부, Rg5 13.8~9.9 중량부, Rk1 9.7~7.1 중량부, Rh4 7.5~4.8 중량부, Rk3 5.1~3.3 중량부, Rg6 2.1~2.4 중량부를 함유하고 있음을 확인할 수 있다.

이어서, 상기 분획을 동결 건조시켜 분말화한 후, 일정한 농도를 수득하기 위해 다시 용해시킨 후 건조과정을 거쳐, 본 발명에 따른 사포닌 혼합물(GFBA-1)을 얻었다.

실시예 2: 사포닌 혼합물을 포함하는 피부보호용 화장료 조성물의 제조

상기 실시예 1에서 얻은 사포닌 혼합물(GFBA-1)에, 하기 표 2에 나타난 바와 같은 성분들을 첨가하여 일반적으로 알려진 통상의 방법으로 본 발명에 따른 화장료 조성물을 제조하였다.

비교예 1: 화장료 조성물의 제조

상기 실시예 2에서 사포닌 혼합물(GFBA-1)을 제외하고, 상기 표 2에 나타난 바와 같은 성분들을 첨가하여 일반적으로 알려진 통상의 방법으로 화장료 조성물을 제조하였다.

실험예 1: 세포독성 실험( MTT assay )

(1) Human fibroblast 유래의 Hs68 (ATCC; CRL-1635) 세포를 5 x 10⁴ cells/well로 96-well plate에 분주하고 세포가 바닥 면에 부착되도록 24시간 배양하였다.

(2) 세포가 바닥 면에 부착한 후에 배양액을 제거하고, 상기 실시예 2에 따른 조성물을 0.1%부터 2~64배로 희석한 시료를 well당 100 ul씩 넣은 후 배양기에서 24시간 동안 배양하였다.

(3) 배양이 끝난 후, 세포 성장에 대한 영향은 MTT (3-[4,5-dimethyl-thiazol-2-yl]-2,5-diphenylterazohum bromide) assay 로 Microplate reader로 570nm 흡광도에서 측정하였다.

도 5는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 피부보호용 화장료 조성물(GFBA-1)의 세포 독성 실험 결과를 나타내는 그래프이다. 도 5에 나타난 바와 같이, Hs68세포에 GFBA-1을 농도 별로(0, 0.001563, 0.003125, 0.00625, 0.0125, 0.025, 0.05, 0.1%)로 처리한 후, 세포 독성 유무를 확인한 결과, 0.1%에서는 세포독성(20.54 ± 2.29%)을 나타내었으며, 0.05%이하의 농도에서는 세포독성이 나타나지 않았다.

실험예 2: 세포 내 콜라겐 생성 실험

(1) Human fibroblast 유래의 Hs68 (ATCC; CRL-1635) 세포를 1.5 x 10⁵ cells/well으로 6-well plate에 분주하고 세포가 바닥 면에 부착되도록 24시간 배양하였다.

(2) 세포가 바닥 면에 부착한 후에 배양액을 제거하고, 상기 실시예 2의 본 발명에 따른 조성물을 상기 실험예 1의 세포독성시험 결과를 토대로 세포 생존율이 100%인 농도에서부터 2~16배 희석(0.001 ~ 0.000008%)하여, 배지에 처리하고 24시간 동안 배양하였다.

(3) 24시간 뒤, 배양액과 세포를 회수하고 세포 lysate로 단백질을 정량 한 뒤 ELISA kit (mdbioproducts; Cat. M036007) 사용하여 배양액에 생성된 콜라겐의 양을 측정하였다.

도 6은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 피부보호용 화장료 조성물(GFBA-1)에 의한 human fibroblast 콜라겐 생성양의 변화를 나타내는 실험 결과 그래프이다. 도 6에 나타난 바와 같이, Ascorbic acid 50uM을 처리한 세포는 대조구(시료물질을 처리하지 않은 세포대조군)보다 높은 콜라겐 합성을 촉진하는 효과를 보였고(도 6의 왼쪽 그래프), 본 발명에 따른 조성물을 0.0002 ~ 0.000008% 농도로 처리한 것은 대조구보다 높은 콜라겐 합성 촉진 효과를 보였다.

실험예 3: 세포 내 human matrix metalloproteinase 1( MMP1 ) 생성 억제 실험

(1) Human fibroblast 유래의 Hs68 (ATCC; CRL-1635) 세포를 1.5 x 105 cells/well으로 6-well plate에 분주하고 세포가 바닥 면에 부착되도록 24시간 배양하였다.

(2) 세포가 바닥 면에 부착한 후에 배양액을 제거하고 PBS로 2회 세척한 후 PBS에서 UVB (80 mJ/cm2; 312nm)조사를 하였다.

(3) 상기 실시예 2의 본 발명에 따른 조성물을 세포독성시험 결과를 토대로 세포 생존율이 100%인 농도에서부터 2~16배 희석(0, 0.001563, 0.003125, 0.00625, 0.0125, 0.025, 0.05%)한 배지에 처리하고 48시간 동안 배양하였다.

(4) 48시간 뒤, 배양액과 세포를 회수하고 세포 lysate로 단백질을 정량 한 뒤 ELISA kit (Amersham; Cat. RPN2610) 사용하여 배양액에 함유된 MMP1양을 측정하였다.

도 7은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 피부보호용 화장료 조성물(GFBA-1)에 의한 Hs68 cell에서의 MMP1 양의 변화를 나타내는 실험 결과 그래프이다(*p<0.05). 도 7에 나타난 바와 같이, MMP1은 UVB조사에 의하여 생성량이 크게 증가되는 것을 확인할 수 있었다(4.50±0.20 → 16.68±0.53 ng/ml). 그리고, 본 발명에 따른 조성물 0.00625% 및 0.0125%의 농도에서는 유의한 변화가 관찰되지 않았으나(19.93±3.18; 13.60±1.60 ng/ml), 0.025% 및 0.05%의 처리농도에서는 MMP1이 유의하게 감소 되었음을 확인하였다(10.30±0.99; 8.52±1.83 ng/ml). 이에 따라, 본 발명에 따른 조성물은 콜라겐 분해를 억제하는 활성이 있음을 알 수 있었다.

실험예 4: 주름개선 인체 적용 실험

눈가에 주름을 가진 만 30~65세의 성인 여성을 대상으로 12주간 상기 실시예 2의 본 발명에 따른 조성물을 1일 2회 도포하도록 한 후, 사진촬영과 주름개선 측정 및 안전성 평가, 설문평가, 육안평가를 수행하였다.

실험예 4-1: 육안 평가 실험

피험자의 눈가 주름 정도는 충분히 밝은 광원 하에서 두 명(KYM, IYS)의 숙련된 연구원에 의해 이중맹검(Double-blind test)으로 평가하였다. 즉, 인체적용시험 시작전(0주), 4주, 8주, 12주 경과 후에 본 센터에 방문한 피험자들을 대상으로 눈가의 주름 정도를 global photodamage score(0:none, 1:none/mild, 2:mild, 3:mild/moderato, 4:moderato, 5:moderato/severe, 6:severe, 7:very severe, ref:Arch Dermatol vol.127(8):1043-1051, 2001)에 근거하여 평가하였다. 육안 평가 분류표는 하기 표 3에 나타낸 바와 같다. 두 전문가의 평가에 차이가 있을 경우에는 효능성은 낮은 단계를, 피부 이상반응은 높은 단계를 선택하였다.

평가 결과는 도 8 및 하기 표 4에 나타난 바와 같다. 도 8은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 피부보호용 화장료 조성물(GFBA-1, 시험제품)과 비교예에 따른 대조제품의 육안 평가 결과를 나타내는 그래프이다.

p-value	4주	8주	12주
	0.414 (p>0.05)	0.019* (p<0.05)	0.004* (p<0.05)

*8주 경과 후에 Levene의 등분산 검정이 유의차 5% 보다 작으므로(p<0.05) 등분산 가정에 위배되어 등분산이 가정되지 않은 유의 확률을 택하였음

상기 표 4와 도 8에 나타난 바와 같이, 4주 후에는 통계적으로 유의한 수준의 차이는 없었지만, 8주 후, 그리고 12주 후에는 비교예에 따른 대조제품에 비하여 본 발명에 따른 조성물(시험제품)은 통계적으로 유의한 수준의 차이를 보였다. 본 시험은 동일 피험자를 대상으로 양측 눈가에 대조제품과 시험제품을 각각 도포하여 비교한 것이므로, 개인차에 의한 변수에 기인한 것은 아니었다.

실험예 4-2: 모사판 제작과 Skin - Visiometer 를 이용한 화상분석 실험

본 발명에 따른 조성물의 사용에 따른 주름개선 효과를 Skin-Visiometer을 이용하여 분석하였다.

도 9는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 피부보호용 화장료 조성물(GFBA-1)을 이용한 모사판 제조 과정을 나타내는 사진이다. 피험자의 방문(0주, 4주, 8주, 12주)시 지정된 눈가 부위에서 모사판을 제작하였다. 모사판의 제작은 항온 항습(22±2°C, 40%~60% humidity) 조건에서 제작하였으며, 피험자는 시험 당일 스킨 등 모든 화장품을 바르지 않도록 하였다. 아울러 방문하여 모사판 제작 부위를 중심으로 제모 후 세안한 다음 30분간 항온 항습 조건에서 안정을 취한 후 실리콘 용액 B(기제), C(촉매제)를 이용하여 모사판을 제작하였다.

제작된 모사판은 Skin-Visiometer SV600의 software를 이용하여 분석하였다. 분석 원리는 인공 광원에서 방출된 빛이 실리콘 재질을 투과하면서 생기는 빛의 Intensity를 Lambert & Beer’s Law에 의해 분석하여 피부주름 개선 정도를 측정하였다(I_ex=I_ine^{- kd}). 그리고, 제작된 모사판을 Skin-Visiometer SV600내 분석 kit에 넣고 Visiometer의 Image analyzer software에 의해 분석하였다. 이때, 모사판은 항상 같은 방향으로 Skin-Visiometer SV600내에 들어가도록 주의한다. Skin-Visiometer SV600의 분석 결과는 R1~R5의 값으로 분석하여 정리하였다. R1~R5의 값이 작아질수록 피부 주름이 개선되어 주름의 깊이가 낮아짐을 의미하며 단위는 임의의 단위(Arbitrary Unit)이다. Skin-Visiometer SV600의 측정 값은 하기 표 5에 나타난 바와 같다.

R1: Skin Roughness R2: Maximum Roughness R3: Average Roughness R4: Smoothness Depth R5: Arithmetic Average Roughness

Skin-Visiometer SV600에 의한 분석 Parameter로는 circle, horizontal, vertical, 3종류가 있으며 본 인체적용시험에서는 circle을 이용하여 R1~R5값을 계산하였다. 이는 미세주름 측정기인 Skin-Visiometer SV600의 Image analyzer software가 주름 분석을 함에 있어 인체의 실제 주름과 같은 그물망 조직을 분석할 수 있는 circle로 분석하는 것이 과학적이라 판단하였기 때문이다. 제작된 모사판의 분석은 시험기간 동안의 모든 모사판 제작이 완료된 후 정량하였다.

모사판 화상 분석 변화 결과는 도 10 내지 도 12 및 하기 표 6에 나타난 바와 같다. 도 10 내지 도 12는 각각 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 피부보호용 화장료 조성물(GFBA-1, 시험제품)과 비교예에 따른 대조제품의 사용 4주후(도 10), 8주후(도 11), 12주후(도 12)의 모사판 화상 분석 변화 결과를 나타내는 그래프이다.

	주	△R1	△R2	△R3	△R4	△R5
p-value	4주	0.197 (p>0.05)	0.155* (p>0.05)	0.074 (p>0.05)	0.388 (p>0.05)	0.768 (p>0.05)
	8주	0.753 (p>0.05)	0.808 (p>0.05)	0.573 (p>0.05)	0.689* (p>0.05)	0.743 (p>0.05)
	12주	0.006 (p<0.05)	0.116 (p>0.05)	0.348* (p>0.05)	0.008 (p<0.05)	0.011* (p<0.05)

* 제품 사용 4주 경과 후에 R2와 제품 사용 8주 경과 후 R4, 제품 사용 12주 경과 후 R3, R5의 경우 Levene의 등분산 검정이 유의차 5% 보다 작으므로(p<0.05) 등분산 가정에 위배되어 등분산이 가정되지 않은 유의 확률을 택하였음

모사판 화상 분석에 대한 통계 분석 결과, 제품 사용 후 12주에서 parameter값인 R1, R4, R5에서 통계적으로 유의한 수준의 주름개선 효과가 있었다. 따라서, 시험제품은 사용 12주 후 대조제품과의 모사판 화상 분석에 대한 통계 분석 결과 통계적으로 유의한 수준(p<0.05)의 주름개선 효과가 있다는 것을 알 수 있었다.

R4값은 전술한 바와 같이 Depth Of Smoothness로 매끄러운 정도를 나타내는 Parameter로 값이 작아질수록 피부의 거칠기가 개선됨을 의미한다. 따라서 R4가 통계적으로 유의하게 측정되었으므로, 제품 사용 전, 제품 사용 12주 후 효과 차이를 보였음을 의미한다.

R5값은 Arithmetic Average Roughness로 mean roughness value를 의미한다. 즉 거칠기 값의 평균으로 주름 깊이와 관련된 직접적인 Parameter이므로 R5가 통계적으로 유의하게 측정되었다는 것은 제품 사용 전, 제품 사용 12주 후 개선 효과 차이가 있다는 것을 의미한다.

실험예 4-3: 순응도 및 안정성 평가 실험

① 순응도 평가

첫 방문시부터 시험이 종료된 시점까지 순응일지에 제품 도포 여부 및 이상 반응 여부를 매일 작성하도록 하였다.

② 안전성 평가

시험제품 및 대조제품의 이상반응인 홍반(Erythema), 부종(Edema), 인설(Scaling), 가려움(Itching), 자통(Stinging), 작열감(Burning), 뻣뻣함(Tightness), 따끔거림(Prickling)이나 다른 이상반응이 발생하는지의 존재 여부를 면밀히 관찰하고 피부 이상반응이 나타날 시 심한 정도에 따라 등급을 표시하고 이에 대한 검사 소견을 작성하였다. 그리고 시험중지 또는 탈락사항이 발생하는지 점검하여 Case Report Form에 기입하였다. 방문하는 날이 아니더라도 시험에 더 이상 참가 할 수 없게 되는 경우는 본인의 서명이 첨부된 “시험참가 포기동의서”를 쓰도록 하였다. 이상 반응 여부 및 등급 분류표는 아래 표 7에 나타난 바와 같다.

피험자 자가 평가 결과, 피험자들은 이상반응 발생 즉시 본 센터로 보고하도록 하였으며 순응일지에 기재하도록 하였다. 또한 방문 시 마다 설문지를 통하여 이상반응 여부에 표기하도록 하였다. 시험이 진행되는 동안 피험자로부터 특별한 이상반응은 보고되지 않았으므로 대조제품 및 시험제품은 피부 이상반응이 없는 것을 알 수 있었다.

또한, 연구자에 의한 평가 결과, 피부과 전문의에 의한 이학적 검사상 대조제품 및 시험제품 모두 사용 후 홍반이나 소양감, 발진 등 피부 이상소견은 관찰되지 않았다. 따라서 대조제품과 시험제품은 피부에 자극이 없는 안전한 조성물임을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명의 조성물은 콜라겐 합성을 촉진하고, 콜라겐 분해를 억제하며, 독성 및 자극감 이 없이 주름개선작용을 나타내는 효과가 있음을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 화장료로 사용하기에 충분한 수준의 안정한 기제임을 알 수 있다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 조성물은 콜라겐 합성을 촉진하고, 콜라겐 분해를 억제하며, 독성 및 자극감 이 없이 주름개선작용을 나타내는 효과가 있음을 알 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 우수한 피부주름 개선효과를 나타내면서도, 피부자극감이 없고 안정성이 우수하여 화장료로 사용되기에 적합하다. 따라서, 본 발명의 조성물은 콜라겐 합성을 촉진하고, 콜라겐 분해를 억제하며, 독성 및 자극감 이 없이 주름개선효과를 향상시키기 위한 화장료로서 유용하게 사용될 수 있다.

한편, 상기에서는 본 발명을 특정의 바람직한 실시예에 관련하여 도시하고 설명하였지만, 이하의 특허청구범위에 의해 마련되는 본 발명의 기술적 특징이나 분야를 이탈하지 않는 한도 내에서 본 발명이 다양하게 개조 및 변화될 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백한 것이다.

Claims (9)

1. 인삼 지상부를 알코올 용매로 추출하고 여과한 후 감압농축하여 인삼 엑스를 얻는 단계;
   상기 얻은 인삼 엑스를 초음파 처리하는 단계;
   상기 초음파 처리한 제제를 탈지하고 원심분리하여 조사포닌을 얻은 단계; 및
   상기 얻은 조사포닌을 아세톤 및 이소프로필알코올로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 용매로 분획하는 단계;를 포함하는 피부 주름개선용 화장료 조성물의 제조방법에 의해 제조되며,
   진세노사이드 F4 42.1~36.6 중량부, Rh1 18.3~17.4 중량부, Rg5 13.8~9.9 중량부, Rk1 9.7~7.1 중량부, Rh4 7.5~4.8 중량부, Rk3 5.1~3.3 중량부, Rg6 2.4~2.1 중량부를 포함하는 피부 주름개선용 화장료 조성물.
   
2. 인삼 화뢰를 에칠알코올 용매로 환류 추출하고 여과한 후 감압농축하여 인삼 엑스를 얻는 단계;
   상기 얻은 인삼 엑스를 증류수 또는 식초에 넣고 초음파 처리하는 단계;
   상기 초음파 처리한 제제에 디에칠에테르를 가하고 초음파 세정기로 탈지한 후 원심분리하여 상등액을 제거한 잔사를 얻은 다음, 상기 얻은 잔사에 부탄올을 가하여 추출한 후 원심분리한 상등액을 여과하고 감압농축하여 조사포닌을 얻은 단계;
   상기 얻은 조사포닌을 아세톤 및 이소프로필알코올로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 용매로 분획하는 단계; 및
   상기 분획한 분획물을 오디에스가 충진된 컬럼에 통과시켜서 정제하는 단계;를 포함하는 피부 주름개선용 화장료 조성물의 제조방법에 의해 제조되며,
   진세노사이드 F4 42.1~36.6 중량부, Rh1 18.3~17.4 중량부, Rg5 13.8~9.9 중량부, Rk1 9.7~7.1 중량부, Rh4 7.5~4.8 중량부, Rk3 5.1~3.3 중량부, Rg6 2.4~2.1 중량부를 포함하는 피부 주름개선용 화장료 조성물.
   
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   유연화장수, 영양화장수, 에센스, 영양크림, 마사지크림 또는 팩의 제형을 가짐을 특징으로 하는 피부 주름개선용 화장료 조성물.
   
   
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