KR101577052B1

KR101577052B1 - 신규한 이소나콜 e3를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 및 혈관신생에 의한 질환의 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101577052B1
Application number: KR1020130097487A
Authority: KR
Inventors: 김태윤; 샴키스호사
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2013-08-16
Filing date: 2013-08-16
Publication date: 2015-12-11
Also published as: KR20150019967A

Abstract

본 발명은 신규한 이소나콜 E₃를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 및 혈관신생에 의한 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다. 좀 더 상세하게는 화학식 1로 표시되는 이소나콜 E₃ 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 및 혈관신생에 의한 질환의 예방 및 치료용 약학적조성물 및 화학식 1로 표시되는 이소나콜 E₃ 를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 및 혈관신생에 의한 질환 예방 및 개선용 식품 조성물 및 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 이소나콜 E₃ 를 유효성분으로 포함하는 조성물들은 염증성 질환 및 혈관신생에 의한 질환들을 예방, 개선 및 치료하는데 탁월한 효과가 있다.

Description

신규한 이소나콜 E3를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 및 혈관신생에 의한 질환의 예방 및 치료용 조성물{Composition for preventing and treating inflammatory diseases and angiogenesis-induced disease comprising novel isonahocol E3 as an active ingredient}

본 발명은 신규한 이소나콜 E₃를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 및 혈관신생에 의한 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다. 좀 더 상세하게는 화학식 1로 표시되는 이소나콜 E₃ 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 및 혈관신생에 의한 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물 및 화학식 1로 표시되는 이소나콜 E₃를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 및 혈관신생에 의한 질환 예방 및 개선용 식품 조성물 및 화장료 조성물에 관한 것이다.

엔도텔린-1(Endothelin-1 ; ET-1)은 21-아미노산 펩타이드로서 강력한 혈관수축, 기관지 수축 및 유사분열 촉진 활성을 가진다 (Uchida et al., 1988; Yanagisawa et al., 1988; MacNulty et al., 1990; Glassberg et al., 1994; D’Agostino et al., 2001). ET-1(Endothelin-1)은 혈관 평활근세포(vascular smooth muscle cell), 섬유아세포(fibroblast),사구체 간질세포(mesangial cell), 신경교세포(glial cell),멜라닌 세포(melanocyte) 및 상피기원 종양세포(tumor cells of epithelial origin)를 포함하여 다양한 세포 유형에서 강력한 유사분열 촉진물질(mitogene)이다(Nelson et al., 2003). ET-1의 생리학적 효과는 세포막 G 단백질 연관 ET_A 와ET_B 수용체를 통해 가해지는데, ET_A와ET_B 수용체는 도관 조직(vascular tissue) 및 비도관 조직 모두에서 발견된다. ET_A 수용체는 각각의엔도텔린 동형단백질(endothelin isoform)에 대하여 친화력의 차이가 있지만, ET_B 수용체는 그렇지 않다. 인간 케라틴세포는 ET_A 와 ET_B receptor를 모두 발현하며, 또한 ET-1을 생산하는데, ET-1은 멜라닌 세포의 성장에 측분비인자 (paracrine factor)로서 그리고 케라틴세포의 재생에 있어 자가분비인자(autocrine factor) 로서 행동한다. ET-1은 멜라닌세포에서 세포증식과 티로시나아제(tyrosinase)의 활성화를 자극하며, 색소침착의 발전(pigmentation development)을 이끈다(Tada et al.,1998). 또한, ET-1은 IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α 와 같은 다양한 사이토카인의 발현 및 GM-CSF, bFGF, VEGF-A, EGF 및 PDGF 와 같은 성장인자들의 발현에 영향을 준다(Matsushima et al.,2004;Giordano et al.,2011). ET-1은 케라틴 세포에서 세포증식 및 세포이주를 향상시키고 다양한 MMP를 생산하는, 혈관신생 표현형을 유도한다고 밝혀져있다. 이는 ET-1이 보통의 피부, 염증 및 다른 병리에서 기능적인 역할을 한다는 것을 시사한다(Tsuboi et al., 1994).

염증 반응은 손상이나 박테리아, 곰팡이, 바이러스 등 외부 물질에 의해 자극되어 각종 염증 매개 인자 및 면역 세포에 의한 효소의 활성화, 염증 매개물질 분비, 체액 침윤, 세포의 이동, 조직 파괴 등 일련의 복합적인 생리적 반응이 일어나는 것을 말하며, 이로 인해 홍반, 부종, 발열, 통증 등과 같은 증상이 수반된다. 염증 반응은 외부 감염원을 제거하고 손상된 조직을 재생하여 생명체의 기능을 회복시키는 작용을 하지만, 항원이 제거되지 않거나, 내부 물질이 원인이 되는 등 염증 반응이 과도하거나 지속적으로 일어나면 오히려 점막 손상, 조직 파괴 등이 일어나고, 암, 염증성 피부 질환, 관절염 등을 초래하기도 한다.

혈관신생(Angiogenesis)이란 기존의 미세혈관으로부터 새로운 모세혈관이 형성되는 과정으로, 정상적으로는 배아의 발달(embryonic development)시, 상처의 치유, 주기적인 여성의 생식기 계통의 변화 때만 일어나며 그 외의 정상적인 조건에서는 거의 일어나지 않는 현상이다. 그러나 혈관신생이 자율적으로 조절되지 못할 때 병적으로 성장함으로써 야기되는 질환들이 있는데, 병리학적 상태에서 나타나는 혈관신생에 관련된 질환으로는 혈관종, 혈관섬유종, 혈관기형 및 심혈관 질환인 동맥경화, 혈관유착, 부종성 경화증, 당뇨병이 있고, 혈관신생에 의한 안과 질환으로는 각막이식성 혈관신생, 혈관신생성 녹내장, 당뇨병성 망막증, 신생혈관에 의한 각막 질환, 반점의 변성, 익상편, 망막 변성, 후수정체 섬유증식증, 과립성 결막염등이 있으며, 류마티스 관절염과 같은 만성 염증성 질환, 모세관 확장증, 화농성 육아종, 지루성 피부염, 여드름과 같은 피부과 질환이 있으며, 종양에서 암의 성장과 전이는 반드시 혈관신생에 의존한다(Ophthalmol 102, 1261-1262, 1995; J Am Acad Derm 34(3):486-497, 1996; Circultion 93(4):632-682, 1996; Cell 86: 353-364, 1996).

상기 혈관신생 과정은 종양 사이토카인, 혈관내피세포 성장인자 (VEGF) 및 염기 섬유아세포 성장인자 (bFGF)에 의하여 내피세포의 성장을 촉진시키는 단계, 메탈로프로테아제(MMP)에 의하여 세포외 기질 단백질을 분해시키는 단계, 세포막 접착분자, 내피세포 분화 및 관 형성에 의하여 매개되는 내피세포의 이동 단계와 같은 여러 단계로 구성되어 있다 (Bussolino, F.et al., Trends Biochem. Sci. 22:251-256, 1997; Kuwano, M. et al., Intern. Med. 40:565-572, 2001; Risau, W. Angiogenesis and endothelial cell function. Arzneimittelforschung 44:416-417, 1994).

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본 발명자들은 해양 생물로부터의 신규한 endothelin-1(ET-1) 길항제를 연구하던 중, 이소나콜 E₃ 가 염증 및 혈관신생 억제 활성을 가진다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 하기 화학식 1로 표시되는 이소나콜 E₃ (isonahocol E₃) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

<화학식 1>

본 발명의 다른 목적은 상기 화학식 1로 표시되는 이소나콜 E₃ (isonahocol E₃) 을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 및 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 화학식 1로 표시되는 이소나콜 E₃ (isonahocol E₃) 을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 및 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 화학식 1로 표시되는 이소나콜 E₃ (isonahocol E₃) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 혈관신생에 의한 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 화학식 1로 표시되는 이소나콜 E₃ (isonahocol E₃) 를 유효성분으로 포함하는 혈관신생 에의한 질환 예방 및 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 화학식 1로 표시되는 이소나콜 E₃ (isonahocol E₃)를 유효성분으로 포함하는 혈관신생 에의한 질환 예방 및 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위해 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 이소나콜 E₃ (isonahocol E₃) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

<화학식 1>

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 상기 화학식 1로 표시되는 이소나콜 E₃ (isonahocol E₃) 을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 및 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 상기 화학식 1로 표시되는 이소나콜 E₃ (isonahocol E₃) 을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 및 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 상기 화학식 1로 표시되는 이소나콜 E₃ (isonahocol E₃) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 혈관신생에 의한 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 상기 화학식 1로 표시되는 이소나콜 E₃ (isonahocol E₃) 를 유효성분으로 포함하는 혈관신생에 의한 질환 예방 및 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 상기 화학식 1로 표시되는 이소나콜 E₃ (isonahocol E₃)를 유효성분으로 포함하는 혈관신생에 의한 질환 예방 및 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 이소나콜 E₃ (isonahocol E₃) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 및 혈관신생에 의한 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

<화학식 1>

본 발명의 이소나콜 E₃은 하기 화학식 1의 구조를 가지며, 천연으로부터 분리 정제하거나, 상업적으로 구입하여 사용하거나 또는 당업계에 공지된 화학적 합성법으로 제조할 수 있다.

<화학식 1>

바람직하게, 본발명의 이소나콜 E₃는 당업자에게 공지된 천연으로부터의 화합물 추출 방법으로 제조 될 수 있다. 예를 들어 Sargassum 속의 갈조식물의 추출액으로 부터 나콜(nahocol)류 및 이소나콜(isonahocol)류를 분리 정제하는 방법일 수 있으며, 좀 더 바람직하게는 Sargassum siliquastrum 으로부터 나콜(nahocol)류 및 이소나콜(isonahocol)류를 추출하는 것일수 있다.

좀더 구체적으로는 Sargassum 속의 갈조식물을 수세, 건조 및 분쇄한 뒤 메탄올, 에탄올과 같은 알코올류, 초산에틸과 같은 에스테르 류, 메틸렌 염화물, 클로로포름과 같은 할로겐화 탄화수소류, 톨루엔과 같은 방향족 탄화수소류 등의 유기 용제를 단독 또는 혼합하여, 용매로 사용하여 추출액을 만든다. 바람직하게는 사염화탄소(CH₂Cl₂)와₍methanol)메탄올을 단독 또는 혼합하여 사용할수 있다.

갈조식물의 추출액으로부터 나콜(nahocol)류 및 이소나콜(isonahocol)류를 분리 정제하는 것은 당업자에게 공지된 방법으로 행해질수 있으며, 예를 들어 실리카겔, 플로리실(florisil)과 같은 담체를 이용하는 흡착크로마토그래피, 옥타데실화 또는 옥틸화 되는 실리카켈과 같은 담체에 이용하는 역상 액체 크로마토그래피, 아비셀과 같은 셀룰로오스나 세파덱스 LH-20, 세파덱스 HP-20(팔마시아사제)과 같은 담체를 이용하는 분배 크로마토그래피 또는 분배율의 차이를 이용한 추출법등이 사용될수 있다. 바람직하게는 역상 HPLC(reverse phase HPLC) 및 silica HPLC를 사용할 수 있다.

본 발명의 이소나콜 E₃는 항염증 및 혈관신생 억제 효과가 있다.

이와 같은 효과는 본 발명의 명세서 일실시예에 잘 나타나있다.

본 발명의 일실시예에서 케라틴 세포에 이소나콜 E₃를 처리한 결과, ET-1에의해 유도되는 염증성 사이토카인 IL-6, IL-8, 및 TNF-α의 mRNA level을 상당히 억제하였다. 또한, 혈관신생인자인 MMP-1, MMP-3 및 VEGF-A의 발현을 농도 의존적으로 상당히 억제함을 확인하였다.

또한 본 발명의 일실시예에서는, 이소나콜 E₃가 HaCaT 세포에서 10μM 이하의 농도에서는 세포독성을 보이지 않음을 확인하였다.

따라서 본 발명은 이소나콜 E₃ 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 및 혈관신생에 의한 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 약학적 조성물은 이소나콜 E₃ 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기에서 ‘약학적으로 허용되는’이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 부여될 때, 통상적으로 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키기 않는 것을 말하여, 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산 (free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하다. 상기 유리산은 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한, 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 이소나콜 E₃ 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염을 단독으로 함유하거나 또는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다.

약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

본 발명의 약학적 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 약학적 조성물은 경피 투여될 수 있다. 상기에서 ‘경피 투여’란 본 발명의 약학적 조성물을 세포 또는 피부에 투여하여 약학적 조성물에 함유된 활성성분이 피부 내로 전달되도록 하는 것을 말한다. 예컨대, 본 발명의 약학적 조성물을 주사형 제형으로 제조하여 이를 30 게이지의 가는 주사 바늘로 피부를 가볍게 단자(prick)하는 방법, 또는 피부에 직접적으로 도포하는 방법으로 투여될 수 있다.

또한, 상기 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.

경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성 성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기재되어 있다.

본 발명의 이소나콜 E₃의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 이소나콜 E₃의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1kg 당 약 0.01 내지 1,000 mg, 가장 바람직하게는 0.1 내지 100 mg일 수 있다. 그러나 상기 이소나콜 E₃의 용량은 약학적 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 이소나콜 E₃을 염증 및 혈관신생 질환의 예방 또는 치료제로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.

상기 염증성 질환은 이에 제한되지는 않으나, 염증성 피부질환, 크론씨 질환(Crohn's desease), 궤양성 대장염과 같은 염증성 장질환, 복막염, 골수염, 봉소염, 뇌막염, 뇌염, 췌장염, 외상 유발 쇼크, 기관지 천식, 알러지성 비염, 낭포성 섬유증, 뇌졸중, 급성 기관지염, 만성 기관지염, 급성 세기관지염, 만성 세기관지염, 골관절염, 통풍, 척추관절병증, 강직성 척추염, 라이터 증후군, 건선성 관절병증, 장질환 척추염, 연소자성 관절병증, 연소자성 강직성 척추염, 반응성 관절병증, 감염성 관절염, 후-감염성 관절염, 임균성 관절염, 결핵성 관절염, 바이러스성 관절염, 진균성 관절염, 매독성 관절염, 라임 병, '혈관염 증후군'과 관련된 관절염, 결절성 다발동맥염, 과민성 혈관염, 루게닉 육아종증, 류마티스성 다발성근육통, 관절 세포 동맥염, 칼슘 결정 침착 관절병증, 가성 통풍, 비-관절 류마티즘, 점액낭염, 건초염, 상과염(테니스 엘보), 신경병증성 관절 질환(charco and joint), 출혈성 관절증(hemarthrosic), 헤노흐-쉔라인 자반병, 비후성 골관절병증, 다중심성 세망 조직구종, 수르코일로시스(surcoilosis), 혈색소증, 겸상 적혈구증 및 기타 혈색소병증, 고지단백혈증, 저감마 글로불린혈증, 가족성 지중해열, 베하트 병, 전신성 홍반성 루푸스, 재귀열, 다발성 경화증, 패혈증, 패혈성 쇼크, 다장기 기능장애 증후군, 급성 호흡곤란 증후군, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 급성 폐손상(acute lung injury) 기관지 폐 형성장애(broncho-pulmonary dysplasia), 건선(psoriasis), 아토피 피부염 (atopic dermatitis), 흑색종(melanoma), 건선성 관절염 (psoriatic arthritis), 홍반, 피부 염증, 급·만성 습진, 접촉성 피부염, 지루성 피부염, 만성단순태선, 간찰진, 박탈 피부염, 구진상 두드러기, 일광 피부염, 일광화상 및 여드름 등을 포함한다.

바람직하게는 염증성 피부질환이며, 이에 한정되지는 않으나 건선(psoriasis), 아토피 피부염 (atopic dermatitis), 흑색종(melanoma), 건선성 관절염 (psoriatic arthritis), 홍반, 피부 염증, 급·만성 습진, 접촉성 피부염, 지루성 피부염, 만성단순태선, 간찰진, 박탈 피부염, 구진상 두드러기, 일광 피부염, 일광화상 및 여드름 등이 포함될 수 있다.

상기 혈관신생에 의한 질환은 이에 한정되지 않으나, 혈관종, 혈관섬유종, 혈관기형, 동맥경화, 혈관유착, 부종성 경화증, 당뇨병, 각막이식성 혈관신생, 혈관신생성 녹내장, 당뇨병성 망막증, 신생혈관에 의한 각막 질환, 반점의 변성, 익상편, 망막 변성, 후수정체 섬유증식증, 과립성 결막염, 류마티스 관절염, 모세관 확장증, 화농성 육아종, 지루성 피부염, 여드름, 암, 조숙아의 망막증, 퇴화반, 수포성류천포창(bullous pemphigoid), 다형 홍반 (erythema multiforme), 헤르페스성 피부염 (dermatitis herpetic formis) 및 건선 등이 포함된다.

바람직하게는 피부에서의 혈관신생에 의한 질환이며, 이에 한정되지는 않으나 수포성류천포창(bullous pemphigoid), 다형 홍반 (erythema multiforme), 헤르페스성 피부염 (dermatitis herpetic formis), 모세관 확장증, 화농성 육아종, 지루성 피부염, 여드름 및 건선 등이 포함될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 이소나콜 E₃ (isonahocol E₃) 을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 및 혈관신생에 의한 질환의 예방 및 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.

예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 이소나콜 E₃을 차, 주스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 액상화 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 본 발명의 이소나콜 E₃과 염증 억제 또는 혈관신생 억제 효과가 있다고 알려진 공지의 물질 또는 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.

또한, 기능성 식품으로는 이에 한정되지 않지만 음료(알코올성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 상기 이소나콜 E₃를 첨가하여 제조할 수 있다.

또한, 본 발명의 이소나콜 E₃을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물 중 상기 이소나콜 E₃의 바람직한 함유량으로는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 최종적으로 제조된 식품 중 0.01 내지 50 중량%이다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 이소나콜 E₃ (isonahocol E₃) 을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 및 혈관신생에 의한 질환의 예방 및 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 화장료 조성물은 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 기제, 보조제 및 첨가제를 사용하여 액체 또는 고체 형태로 제조될 수 있다. 액체 또는 고체 형태의 화장품으로는 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 화장수, 크림제, 로숀제 및 입욕제 등의 형태를 포함할 수 있다. 이 때, 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 기제, 보조제 및 첨가제는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, 물, 알콜, 프로필렌 글리콜, 스테아르산, 글리세롤, 세틸 알콜 및 유동 파라핀 등을 포함할 수 있다.

보다 구체적으로 본 발명의 화장료 조성물은 본 발명의 이소나콜 E₃을 함유하며 피부학적으로 허용 가능한 부형제와 함께 기초 화장품 조성물(화장수, 크림, 에센스, 클렌징 폼 및 클렌징 워터와 같은 세안제, 팩, 보디오일), 색조 화장품 조성물(화운데이션, 립스틱, 마스카라, 메이크업 베이스), 두발 제품 조성물(샴푸, 린스, 헤어컨디셔너, 헤어젤), 기능성화장품 조성물(자와선 차단제, 주름개선제) 및 비누 등의 형태로 제조될 수 있다. 상기 부형제로는 이에 한정되지는 않으나 예를 들어, 피부연화제, 피부 침투 증강제, 착색제, 방향제, 유화제, 농화제 및 용매를 포함할 수 있다. 또한, 향료, 색소, 살균제, 산화방지제, 방부제 및 보습제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 물성개선을 목적으로 점증제, 무기염류, 합성 고분자 물질 등을 포함할 수 있다.

예를 들면, 본 발명의 이소나콜 E₃을 포함하는 세안제 및 비누를 제조하는 경우에는 통상의 세안제 및 비누 베이스에 이소나콜 E₃ 첨가하여 용이하게 제조할 수 있다. 크림을 제조하는 경우에는 일반적인 수중유적형(O/W)의 크림베이스에 이소나콜 E₃을 첨가하여 제조할 수 있다. 여기에 향료, 킬레이트제, 색소, 산화방지제, 방부제 등과 물성개선을 목적으로 한 단백질, 미네랄, 비타민 등 합성 또는 천연소재를 추가로 첨가할 수 있다.

상기 본 발명의 화장료 조성물에 함유되는 이소나콜 E₃의 함량은 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 내지 50 중량% , 바람직하게는 0.01 내지 10 중량% 범위로 함유될 수 있다.

본 발명의 이소나콜 E₃ 는 endothelin-1(ET-1)에 대하여 길항제 활성을 가지고, ET-1에 의해 유도되는 염증 및 혈관신생반응에 대하여 억제 작용을 나타낸다. 따라서 본 발명의 이소나콜 E₃를 유효성분으로 포함하는 조성물들은 염증성 질환 및 혈관신생에 의한 질환들을 예방, 개선 및 치료하는데 탁월한 효과가 있다.

도1은 ET-1에 의해 유도되는 ET_A 및 ET_B 수용체 발현에서, 나콜(nahocol)과 이소나콜(isonahocol) 화합물이 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도2는 이소나콜 E₃의 세포독성실험 결과를 나타낸 것이다.
도3은 이소나콜 E₃의 세포증식 억제 효과를 MTT assay로 실험하여 나타낸 것이다.
도4는 이소나콜 E₃의 세포증식 억제 효과를 BrdU incorporation assay로 실험하여 나타낸 것이다.
도5는 이소나콜 E₃의 세포증식 억제 효과를 BrdU incorporation assay로 실험하여 나타낸 것이다.
도6은 이소나콜 E₃의 IL-6 mRNA 발현 억제효과를 나타낸 것이다.
도7은 이소나콜 E₃의 IL-8 mRNA 발현 억제효과를 나타낸 것이다.
도8은 이소나콜 E₃의 TNF-α mRNA 발현 억제효과를 나타낸 것이다.
도9는 이소나콜 E₃의 세포 이주 억제 효과를 나타낸 것이다.
도10은 HaCaT 세포에서 ET-1(100 nM)을 24시간 처리하였을때 생성되는, 신생혈관 인자들(MMP-1,MMP-2,MMP-3,MMP-9,VEGF-A)의 발현정도를 qRT-PCR로 측정하여 나타낸 것이다.
도11은 이소나콜 E₃의 MMP-1 발현 억제효과를 qRT-PCR로 측정하여 나타낸 것이다.
도12는 이소나콜 E₃의 MMP-3 발현 억제효과를 qRT-PCR로 측정하여 나타낸 것이다.
도13은 이소나콜 v의 VEGF-A 발현 억제효과를 qRT-PCR로 측정하여 나타낸 것이다.
도14는 이소나콜 E₃의 MP-1,MMP-3 및 VEGF-A 발현 억제 효과를 RT-PCR로 측정하여 나타낸 것이다.
도 15는 이소나콜 E₃가 ET-1에 의해 유도된 ET_A 및ET_B 단백질의 발현을 억제함을 나타낸다.
도16은 이소나콜 E₃가 ET-1에 의해 유도된 ERK1/2 인산화(phosphorylation)를 억제함을 나타낸다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

Isonahocol E ₃ 의 제조 및 세포의 준비

< 실시예 1-1> Isonahocol E ₃ 의 추출

isonahocol compound 는 갈조류 Sargassum siliquastrum 로부터 추출되었으며, (Jung et al., 2008). 에 기재된 방법으로 수행되었다.

식물재료(Sargassum siliquastrum)는 대한민국 제주도의 조하대(0-2 m)에서 손으로 수집되었다. 샘플은 화학적으로 조사될 때까지 얼려졌다. 시료는 동결건조되었다가,물에 불려졌고(macerate),CH₂Cl₂와methanol로 반복적으로 추출되었다. 추출물은 n-Butanol 과 H₂O 사이에서 분할되었으며, n-부탄올 층은 15% aqueous methanol 과 n-Hexane 사이에서 재분할되었다. 메탄올 층은 reverse-phase vacuum flash chromatography 에 의해 분리되었고, 10% of aqueous methanol에 녹여서 분리(elute)되었다. 이 부분(fraction)은 isonahocol E₃를 추출하기위해 reverse phase HPLC 로 분리되었다. 최종 정제(purification)는 silica HPLC (30% EtoAc in n-Hexane)로 수행되었다.

< 실시예 1-2> 세포배양 및 자극

HaCaT cell line은 CLS Cell Line Services (Heidelberg, Germany) 로부터 얻었다 (Boukamp et al., 1988). 세포 배양 배지로는 10% fetal bovine serum, 1% l-glutamine, 1% sodium pyruvate (HyClone), 및 1% antibiotic-antimycotic (HyClone)이 첨가된 high glucose DMEM (HyClone) 이 사용되었으며, 세포는 37°C의 5% CO₂ 가습배양기₍humidified incubator) 속에서 배양되었다. 70~80% confluency 일때의 세포를 실험에 사용하였다. 세포에 ET-1 수용체 길항제들 (BQ123 과 BQ788)은 1μM 씩 , isonahocol E₃는 각각 5μM 및 10μM로 3시간 미리 처리하였다. 후에 ET-1 (100 nM)을 24시간 처리하여 자극시켰다. 화합물을 녹이기 위해 사용된 용매는 컨트롤(control)로 사용되었다.

< 실시예 2>

Isonahocol E ₃ 의 ET _A 및 ET _B 수용체 발현에 미치는 효과

ET-1에 의해 유도되는 생물학적 효과의 통제 및 ET_A 와 ET_B 수용체 발현 수준에 관한 나콜(nahocol)과 이소나콜(isonahocol) 화합물의 기능을 이해하기 위하여, 선택된 이소나콜 E₃와 관심있는 몇개의 화합물을 유망한 후보로하여 예비조사를 수행하였다.

HaCaT 세포는 후보 화합물(nahocols A, D_{2 ,}E, isonahocolsD₁,E₃,F)의 각기 안전한 용량(각각 5,10,30,5,10,30 μM)으로 처리되었고, BQ123 와 BQ788 는 1μM 씩 처리되었으며, ET-1 (100 nM)로 자극되었다. 데이터는 유사한 결과를 보인 세번의 독립적인 실험을 대표한다. GAPDH 는 loading control로 사용되었다.

[도 1]에서 보는 바와 같이, 이소나콜 E3가 다른 화합물에 비해 ET_A 및 ET_B 억제 효과가 뛰어나다.

< 실시예 3>

Isonahocol E ₃ 의 세포독성 평가

WST-1 assay 를 이용하여 이소나콜 E₃의 세포 생존능(cell viability) 및 세포독성(cytotoxicity)을 알아보았다.

HaCaT 세포의 생존능 평가(viability test)를 위하여 2-(4-iodophenyl)-3- (4-nitrophenyl)-5-(2, 4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium monosodium salt (WST-1)과 함께 비색분석법(colorimetric assay)이 사용되었다. 세포는 96-well plate 의 50μl medium 속에 분주되었다. 24시간 후에, 최종농도 50μM 까지 test compound 들이 각각의 well 속에 첨가되었다. 실험은 컨트롤(물질이 처리되지 않음)을 포함하여 3회 반복 실시되었다. 10 μl의 WST-1 reagent 가 각각의 well에 처리되었고, 37°C에서 3.5 시간 더 배양하였다. 그 후에 optical density 450 nm 으로 하여, plate reader로 측정하였다. 세포생존능은 컨트롤과 비교하여 처리군의 생존 퍼센테이지를 계산하였다.

[도 2]에서 보는 바와 같이, 이소나콜 E₃는 HaCaT 세포에 대하여 농도 10μM 까지는 세포독성을 보이지 않았다.

<실시예 4>

Isonahocol E ₃ 의 세포증식 억제효과

HaCaT 세포에서 이소나콜 E₃가 ET-1에 의해 유도된 세포증식에 미치는 영향을 분석하였다. HaCaT cell의 세포증식 에세이(Proliferation assay)는 (Man et al., 2006; Weichert et al., 1991)에 기재된대로 MTT 가 수행되었다. 요약하면, 화합물의 효과를 검정하기 위하여, HaCaT세포는 이소나콜 E₃과 함께 미리 배양되었고, ET-1 (100 nM)으로 자극되었다. ET-1 처리의 마지막에, 새로 준비 및 여과한 MTT(5 mg/ml) 20 μl 이 각각의 well에 처리되었고, 3.5시간동안 배양되었다. plate의 medium 을 없애고, 잠시 건조되었다. 세포는 well 당 100 μl dimethyl sulfoxide에 용해되었고, 흡수파장은 595 nm 였으며 spectrophotometric reader Elx800 (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, USA)로 측정되었다. 모든 MTT assay는 3회 시행되었다.

[도 3]에서 보는 바와 같이 이소나콜 E₃는 10 μM에서 ET-1에의해 유도되는 세포증식을 억제하였다. BQ123 은 HaCaT 증식에서 비슷한 효과를 나타냈으나. BQ788은 그렇지 않았다.

< 실시예 5>

Isonahocol E ₃ 의 유사분열 촉진반응(mitogenic responses ) 억제

ET-1에 의해 유도되는 유사분열 촉진반응(mitogenic responses)에 미치는 이소나콜 E₃의 영향은 BrdU incorporation assay 를 이용해서 알아보았다.

BrdU Incorporation Assay는 (Wajapeyee and Somasundaram, 2003)에서 기재된 바대로 수행되었다. 요약하면, HaCaT 세포가 30-40 % confluency 로 커버슬립(cover slip)에 분주되고, 1x10⁶cells/well의 세포밀도로 6well plate에 보관된다. 24시간 후에 starvation 된 세포에 10μM isonahocol E₃ 또는1μM BQ123로 처리하는데, 이때 ET-1 (100 nM) 이 24시간 처리된 상태이다. 그리고 BrdU (20 μM) 이 배양배지에 4시간동안 처리된다. 세포는 phosphate buffered saline (PBS) 으로 세척되고, 상온에서 15분 동안 4% paraformaldehyde 로 고정된다. 세포는 5% triton X-100 으로 permeabilized 되고, chromosomal DNA를 변성시키기 위해 2N HCl/Triton×100에서 배양된다. 세포는 HCl을 제거하기위해 세척되고, 비특이적 결합(nonspecific binding)을 차단하기 위해 1% bovine serum albumin 에서 배양된다. BrdU incorporation은 anti-BrdU mouse monoclonal antibody 와 Alexa flour 555 conjugated goat anti-mouse IgG (Invitrogen)을 처리함으로써 끝난다.

[도 4] 및 [도 5]에서 보는 바와 같이, ET-1 처리에의해 BrdU-positive 세포의 수가 증가되었으나, 이소나콜 E₃ 또는BQ123을 처리한 후에는 ET-1 미처리 군의 수준까지 극적으로 감소되었다. Isonahoccol E₃는 ET-1에 의한 세포의 증식을 억제하는데 BQ123와 대등한 효과를 보였다.이러한 결과는 이소나콜 E₃가 ET-1 처리된 HaCaT 세포에서 DNA합성을 효과적으로 막는다는 것을 시사한다.

< 실시예 6>

Isonahocol E ₃ 의 항염증 효과

ET-1은 IL-6, IL-8 및 TNF-α 같은 다양한 염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)의 생산에 영향을 준다고 알려져있다 (Tsuboi et al., 1994). 그러므로, qRT-PCR(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction) analysis 를 이용하여, 이소나콜 E₃가 IL-6, IL-8 및 TNF-α의 발현을 억제하는지를 조사하였다.

RNA는 모두 TRIzol reagent (Invitrogen)을 이용하여 분리되었다. 총 RNA의 1 microgram이 QuantiTech reverse Transcription kit (Qiagen)에 의해 역전사 되었다. 적어도 3개의 독립적인 RNA 샘플을 이용해 qRT-PCR analysis 가 수행되었는데, 이때 KAPA^TMSYBRFASTq-PCRMasterMix(2x)universal 과 함께 Rotorgene^TM6000(CorbettlifeScience) 가 사용되었다. mRNA의 상대적인 양은, internal control 로서 GAPDH와 함께 ΔΔCt method 를 사용하여 산출되었다. 실험에 사용된 프라이머(TNF-α ; Catalog number QT01079561, IL-6 ; Catalog number QT00083720, IL-8 ; Catalog number QT00000322, MMP-1 ; Catalog number QT00014581, MMP-3 ; Catalog number - QT00060025 , VEGF-A ; Catalog number QT01036861)들은 Qiagen 으로 부터 구입하였으며, 제조사의 방법대로 실험하였다.

[도 6],[도 7] 및 [도 8]에서 보여주는 바와 같이, 이소나콜 E₃를 각각 5 및 10 μM 처리한 것은, ET-1처리에 의해 유도된 IL-6, IL-8, 및 TNF-α의 mRNA level을 상당히 억제하였다. 다른 그룹의 세포는 사이토카인 발현에 미치는 효과를 조사하기 위해, BQ123(Endothelin receptor A에 대한 antagonist) 과 BQ788(Endothelin receptor B에 대한 antagonist)을 1μM 로 미리 처리하였다. BQ123은 TNF-α 와 IL-8 gene의 발현을 현저하게 약화시켰으나, IL-6 생산에는 영향을 주지 못했다. BQ788 또한 IL-8의 mRNA level을 억제하였으나, IL-6 및 TNF-α gene 발현에는 영향을 주지 못했다. 이러한 결과는 이소나콜 E₃가 ET-1으로 유도된 염증성 사이토카인 (pro-inflammatory cytokine) 레벨을 효과적으로 억제하며 BQ123, BQ788의 효과 이상으로 억제함을 보여준다.

< 실시예 7>

Isonahocol E ₃ 의 세포이주( cell migration ) 억제효과

이소나콜 E₃가 HaCaT 세포 이주를 억제하는지 조사하기 위해서, in vitro wound healing assay 를 수행하였다.

HaCaT 세포는 6 well plate의 각 well 당 1x10⁶cell 씩 24시간 분주되었고, PBS로 세척된 후에 0.1% FBS가 첨가된 DMEM/high Glucose medium 에서 배양되었다. 24시간의 배양후에, HaCaT세포 단층막을 200μl micro-tip을 이용하여 1mm깊이, 직선으로 긁어 상처낸다. HaCaT세포는 10μM 이소나콜 E₃으로 미리 처리된 후에, ET-1 (100 nM) 으로 자극되어 24시간 배양된다. 이미지는 상처냈을 때와 그 후 24시간의 간격을 두고 찍었고, phase-contrast microscope (OLYMPUS, Tokyo, Japan)을 이용하였다. 각각의 단층막 샘플에 대하여, 각 상처들의 3개의 영역에서 3번의 측정이 이루어졌다.

[도 9]에서 보는 바와 같이, 배양된 HaCaT 세포로 Confluent된 dish를 긁은 후에, ET-1과 이소나콜 E₃를 처리하였다. ET-1 의 단독처리는 미처리 control에 비하여 상당히 HaCaT 세포이주를 촉진했다. 하지만 이소나콜 E₃의 처리는 ET-1에의해 유도되는 세포이주를 현저하게 억제하였다.

< 실시예 8>

Isonahocol E ₃ 의 혈관신생억제 효과

염증성 사이토카인 (pro-inflammatory cytokine) IL-6 와 TNF-α 는 VEGF같은 혈관신생인자(angiogenic factor)의 발현을 높이는 것으로 알려져있다(Lazar Molnar et al., 2000). 유사하게 ET-1은 MMP-1, MMP-2, MMP-3 및 MMP-9을 포함하여 혈관형성 촉진자(pro-angiogenic factor)의 발현을 잠재적으로 유도한다 (Felx et al., 2006; Olgun and Reznik, 2010). 그러므로 qRT-PCR 및 RT-PCR analysis 를 이용하여, HaCaT cell 에서 ET-1으로 유도된 몇몇 혈관형성 촉진자의 발현에 끼치는 이소나콜 E₃의 영향을 조사하였다.

qRT-PCR은 실시예7과 동일한 방법으로 수행되었다. RT-PCR은 다음과 같은 방법에 의해 수행되었다. cDNA 의 첫번째 가닥(First strand)은 QuantiTech reverse Transcription kit (Qiagen)를 이용하여 역전사 되었고, RT-PCR은 각각의 유전자에 대한 특정 프라이머들(표 1에 기재)을 사용하여 수행되었다. PCR 조건은 증폭의 35 cycle 이 수행되었다(94°C, 30 s; 60°C, 30 s; and 72°C, 1 min). 생산물은 1.5% agarose gel에 resolve 되었으며, ethidium bromide staining으로 시각화되었다.

RT-PCR primer sequences

Gene	서열번호	Primer sequence	Size (bp)
MMP-1	1	Forward 5'-AGTGACTGGGAAACCAGATGCTGA -3' Reverse 5'-AGTCCAAGAGAATGGCCGAGTTCA - 3'	456
	2
MMP-2	3	Forward 5'- ACAGTGCATCTCAGCCCACATAGT-3' Reverse 5'- AAG CTCTGACCTTTCCAGCAGACA- 3'	323
	4
MMP-3	5	Forward 5'- GGCAGGCAAGACAGCAAGGCAT- 3' Reverse 5'- TCGGAGTCCAGCTTCCCCGTC- 3'	301
	6
MMP-9	7	Forward 5’-TACCACCTCGAACTTTGACAGCGA-3’ Reverse 5’- AAAGGCACAGTAGTGGCCGTAGAA-3’	405
	8
TIMP-1	9	Forward 5'- TCTGCAATTCCGACCTCGTCATCA- 3' Reverse 5'- AAACACTGT GCATTCCTCACAGCC-3'	356
	10
TIMP-2	11	Forward 5'- TCGGTC TGAAAGGTGTGGCCTTTA-3' Reverse 5'- GCGCAGTCTGCTTGTCAACTTTCA- 3'	472
	12
VEGF-A	13	Forward 5’- TTTCTGCTGTCT TGGGTGCATTGG-3’ Reverse 5’- TCTGCATGGTGATGTTGGACTCCT-3’	310
	14
GAPDH	15	Forward 5’- AAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3’ Reverse 5’- AGTGATGGCATGGACTGTGGTCAT-3’	534
	16

[도 10]에서 보는 바와 같이 세포에 ET-1을 100 nM로 24시간 처리한 결과, MMP-1, MMP-3 및 VEGF-A를 유도하였으나, MMP-2 와 MMP-9의 발현 level 은 미미하게 유도하였다.

[도 11] 내지 [도 14]에서 보는 바와 같이, Isonahocol E₃ 는 contorol(미처리)과 비교하여 MMP-1, MMP-3 및 VEGF-A의 발현을 농도 의존적으로 상당히 억제하였다. MMP-1 및 VEGF-A는 이소나콜 E₃에 의하여 부분적으로 억제되었지만, MMP-3의 발현은 완전히 억제되었다. 이러한 결과는 HaCaT 세포 내 혈관형성 촉진자에 대한 ET-1의 효과에 있어서 이소나콜 E₃가 길항작용을 한다는 것을 시사한다. BQ123 과 BQ788 로 전 처리된 세포들은 MMP-3 발현 레벨을 제외하고 이소나콜 E₃와 비슷한 결과를 보여준다. 대표적인 혈관 형성 인자들은 ET-1에 의해 증가되며, 이들은 Isonahocol E3에 의해 발현량이 억제된다. 이 효과는 BQ123이나 BQ788에 의한 효과보다 더 크다는 것을 보여준다.

< 실시예 9>

Isonahocol E ₃ 의 ET -1 receptor downregulation

ET-1 수용체 발현에 미치는 이소나콜 E₃의 효과를 알아보기 위해, ET-1 의 존재 하에서 세포에 이소나콜 E₃를 농도별로 처리하였다.

HaCaT 세포는 분주되고 난 후 24시간 동안 serum starved 되었고, ET-1 의 존재 하에서 이소나콜 E₃가 농도별로 24시간동안 처리되었다.

[도 15]에서 보는 바와 같이, 이소나콜 E₃가 ET_A 수용체 발현을 효과적으로 하향조절(downregulation)한다는 것을 보여준다. ET_B는 ET-1에 의해 조금 유도되었음에도 불구하고, 이소나콜 E₃ 10 μM 에서 ET_B 를 하향조절했다.

< 실시예 10>

Isonahocol E ₃ 의 ERK 인산화( phosphorylation ) 억제

ET-1에의해 유도되는 ERK의 활성화는 세포의 성장 및 분화(differentiation)를 조절하는데 자주 필요로된다 (Whelchel et al., 1997). 그러므로 ET-1에의해 유도되는 ERK signaling 활성화에 이소나콜 E₃가 영향을 주는지 알아보았다.

HaCaT 세포는 각 농도별로 3시간동안 이소나콜 E₃로 미리 처리된 후 ET-1(100nM)로 10분간 자극되었다. MAP kinases (ERK, p38, JNK) 및 이들의 인산화 형태에 대한 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다. HaCaT 세포는 protease inhibitor mixture (Roche)가 첨가된 cell lysis buffer [25 mM Tris-phosphate (pH 7.8), 2 mM DTT, 2 mM EDTA, 10% glycerol, 1% Triton X-100] 에서 harvest 되었다. 추출물(extract)은 10% SDS/PAGE에서 분리되었으며, PVDF membrane으로 옮겨졌고, 하기의 primary antibody 및 secondary antibody로 western blott을 하였다.

primary antibody : anti-endothelin A receptor, anti-endothelin B receptor (Abcam), anti-phospho-ERK1/2, anti-phospho-p38, anti-phospho-JNK and anti-ERK1/2, anti-p38, anti-JNK polyclonal antibodies (Cell Signaling Technology, Inc), and anti-GAPDH (Santa Cruz Biotechnology)

secondary antibody; HRP-conjugated anti-Rabbit IgG (Invitrogen)

면역반응성 단백질들(immunoreactive protein)은 향상된 chemiluminescence (ECL solution, West-one, iNtRON biotechnology)에 의해 시각화되었다.

[도 16]에서 보는 바와 같이, 이소나콜 E₃가 HaCaT 세포에서, ET-1에의해 유도되는 ERK1/2 인산화(phosphorylation)를 억제한다. 역으로, p38 과 c-Jun N-terminal kinase (JNK) 인산화는 ET-1 에의해 유도되지 않으며, 이소나콜 E₃의 영향도 받지 않는다.

상기 모든 실시예에서, 통계적 유의도(Statistical significance)는 독립적인 그룹에 대한 student t test와 함께 평균 ± 표준편차(SD) 수치를 비교함으로써 평가되었다. 모든 측정은 3번 반복하여 수행되었으며, 다른 언급이 없는 한 실험은 3회 반복되었다.

데이터는 평균±표준편차로 나타내어졌으며, 적어도 세번의 독립적인 실험을 대표한다.#p<0.05, ##p<0.005 (DMSO-treated group vs. ET-1-treated group); *p<0.05, **p<0.005 (ET-1-treated group vs. compound-treated group).

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 신규한 이소나콜 E₃를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 및 혈관신생에 의한 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다. 좀 더 상세하게는 화학식 1로 표시되는 이소나콜 E₃ 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 및 혈관신생에 의한 질환의 예방 및 치료용 약학적조성물 및 화학식 1로 표시되는 이소나콜 E₃ 를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 및 혈관신생에 의한 질환 예방 및 개선용 식품 조성물 및 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 조성물들은 염증성 질환 및 혈관신생에 의한 질환들을 예방, 개선 및 치료하는데 탁월한 효과가 있어 산업상 이용 가능성이 높다.

<110> CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Composition for preventing and treating inflammatory diseases and angiogenesis-induced disease comprising novel isonahocol E3 as an active ingredient <130> NP13-0045 <160> 16 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for MMP-1 <400> 1 agtgactggg aaaccagatg ctga 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for MMP-1 <400> 2 agtccaagag aatggccgag ttca 24 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for MMP-2 <400> 3 acagtgcatc tcagcccaca tagt 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for MMP-2 <400> 4 aagctctgac ctttccagca gaca 24 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for MMP-3 <400> 5 ggcaggcaag acagcaaggc at 22 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for MMP-3 <400> 6 tcggagtcca gcttccccgt c 21 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for MMP-9 <400> 7 taccacctcg aactttgaca gcga 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for MMP-9 <400> 8 aaaggcacag tagtggccgt agaa 24 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for TIMP-1 <400> 9 tctgcaattc cgacctcgtc atca 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for TIMP-1 <400> 10 aaacactgtg cattcctcac agcc 24 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for TIMP-2 <400> 11 tcggtctgaa aggtgtggcc ttta 24 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for TIMP-2 <400> 12 gcgcagtctg cttgtcaact ttca 24 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for VEGF-A <400> 13 tttctgctgt cttgggtgca ttgg 24 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for VEGF-A <400> 14 tctgcatggt gatgttggac tcct 24 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for GAPDH <400> 15 aaggtcggag tcaacggatt tggt 24 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for GAPDH <400> 16 agtgatggca tggactgtgg tcat 24

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 이소나콜 E₃ (isonahocol E₃) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
<화학식 1>
하기 화학식 1로 표시되는 이소나콜 E₃ (isonahocol E₃) 을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 및 개선용 식품 조성물.
<화학식 1>
하기 화학식 1로 표시되는 이소나콜 E₃ (isonahocol E₃) 을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 및 개선용 화장료 조성물.
<화학식 1>
제1항에 있어서, 상기 염증성 질환은 염증성 피부질환, 크론씨 질환(Crohn's desease), 염증성 장질환, 복막염, 골수염, 봉소염, 뇌막염, 뇌염, 췌장염, 기관지 천식, 알러지성 비염, 급성 기관지염, 만성 기관지염, 급성 세기관지염, 만성 세기관지염, 골관절염, 통풍, 강직성 척추염, 라이터 증후군, 장질환 척추염, 연소자성 강직성 척추염, 감염성 관절염, 후-감염성 관절염, 임균성 관절염, 결핵성 관절염, 바이러스성 관절염, 진균성 관절염, 매독성 관절염, 결절성 다발동맥염, 과민성 혈관염, 관절 세포 동맥염, 가성 통풍, 비-관절 류마티즘, 점액낭염, 건초염, 상과염, 헤노흐-쉔라인 자반병, 수르코일로시스(surcoilosis), 전신성 홍반성 루푸스, 다발성 경화증, 패혈증 및 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease)로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 조성물.
제2항에 있어서, 상기 염증성 질환은 염증성 피부질환, 크론씨 질환(Crohn's desease), 염증성 장질환, 복막염, 골수염, 봉소염, 뇌막염, 뇌염, 췌장염, 기관지 천식, 알러지성 비염, 급성 기관지염, 만성 기관지염, 급성 세기관지염, 만성 세기관지염, 골관절염, 통풍, 강직성 척추염, 라이터 증후군, 장질환 척추염, 연소자성 강직성 척추염, 감염성 관절염, 후-감염성 관절염, 임균성 관절염, 결핵성 관절염, 바이러스성 관절염, 진균성 관절염, 매독성 관절염, 결절성 다발동맥염, 과민성 혈관염, 관절 세포 동맥염, 가성 통풍, 비-관절 류마티즘, 점액낭염, 건초염, 상과염, 헤노흐-쉔라인 자반병, 수르코일로시스(surcoilosis), 전신성 홍반성 루푸스, 다발성 경화증, 패혈증 및 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease)로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 조성물.
제3항에 있어서, 상기 염증성 질환은 염증성 피부질환, 크론씨 질환(Crohn's desease), 염증성 장질환, 복막염, 골수염, 봉소염, 뇌막염, 뇌염, 췌장염, 기관지 천식, 알러지성 비염, 급성 기관지염, 만성 기관지염, 급성 세기관지염, 만성 세기관지염, 골관절염, 통풍, 강직성 척추염, 라이터 증후군, 장질환 척추염, 연소자성 강직성 척추염, 감염성 관절염, 후-감염성 관절염, 임균성 관절염, 결핵성 관절염, 바이러스성 관절염, 진균성 관절염, 매독성 관절염, 결절성 다발동맥염, 과민성 혈관염, 관절 세포 동맥염, 가성 통풍, 비-관절 류마티즘, 점액낭염, 건초염, 상과염, 헤노흐-쉔라인 자반병, 수르코일로시스(surcoilosis), 전신성 홍반성 루푸스, 다발성 경화증, 패혈증 및 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease)로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 조성물.
제4항에 있어서, 상기 염증성 피부질환은 건선(psoriasis), 아토피 피부염 (atopic dermatitis), 홍반, 피부 염증, 급·만성 습진, 접촉성 피부염, 지루성 피부염, 박탈 피부염, 일광 피부염, 및 여드름으로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 조성물.
제5항에 있어서, 상기 염증성 피부질환은 건선(psoriasis), 아토피 피부염 (atopic dermatitis), 홍반, 피부 염증, 급·만성 습진, 접촉성 피부염, 지루성 피부염, 박탈 피부염, 일광 피부염, 및 여드름으로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 조성물.
제6항에 있어서, 상기 염증성 피부질환은 건선(psoriasis), 아토피 피부염 (atopic dermatitis), 홍반, 피부 염증, 급·만성 습진, 접촉성 피부염, 지루성 피부염, 박탈 피부염, 일광 피부염, 및 여드름으로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 조성물.
하기 화학식 1로 표시되는 이소나콜 E₃ (isonahocol E₃) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 혈관신생에 의한 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
<화학식 1>
하기 화학식 1로 표시되는 이소나콜 E₃ (isonahocol E₃) 를 유효성분으로 포함하는 혈관신생에 의한 질환 예방 및 개선용 식품 조성물.
<화학식 1>
하기 화학식 1로 표시되는 이소나콜 E₃ (isonahocol E₃)를 유효성분으로 포함하는 혈관신생에 의한 질환 예방 및 개선용 화장료 조성물.
<화학식 1>
제10항에 있어서, 혈관신생에 의한 질환은 혈관종, 혈관섬유종, 각막이식성 혈관신생, 혈관신생성 녹내장, 당뇨병성 망막증, 신생혈관에 의한 각막 질환, 익상편, 후수정체 섬유증식증, 모세관 확장증, 화농성 육아종 및 암으로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 조성물.
제11항에 있어서, 혈관신생에 의한 질환은 혈관종, 혈관섬유종, 각막이식성 혈관신생, 혈관신생성 녹내장, 당뇨병성 망막증, 신생혈관에 의한 각막 질환, 익상편, 후수정체 섬유증식증, 모세관 확장증, 화농성 육아종 및 암으로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 조성물.
제12항에 있어서, 혈관신생에 의한 질환은 혈관종, 혈관섬유종, 각막이식성 혈관신생, 혈관신생성 녹내장, 당뇨병성 망막증, 신생혈관에 의한 각막 질환, 익상편, 후수정체 섬유증식증, 모세관 확장증, 화농성 육아종 및 암으로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 조성물.