KR101570847B1

KR101570847B1 - 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 다신초 추출물을 포함하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR101570847B1
Application number: KR1020130095931A
Authority: KR
Inventors: 최종완; 정민석; 박창민; 한나경
Original assignee: 주식회사 한국화장품제조
Priority date: 2013-08-13
Filing date: 2013-08-13
Publication date: 2015-11-20
Also published as: KR20150019276A

Abstract

조직배양한 덴드로비움 칸디둠 원괴체상구체 추출물, 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 다신초 추출물, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 화장료 조성물 및 그 제조 방법이 개시된다. 본 발명에 따른 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 원괴체상구체 추출물 및 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 다신초 추출물은 활성산소 소거 및 활성 증대 효과, 피부 멜라닌 생성 억제 효과를 가지므로, 피부보호 및 피부개선을 위한 화장료 조성물에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

조직배양한 덴드로비움 칸디둠 다신초 추출물을 포함하는 화장료 조성물{COSMETIC COMPOSITION INCLUDING AN EXTRACT OF THE TISSUE-CULTURED DENDROBIUM CANDIDUM MULTI-SHOOTS}

본 발명은 화장료 조성물에 관한 것으로서, 더 자세하게는 인체의 피부의 생리활성을 강화시켜 피부보호 및 피부개선에 기여할 수 있는 화장료 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

피부는 외부 자극으로부터 인체를 보호하는 것이다. 그러나 환경적, 물리적, 화학적인 외부 자극에 노출되면 정상적인 피부 보호 기능이 저하되면서 주름, 각질, 기미, 주근깨 등과 같은 피부 문제가 발생하게 된다(Daniell HW, Ann. Intern. Med., 1971, 75(6), 873; Grove GL 등, J. Am. Acad.Dermatol., 1989, 21(3), 631; Griffiths CE 등, Arch. Dermatol., 1992, 128, 347).

외부 자극에 의해 야기되는 피부보호기능 메커니즘 중의 하나는 자유라디칼 경로를 경유하는 것이다(Harman D, J. Gerontol., 1956, 11(3), 298). 외부 자극에 의한 체내의 자유라디칼의 비정상적 발생은 콜라겐 등의 결합조직 형성 파괴, 피부 색소 침착, 세포막 기능저해, DNA 변이 촉진, 단백질 작용 변형, 신진 대사와 관련된 분자들의 변형 등을 유발하여 피부기능을 저하시킨다(Lavker RM 및 Kligman AM, J. Invest. Dermatol., 1988, 90, 325). 따라서 사람의 피부에 대해서 안전성이 인정되는 항산화 물질의 개발이 절실히 요구된다. 이에 따라, 사람의 피부에 대해서 안전성이 보증되며, 경제적이면서 식물 기원의 피부 생리 활성 효능 효과가 우수한 천연 화장품 원료를 개발하고자 천연물을 대상으로 한 연구가 수행되고 있다(Larson RA, Phytochemistry, 1988, 27, 969, (中谷延二, 日本食品工業學會誌, 1990, 37, 569)).

일반적으로, 천연식물 추출물을 함유하는 기능성 화장품은 식물들이 생육할 수 있는 조건인 열대우림기후로부터 냉대, 한대 기후에서 생육하는 모든 식물을 사용하고 있다. 식물들은 각각의 기후와 환경에 적응하여 그 조건에서 최적의 생체 메커니즘을 통해서 생육하게 된다. 따라서 같은 종의 식물이라도, 생육하는 위도에 따른 일조량, 기온, 강수량, 토양의 산도, 비옥도 등의 기후조건, 및 계절별 및/또는 식물체의 부위별로, 식물 내부의 2차 대사산물과 같은 유효성분들의 종류와 함량이 다를 수 있다. 뿐만 아니라, 제조에 따른 공급이 수요를 충족시키기가 어렵고, 가공비용이 많이 드는 등의 단점을 극복하기 어렵다. 이러한 여러 가지 어려움을 개선하기 위해, 최근 식물배양기술을 이용한 화장품 원료개발이 두드러지고 있다.

한편, 덴드로비움(Dendrobium)은 전세계에 1,000여 종이 자생하고 있는 착생란으로 인도, 오스트레일리아, 인도차이나, 태국, 필리핀, 미얀마 등 동남아시아에 분포한다.

덴드로비움 중에서 덴드로비움 칸디둠(Dendrobium candidum)은 난과 석곡속 다년생 초본식물로서 중국에서 오랫동안 사용해온 전통 약제이다. 덴드로비움 칸디둠(Dendrobium candidum)은 백내장, 인후염과 감기치료 등에 처방되고 있으며, 위액분비촉진작용제 및 강장제로 쓰여져 왔다. 덴드로비움 칸디둠(Dendrobium candidum)은 알칼로이드(alkaloids), 스틸베노이드(stilbenoids), 다당류 (polysaccharides) 등 약효성분들을 포함하고 있어서, 면역력 증강, 항 종양, 항 돌연변이 등의 생리활성 효과를 가지는 연구결과가 보고되어 있다.

그러나, 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 원괴체상구체(Tissue-Cultured Dendrobium Candidum Protocorm-Like Body) 및 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 다신초(Tissue-Cultured Dendrobium Candidum Multi-Shoots)의 효능에 대해서 보고된 과학적 실험 결과는 미비할 뿐만 아니라, 특히 화장료 성분으로 응용하기 위한 연구결과는 아직까지 보고된 바 없다.

따라서, 본 발명의 목적은, 조직 배양한 덴드로비움 칸디둠 원괴체상구체 추출물 또는 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 다신초 추출물을 이용하여 세포보호, 항산화 및 미백 효과를 가지는 화장료 조성물 및 그 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 목적들은 이상에서 언급한 목적들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 목적들은 아래의 기재로부터 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은, 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 원괴체상구체 추출물, 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 다신초 추출물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나로 이루어진 조직배양한 덴드로비움 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 한다.

여기서, 상기 조직배양한 덴드로비움 추출물은 상기 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.1 중량% 이상 및 20 중량% 이하의 범위로 함유되는 것이 바람직하다.

특히, 상기 조직배양한 덴드로비움 추출물은, 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 원괴체상구체, 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 다신초, 또는 이들의 혼합물로부터 정제수, C1 내지 C4의 알코올, 및 C1 내지 C5의 다가알코올로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 용매를 이용하여 추출될 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은, 유연화장수, 영양화장수, 영양유액, 유화상크림, 영양크림, 젤상크림, 맛사지크림, 에센스, 바디오일, 메이크업베이스, 파운데이션 및 팩으로 이루어진 군에서 선택되는 제형을 가질 수 있다.

아울러, 본 발명에 따른 조직배양한 덴드로비움 추출물의 제조방법은, (a) 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 원괴체상구체, 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 다신초, 또는 이들의 혼합물을 정제수, C1 내지 C4의 알코올, 및 C1 내지 C5의 다가알코올로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 추출용매에 5일 내지 50일 동안 침적시켜 침적용액을 형성하는 단계; 및 (b) 상기 침적용액을 여과함으로써 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 원괴체상구체 추출물, 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 다신초 추출물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나로 이루어진 조직배양한 덴드로비움 추출물을 얻는 단계;를 포함할 수 있다.

여기서, 상기 추출용매는 상기 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 원괴체상구체, 상기 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 다신초, 또는 이들의 혼합물의 총중량에 대하여 10배 이상 내지 20배 이하의 중량비를 갖는 것이 바람직하다.

아울러, 상기 C1 내지 C4의 알코올은 에탄올이고, 상기 C1 내지 C5의 다가알코올은 1,3-부틸렌글리콜인 것이 바람직하다.

본 발명의 화장료 조성물은 피부 자극으로부터 자유롭고, 세포보호효과와 더불어 항산화, 미백 효과를 가지므로 피부노화방지, 피부개선 및 보호에 매우 효과적이다.

특히, 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 원괴체상구체 추출물 또는 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 다신초 추출물은 항산화 효과 및 피부 멜라닌 생성 억제 효과를 가지므로, 이를 포함하는 화장료 조성물은 스트레스, 자외선, 환경오염 등의 피부 노출로 인해 저하된 피부의 생리활성을 강화시켜 피부 보호 및 피부개선에 기여 할 수 있다.

본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 이를 상세한 설명을 통해 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

이하, 본 발명의 실시를 위한 구체적인 내용을 설명하도록 한다.

본 발명에 따른 "조직배양한 덴드로비움 칸디둠 원괴체상구체(Tissue-Cultured Dendrobium Candidum Protocorm-Like Body)"란 덴드로비움 칸디둠의 줄기로부터 식물조직 배양기술을 이용하여 원괴체상구체(protocorm-like body)를 유도하고 배양한 것을 의미한다. 또한, "조직배양한 덴드로비움 칸디둠 다신초(Tissue-Cultured Dendrobium Candidum Multi-Shoots)"란 덴드로비움 칸디둠 원괴체로부터 유도한 신초를 식물조직 배양기술을 이용하여 기내 배양한 식물체를 의미한다.

본 발명의 발명자들은 조직배양한 덴드로비움 칸디둠의 원괴체상구체 추출물 및 조직배양한 덴드로비움 칸디둠의 다신초 추출물의 효능효과 평가를 중심으로 하여, 식물배양기술을 이용한 화장품으로서의 응용 가능성에 대한 오랜 연구를 통해 본 발명을 완성하였다. 그 결과, 본 발명의 발명자들은 조직배양한 덴드로비움 칸디둠의 원괴체상구체 추출물 및 조직배양한 덴드로비움 칸디둠의 다신초 추출물이 세포보호, 항산화 및 미백 효과가 매우 뛰어나다는 것을 밝혀내었다.

본 발명에 따른 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 원괴체상구체 추출물 및 조직배양한 덴드로비움 칸디둠의 다신초 추출물 중 적어도 하나를 함유한 화장료 조성물은, 각종 외부 자극으로부터 피부를 보호하여 피부를 부드럽고 윤기 있게 가꾸어 주며, 나아가 피부기능 개선에 도움을 준다.

한편, 본 명세서에서 "조직배양한 덴드로비움 추출물"은, 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 원괴체상구체 추출물, 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 다신초 추출물 및 이들의 혼합물(즉, 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 원괴체상구체 추출물 및 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 다신초 추출물을 포함하는 혼합물)로 이루어진 군으로부터 어느 하나로 이루어진 추출물을 의미한다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은, 상기 조직배양한 덴드로비움 추출물을 조성물의 총 중량에 대하여 0.1 내지 10 중량%로 함유하는 것이 바람직하다. 상술한 범위를 만족하면, 유의성이 있는 효과, 즉 각종 외부 자극으로부터 피부를 보호하여 피부를 부드럽고 윤기 있게 가꾸어 주며, 피부기능 개선에 도움을 주는 효과가 나타난다. 또한, 최종 제품에서의 추출물의 고유 냄새, 색상 등을 고려할 때 상기와 같은 범위로 포함되는 것이 유리하다.

또한, 상기 조직배양한 덴드로비움 추출물은, 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 원괴체상구체, 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 다신초 또는 이들의 혼합물을 정제수, C1 내지 C4의 알코올 및 C1 내지 C5의 다가알코올로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 용매를 사용하여 추출하는 것이 바람직하다.

본 발명의 화장료 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 각종 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 핸드크림, 파운데이션, 메이크업베이스, 트윈케익, 마스카라, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클린저 등이 있으며, 이로 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 화장품 조성물이 상술한 형태의 제형으로 제조될 때, 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있다. 또한, 이들 성분의 종류와 양은 당 업자에 의해 용이하게 선정될 수 있다.

본 발명은, (a) 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 원괴체상구체, 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 다신초, 또는 이들의 혼합물을 정제수, C1 내지 C4의 알코올 및 C1 내지 C5의 알킬렌글리콜로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 추출용매에 10℃ 이상 내지 40℃ 이하의 온도 조건에서 5일 내지 50일 동안 침적하여 침적용액을 형성하는 단계; 및 (b) 상기 침적용액을 여과함으로써 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 원괴체상구체 추출물, 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 다신초 추출물 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나로 이루어진 조직배양한 덴드로비움 추출물을 얻는 단계를 포함한다.

상기 (a)단계에서는, 상기 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 원괴체상구체 또는 상기 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 다신초가 건조된 상태인 것이 바람직하다. 상기 침적시간은 20 내지 40 일인 것이 바람직하다.

상기 추출용매는, 상기 건조된 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 원괴체상구체, 상기 건조된 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 다신초, 또는 이들의 혼합물의 총 중량에 대비하여, 10 내지 20배의 중량비(w/w)로 사용하는 것이 바람직하다.

상기 C1 내지 C4의 알코올은 메틸알코올, 에틸알코올, 프로필알코올, 부틸알코올일 수 있으며, 특히 에탄올(에틸알코올)인 것이 바람직하다. 또한, 상기 C1 내지 C5의 다카알코올은, 알킬렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 및 펜틸렌글리콜로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것이 바람직하다.

또한, 상기 추출용매가 상기 알코올과 알킬렌글리콜의 혼합용매일 경우, 이들의 혼합비(w/w)가 6:4 내지 9:1인 것이 바람직하다(즉, 알코올 및 아킬렌글리콜의 전체 혼합용매의 총 중량에 대하여, 알코올의 중량이 60 중량% 이상 및 90 중량% 이하의 범위인 것이 바람직하다). 상기 알코올과 알킬렌글리콜의 혼합용매의 함유량이 상술한 범위이면, 원하는 유용성분만을 추출하는데 보다 효율적인 극성을 갖는다. 여기서, 상기 알코올과 알킬렌글리콜의 혼합용매에 사용되는 알코올의 농도는 70% 내지 100%인 것이 바람직하다.

또한, 상기 추출용매는 상기 정제수와 상기 알킬렌글리콜의 혼합용매일 수 있는데, 이들의 혼합비가 3:7 내지 1:9인 것이 바람직하다(즉, 정제수 및 알킬렌글리콜의 전체 혼합용매의 총 중량에 대하여, 알킬렌글리콜의 중량이 70 중량% 이상 및 90 중량% 이하인 것이 바람직하다).

상기 추출용매가 단독용매일 경우 에탄올인 것이 바람직하다. 그리고, 혼합용매일 경우 알코올과 알킬렌글리콜의 혼합용매를 이용할 수 있고, 바람직하게는 에탄올과 1,3-부틸렌글리콜, 에탄올과 프로필렌글리콜 또는 에탄올과 펜틸렌글리콜의 혼합용매를 이용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 에탄올과 1,3-부틸렌글리콜 의 혼합용매를 이용할 수 있다.

상기 (b)단계는 상기 추출용매를 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상술한 제조공정으로 얻어진 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 원괴체상구체 추출물 또는 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 다신초 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공한다. 상기 제조공정에 의해 얻어진 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 원괴체상구체 추출물 및/또는 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 다신초 추출물에 의한 세포보호효과, 자유라디칼 소거 활성에 따른 항산화 효과 및 타이로시나아제 억제를 통한 피부 멜라린 합성 억제효과를 측정하여, 본 발명의 조직배양한 덴드로비움 원괴체상구체 추출물 및 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 다신초 추출물의 피부 생리 활성 증대 효과를 확인하였다.

나아가, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 아래에서 예시한 제형에 의해 한정되지 않고, 당 기술분야에 알려져 있는 제형을 취할 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물에는 상기 추출물과 더불어 통상 화장료에 배합되는 다른 성분을 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합할 수 있다.

이하에서는 본 발명에 따른 제조예, 시험예 및 제형예를 들어 보다 구체적으로 설명할 것이나, 이들은 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 이들에 의하여 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

[제조예 1 내지 4, 비교제조예 1 내지 비교제조예 4: 조직 배양한 덴드로비움 칸디둠 원괴체상구체 추출물, 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 다신초 추출물, 및 야생의 덴드로비움 추출물의 제조]

조직배양한 덴드로비움 칸디둠 원괴체상구체, 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 다신초, 및 야생의 덴드로비움 칸디둠을 각각 건조 및 세절하여 준비하였다. 여기서, 본 발명에 사용된 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 원괴체상구체 및 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 다신초는 충북대학교 첨단원예기술개발연구센터에서 제공받은 것으로 건조시켜 사용하였다. 상기와 같이 준비된 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 원괴체상구체, 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 다신초, 및 야생의 덴드로비움 칸디둠을 표 1에 기재된 함량으로 존재하는 혼합용매에 4주간 침적하여 숙성하였다. 그 후, 여과지(일본 ToyoroshiKaisha, Ltd.에서 시판되는 5C, 185㎜)에 여과하여 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 원괴체상구체 추출물, 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 다신초 추출물, 및 야생의 덴드로비움 칸디둠 추출물을 수득하였다.

[시험예 1: 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 원괴체상구체 추출물 및 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 다신초 추출물의 세포보호효과 측정]

<세포 배양 (Cell culture)>

ATCC사로부터 구입한 CCD-1064sk 사람섬유아세포를 10% 우태아혈청(FBS), 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)을 첨가한 이스코브스 모디파이드 둘베코스 미듐(Iscove's modified Dulbeco's medium: IMDM)으로 10㎝ 세포 배양접시에 10㎖의 배지로 37℃ 및 5% CO₂ 배양기에서 세포가 70% 내지 80% 합류(confluency)가 되도록 배양하였다. 배지는 일주일에 두 번씩 갈아주고, 합류에 도달한 세포는 트립신-EDTA(trypsin-EDTA)를 사용하여 트립신처리(trypsinization)를 한 후, 계대 배양하여 유지하였다. 이렇게 배양된 사람섬유아세포를 96-멀티웰 플레이트(96-multiwell plate)에 각각 1 × 10⁴세포/웰로 분주하고 24시간 배양하였다. 배양된 세포의 배지를 2% FBS 배지로 교체하고, 제조예 1 및 3, 비교제조예 1 및 3을 각각 처리 농도별로 배지에 희석하여 처리한 후 48시간 동안 CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다.

제조예 1 및 3과 비교제조예 1 및 3에 대한 SDS(Sodium dodecyl sulfate) 세포독성에 대한 세포보호효과 실험을 실시하였다.

사람섬유아세포를 10% 우태아혈청(FBS), 1% 페니실린-스트렙토마이신을 첨가한 IMDM으로 37℃ 및 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배양된 사람섬유아세포를 96-멀티웰 플레이트에 각각 1×10⁴세포/웰로 분주하고 24시간 배양하였다. 배양된 세포의 배지를 2% FBS 배지로 교체하고 SDS(Sodium dodecyl sulfate) 0.002%를 1시간 전처리한 후, 제조예 1 및 3, 비교제조예 1 및 3를 각각 처리 농도별로 배지에 희석하여 병행 처리한 다음에, 24시간 동안 CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 배양이 끝난 세포에, PBS(phosphate buffered saline)에 용해한 MTT 저장 용액(5 mg/㎖)을 새로운 배지에서 10배 희석하고, 이 용액을 세포 각각의 웰에 100㎕씩 첨가하여 37℃에서 4시간 반응시켰다. 반응 후 살아있는 세포는 미토콘드리아에 존재하는 탈수소 효소에 의해 노란색의 수용성 기질인 MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium-bromide]가 비수용성의 MTT-포마즌 결정으로 환원되므로, 이것의 양을 재면 세포 생존율을 측정할 수 있다. 배양 상등액을 제거하고 각각의 웰에 DMSO 200㎕를 첨가하여 세포에서 생성된 MTT-포마즌 결정체를 용해시킨 후 흡수분광광도계(UVmax, Molecular Device, USA)로 포마즌의 흡광도가 최대가 되는 시험필터인 540㎚의 파장에서의 O.D.값과 참조필터인 630㎚ 파장의 O.D.값을 측정하여 그 차이값의 흡광도를 구하였다(참고문헌: The EMBO Journal(2002)21, 2407-2417외 다수). 세포 보호 효과는 흡광도의 백분율로 나타내었다.

※ 세포생존율(%) = (시료 처리군 흡광도)/(무처리군 흡광도)×100

로(Raw) 데이터를 토대로 무처리군의 흡광도와 시료 처리군의 흡광도의 평균을 계산하여 표준편차를 구하였다.

표 2에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 제조예 1 및 3의 경우 야생의 덴드로비움 칸디둠 추출물인 비교제조예 1 및 3보다 외부자극에 대하여 더 우수한 세포보호효과를 촉진시킴을 알 수 있다.

[시험예 2: 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 원괴체상구체 추출물 및 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 다신초 추출물의 타이로시나제 활성 및 멜라닌 합성 억제 효과 측정]

<시험예 2-1: 타이로시나제 활성 저해 시험>

제조예 1 및 3과 비교제조예 1 및 3의 미백활성을 조사하기 위해 타이로시나제 활성 저해 시험을 실시하였다. 실험을 위해, 타이로시나제 효소액은 버섯 타이로시나제(mushroom tyrosinase, T-3824, 1530U/㎎, Sigma)를 1000U/㎖이 되도록 인산염 완충액(pH 6.5)으로 녹여 준비하였으며, 기질액은 L-타이로신(L-tyrosine, 45160-0410, Junsei chemical co. Ltd)을 1.5mM이 되도록 인산염 완충액(pH 6.5)으로 녹여 준비하였다.

제조예 1 및 3과 비교제조예 1 및 3을 완충액에 농도별로 희석하여 검액을 준비하였다. 검액 170㎕, 타이로시나제 효소액 10㎕를 넣고 37℃에서 10분간 방치하였다. 여기에 기질액 20㎕를 넣은 다음 37℃에서 10분간 반응시킨 후, 바로 얼음 중에 5분간 방치한 후, 흡수분광광도계(UVmax, Molecular Device, USA)를 이용하여 파장 490㎚에서 흡광도를 측정하였다. 상기에서 측정된 흡광도를 하기 수학식 2에 대입하여 타이로시나제 활성저해율을 계산하여 표 3에 나타내었다. 검액 대신 인산염 완충액(pH 6.5)을 넣어 조작한 액을 공시험액으로, 기질액 대신 인산염 완충액(pH 6.5)을 넣어 조작한 액을 보정액으로 하였다.

[수학식 2]

타이로시나제 활성저해율(%) = 100 - (A-A'/(B-B') X 100

(A: 검액 반응 후의 흡광도, B: 공시험액의 반응 후의 흡광도, A': 검액의 보정액, B': 공시험액의 보정액)

<시험예 2-2: 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 원괴체상구체 추출물 및 조직배향한 덴드로비움 칸디둠 다신초 추출물의 농도에 따른 멜라닌 합성 억제 측정 실험>

제조예 1 및 3과, 비교제조예 1 및 3에 대하여 B-16 멜라노마 세포(Melanoma cell: 연세대학교 원주 의과대학 분양)를 이용하여 미백효과를 측정하였다. 측정방법으로는 블랙 마우스에서 유래된 B-16 멜라노마 세포를 10% FBS(GIBCO., USA)가 함유된 DMEM으로 6 웰 조직 배양 접시에 2×10⁴ 세포/웰 농도로 2㎖씩 첨가하고 5% CO₂, 37℃ 조건하에서 24시간 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 10% FBS, 2uM α-MSH(Sigma., USA, Melanocyte stimulating Hormone)과 2mM 테오필린(Sigma., USA, theophylline)이 함유된 DMEM으로 교체한 후, 추출물을 동일 배지로 적당량 희석한 후 각각 첨가하고 나서, 5% CO₂ 및 37℃ 조건하에서 세포가 웰의 바닥에 약 80% 이상이 될 때까지 배양하였다. 배양 후 배지를 제거한 다음, PBS(Sigma., USA, Phosphate buffered Saline)로 세척하고 트립신으로 처리하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포를 5000rpm으로 10분간 원심 분리한 후 상등액을 제거하였다. 상등액이 제거된 세포를 60℃ 항온기에서 24시간 건조시킨 후 1N NaOH를 첨가하여 세포 내의 멜라닌을 용해시켰다. 용해된 멜라닌을 흡수분광광도계(Uvmax, Molecular Device, USA)를 이용하여 파장 490㎚에서 흡광도를 측정하였다.

표 3 및 표 4에 나타난 바와 같이, 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 원괴체상구체 추출물(제조예 1) 및 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 다신초 추출물(제조예 3)은 야생의 덴드로비움 칸디둠 추출물(비교제조예 1 및 3)과 비교하여, 타이로시나제 활성을 농도 의존적으로 억제하였으며, 또한 세포내 멜라닌 생성억제 효과도 더 우수하였다.

[시험예 3: 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 원괴체상구체 추출물 및 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 다신초 추출물의 항산화 효과 측정]

자유라디칼 소거능을 측정하는 방법으로, DPPH는 항산화 물질로부터 전자나 수소를 받아 비가역적으로 안정한 분자를 형성하므로 전자공여능으로부터 항산화 활성을 측정할 수 있는데, 항산화 활성이 있는 물질과 만나면 자유라디칼(free radical)이 소거되며 이때의 DPPH 고유의 청남색이 엷어지는 특성이 있고, 이 색차를 비색 정량하여 전자공여능력을 측정한다(Jeon et al., J. Kor. Soc. Food sic. Nutr. 38(1): 1-8, 2009). 또한, ABTS법은 1993년에 시료의 생리활성을 측정하기 위해 고안된 방법이지만, 이후 식품과 천연 수용성 페놀성 물질을 시험하기 위해 널리 응용되었다. ABTS[2,2'-azinobis(3-ethyl-benzo-thiaziline-6-sulfonate)]와 포타슘 퍼설페이트(potassium persulfate)의 혼합으로 생성된 청록색의 라디칼 양이온(ABTS·+)이 페놀성 화합물과 같은 수소공여체(H-donor)와 강렬하게 반응하여 무색으로 변하는데, 이것을 정량하여 전자공여능력을 측정한다(Miller et al., Clin. Sci. 26: 265-277, 1993).

제조예 1 및 3과 비교제조예 1 및 3에 대한 항산화 효과 시험을 실시하였다.

<DPPH(1,1-diphenyl-2 picrylhydrazyl) 라디칼에 의한 항-하이드록실 라디칼 활성(%) 측정>

활성 산소에 의한 반응은 거의 대부분 라디칼 반응으로서 자동산화반응 과정이 포함된다. 생체 내에서 자동산화반응을 차단시키는 역할은 항산화제가 담당하고 있다. 전자를 주는 능력으로서 환원력이 클수록 강한 항산화제가 된다. 항산화제의 환원력을 측정하는 시약으로 1,1-디페닐-2-피크릴하이드로질(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl: DPPH) 라디칼이 있다. DPPH는 화합물 내 질소 중심의 안정화된 구조의 라디칼로 존재한다. 517㎚에서 최대 흡수를 나타내며, 환원되면 517㎚에서 흡수가 없어진다. DPPH(D9132, SIGMA)를 메탄올과 증류수의 6:4(v/v) 혼합용매에 녹이고, 상기 DPPH 용액을 513㎚에서 흡광도가 0.6 정도가 되도록 맞추었다. DPPH 용액 2㎖를 농도에 따라 희석한 시료 1㎖에 각각 첨가하여 혼합하였다. 상온에서 약 1시간 동안 방치한 후, 흡수분광광도계(UVmax, Molecular Device, USA)를 사용하여 513㎚에서 흡광도를 측정하였으며 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

표 5에 나타난 바와 같이, 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 원괴체상구체 추출물(제조예 1)은 야생의 덴드로비움 칸디둠 추출물(비교제조예 1 및 3)과 비교하여 우수한 항산화 효과를 나타내었다.

식물 추출물의 총 항산화력은 Miller et al.(1993)의 방법을 이용하여 측정하였다. 2,2'-Azino-bis(3-ethyl benzothiazoline-6-sulfonate)를 7mM의 농도로 증류수에 용해시키고, 여기에 최종농도가 2.45mM이 되도록 포타슘 퍼설페이트(Potassium persulfate)를 첨가하여 ABTS 양이온(cation) 라디칼을 만들었다. ABTS와 포타슘 퍼설페이트를 동량 혼합하여 암소에서 실온에 12시간 방치한 후, 이용액을 에탄올(ethanol)에 희석하여 734nm에서 흡광도가 0.7이 되도록 조정하여 사용하였다. 식물추출물 시료 10㎕, ABTS 용액(Solution) 190㎕, 증류수 50㎕를 혼합하여, 6분 후 분광광도계(spectrophotometer) 734nm에서 흡광도를 측정하여 흡광도 차이를 백분율(%)로 구하여 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.

[수학식 1]

소거율(%) = (B-A)/B × 100

(B: 추출물 비첨가군의 흡광도, A: 추출물 첨가군의 흡광도)

표 6에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 조직 배양한 덴드로비움 칸디둠 원괴체상구체 추출물(제조예 1)은 야생의 덴드로비움 칸디둠 추출물(비교제조예 1 및 3)과 비교하여 우수한 항산화 효과를 나타내었다.

[시험예 4: 조직 배양한 덴드로비움 칸디둠 원괴체상구체 추출물의 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량 측정]

총 페놀함량은 폴린데니스(Folin-Denis)법을 변형하여 측정하였다(Isabelle 등, 2008). 96 웰 플레이트(well plate)에 시료와 0.2N의 폴린-시오칼토 페놀(Folin-Ciocalteu’s phenol) 시약을 넣고 실온에서 3분 동안 반응시킨 후, 포화 소듐 카보네이트(sodium carbonate)를 넣고 60분 후 760nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 플라보노이드 함량은 디에틸렌 글리콜(diethylene glycol)을 사용하여 측정하였다[Abeysinghe 등, 2007]. 96 웰 플레이트(well plate)에 시료와 90%의 디에틸렌 글리콜을 넣고 3분 동안 마이크로플레이트 교반기(microplate agitater; Titamax 101, Heidolph, Schwabach, Germany)를 이용하여 흔들어주었다. 1N의 수산화나트륨(NaOH) 용액을 각 웰(well)에 넣은 후, 1시간 후에 427nm에서 흡광도를 측정하였다.

표 7에 나타난 바와 같이, 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 원괴체상구체 추출물(제조예 1)은 야생의 덴드로비움 칸디둠 추출물(비교제조예 1 및 3)과 비교하여 총 페놀 함량 및 총 플라보노이드 함량이 더 높음을 확인하였다.

[제형예 1 내지 3: 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 원괴체상구체 추출물, 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 다신초 추출물, 또는 이들의 혼합물을 함유하는 에센스의 제조]

하기 표 8에 나타낸 조성비로, 제조예 1, 제조예 3, 또는 이들의 혼합물(이하, '조직배양한 덴드로비움 추출물')을 포함하는 에센스를 제조하였다.

[제형예 4 내지 6: 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 원괴체상구체 추출물, 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 다신초 추출물, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 유연화장수(스킨)의 제조]

제조예 1, 제조예 3, 또는 이들의 혼합물(이하, '조직배양한 덴드로비움 추출물')을 포함하는 화장료 조성물 중 유연화장수(스킨)의 제형예는 하기 표 9와 같다.

[제형예 7 내지 9: 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 원괴체상구체 추출물, 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 다신초 추출물, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 영양유액(밀크로션)의 제조]

제조예 1, 제조예 3, 또는 이들의 혼합물(이하, '조직배양한 덴드로비움 추출물')을 함유하는 화장료 조성물 중 영양유액(밀크로션)의 처방예는 하기 표 10과 같다.

[제형예 10 내지 12: 조직 배양한 덴드로비움 칸디둠 원괴체상구체 추출물, 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 다신초 추출물, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 크림의 제조]

제조예 1, 제조예 3, 또는 이들의 혼합물(이하, '조직배양한 덴드로비움 추출물')을 함유하는 화장료 조성물 중 크림의 제형예는 하기 표 11과 같다.

[제형예 13 내지 15: 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 원괴체상구체 추출물, 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 다신초 추출물, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 파우더의 제조]

하기 표 12에 나타낸 조성비로, 제조예 1, 제조예 3, 또는 이들의 혼합물('조직배양한 덴드로비움 추출물')을 포함하는 파우더를 제조하였다.

[제형예 16 내지 18: 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 원괴체상구체 추출물, 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 다신초 추출물, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 메이크업베이스의 제조]

하기 표 13에 나타낸 조성비로, 제조예 1, 제조예 3, 또는 이들의 혼합물(이하, '조직배양한 덴드로비움 추출물')을 포함하는 메이크업베이스를 제조하였다.

지금까지 본 발명의 바람직한 실시예에 대해 설명하였으나, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 본질적인 특성을 벗어나지 않는 범위 내에서 변형된 형태로 구현할 수 있을 것이다. 그러므로 여기서 설명한 본 발명의 실시예는 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 하고, 본 발명의 범위는 상술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

조직배양한 덴드로비움 칸디둠 다신초 추출물이 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.1 중량% 이상 및 20 중량% 이하의 범위로 함유된 것을 특징으로 하는, 미백용 화장료 조성물.
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제 1 항에 있어서,
상기 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 다신초 추출물은, 조직배양한 덴드로비움 칸디둠 다신초로부터 정제수, C1 내지 C4의 알코올, 및 C1 내지 C5의 다가알코올로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 용매를 이용하여 추출된 것을 특징으로 하는, 미백용 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서,
유연화장수, 영양화장수, 영양유액, 유화상크림, 영양크림, 젤상크림, 맛사지크림, 에센스, 바디오일, 메이크업베이스, 파운데이션 및 팩으로 이루어진 군에서 선택되는 제형을 갖는 것을 특징으로 하는, 미백용 화장료 조성물.
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