KR101563307B1

KR101563307B1 - 락토바실러스 에시도필러스 유래 13-리놀레산 수화효소에 의한 13-수산화 지방산의 생산 및 월토마이세스 리포퍼를 이용한 델타-데카락톤의 제조방법 및 그 조성물

Info

Publication number: KR101563307B1
Application number: KR1020150127223A
Authority: KR
Inventors: 오덕근; 오혜진; 강우리
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2015-09-08
Filing date: 2015-09-08
Publication date: 2015-10-26
Also published as: KR20150108809A

Abstract

본 발명은 락토바실러스 에시도필러스 유래 13-리놀레산 수화효소에 의한 13-수산화 지방산의 생산 및 월토마이세스 리포퍼를 이용한 델타-데카락톤의 제조방법 및 그 조성물에 관한 것으로,
본 발명에 따르면, 높은 특이성과 친환경적인 방법으로 산업품의 원료 물질인 13-수산화-9-옥타데세노익 산, 13-수산화-9,15-옥타데카디에노익 산, 13-수산화-6,9-옥타데카디에노익 산을 높은 수율로 생산할 수 있으며, 이렇게 생산된 13-수산화-9-옥타데세노익 산은 락톤(lactone) 의 합성 시작물질로서 유용하게 사용되며, 효모를 이용한 락톤생산방법은 종래의 화학적인 생산방법보다 환경 친화적이고 높은 특이성을 보이는 방법이다. 델타-락톤을 생산하기 위해 세포 자체 효소반응을 통한 생산방법으로 식품에 들어가는 원료 물질인 코코넛향이나 유제품의 향을 나타내는 델타-데카락톤을 높은 수율로 대량 생산할 수 있다.

Description

락토바실러스 에시도필러스 유래 13-리놀레산 수화효소에 의한 13-수산화 지방산의 생산 및 월토마이세스 리포퍼를 이용한 델타-데카락톤의 제조방법 및 그 조성물{A METHOD FOR THE PRODUCTION OF 13-HYDROXY-FATTY ACID BY USING LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS 13-LINOLEATE HYDRATASE AND δ-DECALACTONE FROM THE HYDROXY FATTY ACID BY USING WALTOMYCES LIPOFER AND A COMPOSITION THEREFOR}

본 발명은 락토바실러스 에시도필러스 유래 13-리놀레산 수화효소에 의한 13-수산화 지방산의 생산 및 월토마이세스 리포퍼를 이용한 델타-데카락톤의 제조방법 및 그 조성물에 관한 것으로,

본 발명에 따르면, 높은 특이성과 친환경적인 방법으로 산업품의 원료 물질인 13-수산화-9-옥타데세노익 산, 13-수산화-9,15-옥타데카디에노익 산, 13-수산화-6,9-옥타데카디에노익 산을 높은 수율로 생산할 수 있으며, 이렇게 생산된 13-수산화-9-옥타데세노익 산은 락톤(lactone) 의 합성 시작물질로서 유용하게 사용되며, 효모를 이용한 락톤생산방법은 종래의 화학적인 생산방법보다 환경 친화적이고 높은 특이성을 보이는 방법이다. 델타-락톤을 생산하기 위해 세포 자체 효소반응을 통한 생산방법으로 식품에 들어가는 원료 물질인 코코넛향이나 유제품의 향을 나타내는 델타-데카락톤을 높은 수율로 대량 생산할 수 있다.

수산화 지방산은 자연계에 존재하는 물질로서 트리글리세롤, 왁스, 세레브로시드, 그밖에 식물이나 곤충 그리고 미생물에 존재하는 지질 등에서 발견 된다. 미생물이 불포화 지방산을 생물학적인 전환을 통하여 생산하는 수산화 지방산은 일-수산화, 이-수산화 그리고 삼-수산화 지방산의 세 가지 유형이 있다. 수산화 지방산은 향신료를 구성하는 락톤(lactone)의 전구체로서 중요한 산업적인 물질이며, 다른 수산화 지방산이 아닌 지방산에 비하여 반응성이 좋기 때문에 레진, 왁스, 나일론, 플라스틱, 윤활제 그리고 코팅제의 시작 물질로 사용되고 화장품 원료로도 사용된다.

13-수산화-9-옥타데세노익 산, 13-수산화-9,15-옥타데카디에노익 산, 13-수산화-6,9-옥타데카디에노익 산은 윤활제로 사용되고, 가소체 및 레진을 합성하는데 사용되는 세바스산을 생산하는 중요한 물질이다. 이러한 수산화 지방산 유래의 락톤류는 자연계에 폭 넓게 존재하는 물질로서 동식물, 효모, 그리고 곰팡이 등에서 발견되었고 과일이나 우유, 버터의 주요 방향성분이다. 효모는 다양한 위치의 수산화 지방산을 생물학적으로 전환하여 주로 감마(γ) 또는 델타(δ) 두 가지 유형의 락톤을 생산한다. 13-수산화-9-옥타데세노익 산과 같은 수산화 지방산은 이스트(yeast)에 의하여 델타-데카락톤(δ-decalactone)으로 전환된다. 델타-데카락톤은 코코넛 향이나 치즈 향을 내는 특징이 있으며, 식품공정에 필수적인 물질이고 식품산업에서 사용이 증가되고 있다. 그러나 이 물질은 몇몇 과일에 소량으로 존재하기 때문에 유기합성에 의한 합성이 되고 있으나, 세계적으로나 국내의 국민 소득의 증가와 천연 음식 및 향장 소재의 요구, 소비재의 고급화 추세로 인한 천연 물질이 안정성과 기호도에서 선호되는 경향으로 생물전환을 이용한 방법이 절대적으로 필요하다.

기존에 13-수산화-9-옥타데세노익 산을 생산하는 미생물로는 엔터로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 스트렙토코커스 보비스(Streptococcus bovis JB1), 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus IFO 13951), 페디오코커스(Pediococcus sp. AKU 1080) 가 있지만 이들 미생물은 13-수산화-9-옥타데세노익 산을 낮은 수율로 생산할 뿐만 아니라 10-수산화-12옥타데세노익 산 또는 10,13-이수산화 옥타데카노익 산과 같은 부산물이 같이 생산되어 산업화시 비경제적이다.(Michiki Takeuchi et al, European Journal of Lipid Science and Technology (2013), 115, 4, 386-393;Noriaki Kishimoto et al, Lipids (2003), 38, 12, 1269-1274)

또한 효소나 관련효소가 함유된 재조합 미생물을 사용한 경우는 지금까지 보고되지 않고 있다. 또한, 기존에 델타-락톤류를 생산하는 효모로는 사카로마이시스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae), 얄로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 데바리오마시이스 한세니(Debaryomyces hansenii), 한세눌라 아모말라(Hansenula anomala) 등이 있으나 이들 효모의 델타-락톤류 생산수율은 낮은 편이며 델타-락톤류 생산수율은 낮으며 기존에 발효를 통한 델타-락톤류 생산은 많은 양의 배지 소모와 시간 소요가 따른다.

[선행 특허문헌]

대한민국 특허 공개번호 1020130001039

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 부산물 없이 13-수산화-9-옥타데세노익 산, 13-수산화-9,15-옥타데카디에노익 산, 13-수산화-6,9-옥타데카디에노익 산을 고 수율로 생산할 수 있는 미생물과 그 효소 및 재조합 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 13-수산화-9-옥타데세노익 산을 통해 델타-데카락톤을 고 수율로 생산할 수 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 델타-데카락톤을 고 수율로 생산할 수 있는 생물학적 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 델타-데카락톤을 고 수율로 생산할 수 있는 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 균주를 파쇄하여 프라이머(primer)를 사용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하여 13-리놀레산 수화효소 유전자를 증폭하여 13-리놀레산 수화효소 유전자를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 13-리놀레산 수화효소 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것이 바람직하나 상기 서열에 하나 이상의 치환,결손, 역위, 전좌 등의 돌연변이를 통하여 본 발명이 목적하고자 하는 모든 돌연변이체도 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 프라이머 서열은 서열번호 2 및 3의 염기서열로 이루어진 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 13-리놀레산 수화효소 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.

또한 본 발명은 숙주세포에 상기 본 발명의 발현벡터가 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 숙주세포는 대장균인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 상기 본 발명의 형질전환체에 리놀레산을 기질로 첨가하여 13-수산화-9-옥타데세노익 산을 생산하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 형질전환체에 알파리놀렌산을 기질로 첨가하여 13-수산화-9,15-옥타데카디에노익 산을 생산하는 방법를 제공한다.

또 본 발명은 상기 본 발명의 형질전환체에 감마리놀렌산을 첨가하여 13-수산화-6,9-옥타데카디에노익 산을 생산하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 13-리놀레산 수화효소 유전자를 포함하는 13-수산화-9-옥타데세노익산 생산용 조성물을 제공한다.

또 본 발명은 수산화지방산과 월토마이세스 리포퍼를 반응시켜 델타-데카락톤을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 수산화 지방산은 13-수산화-9-옥타데세노익산인 것을 특징으로 하는 델타-데카락톤을 생산하는 방법을 제공한다.

또 본 발명은 수산화지방산 및 월토마이세스 리포퍼를 유효성분으로 포함하는 델타-데카락톤 생산용 조성물을 제공한다.

또 본 발명은 상기 본 발명의 방법에 의하여 제조된 델타-데카락톤을 포함하는 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명자들은 식물의 풍부한 불포화지방산인 리놀레산을 수산화 지방산으로 전환할 수 있는 효소를 조사하였고, 부산물 없이 13-수산화-9-옥타데세노익 산, 13-수산화-9,15-옥타데카디에노익 산, 13-수산화-6,9-옥타데카디에노익 산을 고 수율로 생산할 수 있는 효소 및 재조합 미생물을 선택하였고, 이 효소를 이용하여 얻어진 13-수산화-9-옥타데세노익 산을 통해 델타-데카락톤을 고 수율로 생산할 수 있는 효모를 선택하였다.

본 발명자들은 보다 효과적으로 13-리놀레산 수화효소를 이용하여 13-수산화-9-옥타데세노익 산, 13-수산화-9,15-옥타데카디에노익 산, 13-수산화-6,9-옥타데카디에노익 산을 생산하는 방법을 개발하기 위하여, 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus)로부터 유래한 13-리놀레산 수화효소와 재조합 균주를 대량으로 제조하고, 이러한 친환경적인 과정으로 부산물의 생성없이 13-수산화-9-옥타데세노익 산, 13-수산화-9,15-옥타데카디에노익 산, 13-수산화-6,9-옥타데카디에노익 산을 고수율로 생산할 수 있는 것과 월토마이세스 리포퍼(Waltomyces lipofer)를 이용하여 13-수산화-9-옥타데세노익산을 델타-데카락톤으로 전환 하는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus)로부터 유래한 13-리놀레산 수화효소를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 이로 형질전환된 미생물과, 이를 이용하여 13-리놀레산 수화효소를 제조하는 방법, 그리고 상기 13-리놀레산 수화효소를 이용한 13-수산화-9-옥타데세노익 산, 13-수산화-9,15-옥타데카디에노익 산, 13-수산화-6,9-옥타데카디에노익 산의 제조방법 및 효모 월토마이세스 리포퍼(Waltomyces lipofer)를 이용한 델타-데카락톤 제조방법을 제공한다.

13-리놀레산 수화효소(C-13 positional specific linoleate hydratase)를 13-수산화-9-옥타데세노익 산(13-hydroxy-9-octadecenoic acid), 13-수산화-9,15-옥타데카디에노익 산(13-hydroxy-9,15-octadecadienoic acid), 13-수산화-6,9-옥타데카디에노익 산 (13-hydroxy-6,9-octadecadienoic acid) 생산에 사용하는 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 13-수산화-9-옥타데세노익 산(13-hydroxy-9-octadecenoic acid), 13-수산화-9,15-옥타데카디에노익 산(13-hydroxy-9,15-octadecadienoic acid), 13-수산화-6,9-옥타데카디에노익 산 (13-hydroxy-6,9-octadecadienoic acid)의 생산에 사용되는 13-리놀레산 수화효소(C-13 positional specific linoleate hydratase)의 유전자를 지닌 재조합 미생물을 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 기질로서 리놀레산(linoleate), 알파리놀렌산(α-linoleate), 감마리놀렌산(γ-linolenoleate)을 사용하여 13-수산화-9-옥타데세노익 산(13-hydroxy-9-octadecenoic acid), 13-수산화-9,15-옥타데카디에노익 산(13-hydroxy-9,15-octadecadienoic acid), 13-수산화-6,9-옥타데카디에노익 산 (13-hydroxy-6,9-octadecadienoic acid)을 제조하는 것이 가능한 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 균주로부터 유래한 13-리놀레산 수화효소를 제공한다.

또한, 본 발명은 13-리놀레산 수화효소를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 균주로부터 유래하고 올레산 수화효소 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터 pET 15b/C-13 positional specific linoleate hydratase를 제공한다.

또한, 본 발명은 13-리놀레산 수화효소를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환된 미생물을 제공한다. 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 균주로부터 유래한 13-리놀레산 수화효소 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 대장균 이알(ER) 2566 pET 15b/C-13 positional specific linoleate hydratase를 제공한다.

본 발명에 있어서, 재조합 발현 벡터를 13-수산화-9-옥타데세노익 산의 생산에 사용될 수 있는 것이라면 발현 벡터 pET-15b를 포함하여 유전자 재조합 방법에 이용되는 벡터라면 모두 사용 가능하고, 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환 되는 미생물로는 대장균 ER 2566을 사용하는 것이 바람직하나 재조합 발현 벡터로 형질전환되어 목적하는 유전자를 과발현하고 활성이 있는 효소 단백질을 생산할 수 있는 배양된 13-리놀레산 수화효소를 이용하여 13-수산화-9-옥타데세노익 산을 고 수율로 얻는 생산방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 부산물의 생성 없이 13-수산화-9-옥타데세노익 산, 13-수산화-9,15-옥타데카디에노익 산, 13-수산화-6,9-옥타데카디에노익 산만을 선별적으로 합성할 수 있는 상기 13-리놀레산 수화효소를 이용한 13-수산화-9-옥타데세노익 산, 13-수산화-9,15-옥타데카디에노익 산, 13-수산화-6,9-옥타데카디에노익 산의 생산방법을 제공한다.

상기 13-리놀레산 수화효소는 상기와 같이 13-리놀레산 수화효소를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환된 대장균을 배양하여 재조합 효소 유전자의 발현을 유도한 다음 발현된 단백질을 회수하여 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 기질로서 지방산을 사용하는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 리놀레산(linoleate), 알파리놀렌산(α-linoleate), 감마리놀렌산(γ-linolenoleate)를 사용하는 것이 좋다. 또한, 상기 효소 반응의 시간을 통상적인 방법에 따라 적절히 조절할 수 있다.

본 발명은 효모를 이용하는 생물전환 반응으로 델타-데카락톤의 제조 방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 13-수산화-9-옥타데세노익산을 델타-데카락톤으로 전환할 수 있는 새로운 효모인 월토마이세스 리포퍼를 이용하여 델타-데카락톤을 얻는 제조 방법을 제공한다.

본 발명에서는 효모 월토마이세스 리포퍼의 효모배양배지는 YM broth가 가능하고, 13-수산화-9-옥타데세노익산을 델타-데카락톤으로 전환을 위한 반응 배지는 기존에 방법이 아닌 새로운 방법으로 3.4 g/ℓ 질소원이 함유된 citrate-phosphate 반응배지가 바람직하다.

또한, 효모의 농도는 5 g/ℓ 가 바람직하다.

또한, 상기 생물전환 반응 온도는 20℃ 내지 40℃ 범위에서 이루어지는 것이 바람직하고, 온도 28℃ 내지 35℃ 범위에서 이루어지는 것이 더욱 바람직하다.

또한, 상기 생물전환 반응은 pH 6.0 내지 pH 7.0 범위에서 이루어지는 것이 바람직하고, pH 6.5 내지 pH 7.0 범위에서 이루어지는 것이 더욱 바람직하다. 반응배지는 citrate-phosphate 반응배지를 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 생물전환 반응은 150 rpm 내지 250 rpm 범위에서 이루어지는 것이 바람직하고, 200 rpm 내지 250 rpm 범위에서 이루어지는 것이 더욱 바람직하다.

또한, 상기 기질은 13-수산화-9-옥타데세노익산인 것이 바람직하고, 상기 올레산의 농도는 40 g/ℓ 내지 80 g/ℓ 범위에서 조정되는 것이 바람직하며, 50 g/ℓ 내지 70 g/ℓ 범위에서 조정되는 것이 더욱 바람직하다. 이외에도 감마 또는 델타-락톤류 생산을 위한 다양한 종류의 수산화 기질을 사용할 수 있다.

본 발명의 방법은 미생물, 예를 들어 재조합 미생물, 바람직하게는 본원에 기재된 벡터 또는 유전자 (예를 들어, 야생형 및(또는) 돌연변이 유전자)를 포함하고(하거나) 목적 화합물의 생산을 초래하는 방식으로 배양된 재조합 미생물에 특징이 있다.

" 재조합" 미생물이란 용어는 유전자적으로 변화, 변형 또는 조작되어 (예를 들어, 유전공학적으로 조작되어) 이것이 유래한 자연발생의 미생물에 비해 변화된, 변형된 또는 상이한 유전자형 및(또는) 표현형 (예를 들어, 유전자의 변형이 미생물의 코딩 핵산 서열에 영향을 미치는 경우)을 나타내는 미생물 (예를 들어, 박테리아, 효모 세포, 진균류 세포 등)을 포함한다.

본 발명에 따른 발현 벡터는 이론상, 예를 들어, 문헌[참조: Sambrook et al. (1989)]에 기재되어 있는 바와 같은 당해 분야에 공지된 통상의 방법으로 제조할 수 있다.

상기 문헌에는 또한 벡터의 기능적 성분, 예를 들어, 적합한 프로모터, 인핸서, 종결 및 폴리아데닐화 시그날, 항생제 내성 유전자, 선별 마커, 복제 개시점 및 스플라싱 시그날이 기재되어 있다. 통상의 클로닝 벡터를 사용하여, 성분들, 예를 들어, 플라스미드, 박테리오파지,파지미드, 코스미드 또는 배큘로바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(adeno-associated virus) 및 단순포진 바이러스와 같은 바이러스 벡터 뿐만 아니라, 인공 염색체/미소염색체를 제조할 수 있다.

본 발명의 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 로부터 유래한 13-리놀레산 수화효소는 높은 특이성과 친환경적인 방법으로 산업품의 원료 물질인 13-수산화-9-옥타데세노익 산, 13-수산화-9,15-옥타데카디에노익 산, 13-수산화-6,9-옥타데카디에노익 산을 높은 수율로 생산할 수 있으며, 이렇게 생산된 13-수산화-9-옥타데세노익 산, 13-수산화-9,15-옥타데카디에노익 산, 13-수산화-6,9-옥타데카디에노익 산은 다양한 락톤의 합성 시작물질로서 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 위의 반응 생성물인 13-수산화-9-옥타데세노익산을 기질로 사용하고, 효모 월토마이세스 리포퍼를 이용하여 식품첨가제의 원료 물질인 코코넛향의 델타-데카락톤을 생산할 수 있으며, 종래의 화학적인 방법과 달리 환경 친화적인 생물전환을 통해 자연에 가까운 풍미의 향료를 생산할 수 있다.

도 1a, 1b, 1c는 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus) KCTC 3164 유래의 재조합 균주를 이용한 13-수산화-9-옥타데세노익 산, 13-수산화-9,15-옥타데카디에노익 산, 13-수산화-6,9-옥타데카디에노익 산의 시간별 생산량을 나타낸 것이다. (도면 1a : ● : 13-수산화-9-옥타데세노익 산 ○ : 리놀레산, 도면 1b: ● : 13-수산화-9,15-옥타데카디에노익 산 ○ : 알파리놀렌산, 도면 1c: ● : 13-수산화-6,9-옥타데카디에노익 산 ○ : 감마리놀렌산)
도 2는 효모 월토마이세스 리포퍼(Waltomyces lipofer)를 이용한 델타-데카락톤의 시간별 생산량을 나타낸 것이다.(○ : 13-수산화-9-옥타데세노익 산,● : 델타-데카락톤)

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 지방산업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 13- 리놀레산 수화효소 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터 및 형질전환 미생물의 제조

본 발명의 올레산 수화효소 유전자를 제조하기 위하여, 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 균주로부터 유래한 13-리놀레산 수화효소 유전자를 먼저 분리하였다.

구체적으로, 유전자 염기서열과 아미노산 서열이 밝혀져 있지 않은 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus) KCTC 3164 균주를 선별하고, 다른 strain의 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus)의 DNA 염기서열을 기초로 하여 프라이머(primer)를 고안((5'-TTCATATGTATTATTCCAATGGTAATTACGA-3'(서열번호 2),5'-GCCTCGAGTTAGACTAAATTTGCTTCTTTAAGTA-3'(서열번호 3))하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하여 해당 유전자의 염기서열을 증폭하였다.

대량으로 얻은 13-리놀레산 수화효소 유전자는 제한효소 NdeⅠ과 XhoⅠ을 사용하여 플라스미드 벡터 pET 15b(Novagen사 제품)에 삽입하여 pET 15b/13-리놀레산 수화효소를 제작하였다.

상기와 같이 얻은 재조합 발현벡터는 통상적인 형질전환 방법(참조: Sambrook et al. (1989))에 의하여 대장균 ER 2566 균주에 형질 전환하고, 상기 형질전환된 미생물은 20% 글리세린(glycerine) 용액을 첨가하여 13-수산화-9-옥타데세노익 산, 13-수산화-9,15-옥타데카디에노익 산, 13-수산화-6,9-옥타데카디에노익 산의 생산을 위한 배양을 실시하기 전에 냉동 보관하였다.

실시예 2. 13- 리놀레산 수화효소의 제조 및 회수

효소의 단백질 발현을 위한 재조합 E. coli는 500 ㎖의 LB(Difco, Sparks, MD, USA) 배지와 50 μg/㎖의 암피실린을 가지는 플라스크에서 200 rpm의 통기조건 하에서 37℃에서 배양하였다. 박테리아의 흡광도가 600 nm에서 0.6에 도달할 때, IPTG를 13-리놀레산 수화효소 발현을 유도하기 위하여 최종농도로 0.1 mM 첨가한 후 그 배양액을 6시간 동안 37℃에서 200 rpm으로 교반하면서 배양하였다.

배양된 13-리놀레산 수화효소를 포함하는 대장균 세포를 모아서 사용하였다. 또한, 상기와 같이 과발현되어 생산된 13-리놀레산 수화효소는, 상기 형질전환된 균주의 배양액을 6,000×g로 4℃에서 30분 동안 원심분리하여 0.85% 염화나트륨(NaCl)으로 두 번 세척한 다음, 50 mM 제일인산나트륨, 300 mM 염화나트륨, 10 mM 이미다졸(immidazole), 0.1 mM 단백분해 효소 저해제(phenylmethylsulfonyl fluoride)를 첨가하여 상기 세포 용액을 파쇄기(sonicator)로 파쇄하였다. 상기 세포 파쇄물은 다시 13,000×g로 4℃에서 20분 동안 원심분리하고, 세포 펠렛을 제거한 후 세포 상등액만을 얻어 고속 단백질 액체 크로마토그래피(fast protein liquid chromatography system; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)에 히스텍(His-tag)를 이용한 히스트랩 에이치피(Histrap HP) 흡착 컬럼을 장착하여 13-수산화-9-옥타데세노익 산 생산에 사용되는 효소액으로 분리하였다.

실시예 3. 재조합 균주를 이용한 13-수산화-9- 옥타데세노익 산, 13-수산화-9,15-옥타데카디에노익 산, 13-수산화-6,9-옥타데카디에노익 산의 생산

본 발명의 재조합 균주를 이용한 13-수산화-9-옥타데세노익 산, 13-수산화-9,15-옥타데카디에노익 산, 13-수산화-6,9-옥타데카디에노익 산의 생산성을 확인하기 위하여, 효소의 최적 pH 5.0, 온도(35℃)에서 2.8 g/ℓ의 리놀레산을 기질로 하여 13-수산화-9-옥타데세노익 산, 13-수산화-9,15-옥타데카디에노익 산, 13-수산화-6,9-옥타데카디에노익 산의 시간별 생산량을 측정하였다.

그 결과, 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 유래 13-리놀레산 수화효소는 반응 7시간 후에 2.8 g/ℓ의 리놀레산에서 2.24 g/ℓ의 13-수산화-9-옥타데세노익 산을 생산하여 시간당 0.32 g/ℓ의 생산성과 80% 의 전환수율을 나타냈었다. (도면 1a) 2.8 g/ℓ의 알파리놀렌산에서는 반응 16시간 후에 1.20 g/ℓ의 13-수산화-9,15-옥타데카디에노익 산을 생산하여 시간당 0.08 g/ℓ의 생산성과 43%의 전환수율을 나타냈었다. (도면 1b) 2.8 g/ℓ의 감마리놀렌산에서는 반응 7시간 후에 1.82 g/ℓ의 13-수산화-6,9-옥타데카디에노익 산을 생산하여 시간당 0.26 g/ℓ의 생산성과 65%의 전환수율을 나타냈었다. (도면 1c) 참고로 현재까지 13-수산화-9-옥타데세노익 산에서 가장 높은 생산성을 보인 균주는 Pediococcus sp. AKU 1080로 반응 4일 후에 12.3 g/l의 리놀레산에서 2.3 g/l의 13-수산화-9-옥타데세노익 산을 생산하여 시간당 0.02 g/l의 생산성과 18.7%의 전환수율을 나타냈었다.

실시예 4. 효모의 종류에 따른 생물 전환 활성 조사 및 효모 선발

본 발명에서는 13-수산화-9-옥타데세노익산을 델타-데카락톤으로 전환하는 베타-산화 관여 효소의 발현을 증가된 효모 및 월토마이세스 리포퍼를 얻기 위하여 기존 균주 배지를 사용하지 않고, 유도물질로서 기질인 13-수산화-9-옥타데세노익산이 포함된 반응배지를 사용하였다. 먼저 효모 및 월토마이세스 리포퍼는 YM broth 15 ㎖이 들어있는 시험관에 접종하여 12 시간동안 배양한 다음, 13-수산화-9-옥타데세노익산을 델타-데카락톤으로 전환하는 베타-산화 관여 효소의 발현배지 1.0 내지 4.0 g/ℓ 질소원이 함유된 Citrate-phosphate 반응배지, 0.1 내지 0.5 ml/ℓ 트윈80(tween 80) 및 1.0 내지 3.0 g/ℓ 13-수산화-9-옥타데세노익산 500㎖이 들어있는 2ℓ 베플드 플라스크(baffled flask)에 접종하여 본 배양을 실시하였다. 이 때 상기 배양 과정 중에서 교반 속도는 200 rpm, 배양 온도는 28 ℃로 유지되도록 조정하였고 24시간 동안 배양하여 효소의 발현을 유도하였다. 또한 상기 배양액을 10,000×g로 4 ℃에서 20분 동안 원심분리 한 다음, 50 mM citrate-phosphate 반응배지(pH 7.5)으로 두 번 세척하였다.

생물전환 반응은 8 mM 13-수산화-9-옥타데세노익 산, 5 g/ℓ의 효모 및 0.5 ㎖/ℓ 트윈80이 함유된 10 g/ℓ citrate-phosphate(pH 7.0) 반응배지조건에서 24시간까지 반응을 진행하였다. 이 때 반응 온도는 28℃, 교반속도는 200 rpm으로 반응하였다. 시간에 따라 베플드 플라스크에서 1 ㎖씩을 회수하여 동일 비율의 에틸아세테이트(Ethyl acetate)로 반응을 정지 및 추출이 이루어졌다. 반응을 종료시킨 다음 10-수산화스테아르산의 감소량과 감마-도데카락톤의 생산량을 측정하여 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2는 본 발명에 효모 월토마이세스 리포퍼를 5 g/ℓ 효모량, 2.5 g/ℓ 13-수산화-9-옥타데세노익산을 반응시켜 배양할 때, 13-수산화-9-옥타데세노익산(○)의 감소량 및 그에 따른 델타-데카락톤(●)의 생산량을 나타낸 것이다.

그 결과, 도 2에 나타난 것과 같이, 13-수산화-9-옥타데세노익산과 효모 월토마이세스 리포퍼를 반응시킨 후 15시간이 경과하였을 때, 델타-데카락톤이 최대 생산을 보이고, 전환율은 약 50%였다. 현재까지 델타-데카락톤에서 가장 높은 생산성을 보인 효모는 사카로마이시스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)로 각각 0.09 g/ℓ (Maria de laat et al. 1992. Natural delta-lactones and process of the production thereof. United States Patent US005128261)이다. (도 2)

이상, 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 지방산업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> KONKUK UNIVERSITY INDUSTRIAL COOPERATION CORP <120> A METHOD FOR THE PRODUCTION OF 13-HYDROXY-FATTY ACID BY USING LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS 13-LINOLEATE HYDRATASE AND DELTA-DECALACTONE FROM THE HYDROXY FATTY ACID BY USING WALTOMYCES LIPOFER AND A COMPOSITION THEREFOR <130> HY151100 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1773 <212> DNA <213> Lactobacillus acidophilus <400> 1 atgcattata gtagtggtaa ttatgaagct tttgtaaacg caagtaaacc taaggatgtc 60 gatcagaagt ccgcatatct tgttggttca ggtttggcat cgcttgctag tgctgtattt 120 ttaattcgtg atggtcacat gaagggtgat agaattcata tccttgaaga attgagcctt 180 ccaggtggtt caatggatgg gatctataat aagcaaaaag aaagctacat cattcgtggt 240 ggtcgtgaaa tggaagccca ttttgaatgc ttgtgggact tgtttagatc gattccatca 300 gctgaaaata aagatgaatc ggtcctggat gaattttacc gtttaaatag aaaagatcca 360 agtttcgcaa agactcgtgt cattgttaac cgcggacatg aacttccaac tgacggtcaa 420 ttacttctta ctcccaaggc tgttaaagaa attattgatc tttgcttaac tcctgaaaaa 480 gatttacaaa ataaaaaaat taatgaagtc tttagtaaag aattttttga atcaaacttc 540 tggctttact ggtcaacgat gtttgccttt gagccatggg caagtgcgat ggaaatgcgt 600 cgttacttaa tgcgttttgt tcaacacgtt tctacactta agaatttatc atcactacgc 660 tttactaagt ataaccaata tgaatcatta attttaccaa tggttaaata cttgaaagat 720 cgcggcgtgc aattccatta caacaccgtt gttgataata tctttgttaa ccgttcaaat 780 ggtgaaaaga ttgctaagca aattctttta actgaaaacg gtgaaaaaaa gagcatcgat 840 ttaacagaaa atgacctcgt cttcgttact aacggttcaa ttactgaaag tacaacttat 900 ggtgataact tgcacccagc ttctgaggaa cataaattag gtgctacttg gaaattatgg 960 caaaacttgg cagcgcaaga tgatgacttc ggtcacccag atgtcttctg caaggatatt 1020 ccaaaggcta actgggtaat gtctgctaca attactttta agaataatga tattgtgcca 1080 ttcattgaag cagttaataa gaaggatcca cacagcggct caattgtaac tagtgggcct 1140 actacgatta aggattctaa ctggctactt ggttattcaa tcagtcgtca gcctcacttt 1200 gaagcacaaa agcctaacga attgattgta tggctttatg gtttgttctc agacaccaaa 1260 ggtaactatg ttgaaaagac tatgcctgac tgtaacggta ttgaattatg tgaagaatgg 1320 ctttaccaca tgggtgttcc tgaagaaaga atcccagaaa tggcttcagc tgctacgact 1380 attccagcac acatgccata tattacttca tacttcatgc caagagcatt aggcgacaga 1440 cccaaggttg tgccagacca ctcaaagaac ttggccttca ttggtaactt tgctgaaacg 1500 ccaagagaca ctgtctttac cactgaatac tctgtcagaa ctgcgatgga agctgtatac 1560 accttgctta acattgatcg tggtgtgcca gaagtatttg catctgcctt cgatgtcaga 1620 atgctcatga acgcaatgta ctacttgaat gatcaaaaga agcttgaaga tcttgatttg 1680 cctattgctg aaaagttggc aattaagggg atgctcaaga aagttaaggg cacttatata 1740 gaggaattgc ttaagaagta taagttggtt tag 1773 <210> 2 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 2 ttcatatgta ttattccaat ggtaattacg a 31 <210> 3 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 3 gcctcgagtt agactaaatt tgcttcttta agta 34

Claims

수산화지방산과 월토마이세스 리포퍼를 반응시켜 델타-데카락톤을 생산하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 수산화 지방산은 13-수산화-9-옥타데세노익산인 것을 특징으로 하는 델타-데카락톤을 생산하는 방법.
수산화지방산 및 월토마이세스 리포퍼를 유효성분으로 포함하는 델타-데카락톤 생산용 조성물.
제 3항에 있어서, 상기 수산화 지방산은 13-수산화-9-옥타데세노익산인 것을 특징으로 하는 델타-데카락톤 생산용 조성물.
제 1항 또는 제 2항의 방법에 의하여 생산된 델타-데카락톤를 포함하는 조성물.