KR101555175B1 - Yeast strains having high productivity of alcohol from traditionally fermented soybean products, and uses thereof - Google Patents

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Abstract

본 발명은 알코올 고생산능을 가지는, 토룰라스포라 델브루엑키(Torulaspora delbrueckii) JBCC 623 균주 및 피키아 구일리에르몬디(Pichia guilliermondii) JBCC 848 균주, 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주의 배양액의 농축액을 유효성분으로 함유하는 알코올 생산용 조성물 또는 저염화 장류의 보존성을 향상시키기 위한 조성물 및 코지(Koji)에 상기 균주, 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주의 배양액의 농축액을 첨가하여 발효하는 단계를 포함하는 저염화 장류의 보존성을 향상시키는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a strain of Torulaspora delbrueckii JBCC 623 and a strain of Pichia guilliermondii JBCC 848 having an alcohol resistance ability, a culture of the strain or a concentrate of the culture of the strain A composition for improving alcohol-containing composition or a composition for improving the preservation of a low-boiled soybean as an active ingredient, and a step of adding fermentation to the koji by adding the strain, the culture of the strain or a concentrate of the culture medium of the strain to the koji, To a method for improving the preservability of low-boiled sweet potatoes.

Description

전통장류 유래 알코올을 고생산하는 효모 균주 및 이의 용도{Yeast strains having high productivity of alcohol from traditionally fermented soybean products, and uses thereof}[0001] The present invention relates to a yeast strains which produce a high yield alcohol from soy sauce and a use thereof,

본 발명은 전통장류 유래 알코올을 고생산하는 효모 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 알코올 고생산능을 가지는, 토룰라스포라 델브루엑키(Torulaspora delbrueckii) JBCC 623 균주 및 피키아 구일리에르몬디(Pichia guilliermondii) JBCC 848 균주, 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주의 배양액의 농축액을 유효성분으로 함유하는 알코올 생산용 조성물 또는 저염화 장류의 보존성을 향상시키기 위한 조성물 및 코지(Koji)에 상기 균주, 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주의 배양액의 농축액을 첨가하여 발효하는 단계를 포함하는 저염화 장류의 보존성을 향상시키는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to yeast strains and the use thereof to produce high-derived traditional sauces alcohol, more particularly, having an alcohol suffering sanneung, torulra spokes la del Brewer ekki (Torulaspora delbrueckii) JBCC 623 strain and the blood in Escherichia guilri hormone D. ( Pichia guilliermondii) JBCC 848 strain, a culture of the strain or a concentrate of the culture solution of the strain as an active ingredient, or a composition for improving the preservability of a low- And fermenting a culture of the strain or a concentrate of the culture medium of the strain to improve the preservability of the low-boiled variety.

된장, 간장, 청국장 등의 발효 장류는 함께 콩을 주원료로 하여 발효, 숙성시킨 우리 민족의 대표적인 대두 발효식품으로 저장성이 뛰어나고, 그 특유의 맛과 향을 지니고 있어 우리나라 식문화에서 중요한 위치를 차지해 왔을 뿐만 아니라 곡류와 채식위주의 우리 식생활에서 주요 단백질 섭취원으로서 널리 애용되어 온 전통 식품이다. 즉, 콩을 주원료로 하는 된장 및 간장과 같은 장류는 소금에서 오는 짠맛, 단백질 가수분해 산물인 아미노산에서 오는 구수한 맛, 발효에 의한 향 등이 조화를 이루어 독특한 향미와 색이 생성된 우리 고유의 전통 발효식품이다. 또한 미생물 효소에 의해 원료의 단백질과 탄수화물을 분해하여 이용하는 식품으로 단백질과 아미노산 함량이 높아 영양학적으로 중요시되는 우리나라의 대표적인 전통발효식품이며, 곡류위주의 식생활에서 부족되기 쉬운 필수 아미노산 및 지방산, 유기산, 미네랄, 비타민류 등의 영양소를 보충해 주는 중요한 기능을 가진 식품이다. 또한 최근에 된장의 항암효과, 항 돌연변이 효과, 면역기능 강화 효과, 항고혈압 효과, 혈전용해 효과, 콜레스테롤 저하 효과, 항산화 효과 등 다양한 기능성이 밝혀져 새롭게 관심을 끌고 있는 식품이다.Soybean fermented soybean fermented soybean fermented soybean fermented soybean fermented soybean fermented soybean fermented soybean fermented soybean fermented soybean fermented soybean fermented soybean fermented soybean fermented soybean fermented soybean fermented soybean fermented soybean fermented soybean fermented soybean fermented soybean fermented soybean fermented soybean fermented soybean fermented soybean fermented soybean fermented soybean fermented soybean fermented soybean fermented soybean fermented soybean It is a traditional food that has been widely used as a main protein intake source in our diet of grains and vegetarianism. In other words, soybean paste and soy sauce mainly made from soybeans have a unique tradition of producing unique flavors and colors by harmonizing the salty taste of salt, the salty flavor from amino acid, which is a protein hydrolysis product, Fermented food. It is a traditional fermented food, which is a typical fermented food of Korea which is highly nutritious due to its high protein and amino acid content. It is a food which decomposes raw protein and carbohydrate by microbial enzyme. Minerals, vitamins and other nutrients that have an important function to supplement. Recently, it has been attracting attention because of its various functions such as anticancer effect, antimutagenic effect, immune function enhancing effect, antihypertensive effect, thrombolytic effect, cholesterol lowering effect and antioxidant effect of doenjang.

그러나 전통장류는 보존성을 높이기 위하여 통상적으로 높은 농도의 소금을 첨가하므로 전통고추장의 경우는 9∼10%, 전통된장의 경우 12∼15%, 간장의 경우 18∼25%의 소금을 함유한다. 따라서 전통장류는 고염 제품으로 분류되어 건강에 관심이 많은 소비자들이 기피하는 현상(고혈압 등 성인병의 원인)이 나타나고 있다. 실제로 세계보건기구(WHO)가 권장하는 하루 적정 소금 섭취량은 5 g이며, 반면 짜고 자극적인 음식을 선호하는 한국 성인의 하루 평균 소금 섭취량은 13.5 g으로 한국 성인의 소금 섭취량은 세계보건기구 권장량의 3배에 가깝다. 문제는 소금 섭취량의 대부분을 가공식품에서 얻는 서구 사람들과 달리 한국인들은 김치류와 장류 등 전통식단에서 소금을 절반 가까이 섭취한다는 것이며, 식품의약품안전처는 나트륨 섭취의 주요 급원을 김치류(25%), 장류(22%), 소금(20%) 순으로 명시하였다. 결과적으로 우리나라는 소금을 가장 많이 섭취하고 있는 나라로 조사결과에서 드러났으며, 이는 김치 및 절임, 장류 등 식생활에서 중요한 반찬이며, 대부분의 음식들의 조미료로 쓰이는 장류의 사용으로 인한 결과로 이로 인해 각종 만성 질환의 발병률이 높아지고 있다. However, in order to increase the preservability, traditional sweet potatoes usually contain a high concentration of salt, so they contain salt of 9 to 10% for traditional kochujang, 12 to 15% for traditional miso, and 18 to 25% for soy sauce. Therefore, traditional herbs are classified as high salt products, and consumers who are interested in health are avoiding (cause of adult diseases such as hypertension). In fact, the World Health Organization (WHO) recommends a daily salt intake of 5 g, while Korean adults who prefer salty and intolerant food have a daily average salt intake of 13.5 g, It is near the ship. The problem is that Koreans eat almost half of their salt in traditional diets such as kimchi and soup, unlike the western people who get most of their salt intake from processed foods. The Food and Drug Administration's main source of sodium intake is kimchi (25%), (22%), and salt (20%). As a result, Korea is the country that consumes the most salt, and it is revealed in the survey result that it is an important side dish in the diet such as kimchi, pickles and soy sauce, and as a result of using the soy sauce which is used as seasoning for most foods, The incidence of the disease is increasing.

또한 최근 염분이 많은 장류에 대한 나트륨량 등을 표시할 수 있도록 하는 영양표시를 법제화하기로 하고 장류협회, 소비자 단체 등의 의견을 수렴해 관련 법안 개정에 나서고 있으며, 나트륨 줄이기 운동과 함께 식품업계에서도 저염화를 위한 연구에 돌입하여 나트륨 줄이기 운동에 발빠르게 참여하고 있다. 이처럼 식생활 패턴이 현대에 와서 많이 변화되어 가고 있고 국민이 가장 많이 쓰고 있는 식재료의 저염화 필요성이 가장 대두되고 있는 실정이다. 따라서 이러한 저장성을 위한 장류의 과다한 식염 사용은 과도한 짠맛과 함께 고혈압, 뇌졸중, 위암, 신장병, 간경변증, 만성신부전증 등 성인병을 유발하므로 기호성 향상과 성인병 예방을 위해 장류의 식염 함량을 낮출 필요가 있다. In addition, we recently decided to legislate nutrition labeling that can display the amount of sodium for many types of salty foods, and amend the related laws by collecting opinions from the association of soy sauce and consumer groups. In addition to the sodium reduction campaign, Research into low-chloride has begun and has been quick to participate in the sodium reduction campaign. As a result, the pattern of eating habits has changed a lot in the modern times, and the necessity of lowering of the foodstuff most used by the people is the most important. Therefore, it is necessary to reduce the salt content of soy sauce to improve palatability and to prevent adult diseases, because excessive salt use of soy sauce for such a storage property causes excessive sour taste and hypertension, stroke, gastric cancer, kidney disease, liver cirrhosis and chronic renal failure.

장류에서 소금의 역할은 미생물에 대한 식품 부패를 예방할 뿐만 아니라 식품의 발효를 조절하고 결국 텍스쳐와 향미 등에 영향을 미친다. 장류 제조에 있어서 단순하게 소금의 함량을 줄이는 것은 부패 미생물의 증식으로 인한 보존성의 문제와 함께 소금의 농도로 인해 야기되는 발효양상의 패턴이 변화하면서 장류 고유의 맛과 향미가 감소되며, 결과적으로 식품의 품질 저하를 일으키는 문제가 있다. The role of salt in soy sauce not only prevents food spoilage to microorganisms, but also controls the fermentation of food and ultimately affects texture and flavor. The simple reduction of the salt content in the production of soybean paste is accompanied by the problem of the preservation due to the growth of the spoilage microorganism and the change of the pattern of the fermentation pattern caused by the salt concentration, There is a problem of deteriorating the quality of the film.

따라서 저염 장류제품의 제조시 필연적으로 발생하는 보존성 문제를 해결하기 위해 에탄올 첨가, 감마선 조사와 같은 다양한 물리적, 화학적 방법들이 연구되고 있으며, 이중 산업현장에서 적용되고 있는 기술로는 물리적 방법으로 저온살균 방법(공장산 고추장에서 활용)이 있고, 화학적 방법으로 95% 주정처리 및 겨자·고추냉이 첨가 등의 방법이 현실화되어 있다. 하지만 이러한 방법들은 전통장류제품에 염도를 저하시키는데 일부 효과적이나 맛과 향미의 저하가 필연적으로 수반되어 왔다. 한편, 일본의 경우, 저염화 방법에 미생물관리와 화학적 방법, 물리적 방법을 동시에 전통장류제조공정에 포함시킴으로써 맛과 향미를 향상시키면서도 저염화시키는 기술을 보유하고 있다. 또한 일본 및 중국 등에서의 콩 발효 제품의 저염화를 위한 연구로 알코올 성분을 첨가함으로서 부패 미생물을 제어하고자 하였다. 대부분의 병원성 및 부패 미생물은 알코올에 대한 내성을 나타내지 않기 때문에 이러한 방법이 매우 효과적인 수단이 될 수 있음을 시사하고 있다. 그러나, 이러한 방법은 알코올의 첨가라는 인위적인 수단에 의존함으로써 전통식품의 이미지에 좋은 영향을 주지 않을 것으로 사료된다. 또한 높은 농도로 사용시 고유의 전통 장류 풍미도 감소할 수밖에 없다. 따라서 전통장류의 저염화를 위해서는 부패 미생물의 제어뿐만 아니라 전통식품 고유의 향미를 보완시켜 줄 새로운 방법이 모색되야 한다. Therefore, various physical and chemical methods such as ethanol addition and gamma irradiation have been studied in order to solve the preservation problem that necessarily occurs in the production of low salt products. Among the techniques applied in the industrial field, there are physical methods such as pasteurization (Utilized in the factory), and chemical methods such as 95% alcohol treatment and mustard and horseradish addition have been realized. However, these methods have been effective in lowering the salinity of traditional herbal products, but have inevitably accompanied deterioration of taste and flavor. In Japan, on the other hand, low-chlorination methods include microbial control, chemical methods, and physical methods at the same time as traditional salt-making processes, thereby improving the taste and flavor while lowering the salinity. In order to control fermentation of soybean fermentation products in Japan and China, we tried to control spoilage microorganisms by adding alcohol. Most pathogenic and rotting microorganisms do not show tolerance to alcohol, suggesting that this can be a very effective tool. However, this method does not have a good effect on the image of traditional food by relying on an artificial means of adding alcohol. In addition, when used at high concentrations, the flavor of traditional Korean traditional herbs is inevitably reduced. Therefore, in order to lower the chlorophyll content of traditional soy sauces, new methods to complement the flavor of traditional foods as well as to control microorganisms must be sought.

가장 적합한 방법은 우리나라의 전통장류로부터 고알콜을 생성함으로써 저염화 장류의 발효단계에서 인위적인 수단이 아닌 자연적인 수단으로 항균력을 부여하여 부패미생물를 억제하며, 동시에 이러한 저염화발효 프로세스를 수행함에 있어 감소되는 전통장류 유래의 향미성분을 보완할 향미성분을 발생하는 능력을 지닌 발효 미생물을 활용하는 것이 가장 바람직하다. 따라서 본 발명에서는 우리나라의 전통장류로부터 고 알코올을 생성함으로써 항균력을 부여할 신규의 효모를 분리하고자 한다. The most suitable method is to produce high alcohol from Korean traditional herbs, thereby inhibiting spoilage microorganisms by imparting antimicrobial activity by natural means rather than artificial means at the fermentation stage of low chloride fermented soy sauce, and at the same time, It is most preferable to utilize a fermenting microorganism having an ability to generate a flavor component that complements the flavor component derived from the traditional pulp. Therefore, the present invention seeks to isolate a new yeast to be imparted with antimicrobial activity by producing high alcohol from traditional Korean soy sauce.

장류의 주원료는 단백질과 전분질로 1차적으로 단백질 분해효소(protease)와 전분 분해효소(amylase)를 많이 분비하는 미생물들이 관여하게 되고, 2차적으로는 장의 후숙 과정에서 여러 가지 향미 성분을 생성시키는 미생물들이 관여하는 것으로 알려져 있다. 특히 이러한 2차적 장의 후숙 과정에서 일부 효모류는 장류의 풍미 물질을 형성하는데 지대한 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 콩과류 같은 식물체는 특히 염이 존재하는 고상발효(solid-state fermentation) 중 효모에 의하여 향미를 형성하게 된다. 이러한 성분에는 고급 알코올류(alcohols), 에스테르류(esters), 휘발성 페놀류(volatile phenols), 푸라논류(furanones) 같은 것들이 포함된다. The main ingredients of the soy sauce are proteins and starches, which are primarily involved in microorganisms that secrete protease and amylase. Secondarily, microorganisms that produce various flavor components Are known to be involved. Especially, it is known that some yeast have a great influence on the formation of the flavor material of soy sauce in the course of such secondary growth. Plants such as leguminous plants are particularly flavored by yeast during solid-state fermentation in which salts exist. Such ingredients include higher alcohols, esters, volatile phenols, furanones, and the like.

일반적으로 장류에서의 이러한 향미성분들의 생성은 발효·숙성 6개월 정도의 시간이 소요(time-consuming)되는 것으로 알려져 있으며, 또한 고농도의 염이 존재할 때 이러한 향미성분을 생성하는 효소의 활성이 줄어들며, 반면 일정 수준 이하의 염 농도에서는 향미에 관여하는 내염성 효모들의 생존 저하로 인한 향미성분 생성 저하의 결과를 초래할 수 있다고 알려져 있다. Generally, it is known that the production of these flavor components in the soy sauce is time-consuming about 6 months of fermentation and ripening. Also, when the salt is present at a high concentration, the activity of the enzyme that produces such flavor decreases, On the other hand, it is known that salt concentration below a certain level may result in degradation of flavor components due to degradation of salty yeasts involved in flavor.

한국등록특허 제06071570호에서는 고추장 제조방법 및 그 제조방법에 따라 제조된 고추장이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 전통장류 유래 알코올을 고생산하는 효모 균주 및 이의 용도에 대해서는 밝혀진 바가 없다.Korean Patent No. 06071570 discloses a kochujang preparation method and a kochujang prepared according to the preparation method thereof. However, as in the present invention, a yeast strain that produces a high-yielding alcohol from a traditional crop and its use has not been disclosed.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 전통 장류로부터 고알코올을 생성하고 전통장류와 관련된 향미성분을 생성할 수 있는 효모를 분리하였다. 상기 균주를 전통 장류 제품의 고유 풍미를 증진시키고 보존성을 향상시킨 저염화 장류를 제조하기 위한 발효 미생물로서 제공하고자 본 발명을 완성하였다. SUMMARY OF THE INVENTION The present invention has been made in view of the above-mentioned needs, and the present inventors have separated yeasts capable of producing high alcohol from traditional herbs and producing flavor components related to traditional herbs. The present invention has been accomplished in order to provide the above strain as a fermentation microorganism for producing a low chlorinated soy sauce having improved inherent flavor and improved preservability of a traditional soy sauce product.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 알코올 고생산능을 가지는, 토룰라스포라 델브루엑키(Torulaspora delbrueckii) JBCC 623 균주(KACC93183P)를 제공한다.In order to solve the above-mentioned problems, the present invention relates to a method for producing an alcohol- delbrueckii ) JBCC 623 strain (KACC93183P).

또한, 본 발명은 알코올 고생산능을 가지는, 피키아 구일리에르몬디(Pichia guilliermondii) JBCC 848 균주(KACC93184P)를 제공한다.In addition, the present invention provides a Pichia guilliermondii strain JBCC 848 (KACC93184P) having an alcohol-overproducing ability.

또한, 본 발명은 상기 균주, 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주의 배양액의 농축액을 유효성분으로 함유하는 알코올 생산용 조성물 또는 저염화 장류의 보존성을 향상시키기 위한 조성물을 제공한다.The present invention also provides a composition for the production of alcohol or a composition for improving the shelf-life of a low-boiled herbarium containing the strain, the culture of the strain or a concentrated liquid of the culture medium as an active ingredient.

또한, 본 발명은 코지(Koji)에 상기 균주, 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주의 배양액의 농축액을 첨가하여 발효하는 단계를 포함하는 저염화 장류의 보존성을 향상시키는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for enhancing the preservability of a low-boiled pulp including the step of fermenting the strain, the culture of the strain, or a concentrate of the culture medium of the strain to Koji.

본 발명에서는 우리나라의 전통장류로부터 고알콜을 생성함으로써 저염화 장류의 발효단계에서 인위적인 수단이 아닌 자연적인 수단으로 항균력을 부여하여 부패 미생물을 억제하며, 동시에 이러한 저염화발효 프로세스를 수행함에 있어 감소되는 전통장류 유래의 향미성분을 보완할 향미성분을 발생하는 능력을 지닌 발효 미생물인 알코올 고생산능을 가지는, 토룰라스포라 델브루엑키 JBCC 623 균주 및 피키아 구일리에르몬디 JBCC 848 균주를 분리하였다. 상기 균주를 이용하여 전통 장류 제품의 고유 풍미를 증진시키고 보존성을 향상시킨 저염화 장류의 개발이 가능하므로 본 발명은 궁극적으로는 우리의 전통 발효식품의 부가가치를 넓히고 소비자 건강증진에 기여할 수 있다.In the present invention, by producing high alcohol from Korean traditional soybean, anti-microbial power is given by natural means rather than artificial means in the fermentation stage of low chloride fermented soybean to inhibit spoilage microorganisms, and at the same time, A strain of Torula sporea del brucecki JBCC 623 and a strain of Pichia guillerium di JBCC 848, which have a fermenting microorganism alcohol ability capable of generating a flavor component to complement the flavor component derived from a traditional herbarium, were isolated. The present invention can ultimately increase the added value of our traditional fermented foods and contribute to the promotion of consumer health, because it is possible to develop low-boiled soy sauce having improved inherent flavor and improved preservability by using the above strains.

도 1은 본 발명에서 선별된 효모 JBCC 623과 JBCC848의 25%(w/v) 글루코스 농도의 배지에서 에탄올 및 고급알코올(3-methyl-1-butanol) 생성량을 나타낸다. *623, 본 발명에서 분리한 JBCC 623 효모 균주; *848, 본 발명에서 분리한 JBCC 848 효모 균주; ZR 12066, 대조구인 지고사카로마이세스 룩시이(Zygosaccharomyces rouxii) KCCM 12066 균주; ZR 50054, 대조구인 지고사카로마이세스 룩시이 KCCM 55054; SC 30008, 대조구인 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces serevisiae) KACC 30008.
도 2는 전통 간장으로부터 분리된 효모들 중에서 알코올 고생산 효모로 분리된 JBCC 623의 계통수를 나타낸다.
도 3은 전통 간장으로부터 분리된 효모들 중에서 알코올 고생산 효모로 분리된 JBCC 848의 계통수를 나타낸다.
도 4는 토룰라스포라 델브루엑키 JBCC 623 균주(A) 및 피키아 구일리에르몬디 JBCC 848(B)의 FE-SEM 사진을 나타낸다.
도 5는 토룰라스포라 델브루엑키 JBCC 623 균주의 에탄올 최적 조건을 나타낸다. 탄소원(A), 글루코스(B) 및 NaCl(C) 농도, 초기 pH(D), 온도(E), 및 배양 시간(F).
도 6은 토룰라스포라 델브루엑키 JBCC 623 균주의 에탄올 생산을 나타낸다. 25% 글루코스를 첨가한 5, 10, 15, 20%(w/v) 메주(A) 및 청국장(B).
도 7은 전통 장류로부터 분리한 토룰라스포라 델브루엑키 JBCC 623 균주에 의한 코지 발효 과정을 나타낸다.Figure 1 shows the amount of ethanol and 3-methyl-1-butanol produced in the medium of 25% (w / v) glucose concentration of the selected yeasts JBCC 623 and JBCC848 in the present invention. * 623, JBCC 623 yeast strain isolated in the present invention; * 848, JBCC 848 yeast strain isolated in the present invention; ZR 12066, control Zygosaccharomyces rouxii , KCCM 12066 strain; ZR 50054, a control group, KCCM 55054; SC 30008, control Saccharomyces cerevisiae serevisiae) KACC 30008.
Figure 2 shows the phylogenetic tree of JBCC 623 isolated from yeast isolated from traditional soy sauce by high alcohol production yeast.
Figure 3 shows the phylogenetic tree of JBCC 848 isolated from yeast isolated from traditional soy sauce by high alcohol production yeast.
Fig. 4 shows FE-SEM photographs of Torula sporea del brucqki JBCC 623 strain (A) and Pichia gylariemdie JBCC 848 (B).
FIG. 5 shows the ethanol optimum conditions of the strain Torulra sp. Delbruecki JBCC 623. Carbon source (A), glucose (B) and NaCl (C) concentrations, initial pH (D), temperature (E), and incubation time (F).
Figure 6 shows the ethanol production of the Torula Spores delbruecki strain JBCC 623. 5, 10, 15, 20% (w / v) Meju (A) and Chungkukjang (B) supplemented with 25% glucose.
FIG. 7 shows a koji fermentation process by a strain of Torula sporea del brucqki JBCC 623 isolated from a traditional soybean.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 알코올 고생산능을 가지는, 토룰라스포라 델브루엑키(Torulaspora delbrueckii) JBCC 623 균주(KACC93183P)를 제공한다. 본 발명에서 상기 균주는 알코올 고생산능을 가지며, 바람직하게는 에탄올 고생산능을 가지는 균주이다.In order to accomplish the above object, the present invention provides a method for producing an alcohol- delbrueckii ) JBCC 623 strain (KACC93183P). In the present invention, the strain has an alcohol overproducing ability, preferably a strain having ethanol overpotential.

또한, 본 발명은 알코올 고생산능을 가지는, 피키아 구일리에르몬디(Pichia guilliermondii) JBCC 848 균주(KACC93184P)를 제공한다. 본 발명에서 상기 균주는 알코올 고생산능을 가지며, 바람직하게는 고급알코올 고생산능을 가지며, 가장 바람직하게는 3-메틸-1-부탄올 고생산능을 가지는 균주이다.In addition, the present invention provides a Pichia guilliermondii strain JBCC 848 (KACC93184P) having an alcohol-overproducing ability. In the present invention, the strain has an alcohol overproducing ability, preferably a high alcohol having a high productivity, and most preferably a strain having 3-methyl-1-butanol high productivity.

본 발명에 따른 알코올을 고생산하는 균주는 순창군 민속마을에서 생산되는 메주를 시료로 이용하여 분리하였으며, 상기 분리된 균주들 중에서 알코올류 생산성이 높은 JBCC 623 균주 및 JBCC 848 균주를 분리하였다.The strains producing the alcohol according to the present invention were separated by using Meju produced in the Seongchang-gun folk village as samples and isolating JBCC 623 strain and JBCC 848 strain having high alcohol productivity among the isolated strains.

상기 분리된 JBCC 623 균주 및 JBCC 848 균주의 동정을 위하여 26s rDNA 염기서열 분석을 실시한 결과, 본 발명의 JBCC 623 균주는 도 2에 나타낸 바와 같이 토룰라스포라 델브루엑키(Accession no. JF920157) 및 토룰라스포라 델브루엑키(Accession no. KC754972)와 가장 높은 유사도를 나타내었고, JBCC 848 균주는 도 3에 나타낸 바와 같이 피키아 구일리에르몬디(Accession no. EF490689)와 가장 높은 유사도를 나타내었다. 따라서, 알코올을 고생산하는 특징을 가지고 있으므로, 상기 JBCC 623 균주 및 JBCC 848 균주를 토룰라스포라 델브루엑키(Torulaspora delbrueckii) JBCC 623 균주 및 피키아 구일리에르몬디(Pichia guilliermondii ) JBCC 848 균주라 각각 명명하였다.As a result of sequencing of the 26s rDNA for identification of the isolated JBCC 623 and JBCC 848 strains, the JBCC 623 strain of the present invention was identified as Accession No. JF920157 and Torula, The highest degree of similarity was shown with Accession no. KC754972, and JBCC 848 showed the highest degree of similarity with Accession no. EF490689 as shown in Fig. Thus, it has a feature of producing the alcohol and the JBCC 623 strain and the 848 strain JBCC torulra la del Spokane Brewer ekki (Torulaspora delbrueckii ) JBCC 623 strain and Pichia < RTI ID = 0.0 > guilliermondii ) JBCC 848 strain.

본 발명의 균주 토룰라스포라 델브루엑키(Torulaspora delbrueckii) JBCC 623 균주 및 피키아 구일리에르몬디(Pichia guilliermondii ) JBCC 848 균주를 국립농업과학원 농업유전자원센터에 2013년 8월 16일자로 각각 기탁하였다 (순서대로 기탁번호는 각각 KACC93183P 및 KACC93184P).Strain of the present invention torulra la del Spokane Brewer ekki (Torulaspora delbrueckii ) JBCC 623 strain and Pichia < RTI ID = 0.0 > guilliermondii ) JBCC 848 strain was deposited at the National Institute of Agricultural Science and Technology, National Institute of Agricultural Science and Technology on Aug. 16, 2013 (respectively KACC93183P and KACC93184P).

또한, 본 발명은 상기 균주, 균주의 배양물 또는 상기 균주의 배양액의 농축액을 유효성분으로 함유하는 알코올 생산용 조성물 또는 저염화 장류의 보존성을 향상시키기 위한 조성물을 제공한다.The present invention also provides a composition for producing alcohol or a composition for improving the shelf-life of a low-boiled herbarium containing the culture of the strain, the strain or a concentrated liquid of the culture medium of the strain as an active ingredient.

또한, 본 발명은 코지(Koji)에 상기 균주, 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주의 배양액의 농축액을 첨가하여 발효하는 단계를 포함하는 저염화 장류의 보존성을 향상시키는 방법을 제공한다.
The present invention also provides a method for enhancing the preservability of a low-boiled pulp including the step of fermenting the strain, the culture of the strain, or a concentrate of the culture medium of the strain to Koji.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples. However, the following examples are illustrative of the present invention, and the present invention is not limited to the following examples.

실시예Example 1. 전통 방식으로 제조된 장류의 발효기간별 수집 1. Collection of fermented periodically fermented soybeans

본 발명에서 사용한 장류는 전북 순창 지역에서 전통적으로 제조되는 장류를 수집하여 사용하였다. 메주부터 장을 담근 후 1일, 10일, 20일, 30일, 40일, 50일, 60일 및 70일로 10일마다 수집하여 균주 분리용 시료로 사용하였다.
The pastes used in the present invention were collected and used traditionally in southern Jeonbuk province. The cells were harvested every day for 10 days at 1 day, 10 days, 20 days, 30 days, 40 days, 50 days, 60 days, and 70 days after soaking from the meju.

실시예Example 2. 전통 방식으로 제조된 전통 장류로부터 효모의 분리 2. Separation of yeast from traditional herbs prepared in traditional manner

효모의 분리를 위하여 장류 시료는 멸균된 펩톤수(peptone water)를 사용하여 십진법으로 희석한 후 페니실린-스트렙토마이신(Sigma) 항생제가 포함된 YM 아가 배지(Difco)에 0.1 mL을 도말하여 29℃에서 3일간 배양하였다. 분리된 효모 균주는 동일한 조건에서 YM 액체 배지와 YM 아가 배지에 3번 이상 계대 배양한 후 장류 유래의 분리 균주로서 사용하였다. 결과적으로 발효기간별로 수집된 장류로부터 약 1,200점의 효모를 분리하였다.
For the isolation of yeast, the yeast samples were diluted by the decidual method using sterilized peptone water and 0.1 mL was plated on a YM agar medium (Difco) containing penicillin-streptomycin (Sigma) antibiotics at 29 ° C And cultured for 3 days. The isolated yeast strains were cultured in YM liquid medium and YM agar medium at least three times in the same conditions and used as isolated strains derived from the genus. As a result, about 1,200 yeasts were isolated from the collected fermentation period.

실시예Example 3.  3. 알콜Alcohol 생성능Generation 우수 균주 선발을 위한 스크리닝 방법의 확립 Establishment of Screening Method for Selecting Excellent Strain

상기와 같이 전통 장류로부터 분리한 약 1,200점의 효모 균주를 대상으로 알콜 생성능 우수 균주를 선별하기 위한 시험을 실시하였다. 각 균주는 YM 액체배지에 24시간 동안 전 배양된 균주를 기질로 25%(w/v)의 글루코스가 함유된 YM 액체배지에 2%(v/v) 비율로 접종하여 29℃, 180 rpm에서 2일 동안 배양함으로써 균주를 성장시킨 후, 동일한 온도에서 정치배양을 2일 동안 추가적으로 수행함으로써 알콜 발효를 유도하였다. 배양액의 전처리는 원심분리(8,000 rpm, 5 min, 4℃)하여 얻어진 상등액에 내부표준물질(internal standard)로서 이소프로판올을 5%(v/v) 농도가 되도록 첨가시킨 후 증류하여 얻어진 액을 0.45 μm 맴브레인 필터로 여과하여 GC(gas chromatography, 가스 크로마토그래피) 분석을 위한 시료로 하였으며, 그 분석조건은 표 1과 같다. 각 시료의 GC 정량 분석을 위하여 표준물질로서 에탄올과 이소프로판올은 필요한 농도 구배별로 수행한 후 비교를 위하여 사용되었으며, 각각 1.707 분과 1.842 분의 지연시간(retention time)을 나타내었다.As a result, about 1,200 yeast strains isolated from the traditional soybean cultivars were tested to select strains having excellent alcohol production ability. Each strain was inoculated in a YM liquid medium containing 25% (w / v) glucose at a ratio of 2% (v / v) at 29 ° C and 180 rpm for 24 hours in a YM liquid medium for 24 hours The strain was grown by culturing for 2 days and then incubated at the same temperature for 2 days to induce alcohol fermentation. Pretreatment of culture broth was performed by centrifugation (8,000 rpm, 5 min, 4 ° C) and 5% (v / v) isopropanol was added as an internal standard to the supernatant obtained. The sample was filtered with a membrane filter and used for GC (gas chromatography) analysis. The analysis conditions are shown in Table 1. For the GC quantitative analysis of each sample, ethanol and isopropanol were used as standard substances for the comparison after the required concentration gradient, respectively, and the retention time was 1.707 minutes and 1.842 minutes, respectively.

알콜 분석을 위한 가스 크로마토그래피의 분석 조건Analysis conditions of gas chromatography for alcohol analysis ItemsItems ConditionCondition InstrumentInstrument Gas chromatography(HP 6890 system)Gas chromatography (HP 6890 system) DetectorDetector Flame ionization detector(FID)Flame ionization detector (FID) ColumnColumn DB-5 column
30 m×0.25 mm id(0.25 μm film thickness)DB-5 column
30 m x 0.25 mm id (0.25 μm film thickness) Mobile phaseMobile phase HeHe Flow rateFlow rate 1.3 mL/min1.3 mL / min Split raioSplit raio 50:1 50: 1 Detector temp.Detector temp. 250℃250 ℃ Oven temp.Oven temp. 70℃ for 2 min, 20℃/min to 150℃70 ° C for 2 min, 20 ° C / min to 150 ° C

즉, 전통장류로부터 분리된 약 1,200점의 효모를 대상으로 고알콜 생성능을 보유한 발효 우수 효모 균주를 분리하기 위하여 기질인 25%(w/v)의 글루코스를 함유하는 YM 액체 배지에서 배양한 후 상등액의 알콜 함량을 분석한 결과, 전통장류로부터 분리된 효모 균주들 중에서 JBCC 623 균주가 약 14.1±2.83%의 높은 알콜 생성능을 보이면서 고알콜 생성 효모로 최종 선발되었다.Namely, about 1,200 yeasts isolated from the traditional soybean were cultured in a YM liquid medium containing 25% (w / v) glucose as a substrate for isolating fermented yeast strains having high alcohol production ability, , The JBCC 623 strain was selected as a high alcohol - producing yeast with a high alcohol production ability of about 14.1 ± 2.83% among the yeast strains isolated from the traditional soybean.

그리고 선발된 균주의 알콜 생성능 확인을 위하여 표준 균주 몇 개를 분양받아 비교 분석하였다. 실험에 사용된 고알콜 생성 효모의 대조균주는 한국미생물보존센터(KCCM)로부터 분양받은 지고사카로마이세스 룩시이(Zygosaccharomyces rouxii) KCCM 12066, 지고사카로마이세스 룩시이 KCCM 55054와 한국농업미생물자원센터(KACC)로부터 분양받은 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces serevisiae) KACC 30008를 사용하였다. 즉, 본 발명에서 고알콜 생성능을 보이며 선발된 JBCC 623 균주와 함께 지고사카로마이세스 룩시이 KCCM 12066, 지고사카로마이세스 룩시이 KCCM 55054 및 사카로마이세스 세레비지애 KACC 30008는 기질로 10, 20, 30%(w/v)의 글루코스가 함유된 YM 액체배지에 2%(v/v) 비율로 접종하여 29℃, 180 rpm에서 2일 동안 배양한 후, 동일한 온도에서 정치배양을 2일 동안 추가적으로 수행 후 배양액의 전처리는 원심분리(8,000 rpm, 5 min, 4℃)하여 상등액을 수집하고 내부표준물질(internal standard)로서 이소프로판올을 5%(v/v) 농도가 되도록 첨가시킨 후 증류하여 얻어진 액을 0.45 μm 맴브레인 필터로 여과하여 표 1의 조건으로 GC-FID 분석하였다.To confirm the alcohol production ability of selected strains, several standard strains were distributed and analyzed. The control strains of the high-alcohol-producing yeast used in the experiment were Zygosaccharomyces ( Lactobacillus sp.) Purchased from the Korean Microorganism Conservation Center (KCCM) rouxii ) KCCM 12066, < RTI ID = 0.0 > KCCM 55054 and the Korean Agricultural Microorganism Resource Center (KACC), Saccharomyces serevisiae) was used KACC 30008. That is, in the present invention, in combination with the selected JBCC 623 strain exhibiting high alcohol-producing ability, KCCM 12066, < RTI ID = 0.0 > KCCM 55054 and Saccharomyces cerevisiae KACC 30008 were inoculated in a 2% (v / v) ratio to a YM liquid medium containing 10, 20, 30% (w / v) After incubation for 2 days at rpm, the culture was incubated at the same temperature for 2 days. The supernatant was collected by centrifugation (8,000 rpm, 5 min, 4 ° C) and the internal standard The isopropanol was added to a concentration of 5% (v / v) and distilled. The resulting solution was filtered with a 0.45 μm membrane filter and analyzed by GC-FID under the conditions shown in Table 1.

그 결과, JBCC 623가 가장 높은 14.8%(v/v)의 알콜생성량을 나타내면서 본 발명에서 고알콜 생성 효모로 최종 선발되었다. 또한 JBCC 623 효모 균주는 타입 균주(type strain)인 사카로마이세스 세레비지애 KACC 30008와 지고사카로마이세스 룩시이 KCCM 12066, 지고사카로마이세스 룩시이 KCCM 55054와 비교하여도 월등하게 높은 수준을 나타냈다(도 1).
As a result, JBCC 623 was finally selected as a high alcohol-producing yeast in the present invention, showing the highest alcohol production amount of 14.8% (v / v). In addition, the JBCC 623 yeast strain is a type strain, Saccharomyces cerevisiae KACC 30008, and Gigusaccharomyces cerevisiae KCCM 12066, and Gigasakaromasaisu Koshi KCCM 55054 (Fig. 1).

실시예Example 4. 휘발성 향미성분  4. Volatile flavor component 생성능Generation 효모 균주의 선발 Selection of yeast strains

알콜 생성능 우수 균주 선발을 위한 스크리닝을 수행하는 중 수집되었던 배양 상등액을 가지고 실험자의 관능적 분석을 기초로 하여 약 400점의 효모 균주를 1차적으로 스크리닝한 후 고급 알콜류로써 카라멜향을 나타내는 것으로 알려져 있는 2-메틸 부탄올 또는 3-메틸 부탄올을 향미생성 지표 물질로 하여 GC 분석을 수행하였다. 그 중 2-메틸 부탄올 또는 3-메틸 부탄올을 고생산하는 10점의 효모를 대상으로 최종적으로 GC-MS 분석을 통해 생성된 휘발성 향미성분을 분석하였다. 먼저, 상기의 알콜 발효 방법을 통한 효모 배양 상등액의 향기 성분 포집을 위하여 해드스페이스법(Hakala et al, 2002, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50, 1133-1142)에 따라 퍼지 앤드 트랩 분석기(purge and trap analyzer, JDT-505II)을 사용하여 전처리한 후 GC-MS 분석하였다. 즉, 전 배양된 균주를 기질로 25%(w/v)의 글루코스가 함유된 YM 액체배지에 2%(v/v) 비율로 접종하여 29℃, 180 rpm에서 2일 동안 배양함으로써 균주를 성장시킨 후, 동일한 온도에서 정치배양을 2일 동안 추가적으로 수행함으로써 발효를 유도하였다. 이때 JBCC 623 효모를 접종하지 않은 처리구를 대조군으로 동일한 조건으로 분석하였다. 발효된 배양액으로부터 향기성분은 시료 5 mL을 시료병(55 mm OD x 120 nm)에 취하여 질소로 퍼징(purging)하면서 추출하였다. 퍼지 앤드 트랩 시스템의 마운트(mount), 바톰(bottom), 밸브 및 라인 등 각 부분의 온도는 100℃로 고정하였고, 퍼징하는 동안 워터 배스의 온도는 40℃로 하였으며, 퍼징은 30 psi의 질소를 분당 100 mL 속도로 12분간 실시하여 60∼80 매쉬의 Tenax GC(polymer of 2,6-diphenyl-p-phenyl oxide)가 충전된 흡착관에 향기 성분을 흡착시켰다. 흡착관은 50℃로 예비 가열하였고, 220℃에서 4분간 가열 탈착을 실시하였으며 휘발성 성분들의 잔류 가능성을 방지하기 위하여 시료가 주입된 시료병을 완전세척 후 120℃의 건조기에서 2시간 정도 건조시켜 잔여 향기 성분을 없앤 후 사용하였다. 시료로부터 추출된 휘발성 향기 성분 분석은 표 2와 같은 조건에서 GC-MS(gas chromatography mass spectrometer, 가스 크로마토그래피)를 이용하여 분석하였으며, 향기 성분의 동정은 GC-MS에 내장된 윌리 라이브러리(Wiley library)의 매스 스펙트럼과 비교하여 확인하였다.The culture supernatant collected during the screening for selecting an excellent alcohol-producing strain was subjected to screening of about 400 yeast strains on the basis of the sensory analysis of the experimenter and then subjected to screening of 2 -Methyl butanol or 3-methyl butanol as a flavor-producing indicator substance. Among them, volatile flavor components were finally analyzed by GC-MS analysis on 10 yeasts that produce 2-methylbutanol or 3-methylbutanol. First, a purge and trap analyzer according to the head space method (Hakala et al, 2002, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50, 1133-1142) was used to collect the fragrance components of the yeast culture supernatant through the above- trap analyzer, JDT-505II) and analyzed by GC-MS. That is, the pre-cultured strain was inoculated into a YM liquid medium containing 25% (w / v) glucose as a substrate at a ratio of 2% (v / v) and cultured at 29 ° C and 180 rpm for 2 days to grow , Followed by incubation at the same temperature for 2 days to induce fermentation. At this time, the treatments not inoculated with JBCC 623 yeast were analyzed under the same conditions as the control group. From the fermented broth, 5 mL of the sample was taken in a sample bottle (55 mm OD x 120 nm) and purged with nitrogen. The temperature of each part of the fuzzy and trap system, such as mount, bottom, valve and line, was fixed at 100 ° C. During the purging, the temperature of the water bath was 40 ° C. The fractions were adsorbed on a 60-80 mesh Tenax GC (polymer of 2,6-diphenyl-p-phenyl oxide) adsorption column at a rate of 100 mL / min for 12 minutes. The adsorption tube was preheated to 50 ° C. and heated and desorbed at 220 ° C. for 4 minutes. To prevent the possibility of volatile components remaining, the sample bottle was thoroughly washed and dried in a dryer at 120 ° C. for about 2 hours. The fragrance ingredients were removed and used. Analysis of the volatile flavor components extracted from the samples was carried out by GC-MS (gas chromatography mass spectrometer) under the same conditions as in Table 2. The identification of the fragrance components was performed using the Wiley library built in GC-MS ). ≪ / RTI >

휘발성 향미성분 분석을 위한 GC-MS 분석 조건GC-MS analysis conditions for analyzing volatile flavor components ItemItem ConditionCondition InstrumentInstrument GC-MSGC-MS Column Column DB-5 fused silica capillary columnDB-5 fused silica capillary column Oven temp.Oven temp. 40℃(held 3min)-220℃(held 10min), 2℃/min40 ° C (held 3 min) -220 ° C (held 10 min), 2 ° C / min Injector temp.Injector temp. 220℃220 ℃ Detector temp.Detector temp. 250℃250 ℃ DetectorDetector Mass spectrometer(MS)Mass spectrometer (MS) Carrier gasCarrier gas He, 1.2 mL/minHe, 1.2 mL / min Split ratioSplit ratio 1:201:20 Make up gasMake up gas He, 25 mL/minHe, 25 mL / min

그 결과, JBCC 848가 가장 높은 37.08 ppm(v/v)의 알콜생성량을 나타내면서 본 발명에서 고알콜 생성 효모로 최종 선발되었다. 또한 JBCC 848 효모 균주는 타입 균주(type strain)인 사카로마이세스 세레비지애 KACC 30008와 지고사카로마이세스 룩시이 KCCM 12066, 지고사카로마이세스 룩시이 KCCM 55054와 비교하여도 월등하게 높은 수준을 나타냈다(도 1).As a result, JBCC 848 was finally selected as a high alcohol-producing yeast in the present invention, showing the highest alcohol production amount of 37.08 ppm (v / v). The JBCC 848 yeast strain also contains a strain of type Saccharomyces cerevisiae KACC 30008, KCCM 12066, and Gigasakaromasaisu Koshi KCCM 55054 (Fig. 1).

이러한 결과는 전통장류 제조과정 중에서 분리한 효모 JBCC 623과 JBCC 848은 장류의 유효한 향미성분인 에탄올과 고급 알코올류를 생성할 수 있는 균주임을 나타내는 결과이다.
These results indicate that the yeast strains JBCC 623 and JBCC 848 isolated in the process of producing traditional soybean products are strains capable of producing ethanol and high alcohol, which are effective flavor components of soy sauce.

실시예Example 5. 선발된 효모의 26S  5. 26S of selected yeast rRNArRNA // ITSITS 시퀀싱 분석을 이용한 분자생물학적 동정 Molecular biology identification using sequencing analysis

선발된 효모균주 JBCC 623와 JBCC 848 효모의 26S rRNA 유전자의 D1/D2 도메인과 ITS1-5.8S rDNA-ITS2 영역 염기서열을 분석하기 위하여, YM 아가 배지에 분리균주를 접종하여 29℃에서 24시간 동안 배양한 후 사용하였다. 선발된 균주의 플레이트상의 싱글 콜로니를 사용하여 NL1 (5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3' : 서열번호 1)과 NL4 (5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3': 서열번호 2) 프라이머 세트 또는 ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3': 서열번호 3), ITS4 (5'-TCCTCCCGCTTATTGATATGC-3' :서열번호 4) 프라이머 세트를 가지고 MycyclerTM Thermal Cycler (Bio-Rad, Hercules, California, USA)을 사용하여 다음 조건에서 수행하였다(표 3 및 표 4). 먼저 NL1과 NL4 프라이머 세트를 사용한 반응 조건으로 전변성 단계 95℃에서 7분, 변성 단계 95℃에서 60초, 어닐링 단계 53℃에서 45초, 72℃에서 60초간 연장을 35회 반복하였고 마지막 연장은 72℃에서 7분간 시행하였다. 또한, ITS1-5.8S rDNA-ITS2 영역 ITS1과 ITS4 프라이머 세트를 사용한 반응 조건은 전변성 단계 95℃에서 5분, 변성 단계 95℃에서 1분, 어닐링 단계 55.5℃에서 2분, 72℃에서 1분간 연장을 35회 반복하였고 마지막 연장은 72℃에서 10분간 시행하였다. 증폭된 PCR 산물은 1×TBE 버퍼 상에서 2.0%(w/v) 아가로스 겔을 100 볼트로 전기영동 후 이를 QIAEX II 아가로스 겔 추출 키트(Qiagen Valencia, CA, USA)를 사용하여 회수한 후 DNA 염기서열을 결정하였다. 얻어진 염기서열은 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 Basic Local Alignment Search Tool과 Ribosomal Database Project II tool에 등록되어 있는 데이터 베이스를 사용하여 검색하였으며, 높은 유사성을 가지는 염기서열을 기초로하여 그룹별로 정리한 후 클러스터 W(EBI, UK)를 이용한 다중 정렬을 통해 시퀀스 데이터들을 비교하였다.In order to analyze the D1 / D2 domain and the ITS1-5.8S rDNA-ITS2 region of the 26S rRNA gene of selected yeast strains JBCC 623 and JBCC 848 yeast, isolates were inoculated into YM agar medium and incubated at 29 ° C for 24 hours And cultured. (5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3 ': SEQ ID NO: 1) and NL4 (5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3': SEQ ID NO: 2) primer set or ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG- 3 ') using single colonies on the plate of the selected strains. 3 ': SEQ ID NO: 3), ITS4 (5'-TCCTCCCGCTTATTGATATGC -3': using the SEQ ID NO: 4) with a primer set Mycycler TM Thermal Cycler (Bio-Rad , Hercules, California, USA) was carried out under the following conditions: ( Table 3 and Table 4). In the reaction conditions using the NL1 and NL4 primer sets, the denaturation step was performed at 95 ° C for 7 minutes, denaturation step at 95 ° C for 60 seconds, annealing step at 53 ° C for 45 seconds, and extension at 72 ° C for 60 seconds. 72 ℃ for 7 minutes. In addition, the reaction conditions using the ITS1-5.8S rDNA-ITS2 region ITS1 and ITS4 primer sets were 5 min at 95 ° C for the denaturation step, 1 min at the denaturation step at 95 ° C, 2 min at the annealing step at 55.5 ° C, The extension was repeated 35 times and the last extension was carried out at 72 ° C for 10 minutes. The amplified PCR product was electrophoresed on a 2.0% (w / v) agarose gel in 1 × TBE buffer at 100 volts and recovered using a QIAEX II agarose gel extraction kit (Qiagen Valencia, CA, USA) The nucleotide sequence was determined. The obtained nucleotide sequence was searched using the database registered in the Basic Local Alignment Search Tool of the National Center for Biotechnology Information (NCBI) and the Ribosomal Database Project II tool. Based on the nucleotide sequence having high similarity, Sequence data were compared through multiple alignments using post cluster W (EBI, UK).

NL1과 NL4의 프라이머를 사용한 PCR 분석 조건PCR analysis conditions using NL1 and NL4 primers Reaction mixtureReaction mixture PCR conditionPCR condition 10×Taq reaction buffer10 × Taq reaction buffer 5 μL5 μL dNTP mix(2.5 mM each)dNTP mix (2.5 mM each) 4 μL4 μL 95℃, 7 min95 ° C, 7 min Primer NL1(20 pmol)Primer NL1 (20 pmol) 0.25 μL0.25 μL 95℃, 1 min ━━━┑95 ℃, 1 min ━━━┑ Primer NL4(20 pmol)Primer NL4 (20 pmol) 0.25 μL0.25 μL 53℃, 45 sec 35 cycle53 ° C, 45 sec 35 cycles Template DNATemplate DNA 1 μL1 μL 72℃, 1 min ━━━┙72 ℃, 1 min ━━━┙ Taq polymerase(2.5 U/mL)Taq polymerase (2.5 U / mL) 0.5 μL0.5 μL 72℃, 7 min72 C, 7 min D.W.D.W. up to 50 mLup to 50 mL

ITS1과 ITS4의 프라이머를 사용한 PCR 분석 조건PCR analysis conditions using primers of ITS1 and ITS4 Reaction mixtureReaction mixture PCR conditionPCR condition 10×Taq reaction buffer10 × Taq reaction buffer 5 μL5 μL dNTP mix(2.5 mM each)dNTP mix (2.5 mM each) 4 μL4 μL 95℃, 5 min95 ° C, 5 min Primer ITS1(20 pmol)Primer ITS1 (20 pmol) 0.25 μL0.25 μL 95℃, 1 min ━━━┑95 ℃, 1 min ━━━┑ Primer ITS4(20 pmol)Primer ITS4 (20 pmol) 0.25 μL0.25 μL 55.5℃, 2 min 35 cycle55.5 ° C, 2 min 35 cycles Template DNATemplate DNA 1 μL1 μL 72℃, 2 min ━━━┙72 ℃, 2 min ━━━┙ Taq polymerase(2.5 U/mL)Taq polymerase (2.5 U / mL) 0.5 μL0.5 μL 72℃, 10 min72 ° C, 10 min D.W.D.W. up to 50 mLup to 50 mL

또한 분리된 효모 균주의 생화학적 특성 분석을 통한 분자생물학적 동정 결과의 확인 및 탄소원 이용능을 시험하기 위하여 API 20C AUX kit(BioMerieus, France)을 이용하여 제조회사의 시험방법에 따라 시험하였다. 그 결과, 도 2에 보여지듯 JBCC 623 균주는 토룰라스포라 델브루엑키(Torulaspora delbrueckii , Accession no. JF920157)와 99%의 가장 높은 상동성을 나타내었다. 이는 ITS1과 ITS4 프라이머를 사용한 분석 결과를 통해서도 일치되게 토룰라스포라 델브루엑키(Torulaspora delbrueckii , Accession no. KC754972) 균주와 가장 높은 상동성을 나타내었다. JBCC 623 균주의 당 이용성은 표 5와 같이 D-글루코스, L-아라비노스, D-자일로스, 아도니톨, 자일리톨, D-갈락토스, 이노시톨, 메틸-α-D-글루코피라노시드, N-아세틸-글루코사민, D-셀리오비오스, D-락토스(bovine origin), D-말토스, D-멜레지토스를 탄소원으로 이용할 수 있었으며, 반면 글리세롤, 칼슘 2-케토-글루코네이트, D-솔비톨, D-사카로스, D-트레할로스 및 D-라피노스를 이용하지 못하는 것을 확인할 수 있었으나 API 키트로 동정될 수 있는 균종에 속해 있지 않다. 따라서, 최종적으로 선발된 JBCC 623 균주는 토룰라스포라 델브루엑키 JBCC 623 (KACC93183P)으로 명명되었다. 또한 JBCC 848 균주는 피키아 구일리에르몬디(Pichia guilliermondii, Accession no. EF490689)와 99%의 가장 높은 상동성을 나타내었으며, 전형적인 특징으로 이노시톨과 D-락토스 (bovine origin)를 이용하지 못하는 것으로 나타나면서 26S rRNA 시퀀스 분석 결과와 일치하여 캔디다 구일리에르몬디(Candida guilliermondii)(84.3%)로 동정되었다. 따라서 JBCC 848 균주는 피키아 구일리에르몬디 JBCC 848(KACC93184P)로 최종 명명되었다. (출처-Wikipedia: 피키아 구일리에르몬디의 동의어는 캔디다 구일리에르몬디. 또한, API 키트로 나타날 수 있는 동정 결과에 캔디다 구일리에르몬디라고 기재됨)In addition, the test was conducted according to the manufacturer's test method using the API 20C AUX kit (BioMerieus, France) to confirm the results of molecular biology identification and biodegradability of the separated yeast strains and to test the carbon source availability. As a result, it is shown in Figure 2 jideut JBCC 623 strain torulra la del Spokane Brewer ekki (Torulaspora delbrueckii , Accession no. JF920157) and showed the highest homology of 99%. This sports torulra in correspondence through the results using the ITS1 and ITS4 primers la del Brewer ekki (Torulaspora delbrueckii , Accession no. KC754972) strain. The sugar availability of the JBCC 623 strain is shown in Table 5 as D-glucose, L-arabinose, D-xylose, adonitol, xylitol, D-galactose, inositol, methyl- alpha -D-glucopyranoside, N- Acetyl-glucosamine, D-celiobiose, bovine origin, D-maltose and D-merritose could be used as carbon sources while glycerol, calcium 2-keto-gluconate, D-sorbitol, D - Saccharose, D-trehalose and D-raffinose were not available, but they are not in the species that can be identified by the API kit. Thus, the finally selected JBCC 623 strain was named Torulaspore del Brucki JBCC 623 (KACC93183P). In addition, JBCC 848 showed the highest homology of 99% with Pichia guilliermondii ( Accession no. EF490689), and was found to be unable to use inositol and D-lactose (bovine origin) as a typical feature ( Candida guilliermondii) (84.3%) in agreement with the results of 26S rRNA sequence analysis. Thus, the JBCC 848 strain was finally named Pichia Guillermo di JBCC 848 (KACC93184P). (Source - Wikimedia Foundation: Synonyms are Candida Willy Ermordy. Also, the identification result, which may appear as an API kit, is referred to as Candida gilerium radii)

본 발명에서 분리한 효모 JBCC 623 및 JBCC 848의 API 키트를 이용한 생화학적 분석 결과Biochemical analysis using yeast JBCC 623 and JBCC 848 API kits isolated from the present invention No.No. TestsTests Active ingredientsActive ingredients JBCC 623 JBCC 623 JBCC 848JBCC 848 1One GLUGLU D-GlucoseD-Glucose ++ ++ 22 GLYGLY GlycerolGlycerol -- ++ 33 2KG2KG Calcium 2-keto-gluconateCalcium 2-keto-gluconate -- ++ 44 ARAARA L-ArabinoseL-Arabinose ++ ++ 55 XYLXYL D-XyloseD-Xylose ++ ++ 66 ADOADO AdonitolAdonitol ++ ++ 77 XLTXLT XylitolXylitol ++ ++ 88 GALGAL D-GalactoseD-Galactose ++ ++ 99 INOINO InositolInositol ++ -- 1010 SORSOR D-SorbitolD-Sorbitol -- ++ 1111 MDGMDG Methyl-α-D-glucopyranosideMethyl-alpha-D-glucopyranoside ++ ++ 1212 NAGNAG N-Acetyl-glucosamineN-Acetyl-glucosamine ++ ++ 1313 CELCEL D-celiobioseD-celiobiose ++ ++ 1414 LACLAC D-Lactose(bovine origin)D-Lactose (bovine origin) ++ -- 1515 MALMAL D-maltoseD-maltose ++ ++ 1616 SACSAC D-saccharose(sucrose)D-saccharose (sucrose) -- ++ 1717 TRETRE D-trehaloseD-trehalose -- ++ 1818 MLZMLZ D-melezitoseD-melezitose ++ ++ 1919 RAFRAF D-raffinoseD-raffinose -- ++

실시예Example 6. 전자현미경( 6. Electron microscope ( FEFE -- SEMSEM )을 이용한 효모의 형태학적 특성 분석Analysis of the morphological characteristics of yeast

선발된 효모 토룰라스포라 델브루엑키 JBCC 623와 피키아 구일리에르몬디 JBCC 848의 형태학적 특성을 분석하기 위하여 그 세포 형태를 전자현미경(SEM, scanning electron microscopy) 분석을 통해 살펴보았다. SEM 관찰용 균체 시료의 전처리는 각각의 효모를 0.25%의 페니실린-스트렙토마이신 용액을 첨가한 YM 액체 배지에 24-48시간 동안 배양시킨 균체액을 가지고 다음과 같이 실시하였다. 즉, 균주 배양액을 4℃에서 원심분리 하여 균체를 회수한 다음 2.5% 글루타르알데히드(sigma)를 사용하여 30분 동안 1차 고정시킨 후, 10,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 균체를 회수하고 0.9%(w/v) NaCl 용액으로 3-5회 반복하여 세척하였다. 1%(w/v) 오스뮴 테트라옥시드(sigma)를 사용하여 20분간 2차 고정 후, 0.9%(w/v) NaCl을 사용하여 3-5회 반복 세척하였다. 2차 고정이 끝난 후 회수된 균체는 2% 우라실 아세테이트(EMS, w/v)를 첨가하여 30분 동안 염색 후, 회수된 균체는 25, 50, 70, 90, 100% 에탄올(v/v)을 순서대로 첨가하여 탈수시켰으며 탈수가 끝난 혼합액을 슬라이드 글라스에 분주하여 건조하였다. 슬라이드 글라스 위에 건조된 시료는 이온 스퍼터를 이용하여 20분 동안 골드 코팅한 후, FE-SEM(SUPRA 40VP)을 통해 상을 관찰하였다. In order to analyze the morphological characteristics of the selected yeast strains, Torula spore delbruecki JBCC 623 and Pichia guillerium di JBCC 848, their cell morphology was examined by scanning electron microscopy (SEM). Pretreatment of the bacterial cell samples for SEM observation was carried out as follows, with the yeast cells cultured in YM liquid medium supplemented with 0.25% penicillin-streptomycin solution for 24-48 hours. That is, the culture broth was centrifuged at 4 ° C to collect the cells, and then fixed with 2.5% glutaraldehyde (Sigma) for 30 minutes. Then, the cells were recovered by centrifugation at 10,000 rpm for 5 minutes to obtain 0.9 % (w / v) NaCl solution. After secondary fixation for 20 minutes with 1% (w / v) osmium tetraoxide (sigma), the cells were washed 3-5 times with 0.9% (w / v) NaCl. The recovered cells were stained with 25%, 50%, 70%, 90%, 100% ethanol (v / v) for 30 minutes after adding 2% uracil acetate (EMS, w / v) Were added in order to dehydrate. The dehydrated mixture was dispensed into a slide glass and dried. The dried samples on the slide glass were gold-coated for 20 minutes using an ion sputter, and then observed through FE-SEM (SUPRA 40VP).

그 결과, 도 4에 보이는 것처럼 토룰라스포라 델브루엑키 JBCC 623의 세포형태는 평균 3.2 ㎛의 구형이었으며 피키아 구일리에르몬디 JBCC 848은 평균 2.7 ㎛의 타원형으로 두 균주 모두 다극 출아에 의해 생육하는 것을 확인할 수 있었다.
As a result, as shown in FIG. 4, the cell shape of the Torula sporea del brucqki JBCC 623 was spherical with an average of 3.2 탆, and Pichia Guileriemondi JBCC 848 was an oval shape with an average of 2.7 탆, .

실시예Example 7. 선발된  7. Selected 토룰라스포라Torula Spore 델브루엑키Delbruecki JBCCJBCC 623 및  623 and 피키아Pikia 구일리에르몬디Guilheromondy JBCCJBCC 848 균주의 생육 특성 Growth characteristics of strain 848

토룰라스포라 델브루엑키 JBCC 623 및 피키아 구일리에르몬디 JBCC 848 균주의 생육 가능 pH와 온도 범위를 살펴보았다. 먼저, 글루코스 10 g/L, 효모 추출물 3 g/L, 말트 추출물 3 g/L, 펩톤 5 g/L의 YM 액체 배지에 16시간 전배양한 균주를 상기에 기술된 YM 기본 액체 배지를 0.1N NaOH 또는 0.1N HCl 용액을 사용하여 pH를 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12로 각각 조정하여 확인하였다. 즉, 다른 pH를 가지는 각각의 YM 액체배지에 1%(v/v) 비율로 접종하여 29℃, 180 rpm에서 2일 동안 배양하면서, 각각 12, 24, 48시간에 균주의 성장 정도를 Beckman Coulter DU-800 UV-VIS 스펙트로미터를 사용하여 OD600 값으로써 측정하였다. 효모의 생육에 있어서 배양온도의 영향을 살펴보기 위하여 상기와 동일한 배양 조건에서 배양 온도만을 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45℃로 설정한 후 살펴보았다. 내당성 분석은 상기에 기술된 YM 기본 액체 배지 조성에서 탄소원인 글루코스의 농도를 0, 5, 10, 20, 30, 40, 50%(w/v)의 비율로 각각 조제한 배양액에 상기와 동일한 조건으로 배양 한 후 살펴보았다. 내염성 분석은 상기에 기술된 YM 기본 액체 배지 조성에 0, 2.5, 5.0, 7.5, 10.0, 12.5, 15.0, 17.5, 20.0%(w/v)의 비율로 NaCl을 첨가한 각각의 배지를 조제하여 염 농도에 따른 균체 성장에 미치는 영향을 확인하였다. 아황산 내성 분석을 위하여 상기에 기술된 YM 기본 액체 배지 조성에 0, 100, 200, 300, 400, 500 ppm(w/v)의 비율로 아황산염(potassium disulfite, K2S2O5)을 첨가하여 각각의 배지를 조제하여 아황산염 농도에 따라 균체 성장에 미치는 영향을 살펴보았다. 내알코올성 분석을 위하여 상기에 기술된 YM 기본 액체 배지 조성에 0, 2.5, 5.0, 7.5, 10.0, 12.5, 15.0, 17.5, 20.0%(v/v)의 비율로 에탄올(ethanol)을 첨가하여 각각의 배지를 조제하여 알코올 농도에 따라 균체 성장에 미치는 영향을 살펴보았으며 그 결과는 표 6과 같다.The growth pH and temperature range of the Torulra spore del brucki JBCC 623 and Pichia gylariermodi JBCC 848 strains were examined. First, the strain cultured for 16 hours in a YM liquid medium of 10 g / L of glucose, 3 g / L of yeast extract, 3 g / L of malt extract and 5 g / L of peptone was added to the above- NaOH or 0.1N HCl solution was used to adjust the pH to 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, That is, inoculated at a ratio of 1% (v / v) to each YM liquid medium having different pH and incubated at 29 ° C and 180 rpm for 2 days, the degree of the growth of the strain was measured at Beckman Coulter And measured with an OD 600 value using a DU-800 UV-VIS spectrometer. In order to investigate the influence of the culture temperature on the growth of yeast, only the culture temperature was set at 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ° C under the same culture conditions as above. The glucose tolerance assay was performed in the same manner as in the above-described conditions except that the concentration of glucose, which is a carbon source in the YM basic liquid medium composition described above, was adjusted to 0, 5, 10, 20, 30, 40, 50% (w / v) And then examined. Salt resistance analysis was carried out by preparing each medium in which NaCl was added at a ratio of 0, 2.5, 5.0, 7.5, 10.0, 12.5, 15.0, 17.5, 20.0% (w / v) to the YM basic liquid medium composition described above, And the effect on cell growth was investigated. Sodium sulfite (potassium disulfite, K2S2O5) was added to the YM basic liquid medium composition described above at a ratio of 0, 100, 200, 300, 400 and 500 ppm (w / v) The effect of sulfite on bacterial growth was investigated. Ethanol was added to the YM basic liquid medium composition described above at a ratio of 0, 2.5, 5.0, 7.5, 10.0, 12.5, 15.0, 17.5, 20.0% (v / v) The effect of alcohol on cell growth was investigated. The results are shown in Table 6.

선발된 토룰라스포라 델브루엑키 JBCC 623 및 피키아 구일리에르몬디 JBCC 848 균주의 생육 특성Growth characteristics of the selected Torula sporea del brucki JBCC 623 and Pichia gylioremdie JBCC 848 strain TestTest Range　Range T. delbrueckii
JBCC623 T. delbrueckii
JBCC623 P. guilliermondii
JBCC848 P. guilliermondii
JBCC848 pH tolerancepH tolerance pH 2pH 2 -- ++++ pH 3-pH 10pH 3-pH 10 ++++++ ++++++ pH 11pH 11 ++++++ ++++++ pH 12pH 12 ++++ ++++++ Temperature toleranceTemperature tolerance 10℃10 ℃ ++++ ++++ 15-30℃15-30 ° C ++++++ ++++++ 35℃35 ℃ ++ ++++++ 40℃40 ℃ -- ++++ 45℃45 ° C -- -- Glucose toleranceGlucose tolerance 0% glucose0% glucose ++ ++ 1-30% glucose1-30% glucose ++++++ ++++++ 40% glucose40% glucose ++++++ ++ 50% glucose50% glucose ++++ -- NaCl toleranceNaCl tolerance 0-10% NaCl0-10% NaCl ++++++ ++++++ 12.5% NaCl12.5% NaCl ++++++ ++++++ 15% NaCl15% NaCl ++++ ++ 17.5% NaCl17.5% NaCl ++ -- 20% NaCl20% NaCl -- -- K2S2O5 toleranceK 2 S 2 O 5 tolerance 0-500 ppm K2S2O5 0-500 ppm K 2 S 2 O 5 ++++++ ++++++ 600 ppm K2S2O5 600 ppm K 2 S 2 O 5 ++++++ ++++++ 700 ppm K2S2O5 700 ppm K 2 S 2 O 5 ++++ ++++++ 800 ppm K2S2O5 800 ppm K 2 S 2 O 5 ++ ++++++ 900 ppm K2S2O5 900 ppm K 2 S 2 O 5 -- -- Alcohol toleranceAlcohol tolerance 0-5% ethanol0-5% ethanol ++++++ ++++++ 7.5% ethanol7.5% ethanol ++++++ ++ 10% ethanol10% ethanol ++++++ ++ 12.5% ethanol12.5% ethanol ++ -- 　 15% ethanol15% ethanol ++ --

토룰라스포라 델브루엑키 JBCC 623 균주는 pH 3에서 pH 12까지 다양한 pH 범위에서 생육 가능했으며, 35℃의 온도까지 생육 가능하였다. 또한 50% 이상의 글루코스 농도, 17.5% NaCl, 800 ppm의 포타슘 디설페이트, 15%의 알콜 농도에서 생육할 수 있는 내당성, 내염성, 내아황산염, 내알콜성 효모이다. 피키아 구일리에르몬디 JBCC 848 효모의 경우 pH 2에서 pH 12까지 다양한 pH 범위에서 생육할 수 있으며, 40℃의 온도까지 생육할 수 있는 내열성 효모이다. 또한 40%의 글루코스 농도, 15% NaCl, 800 ppm의 포타슘 디설페이트, 10%의 알콜 농도에서 생육할 수 있는 내당성, 내염성, 내아황산염, 내알콜성 효모이다.
The Torula sporea del bruckie strain JBCC 623 was able to grow in various pH ranges from pH 3 to pH 12 and was able to grow to a temperature of 35 ° C. It is also resistant to salt, salt tolerance, sulfite, and alcoholic yeast that can grow at a glucose concentration of 50% or more, 17.5% NaCl, 800 ppm potassium disulfate, and 15% alcohol. Pichia Guileri Ermodi JBCC 848 Yeast is a heat-resistant yeast that can grow in various pH ranges from pH 2 to pH 12 and can grow to a temperature of 40 ° C. It is also resistant to glucose, salt tolerance, sulfite, and alcoholic yeast that can grow at a glucose concentration of 40%, 15% NaCl, 800 ppm potassium disulfate, and 10% alcohol.

실시예Example 8. 선발된  8. Selected 토룰라스포라Torula Spore 델브루엑키Delbruecki JBCCJBCC 623의  623 알콜발효Alcohol fermentation 최적조건 분석 Optimal condition analysis

토룰라스포라 델브루엑키 JBCC 623 균주의 알콜 생성능에 있어서 탄소원, 탄소원의 농도, 염농도, 초기 pH, 배양온도 및 배양시간의 영향을 살펴보았다. 먼저, 알콜 생성에 있어서 탄소원의 영향을 살펴보기 위하여 글루코스 10 g/L, 효모 추출물 3 g/L, 말트 추출물 3 g/L, 펩톤 5 g/L의 YM 액체 배지에 16시간 전배양한 토룰라스포라 델브루엑키 JBCC 623 균주를 상기에 기술된 YM 기본 액체 배지 조성에서 글루코스 대신에 탄소원으로 프락토스, 갈락토스, 글루코스, 만노스, 리보스 및 자일로스를 25%(w/v)의 비율로 각각 조제하여 확인하였다. 즉, 균주를 기질로 25%(w/v)의 각각의 탄소원이 함유된 YM 액체배지에 2%(v/v) 비율로 접종하여 29℃, 180 rpm에서 2일 동안 배양함으로써 균주를 성장시킨 후, 동일한 온도에서 정치배양을 2일 동안 추가적으로 수행함으로써 알콜 발효를 유도하였다. 생성된 알콜 분석을 위한 배양액의 전처리는 원심분리(8,000 rpm, 5 min, 4℃)하여 상등액을 수집하고 얻어진 상등액에 내부표준물질로서 이소프로파놀을 5%(v/v) 농도가 되도록 첨가시킨 후 증류하여 얻어진 액을 0.45 μm 맴브레인 필터로 여과하여 GC-FID로 분석하였다(표 1). 또한 토룰라스포라 델브루엑키 JBCC 623 균주의 알콜 생성능에 있어서 탄소원 농도의 영향을 살펴보았다. 상기에 기술된 YM 기본 액체 배지 조성에서 탄소원인 글루코스의 농도를 0, 10, 20, 30, 40, 50%(w/v)의 비율로 각각 조제하여 확인하였다. 알콜 생성능에 있어서 NaCl(sodium chloride)의 영향은 YM 기본 액체 배지 조성에서 탄소원인 글루코스의 농도를 25%(w/v)의 비율로 고정한 후 0, 2.5, 5.0, 10, 15, 20, 25, 30%(w/v)의 비율로 NaCl을 첨가하여 확인하였다. 초기 pH의 영향은 글루코스의 농도를 25%(w/v)의 비율로 고정한 YM 배양액의 pH를 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10로 각각 조정한 후 확인하였으며, 배양 온도의 영향은 글루코스의 농도를 25%(w/v)의 비율로 고정한 YM 액체배지에 2%(v/v) 비율로 접종한 후 각각 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37℃의 다른 온도에서 180 rpm으로 2일 동안 배양함으로써 균주를 성장시킨 후, 동일한 온도에서 정치배양을 2일 동안 추가적으로 수행함으로써 측정하였다. 또한, 토룰라스포라 델브루엑키 JBCC 623 균주의 알콜 생성능에 있어서 배양 시간의 영향을 살펴보기 위해 글루코스의 농도를 25%(w/v)의 비율로 고정한 YM 액체배지에 2%(v/v) 비율로 접종한 후 29℃의 온도에서 180 rpm으로 2일 동안 배양함으로써 균주를 성장시킨 후, 동일한 온도에서 정치배양을 0, 12, 24, 48, 72, 76, 120, 144시간 동안 각각의 다른 시간으로 추가적으로 수행함으로써 알콜 발효 후 생성된 알콜 농도를 GC-FID로 분석하였다.The effect of carbon source, concentration of carbon source, salt concentration, initial pH, incubation temperature and incubation time on the alcohol production ability of JBCC 623 strains of Torula spore delbrueckii was examined. First, in order to examine the effect of carbon sources on alcohol production, 10 g / L of glucose, 3 g / L of yeast extract, 3 g / L of malt extract and 5 g / L of peptone, Lardilla broccoli JBCC 623 strain was prepared in the above-described YM basic liquid medium composition at a ratio of 25% (w / v) of fructose, galactose, glucose, mannose, ribose and xylose as a carbon source instead of glucose Respectively. That is, the strain was inoculated into a YM liquid medium containing 25% (w / v) of each carbon source as a substrate at a ratio of 2% (v / v) and cultured at 29 ° C and 180 rpm for 2 days to grow the strain After that, alcohol fermentation was induced by performing additional incubation at the same temperature for 2 days. The supernatant was collected by centrifugation (8,000 rpm, 5 min, 4 ° C) for the alcohol analysis, and isopropanol was added to the supernatant as an internal standard at a concentration of 5% (v / v) After distillation, the resulting solution was filtered with a 0.45 μm membrane filter and analyzed by GC-FID (Table 1). In addition, the effect of carbon source concentration on the alcohol production ability of JBCC 623 strains was investigated. The concentration of glucose, which is a carbon source in the above-described YM basic liquid medium composition, was determined at a ratio of 0, 10, 20, 30, 40 and 50% (w / v). The effect of NaCl (sodium chloride) on the alcohol production ability was determined by fixing the concentration of glucose, which is a carbon source, in the composition of the YM basic liquid medium at a ratio of 25% (w / v), then 0, 2.5, 5.0, 10, 15, 20, 25, And 30% (w / v) NaCl. The effect of the initial pH was confirmed by adjusting the pH of the YM culture medium in which the glucose concentration was fixed to 25% (w / v) at 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 and 10, Were inoculated at a concentration of 2% (v / v) in a YM liquid medium fixed with glucose at a concentration of 25% (w / v), and then incubated at 13, 17, 21, 25, 29, The strain was grown by incubating at 180 rpm for two days at different temperatures, and then incubated at the same temperature for 2 days. Also, To examine the effect of incubation time on the alcohol production ability of the Torulasparra delbruecki strain JBCC 623, a 2% (v / v) ratio was added to a YM liquid medium fixed with a glucose concentration of 25% (w / v) After inoculation, the strain was grown by incubation at 29 rpm at 180 rpm for 2 days, and then incubated at the same temperature for 0, 12, 24, 48, 72, 76, 120, The alcohol concentration after alcohol fermentation was further analyzed by GC-FID.

그 결과, 토룰라스포라 델브루엑키 JBCC 623 균주의 균체 성장 정도는 도 5A와 같이 글루코스를 탄소원으로 하였을 때 알콜 생성량은 8.30%(v/v)로 가장 높았으며 만노스에서도 8.23%(v/v)로 유사한 수준을 나타냈다. 탄소원을 글루코스로 고정한 후 그 농도에 대한 알콜 생성량을 살펴본 결과, 30%(w/v)의 글루코스 농도에서 9.91%(v/v)의 알콜 생성량을 보이면서 가장 높았으며 25%와 20%의 글루코스 농도에서도 8.03%으로 유사한 수준을 나타냈다(도 5B). 토룰라스포라 델브루엑키 JBCC 623 균주의 알콜 생성에 있어서 염의 농도에 대한 저해를 받는지의 유/무를 살펴보기 위하여 다양한 농도의 염을 첨가하여 살펴본 결과, 도 5C와 같이 비록 염 농도가 증가함에 따라 알콜 생성량도 감소하였으나, 염을 첨가하지 않은 조건에서 알콜 생성량은 11.9%(v/v) 수준이 10%(w/v)의 NaCl 농도 하에서도 9.21%, 20%의 NaCl에서는 6.27%, 30% NaCl에서는 2.31%의 수준을 나타냈다. 도 5D와 같이 초기 pH에 대한 알콜 생성 정도는 pH 5.0에서 9.56%(v/v)으로 가장 높은 수준을 보였고, pH 6.0-8.0 구간에서는 8.39-8.23%의 생성량을 유지하였다. 또한 pH 9.0에서 7.54%, pH 10.0에서는 6.88%의 알콜 생성량을 나타냈으며, pH 4.0에서도 6.42% 수준을 나타냈다. 반면 pH 3.0에서는 2.92%의 수준을 나타냈다. 발효 온도에 따른 알콜 생성량은 도 5E와 같이 25℃의 온도하에서 12.24%(v/v)으로 가장 높은 수준을 보였고 29℃에서 11.91%로 유사한 수준을 나타냈다. 반면 그 이상으로 온도가 높아졌을 경우 33℃에서 4.00%, 37℃에서 1.62%의 수준으로 알콜 생성량은 매우 감소되었으며, 21℃하에서 7.77%, 13℃하에서 2.31% 수준을 보이면서 토룰라스포라 델브루엑키 JBCC 623 균주의 알콜 발효는 20-30℃ 사이의 온도에서 적합한 것으로 나타났다. 또한 발효 시간에 따른 알콜 수준은 도 5F와 같이 시간에 따른 알콜 생성량이 증가되는 경향을 보였으며, 후 발효 72-96시간에 11.05%에서 11.50% 수준으로 가장 높았으며 이 이후의 알콜 수준은 다시 감소되는 경향을 나타냈다.
As a result, the amount of alcohol production was 8.30% (v / v) and 8.23% (v / v) in mannose when glucose was used as a carbon source, as shown in FIG. 5A, As shown in Fig. As a result of examining the alcohol production relative to the concentration of the carbon source after fixing the carbon source, it was found that the alcohol production amount was 9.91% (v / v) at the glucose concentration of 30% (w / v) and the highest was 25% and 20% And 8.03%, respectively (FIG. 5B). As shown in FIG. 5C, when the concentration of salt was increased, it was found that the concentration of the alcohol in the alcohol production of the Torulra spore del brucki strain JBCC 623 In the absence of salt, the amount of alcohol was 11.9% (v / v), 9.21% at 10% (w / v) NaCl, 6.27% at 20% NaCl, 30% NaCl And 2.31% respectively. As shown in FIG. 5D, the degree of alcohol formation at the initial pH was 9.56% (v / v) at pH 5.0, and the amount of alcohol was maintained at 8.39-8.23% at pH 6.0-8.0. Also, the amount of alcohol produced was 7.54% at pH 9.0, 6.88% at pH 10.0, and 6.42% even at pH 4.0. On the other hand, at pH 3.0, it was 2.92%. As shown in FIG. 5E, the amount of alcohol produced according to the fermentation temperature was 12.24% (v / v) at 25 ° C and 11.91% at 29 ° C. On the other hand, when the temperature was higher than that, the alcohol production was reduced to 4.00% at 33 ° C and 1.62% at 37 ° C, and 7.77% at 21 ° C and 2.31% at 13 ° C, Alcohol fermentation of strain JBCC 623 appeared to be suitable at temperatures between 20-30 ° C. As shown in FIG. 5F, the amount of alcohol produced by the fermentation time tended to increase with time, and the highest level of alcohol production from 11.05% to 11.50% at 72-96 hours after the fermentation, Respectively.

실시예Example 9. 메주 및 청국장 배지에서  9. In the meju and chungkukjang badge 토룰라스포라Torula Spore 델브루엑키Delbruecki JBCCJBCC 623의  623 알콜Alcohol 생성 produce

전통장류로부터 분리된 효모 균주 중 가장 뛰어난 알콜 생성능을 보이면서 최종 선발된 토룰라스포라 델브루엑키 JBCC 623 균주의 장류 적용 적합성을 시험하기 위해 메주 및 청국장 배지에서 알콜 생성능을 조사하였다. 곱게 분쇄된 메주 및 청국장 분말 시료는 (재)순창군발효미생물 관리센터로부터 제공받아 사용하였으며, 이를 사용한 배양액의 조성은 메주 분말 또는 청국장 분말을 5, 10, 15, 20%(w/v)의 농도를 함유하도록 조절하였다. 또한 알콜 발효를 위한 기질로써 25%(w/v)의 글루코스를 첨가하여 사용하였다. 전배양된 균주를 2%(v/v) 비율로 접종하여 29℃, 180 rpm에서 2일 동안 배양함으로써 균주를 성장시킨 후, 동일한 온도에서 정치배양을 2일 동안 추가적으로 수행함으로써 알콜 발효를 유도하였다. 배양액의 전처리는 원심분리(8,000 rpm, 5 min, 4℃)하여 상등액을 수집하고 얻어진 상등액의 알콜 농도를 GC-FID로 분석하였다(표 1). 그 결과, 도 6과 같이 25%로 당농도를 고정시킨 상태에서 JBCC 623 효모의 알콜생성 수준은 메주 또는 청국장 분말의 첨가율이 증가됨에 따라 증가되는 양상을 보였다. 특히 20%의 메주 분말을 함유한 배양액에서 JBCC 623 효모의 알콜 생성은 6.62% 수준이었고, 20%의 청국장 분말을 함유한 배양액에서는 7.61%의 수준의 생성량을 보였다.
In order to test the suitability of the finally selected strain, Torula spore delbrueckii JBCC 623, for the best applicability of soybean cultivars, the alcohol production ability was investigated in meju and chungkukjang medium. The finely pulverized meju and chungkukjang powder samples were supplied and used from the Sunchang Fungus Microorganism Control Center. The composition of the medium was as follows: Meju powder or chungkukjang powder was added at concentrations of 5, 10, 15, 20% (w / v) ≪ / RTI > In addition, 25% (w / v) of glucose was used as a substrate for alcohol fermentation. The strain was inoculated at a rate of 2% (v / v) and cultured at 29 DEG C and 180 rpm for 2 days to induce alcohol fermentation by further performing stationary culture at the same temperature for 2 days . The supernatant was collected by centrifugation (8,000 rpm, 5 min, 4 ° C) and the alcohol concentration of the obtained supernatant was analyzed by GC-FID (Table 1). As a result, As shown in FIG. 6, the alcohol production level of JBCC 623 yeast was increased with the addition of meju or chungkukjang powder at a sugar concentration of 25%. Especially, in the culture medium containing 20% of meju powder, the alcohol production of JBCC 623 yeast was 6.62% and the yield of the culture containing 20% of chungkookjang powder was 7.61%.

실시예Example 10.  10. 토룰라스포라Torula Spore 델브루엑키Delbruecki JBCCJBCC 623을 이용한 콩, 찹쌀 및 멥쌀 코지 발효 Soybean, glutinous rice and rice koji fermentation using 623

선발된 토룰라스포라 델브루엑키 JBCC 623 균주의 장류 적용 적합성을 시험하기 위해 코지 분말을 콩, 찹쌀 및 멥쌀로 제조하여 각각 랩-스케일(lab-scale)의 장류 발효에 적용하였다. 콩, 찹쌀, 멥쌀을 사용하여 각각 제조된 코지 분말은 (재)순창군발효미생물 관리센터로부터 제공받아 사용하였으며 이를 사용한 발효액의 조성은 도 7과 같이 조절하였다. 먼저, 각각 코지 분말의 당함량을 DNS법을 사용하여 조사한 결과 콩 코지는 약 1.6%의 당 농도를, 찹쌀 코지와 멥쌀코지는 약 7.1%의 당 농도를 함유하고 있었다. 본연의 코지를 사용한 시험구와 글루코스를 첨가함으로써 당 농도를 25%(w/v)가 되도록 조절한 처리구를 준비하였다. 당을 첨가하거나 무첨가한 코지 분말은 14%(w/v)의 염 함량을 조절하여 무균 조작된 염수를 1:4(w:v)의 비율로 혼합된 후 OD값 1.0의 토룰라스포라 델브루엑키 JBCC 623 균주를 접종하지 않은 구와 2%(v/v) 또는 5%(v/v)의 농도로 접종하여 30℃에서 7일 동안 정치 배양함으로써 코지발효하였다. 코지 발효된 각각의 시료를 가지고 하기에 서술된 바와 같이 효모 생균수, 최종 pH, 총산도, 환원당 함량 및 생성된 알콜 함량을 측정하였다. To test the suitability of the selected Torula Spores delbruecki strain JBCC 623 for soybean paste application, koji powder was prepared from beans, glutinous rice and rice, and applied to lab-scale soybean fermentation respectively. The koji powder prepared using soybean, glutinous rice, and rice was supplied from the fermented microorganism control center of Sunchang-gun, and the composition of the fermentation broth was adjusted as shown in FIG. First, the content of sugar in koji powder was investigated by DNS method. As a result, soybean koji contained about sugar content of about 1.6%, and glutinous rice koji and rice koji koji contained about 7.1% sugar. A treatment group in which the sugar concentration was adjusted to 25% (w / v) by adding glucose to the test strip using the original coagulum was prepared. Coarse powder with or without added sugar was mixed with sterilized saline at a ratio of 1: 4 (w: v) by adjusting the salt content of 14% (w / v) The cells were inoculated at a concentration of 2% (v / v) or 5% (v / v) with the non-inoculated E.coli strain JBCC 623 and coagulated for 7 days at 30 ° C. The koji fermented samples were subjected to the measurement of yeast cell count, final pH, total acidity, reducing sugar content and produced alcohol content as described below.

발효된 장류 시료의 효모의 생균수는 평판배양법으로 측정하였다. 세균의 배양을 억제하기 위한 페니실린-스트렙토마이신 용액을 포함하는 YM 아가(Difco, USA) 배지를 사용하였고, 1%(w/v) 펩톤 용액을 사용하여 십진법으로 희석한 샘플을 100 μL 도말한 후 29℃에서 48시간 배양 한 후 30-300개의 집락(colony)을 형성한 플레이트의 콜로니 수를 측정하였다. 생균수는 로그 cfu/mL으로 표현하였다. pH는 제조된 장류를 10,000 rpm에서 20분 동안 원심분리한 상등액을 Orion model 710 pH meter(Thermo, Beverly, MA, USA)로 측정하였으며, 산도 측정은 상등액 10 mL에 혼합지시약(bromothymol blue 0.2 g, neutral red 0.1 g, absolute ethanol 300 mL) 2-3 방울을 가한 뒤 0.1N NaOH로 담록색이 나타날 때까지 적정 시키는데 소요되는 mL 수를 산도로 표시하여 계산하였다. 환원당 함량은 시료 상등액을 가지고 DNS(dinitrosalicylic acid)법으로 측정하였다. 생성된 알콜 함량 측정은 시료 상등액 5 mL와 GC 분석을 위한 내부표준물질로 10%(v/v) 이소프로필 알코올 5 mL를 첨가하여 혼합한 후 그 액을 증류하여 GC-FID로 분석하였다(표 1).The viable cell counts of the fermented soybean samples were measured by plate culture. (Difco, USA) medium containing penicillin-streptomycin solution for inhibiting bacterial culture was used, and 100 μL of a sample diluted by the decimal method using a 1% (w / v) peptone solution was applied After culturing at 29 DEG C for 48 hours, colonies of 30-300 colony-forming plates were counted. The number of viable cells was expressed as log cfu / mL. The pH was measured by using Orion model 710 pH meter (Thermo, Beverly, MA, USA) and centrifuged at 10,000 rpm for 20 minutes. The pH of the supernatant was measured with a mixture indicator (bromothymol blue 0.2 g, neutral red 0.1 g, absolute ethanol 300 mL). After adding 2-3 drops, the number of mL required for titration until the appearance of the pale green color with 0.1 N NaOH was calculated by the acidity. Reducing sugar content was measured by dinitrosalicylic acid (DNS) method with sample supernatant. The resulting alcohol content was measured by adding 5 mL of the supernatant of the sample and 5 mL of 10% (v / v) isopropyl alcohol as an internal standard substance for GC analysis, and then the solution was distilled and analyzed by GC-FID One).

알콜 생성 우수 효모로 분리된 토룰라스포라 델브루엑키 JBCC 623 균주의 장류 적용 적합성을 시험하기 위하여 도 7과 같이 콩, 찹쌀, 멥쌀로 각각 제조된 코지를 사용하여 코지 발효를 수행한 후 효모의 생균수, 최종 pH, 총산도, 환원당량 및 알콜 생성량을 측정한 결과(표 7), 토룰라스포라 델브루엑키 JBCC 623 균주를 접종하지 않은 모든 처리구에서는 YM 고체 배지상에서 효모 균주가 검출되지 않았다. 반면 JBCC 623 균주를 2%(v/v) 또는 5% 접종한 처리구에서는 모두 효모가 검출되었으나 균주의 2%와 5%의 접종 비율은 효모의 생균수에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 특히 어느정도 당이 존재하던 멥쌀과 찹쌀 코지 발효에 있어서는 당의 첨가가 효모의 생육에 유의적이지는 않았으나 당 함량이 상대적으로 낮았던 콩 코지 발효에 있어서는 당을 첨가했을 때 효모의 생균수가 증가되었다. 그러나 환원당량을 제외하고는 최종 pH, 총산도 및 알콜 생성량은 당 첨가에 큰 영향을 받지 않는 것으로 나타났다. 토룰라스포라 델브루엑키 JBCC 623의 알콜 생성량은 찹쌀 코지에 당을 첨가하지 않고 2% 또는 5% 접종한 처리구에서 4.9±1.7%와 4.6±1.0% 수준으로 가장 높은 결과를 나타냈으나, 찹쌀과 멥쌀의 경우 관능적으로 막걸리 발효취의 냄새가 났다(데이터 미제시). 반면 콩 코지 발효에 있어서 JBCC 623 균주를 접종하지 않은 처리구와 비교하여 처리한 군에서 알콜 생성량이 최대 3.2배 증가되는 것을 확인할 수 있었다.In order to test the suitability of the strains of Torulasparra delbruecki isolate JBCC 623 isolated from alcohol-producing yeast strains to soybean paste, koji fermented with soybeans, glutinous rice and rice flour, respectively, as shown in Fig. 7, (Table 7). Yeast strains were not detected on the YM solid medium in all the treatments not inoculated with the JBCC 623 strain of Torula spores. On the other hand, yeast was detected in all treatments of 2% (v / v) or 5% of JBCC 623 strain, but 2% and 5% of strains did not affect the number of yeast live cells. Especially, in the fermentation of rice and glutinous rice koji which had some sugar content, the addition of sugar did not significantly affect the growth of yeast, but the yeast viable cell count was increased in soybean koji fermentation, which had a relatively low sugar content. However, except for reducing equivalents, final pH, total acidity, and alcohol production were not significantly affected by sugar addition. The alcohol production of Torula spore delbruecki JBCC 623 was the highest at 4.9 ± 1.7% and 4.6 ± 1.0% in 2% or 5% inoculated rice without addition of sugar to glutinous rice koji, In the case of rice, the smell of fermented rice wine was sensual (data not shown). On the other hand, in soybean koji fermentation, the amount of alcohol production was increased 3.2 times in the treated group compared with the treatment group not inoculated with JBCC 623 strain.

토룰라스포라 델브루엑키 JBCC 623을 이용한 콩, 찹쌀 및 멥쌀 코지 발효 결과Result of Fermentation of Soybean, Glutinous Rice and Coarse Rice Using JBCC 623 from Torulasparra del Bruceki 　 Yeast log cfu/mLYeast log cfu / mL Final pHFinal pH Total activity (%)Total activity (%) Produced alcohol (%)Produced alcohol (%) Reduced sugar (%)Reduced sugar (%) (A)　Koji with soybean(A) Koji with soybean Soy-N-0Soy-N-O NDND 6.0±0.16.0 ± 0.1 3.0±0.13.0 ± 0.1 0.6±0.20.6 ± 0.2 1.3±0.01.3 ± 0.0 Soy-N-2Soy-N-2 2.7±0.32.7 ± 0.3 5.3±0.05.3 ± 0.0 3.2±0.53.2 ± 0.5 1.5±0.51.5 ± 0.5 2.9±0.02.9 ± 0.0 Soy-N-5Soy-N-5 4.0±0.04.0 ± 0.0 5.5±0.05.5 ± 0.0 4.0±0.64.0 ± 0.6 1.6±0.21.6 ± 0.2 2.8±0.02.8 ± 0.0 Soy-G-0Soy-G-0 NDND 5.7±0.05.7 ± 0.0 2.8±0.02.8 ± 0.0 0.5±0.00.5 ± 0.0 13.0±0.013.0 ± 0.0 Soy-G-2Soy-G-2 5.5±0.15.5 ± 0.1 5.3±0.15.3 ± 0.1 4.2±0.24.2 ± 0.2 1.4±0.31.4 ± 0.3 13.2±0.013.2 ± 0.0 Soy-G-5Soy-G-5 6.6±0.86.6 ± 0.8 5.4±0.15.4 ± 0.1 4.2±0.44.2 ± 0.4 1.4±0.41.4 ± 0.4 12.9±0.012.9 ± 0.0 (B) Koji with glutinous rice (B) Koji with glutinous rice Glu-N-0Glu-N-O NDND 4.7±0.04.7 ± 0.0 1.2±0.01.2 ± 0.0 1.5±0.51.5 ± 0.5 9.0±0.09.0 ± 0.0 Glu-N-2Glu-N-2 6.2±0.56.2 ± 0.5 4.3±0.14.3 ± 0.1 1.2±0.31.2 ± 0.3 4.9±1.74.9 ± 1.7 5.1±0.05.1 ± 0.0 Glu-N-5Glu-N-5 6.1±0.36.1 ± 0.3 4.0±0.14.0 ± 0.1 1.4±0.21.4 ± 0.2 4.6±1.04.6 ± 1.0 5.1±0.05.1 ± 0.0 Glu-G-0Glu-G-O NDND 4.6±0.24.6 ± 0.2 1.1±0.01.1 ± 0.0 1.3±0.41.3 ± 0.4 7.1±0.07.1 ± 0.0 Glu-G-2Glu-G-2 5.5±0.55.5 ± 0.5 4.2±0.14.2 ± 0.1 1.2±0.11.2 ± 0.1 2.6±0.42.6 ± 0.4 12.0±0.012.0 0.0 Glu-G-5Glu-G-5 5.3±0.75.3 ± 0.7 4.2±0.04.2 ± 0.0 1.1±0.01.1 ± 0.0 2.4±0.72.4 ± 0.7 11.7±0.011.7 ± 0.0 (C) Koji with nonglutinous rice(C) Koji with nonglutinous rice Nong-N-0Nong-N-0 NDND 4.5±0.34.5 ± 0.3 1.1±0.11.1 ± 0.1 1.9±0.21.9 ± 0.2 9.2±0.09.2 ± 0.0 Nong-N-2Nong-N-2 5.3±0.15.3 ± 0.1 4.4±0.04.4 ± 0.0 1.0±0.01.0 ± 0.0 2.6±1.02.6 ± 1.0 5.0±0.05.0 ± 0.0 Nong-N-5Nong-N-5 5.8±0.25.8 ± 0.2 4.4±0.04.4 ± 0.0 1.1±0.01.1 ± 0.0 3.9±0.73.9 ± 0.7 5.0±0.05.0 ± 0.0 Nong-G-0Nong-G-0 NDND 4.1±0.04.1 ± 0.0 1.1±0.01.1 ± 0.0 1.6±0.31.6 ± 0.3 7.5±0.07.5 ± 0.0 Nong-G-2Nong-G-2 5.2±0.35.2 ± 0.3 4.2±0.14.2 ± 0.1 1.0±0.01.0 ± 0.0 1.5±0.61.5 ± 0.6 12.4±0.012.4 ± 0.0 Nong-G-5Nong-G-5 5.5±0.25.5 ± 0.2 4.2±0.14.2 ± 0.1 1.0±0.11.0 ± 0.1 1.9±0.71.9 ± 0.7 11.8±0.011.8 ± 0.0

농업생명공학연구원Agricultural Biotechnology Research Institute KACC93183PKACC93183P 2013081620130816 농업생명공학연구원Agricultural Biotechnology Research Institute KACC93184PKACC93184P 2013081620130816

<110> Sunchang Research Center for Fermentation Microbes(SRCM) <120> Yeast strains having high productivity of alcohol from traditionally fermented soybean products, and uses thereof <130> PN13310 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gcatatcaat aagcggagga aaag 24 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ggtccgtgtt tcaagacgg 19 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 tccgtaggtg aacctgcgg 19 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tcctcccgct tattgatatg c 21 <110> Sunchang Research Center for Fermentation Microbes (SRCM) <120> Yeast strains having high productivity of alcohol from          traditionally fermented soybean products, and uses thereof <130> PN13310 <160> 4 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gcatatcaat aagcggagga aaag 24 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ggtccgtgtt tcaagacgg 19 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 tccgtaggtg aacctgcgg 19 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tcctcccgct tattgatatg c 21

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알코올 고생산능을 가지는, 토룰라스포라 델브루엑키(Torulaspora delbrueckii) JBCC 623 균주(KACC93183P).Torulaspora delbrueckii JBCC 623 strain (KACC93183P), which has alcohol-tolerant activity. 삭제delete 제1항의 균주, 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주의 배양액의 농축액을 유효성분으로 함유하는 알코올 생산용 조성물.A composition for producing an alcohol containing the strain of claim 1, a culture of the strain, or a concentrated liquid of the culture medium of the strain as an active ingredient. 제1항의 균주, 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주의 배양액의 농축액을 유효성분으로 함유하는 저염화 장류의 보존성을 향상시키기 위한 조성물.A composition for improving the shelf-life of a strain of claim 1, a culture of the strain, or a concentrated solution of the culture medium of the strain as an active ingredient. 코지(Koji)에 제1항의 균주, 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주의 배양액의 농축액을 첨가하여 발효하는 단계를 포함하는 저염화 장류의 보존성을 향상시키는 방법.A method for improving the shelf-life of a low-boiled variety, comprising adding the strain of claim 1, a culture of the strain or a concentrated liquid of the culture medium of the strain to Koji and fermenting the same.
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