KR101555025B1 - 참모자반 추출물을 포함하는 면역 증진용 조성물의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 참모자반을 담수로 2 내지 3회 세척하는 단계; 상기 세척된 참모자반을 2~5일간 음건하는 단계; 상기 음건된 참모자반을 분쇄하여 0.01 μm 이상 0.5 μm 이하의 분말로 제조하는 단계; 상기 참모자반 분말을 50 이상 300 g/L의 밀도로 물에 침지하고 교반한 후, 이를 80 ℃ 이상 95 ℃ 이하의 열수로 1시간 내지 3시간 동안 환류 냉각 추출하는 단계; 상기 참모자반 환류 냉각 추출물을 감압여과하는 단계; 상기 참모자반 감압여과물을 에탄올 추출하는 단계; 상기 참모자반 에탄올 추출물을 조다당 침전물을 분리하는 단계;및 상기 조다당 침전물로부터 물 및 에탄올을 제거하는 단계를 포함하는, 면역 증진용 식품 조성물의 제조 방법에 대한 것이다.

Description

참모자반 추출물을 포함하는 면역 증진용 조성물의 제조 방법{A PREPARATION METHOD OF IMMUNE-BOOSTING COMPOSITION COMPRISING SARGASSUM FULVELLUM EXTRACT}

본 발명은 참모자반 추출물을 포함하는 면역 증진용 조성물의 제조 방법에 대한 것이다.

참모자반 (Sargassum fulvellum)은 해조류중 갈조류인 모자반과에 속하는 1년생 해초이다.

최근 모자반의 기능성이 주목을 받게 되면서, 외톨개모자반(Myagropsis myagroides)의 항비만 효능(한국공개특허 10-2014-0083566호), 괭생이 모자반(Sargassum horneri)의 항비만 효능(한국공개특허 10-2014-0083493호) 등이 보고된 바 있다.

한편, 대식세포(macrophage)는 세균이나 이물질을 탐식, 제거하는 과정에서 여러 가지를 분비하여 면역현상을 조절하며, 항원에 대한 면역작용의 중추적인 역할을 하는 세포로써, 항원제시와 림프구의 비특이적인 면역작용에 관계하며，종양세포에 대해서는 직접적인 상해활성을 나타낸다. 또한, TLR(toll like receptor)에 반응하는 물질(LPS 혹은 천연물)은 macrophage를 활성화하여 T세포와 B세포의 증식, 식균 작용을 위한 대식세포의 활성화, 미생물 감염에 대한 방어 등의 2차 면역반응을 조절할 수 있는 IL-1，IL-6, lL-12 및 TNF-α와 같은 사이토카인을 생산한다고 알려져 있다. IL 6 및 TNF-α는 대식세포에 의해 유도되는 대표적인 사이토카인으로서 세균감염에 따른 염증반응에 있어서 중추적인 역할을 하며 염증병소에서 그 양이 증가되는 것으로 알려져 있다. IL-6는 IL-1과 협동적으로 작용하여 T 세포와 B 세포의 분화에 관여하고 항암효과가 있다고 보고되었으며, TNF-α는 특정 암세포에 대한 세포독성과 항 바이러스성 작용이 있고, 급성 및 만성 염증질환에서 일어나는 여러 가지 생체반응에도 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 한편, IL 12는 NK cell의 활성화 및 Th1 type의 면역 반응을 유도하는 사이토카인으로써 암세포와 같은 세포성 외래물질에 대한 반응성을 높이는 작용을 한다고 알려져 있다.

본 발명자들은 참모자반에 대하여 연구하던 중 참모자반을 음건한 후, 이를 분쇄하고, 특정 온도로 환류 냉각 추출하고, 여과, 에탄올 추출을 하여 제조한 참모자반 추출물의 면역 증진 효능이 우수한 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 면역 증진용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 참모자반 추출물을 이용한 면역 증진용 조성물의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 면역 증진용 조성물은 TNF -α, IL-12, IL-6 등 사이토카인 생산 활성이 높으며 면역 증진능을 갖는다.

도 1은 본 발명의 참모자반 추출물의 대식세포 독성 및 사이토카인 분비능을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 참모자반 추출물의 대식세포 표면 활성 인자 활성 조절능을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 참모자반 추출물의 비장세포 증식 및 사이토카인 분비능을 나타낸다.

본 발명은,

참모자반을 담수로 2 내지 3회 세척하는 단계;

상기 세척된 참모자반을 2~5일간 음건하는 단계;

상기 음건된 참모자반을 분쇄하여 0.01 μm 이상 0.5 μm 이하의 분말로 제조하는 단계;

상기 참모자반 분말을 50 이상 300 g/L의 밀도로 물에 침지하고 교반한 후, 이를 80 ℃ 이상 95 ℃ 이하의 열수로 1시간 내지 3시간 동안 환류 냉각 추출하는 단계;

상기 참모자반 환류 냉각 추출물을 감압여과하는 단계;

상기 참모자반 감압여과물을 에탄올 추출하는 단계;

상기 참모자반 에탄올 추출물을 조다당 침전물을 분리하는 단계;및

상기 조다당 침전물로부터 물 및 에탄올을 제거하는 단계를 포함하는,

면역 증진용 식품 조성물의 제조 방법에 대한 것이다.

또한 본 발명은,

상기 방법으로 제조된 면역 증진용 식품 조성물에 대한 것이다.

본 발명은,

참모자반을 담수로 2 내지 3회 세척하는 단계;

상기 세척된 참모자반을 2~5일간 음건하는 단계;

상기 음건된 참모자반을 분쇄하여 0.01 μm 이상 0.5 μm 이하의 분말로 제조하는 단계;

상기 참모자반 분말을 50 이상 300 g/L의 밀도로 물에 침지하고 교반한 후, 이를 80 ℃ 이상 95 ℃ 이하의 열수로 1시간 내지 3시간 동안 환류 냉각 추출하는 단계;

상기 참모자반 환류 냉각 추출물을 감압여과하는 단계;

상기 참모자반 감압여과물을 에탄올 추출하는 단계;

상기 참모자반 에탄올 추출물을 조다당 침전물을 분리하는 단계;및

상기 조다당 침전물로부터 물 및 에탄올을 제거하는 단계를 포함하는,

면역 증진용 약학적 조성물의 제조 방법에 대한 것이다.

또한 본 발명은,

상기 방법으로 제조된 면역 증진용 약학적 조성물에 대한 것이다.

본 발명은,

참모자반을 담수로 2 내지 3회 세척하는 단계;

상기 세척된 참모자반을 2~5일간 음건하는 단계;

상기 음건된 참모자반을 분쇄하여 0.01 μm 이상 0.5 μm 이하의 분말로 제조하는 단계;

상기 참모자반 분말을 50 이상 300 g/L의 밀도로 물에 침지하고 교반한 후, 이를 80 ℃ 이상 95 ℃ 이하의 열수로 1시간 내지 3시간 동안 환류 냉각 추출하는 단계;

상기 참모자반 환류 냉각 추출물을 감압여과하는 단계;

상기 참모자반 감압여과물을 에탄올 추출하는 단계;

상기 참모자반 에탄올 추출물을 조다당 침전물을 분리하는 단계;및

상기 조다당 침전물로부터 물 및 에탄올을 제거하는 단계를 포함하는,

면역 증진용 사료 조성물의 제조 방법에 대한 것이다.

또한 본 발명은,

상기 방법으로 제조된 면역 증진용 사료 조성물에 대한 것이다.

또한 본 발명은,

참모자반을 담수로 2 내지 3회 세척하는 단계;

상기 세척된 참모자반을 2~5일간 음건하는 단계;

상기 음건된 참모자반을 분쇄하여 0.01 μm 이상 0.5 μm 이하의 분말로 제조하는 단계;

상기 참모자반 분말을 50 이상 300 g/L의 밀도로 물에 침지하고 교반한 후, 이를 80 ℃ 이상 95 ℃ 이하의 열수로 1시간 내지 3시간 동안 환류 냉각 추출하는 단계;

상기 참모자반 환류 냉각 추출물을 감압여과하는 단계;

상기 참모자반 감압여과물을 에탄올 추출하는 단계;

상기 참모자반 에탄올 추출물을 조다당 침전물을 분리하는 단계;및

상기 조다당 침전물로부터 물 및 에탄올을 제거하는 단계를 포함하는,

TNF-알파, 인터루킨-1B, 인터루킨-6 및 인터루킨-12로 구성되는 군으로부터 선택되는 사이토카인의 분비 증진능을 갖는 참모자반 조다당 추출물의 제조 방법에 대한 것이다.

이하, 본 발명을 자세히 설명한다.

담수 세척 단계

본 발명의 제조 방법은 참모자반을 담수로 2 내지 3회 세척하는 단계를 포함한다. 상기 담수 세척을 통하여 참모자반의 이물 뿐 아니라 소금기도 제거할 수 있다.

음건 단계

상기 담수 세척된 참모자반은 2~5일 간 건조 공정을 거친다. 상기 건조 공정은 열 건조도 가능하나 자연건조가 바람직하며, 특히 음건이 경제적이다.

분쇄 단계

상기 음건된 참모자반을 분쇄하여 0.01 μm 이상 0.5 μm 이하의 분말로 제조한다. 참모자반 분말이 0.01 μm 미만이거나 0.5 μm 초과인 경우 이후의 물 추출 단계에서 추출 효율이 낮아지게 되며, 추후 감압 여과 단계에서 수율이 낮아질 수 있다.

물 추출 단계

분쇄된 참모자반 분말을 50 이상 300 g/L의 밀도로 물에 침지하고 교반한 후, 이를 80 ℃ 이상 95 ℃ 이하의 열수로 1시간 내지 3시간 동안 환류 냉각 추출한다. 이 때, 100 ℃ 이상의 열수를 사용하거나 곧바로 알코올 추출을 하는 경우, 본 발명에서 목적으로 하는 면역 증진 성분들이 충분히 많지 않은 추출물을 얻게 될 수 있다.

그러므로 100 ℃ 미만의 열수, 바람직하게는 80 ℃ 이상 95 ℃ 이하의 열수, 더욱 바람직하게는 87 내지 93 ℃의 열수를 이용한다. 상기 환류 냉각 시간이 1시간 미만인 경우 추출물의 면역 증진 성능이 낮아지며, 환류 냉각 시간이 3시간을 초과하는 경우 추출 효율이 낮아진다.

감압여과 단계

상기 환류 냉각 추출된 상기 참모자반 환류 냉각 추출물을 감압여과하여 감압여과물을 수득한다. 상기 감압여과는 여과지를 이용하여 수행하는 것이 바람직하며, 상기 감압여과 압력은 대기압 미만의 압력이면 되고 특별히 제한되는 것은 아니다.

에탄올 추출 단계

상기 참모자반 감압여과물을 에탄올 추출한다. 상기 에탄올 추출은 상기 에탄올 추출은 1 ℃ 이상 18 ℃ 이하의 온도에서 수행하며, 바람직하게는 냉장 온도에서 수행하는데, 이는 1 ℃ 이상 10 ℃ 이하이고, 바람직하게는 2 ℃ 이상 5 ℃ 이하이다. 상기 에탄올 추출 단계는 상기 에탄올 추출은 상기 참모자반 감압여과물을 에탄올에 넣고 냉장 조건 하 10 내지 15시간 방치하여 수행하는 것이 바람직하다.

조다당 침전물 분리 단계

상기 참모자반 에탄올 추출물로부터 조다당 침전물을 분리한다. 상기 조다당 침전물의 분리는 냉장 조건 하 10 내지 15시간 방치한 상기 에탄올 추출물에서, 추출물 상단의 상청액을 따라내고 밑에 가라앉은 침전물을 수득하여 수행하는 것이 유리하다.

조다당 침전물로부터 물 및 에탄올 제거 단계

상기 조다당 침전물로부터 물 및 에탄올을 제거하여 본 발명의 면역 증진 효능이 높은 참모자반 추출물을 제조하게 된다. 상기 조다당 침전물로부터 물 및 에탄올의 제거는 회전식 감압분별증발 장치를 이용하여 수행한다.

면역증진용 조성물

본 발명의 면역증진용 조성물은 TNF-알파, 인터루킨-1B, 인터루킨-6 및 인터루킨-12로 구성되는 군으로부터 선택되는 인터루킨의 분비 증진능, TNF-γ의 분비 증진능을 갖는다. 상기 면역 증진용 조성물은 식품 조성물, 사료 조성물 또는 약학적 조성물이 될 수 있다. 본 발명의 면역증진용 조성물은 인터루킨-10의 분비 증진능이 없다.

식품 조성물

본 발명의 상기 식품이란 건강보조식품, 건강기능식품, 기능성 식품, 운동 보조제 등이나 이에 제한되는 것은 아니며, 천연식품, 가공식품, 일반적인 식자재 등에 본 발명의 참모자반 추출물을 첨가한 것도 포함된다.

본 발명의 참모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물은, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 조성물과 함께 사용될 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방 또는 건강 유지 목적)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 참모자반 추출물을 식품 또는 음료의 제조시에 원료에 대하여 0.01 내지 70.00 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 30.00 중량%의 양으로 첨가할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 10.00 중량%의 양으로 첨가할 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 참모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물은 정제, 경질 또는 연질 캅셀제, 액제, 현탁제 등과 같은 경구투여용 제제의 형태로 이용될 수 있으며, 이들 제제는 허용 가능한 통상의 담체, 예를 들어 경구투여용 제제의 경우에는 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 가용화제, 현탁화제, 보존제 또는 증량제 등을 사용하여 조제할 수 있다.

상기 참모자반 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료, 파우더 제제 및 비타민 복합제 등을 들 수 있으나 이들 종류의 식품으로 제한되는 것은 아니다.

사료 조성물

본 발명의 참모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 사료 조성물은 통상적인 사료와 함께 배식할 수 있으며, 본 발명의 사료 조성물을 통상적인 사료 조성물에 첨가하여 기능성 사료 조성물을 제조하여 이용할 수도 있다. 또한 본 발명의 사료 조성물은 본 발명의 참모자반 추출물 외 기능성 성분을 추가로 포함할 수도 있다. 상기 통상적인 사료 조성물과 본 발명의 참모자반 추출물이 혼합된 기능성 사료 조성물의 제조 시, 본 발명의 참모자반 추출물은 총 사료 조성물에 대하여 0.01 내지 30.00 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 20.00 중량%의 양으로 첨가될 수 있다. 사료 조성물의 상기 참모자반 추출물의 유효용량은 상기 식품 조성물의 유효 용량에 준해서 사용할 수 있으나, 지속적인 면역 증강을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

본 발명의 사료 조성물은 가축 또는 가금을 대상으로 한다. 상기 가축 또는 가금은 소, 돼지, 닭, 말, 양, 당나귀, 노새, 멧돼지, 토끼, 메추라기, 집오리, 장닭, 투계용 닭, 비둘기, 칠면조, 개, 고양이, 원숭이, 햄스터, 생쥐, 래트, 구관조, 앵무새, 잉꼬, 카나리아 등이나 이들에 제한되는 것은 아니며 가정 내에서 사육 가능한 인간 이외의 포유 동물 또는 조류이면 본 발명의 사료 조성물의 대상이라 할 것이다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

<재료 및 방법>

시판되는 참모자반을 구입하여 이용하였다.

<실험예 1> 참모자반 추출물의 제조

참모자반을 담수로 2회에서 3회 세척하여 소금기를 제거하였다 그 후 3일간 자연건조 시키고, 이를 분쇄기로 분쇄하여 입자사이즈가 0.5 μm 이하의 참모자반 건조 분말을 제조하였다. 상기 참모자반 분말 100 g을 물 1 L에 침지하여 잘 교반한 다음, 90 ℃에서 1시간 내지 3시간 동안 환류 냉각관을 이용하여 환류 냉각 추출하였다. 그 후 상기 추출물을 여과지(와트만사, 미국)로 감압여과하였다. 상기 감압여과된 여과물에서 조다당을 분리하기 위하여 100% 에탄올을 첨가하여 최종 에탄올의 농도가 70%가 되도록 잘 섞어 주고 4 ℃에서 12 시간 동안 방치하면서 조다당 침전물을 분리하였다. 상기 얻어진 조다당 침전물을 회전식 감압분별증발 장치를 통하여 에탄올 및 물을 증발시키고, 본 발명의 참모자반 조다당 추출물로 사용하였다.

<실험예 2> 대식세포 독성 및 사이토카인 분비능 평가

상기 실험예 1에서 제조한 참모자반 조다당 추출물의 면역세포 활성능을 평가하였다. 구체적인 방법은 하기와 같다. 상기 참모자반 조다당 추출물을 대식세포 기원의 면역세포주인 RAW264.7 세포에 12.5, 25, 50, 및 100 μg/mL의 농도로 처리하고, 대식세포 생존능, TNF-알파, 인터루킨(IL)-1B , 6 IL-6, IL-12, NO의 분비능을 측정하였다.

그 결과, 본 발명의 참모자반 조다당 추출물은 면역세포의 세포독성을 유발하지 않는 것으로 확인되었다. 또한 본 발명의 참모자반 조다당 추출물은 면역활성에 중요한 지표성분인 일산화질소(nitric oxide) 및 사이토카인(TNF-a, IL-1B, IL-6, IL-12)의 분비능을 증가시키는 것으로 나타났다. 또한 본 발명의 참모자반 조다당 추출물은 면역 반응을 억제 시키는 사이토카인(IL-10)의 분비능은 증가시키지 않는 것으로 확인되었다(도 1).

<실험예 3> 대식세포 표면 활성인자 활성 조절능 평가

상기 실험예 1에서 제조한 참모자반 조다당 추출물의 대식세포 표면 활성인자 활성 조절능을 평가하였다. 구체적인 방법은 하기와 같다. 대식세포 기원의 면역세포주인 RAW264.7 세포에 참모자반 조다당 추출물을 50, 및 100 μg/mL의 농도로 처리한 후 24 시간 동안 방치 시키고, 각각의 세포를 회수하였다. 항체의 비 특이적인 결합을 방지하기 위하여 회수된 각각의 세포에 1 μg/mL의 Fcγ I/III(BD bioscience)을 처리하여 4 ℃에서 20 분간 방치한 후, 세포 표면에 발현되는 활성인자들의 발현을 알아보기 위하여 anti-CD80-PE, anti-CD86-PE, 및 II-PE(BD bioscience, CA, USA)와 같은 세포 표면 항체를 각각 1000배 희석하여 각각의 세포에 처리하고 30 분 동안 방치한 후, 유세포 분석기(FACS callibur, BD Biosciences)를 이용하여 대식세포 표면 활성인자들의 활성에 관하여 분석하였다.

그 결과, 본 발명의 참모자반 조다당 추출물은 활성화된 대식세포에서 발현되는 세포표면 활성인자인 CD 80 및 CD 86의 발현을 증가시키는 것이 확인되었다(도 2).

<실험예 4> 비장세포 증식능 및 사이토카인 분비능 평가

상기 실험예 1에서 제조한 참모자반 조다당 추출물의 비장세포 증식능 및 사이토카인 분비능을 평가하였다. 1주간의 순화를 마친 마우스를 경추 탈골법으로 희생시킨 후 비장을 무균적으로 적출하여 10%의 Fetal bovine serum(FBS)와 항생제 penicillin과 streptomycin(100 unit/mL, 100 μg/mL)을 함유한 RPMI-1640 배지로 세척한 후 tissue grinder(Corning costar, Corning, NY, USA)로 균질화하여 비장세포를 유리시켰다. 세포현탁액에 적혈구를 제거하기 위하여 RBC lysis buffer(BD Bioscience)를 첨가하여 적혈구를 제거하였고, 혈구계수기를 이용하여 세포수를 측정하였다. 마우스 비장으로부터 유리된 비장세포에 참모자반 조다당 추출물을 12.5, 25, 50, 및 100 μg/mL의 농도로 24시간 동안 처리한 후, 비장세포의 증식능 및 비장세포가 분비하는 사이토카인의 분비량에 관하여 측정하였다.

비장세포는 대식세포 외 또 다른 면역세포이다. 본 실험에서는 비장세포에 참모자반 조다당 추출물을 농도 별로 처리할 경우, 면역증강에 중요한 역할을 하는 사이토카인인 IFN-r의 분비능 및 알레르기와 아토피 등의 원인이 되는 사이토카인인 IL-4의 분비능에 미치는 영향을 평가하였다.

그 결과, 본 발명의 참모자반 조다당 추출물은 IFN-γ의 분비를 증가시켰으며, 알레르기와 아토피 등의 원인이 되는 사이토카인인 IL-4의 분비능에는 영향을 주지 않는 것으로 확인되었다(도 3).

따라서 참모자반 조다당 추출물은 대식세포와 비장세포와 같은 면역세포의 독성을 미치지 않으며, 면역조절에 중요한 역할을 수행하는 사이토카인의 분비능을 조절하여 면역 활성을 유도하는 것을 알 수 있었다.

<실험예 5>

상기 실험예 1에서 제조한 참모자반 조다당 추출물의 성분을 분석한 결과, 조다당으로 확인되었으며, 단백질 성분은 없는 것으로 나타났다(데이터 도시하지 않음).

Claims (11)

1. 참모자반을 담수로 2 내지 3회 세척하는 단계;
   상기 세척된 참모자반을 2~5일간 음건하는 단계;
   상기 음건된 참모자반을 분쇄하여 0.01 μm 이상 0.5 μm 이하의 분말로 제조하는 단계;
   상기 참모자반 분말을 50 이상 300 g/L의 밀도로 물에 침지하고 교반한 후, 이를 80 ℃ 이상 95 ℃ 이하의 열수로 1시간 내지 3시간 동안 환류 냉각 추출하는 단계;
   상기 참모자반 환류 냉각 추출물을 감압여과하는 단계;
   상기 참모자반 감압여과물을 에탄올 추출하는 단계;
   상기 참모자반 에탄올 추출물의 상단의 상청액을 따라내고 밑에 가라앉은 침전물을 수득하여 조다당 침전물을 분리하여 수득하는 단계;및
   상기 수득한 조다당 침전물로부터 물 및 에탄올을 제거하는 단계를 포함하는,
   면역 증진용 식품 조성물의 제조 방법으로,
   상기 면역 증진용 식품 조성물은 TNF-알파, 인터루킨-1B, 인터루킨-6 및 인터루킨-12의 분비능을 증진시키는 것을 특징으로 하는 면역 증진용 식품 조성물의 제조 방법.
   
2. 제 1항에 있어서,
   상기 에탄올 추출은 1 ℃ 이상 18 ℃ 이하의 온도에서 수행하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
   
3. 제 1항에 있어서,
   상기 에탄올 추출은 상기 참모자반 감압여과물을 에탄올에 넣고 냉장 조건 하 방치하여 수행하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
   
4. 삭제
5. 제 1항에 있어서,
   상기 조다당 침전물로부터 물 및 에탄올의 제거는 회전식 감압분별증발 장치를 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
   
6. 제 1항의 방법으로 제조된, TNF-알파, 인터루킨-1B, 인터루킨-6 및 인터루킨-12의 분비능을 증진시키는 것을 특징으로 하는 면역 증진용 식품 조성물.
   
7. 삭제
8. 제 6항에 있어서,
   인터루킨-10의 분비 증진능이 없는 것을 특징으로 하는 면역 증진용 식품 조성물.
   
9. 제 6항에 있어서,
   TNF-r의 분비능을 증진시키는 것을 특징으로 하는 면역 증진용 식품 조성물.
   
10. 참모자반을 담수로 2 내지 3회 세척하는 단계;
    상기 세척된 참모자반을 2~5일간 음건하는 단계;
    상기 음건된 참모자반을 분쇄하여 0.01 μm 이상 0.5 μm 이하의 분말로 제조하는 단계;
    상기 참모자반 분말을 50 이상 300 g/L의 밀도로 물에 침지하고 교반한 후, 이를 80 ℃ 이상 95 ℃ 이하의 열수로 1시간 내지 3시간 동안 환류 냉각 추출하는 단계;
    상기 참모자반 환류 냉각 추출물을 감압여과하는 단계;
    상기 참모자반 감압여과물을 에탄올 추출하는 단계;
    상기 참모자반 에탄올 추출물의 상단의 상청액을 따라내고 밑에 가라앉은 침전물을 수득하여 조다당 침전물을 분리하여 수득하는 단계;및
    상기 수득한 조다당 침전물로부터 물 및 에탄올을 제거하는 단계를 포함하는,
    TNF-알파, 인터루킨-1B, 인터루킨-6 및 인터루킨-12로 구성되는 군으로부터 선택되는 사이토카인의 분비 증진능을 갖는 참모자반 조다당 추출물의 제조 방법.
    
11. 참모자반을 담수로 2 내지 3회 세척하는 단계;
    상기 세척된 참모자반을 2~5일간 음건하는 단계;
    상기 음건된 참모자반을 분쇄하여 0.01 μm 이상 0.5 μm 이하의 분말로 제조하는 단계;
    상기 참모자반 분말을 50 이상 300 g/L의 밀도로 물에 침지하고 교반한 후, 이를 80 ℃ 이상 95 ℃ 이하의 열수로 1시간 내지 3시간 동안 환류 냉각 추출하는 단계;
    상기 참모자반 환류 냉각 추출물을 감압여과하는 단계;
    상기 참모자반 감압여과물을 에탄올 추출하는 단계;
    상기 참모자반 에탄올 추출물의 상단의 상청액을 따라내고 밑에 가라앉은 침전물을 수득하여 조다당 침전물을 분리하여 수득하는 단계;및
    상기 수득한 조다당 침전물로부터 물 및 에탄올을 제거하는 단계를 포함하는,
    면역 증진용 사료 조성물의 제조 방법으로,
    상기 면역 증진용 사료 조성물은 TNF-알파, 인터루킨-1B, 인터루킨-6 및 인터루킨-12의 분비능을 증진시키는 것을 특징으로 하는 면역 증진용 사료 조성물의 제조 방법.

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