KR101546021B1 - 뚝새풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 개선용 조성물 - Google Patents
뚝새풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 개선용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 뚝새풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환 개선용 조성물에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 뚝새풀 추출물을 이용하여 염증성 질환 관련연구를 진행한 결과, 뚝새풀 추출물(유효농도 100 ~ 200 ㎍/㎖)이 RAW 264.7 세포에서 NF-κB 전사 활성을 억제함으로써 LPS에 의해 유도되는 iNOS 그리고 COX-2 단백질과 pro-inflammatory cytokine인 TNF-α및 IL-6의 발현을 효과적으로 저해하였다. 따라서,뚝새풀 추출물은 대식세포를 매개로한 염증반응의 작용기전 연구에 중요한 기초 자료가 될 수 있을 뿐만 아니라, 향 후 염증성 질환의 예방과 치료에 효과적으로 사용할 수 있을 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 뚝새풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 개선용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 대식세포주인 RAW 264.7 cell에서 LPS로 유도된 염증반응을 억제할 수 있는 뚝새풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 개선용 조성물에 관한 것이다.
뚝새풀은 벼과 (Gramineae)에 속하는 일년생 또는 이년생 초본으로 우리나라 전 지역 습지, 논경지에서 흔히 볼 수 있으며, 일반적으로 가을에 추수후 발아하여 지표면에서 유묘 상태로 월동하며 초여름에 성숙한다. 뚝새풀은 둑새풀, 독새풀, 혹은 독쌔기풀이란 이명을 가지고 있으며 한방에서 뚝새풀의 전초를 간맥랑(看麥娘)이라 한다. 효능은 전신부종과 어린아이의 수두와 복통, 설사에 효능이 있다고 알려져 있다(중화본초, 1999). 본 발명은 동절기 우점잡초인 뚝새풀의 신소득 작물화 및 자원의 산업화를 위하여 항염증 조사를 수행하였다.
염증 반응은 외부 자극에 대한 생체조직의 방어반응의 하나로서 물리적 작용이나 유해물질, 화학적 자극, 세균감염 등에 의한 손상을 수복 재생하려는 기전이며, 지속적인 염증반응은 오히려 점막손상을 촉진하고, 그 결과 일부에서는 암 발생 등 각종 질환을 유도한다. 그람 음성균의 외막성분인 lipopolysaccharide(LPS)는 국소 염증, 항체 생산, 폐혈증과 같은 다양한 반응을 일으키며, 대식세포는 LPS 감염초기에 반응하고 숙주의 방어와 항상성 유지에 중추적인 역할을 한다. 그러나 고농도의 LPS 자극은 대식세포에서 tumor necrosis factor-α(TNF-α), interleukin(IL)-1 및 IL-6, nitric oxide (NO)와 같은 전 염증성 매개물질을 분비시켜 숙주에 치명적인 결과를 초래 할 수 있다. 일반적으로 NO는 대식세포가 활성화되면 inducible NO synthase (iNOS)로부터 생산되며 몇몇 바이러스나 기생충을 억제하는 항균 효과를 가지고 있지만, 과도한 NO의 형성은 염증을 유발시키게 되며 조직의 손상, 유전자 변이 및 신경 손상 등을 유발하는 것으로 알려져 있다.
TNF-α, IL-1 및 IL-6와 같은 전염증성 cytokine의 발현은 extracellular signal-regulated kinase1/2 (ERK1/2), p38 kinases (p38), c-Jun NH2-terminal kinase (JNK)와 같은 mitogen-activated protein kinases (MARKs)와 nuclear factor kappa B (NF-κB)에 의해 조절 된다. NF-κB는 면역과 염증 반응에 관계된 유전자의 발현에 중요한 역할을 하는데, NF-κB가 활성화되면 NF-κB와 결합해 있던 inhibitory kappa B α(IκBα)가 분해되면서 NF-κB가 세포 원형질에서 핵으로 들어가게 되며 이후 TNF-α, IL-12, IL-6와 같은 cytokine 발현의 전사 인자로서 작용한다.
이에 본 발명에서는 뚝새풀 추출물이 대식세포주인 RAW 264.7 cell에서 LPS로 유도된 염증반응을 억제할 수 있는지의 여부를 확인하기 위하여 NO 및 iNOS, COX-2, 전 염증성 cytokine (TNF-α, IL-6)의 발현정도와 IκBα의 분해 억제효과를 연구하여 유의한 결과를 얻었다.
본 발명의 목적은 뚝새풀 추출물을 활용한 염증성질환의 개선, 완화 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 뚝새풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환 개선용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명에서,
상기 뚝새풀 추출물은 에탄올 추출물인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에서,
상기 뚝새풀 추출물은 음건한 뚝새풀 100g을 100 부피% 에탄올 5L에 투입하여 3 시간씩 두 번 추출한 후, 250 mesh와 whatman 여과지로 여과하고, 여과액을 45℃에서 감압 농축하여 에탄올을 증발시키고 동결건조하여 얻은 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 뚝새풀 추출물을 이용하여 염증성질환 관련연구를 진행한 결과, 뚝새풀 추출물(유효농도 100 ~ 200 ㎍/㎖)은 RAW 264.7 세포에서 NF-κB 전사 활성을 억제함으로써 LPS에 의해 유도되는 iNOS 그리고 COX-2 단백질과 pro-inflammatory cytokine인 TNF-α및 IL-6의 발현을 효과적으로 저해하였다. 따라서,뚝새풀 추출물은 대식세포를 매개로한 염증반응의 작용기전 연구에 중요한 기초 자료가 될 수 있을 뿐만 아니라, 향 후 염증성 질환의 예방과 치료에 효과적으로 사용할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 뚝새풀 추출물(DS)이 RAW 264.7 cell의 세포생존율에 미치는 영향을 농도별로 나타낸 그래프,
도 2는 뚝새풀 추출물(DS)이 RAW 264.7 cell에서 LPS로 유도된 NO 생성에 미치는 영향을 농도별로 나타낸 그래프,
도 3은 뚝새풀 추출물(DS)이 RAW 264.7 cell에서 LPS로 유도된 iNOS 발현에 미치는 영향을 농도별로 나타낸 그래프,
도 4는 뚝새풀 추출물(DS)이 RAW 264.7 cell에서 LPS로 유도된 COX-2 발현에 미치는 영향을 농도별로 나타낸 그래프,
도 5는 뚝새풀 추출물(DS)이 RAW 264.7 cell에서 LPS로 유도된 p-IκBα 발현에 미치는 영향을 농도별로 나타낸 그래프,
도 6의 (a),(b)는 뚝새풀 추출물(DS)이 TNF-α(a)와 IL-6(b) 발현에 미치는 영향을 농도별로 나타낸 그래프.
도 2는 뚝새풀 추출물(DS)이 RAW 264.7 cell에서 LPS로 유도된 NO 생성에 미치는 영향을 농도별로 나타낸 그래프,
도 3은 뚝새풀 추출물(DS)이 RAW 264.7 cell에서 LPS로 유도된 iNOS 발현에 미치는 영향을 농도별로 나타낸 그래프,
도 4는 뚝새풀 추출물(DS)이 RAW 264.7 cell에서 LPS로 유도된 COX-2 발현에 미치는 영향을 농도별로 나타낸 그래프,
도 5는 뚝새풀 추출물(DS)이 RAW 264.7 cell에서 LPS로 유도된 p-IκBα 발현에 미치는 영향을 농도별로 나타낸 그래프,
도 6의 (a),(b)는 뚝새풀 추출물(DS)이 TNF-α(a)와 IL-6(b) 발현에 미치는 영향을 농도별로 나타낸 그래프.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명하나, 하기 실시예 및 제조예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐으로, 본 발명의 내용이 하기 실시예나 제조예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 뚝새풀 추출물의 염증성 질환 개선 및 완화 효과 확인
1-1. 시약제조
시약인 Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM)과 fetal bovine serum (FBS), penicillin, streptomycin은 Gibco/BRL (Eggenstein, Germany)에서 구입하였고, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5- (3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS, CellTiter 96AQueous One Solution Cell Proliferation Assay), Griess reagent system은 Promega (Madison, USA)에서 구입하였다. Lipopolysaccaride (LPS), dimethyl sulfoxide (DMSO)는 Sigma Chemical Co. (St. Lousi, MO, USA)에서 구입하였고, TNF-α, IL-6의 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Kit는 R&D systems (DuoSet ELISA Development Systems, MN, USA)에서 구입하였다. iNOS, COX-2, IκBα, p-IκBα, β-actin antibodies는 Cell Signaling Technology, Inc. (MA, USA)에서 구입하였다.
1-2. 추출물 제조 및 세포 배양
뚝새풀은 전남 강진군 강진읍(2013. 4. 17)에서 직접 채취한 것을 사용하였다.
음건한 뚝새풀 100g을 100% 에탄올 (ethanol, w/v) 5L를 투입하여 3 시간씩 두 번 추출한 후, 250 mesh와 whatman 여과지로 여과하였다. 여과액을 45℃에서 감압 농축하여 에탄올을 증발시키고 동결건조 (Ilshin, Korea)하여 6g의 뚝새풀 시료를 (6% 수율) 얻었다.
한국세포주은행 (KCLB, Seoul, Korea)으로부터 분양받은 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 cell은 Penicillin/streptomycin 100 unit/㎖과 10% FBS가 함유된 DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5 % CO2 incubator에서 배양하였다.
2-1. MTS 분석
뚝새풀 추출물(DS)의 RAW 264.7 cell에 대한 세포 독성 효과를 측정하기 위해 MTS assay를 실시하였다. 96 well plate에 3 ×105 cells/㎖로 분주하였고, DMEM FBS 10% 조건에서 뚝새풀 추출물을 농도별로 24시간 처리하였다. 그 후에는 각각 세포 배양액 용량의 1/10 배의 MTS 용해액을 첨가한 후 37℃에서 2 시간 배양한 후 ELISA microplate reader (Infinite 200 pro, TECAN, Austria)를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.
2-2. Nitric oxide (NO) 농도 측정
LPS로 활성화된 RAW 264.7 cell에서 뚝새풀 추출물의 NO 생성 억제를 측정하기 위해 뚝새풀 추출물을 50, 100, 200 ㎍/㎖ 농도로 처리한 실험군과 대조군을 24시간 세포 배양 후 Griess reagent system (G2930, Promega, USA)을 이용하여 NO를 측정하였다. 96 well plate에 세포 배양 상등액과 Griess reagent를 1:1로 혼합하여 넣고 10분 동안 반응 시킨 후 ELISA microplate reader (Infinite 200 pro, TECAN, Austria)를 이용하여 540 nm 에서 흡광도를 측정하였다.
2-3. Immunoblot 분석
뚝새풀 추출물의 항염증 효과를 확인하기 위해 Western blot을 이용하여 iNOS와 COX-2, IκBα, p-IκBα 단백질의 발현 정도를 분석하였다. 뚝새풀 추출물을 농도별로 처리한 실험군과 대조군을 24시간 배양 후 62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8), 2 % SDS, 5 % β-mercaptoethanol, 2 mM phenyl-methylsulfonyl fluoride, protease inhibitors (completeTM, Roche, Manngeim, Germany), 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF과 10 mM EDTA을 함유하는 완충제를 사용하여 세포를 용해시켰다. 세포 용해액을 15,000rpm로 4℃에서 30 분간 원심 분리하여 단백질만 포함하고 있는 상층액만을 얻었다. 정량한 단백질 20㎍을 10 % SDS-PAGE에 전기 영동시킨 후 PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane (BIO-RAD, Richmond, CA, USA)으로 옮겼다. 그리고 membrane의 blocking은 5 % bovine serum albumin (BSA)이 함유된 TTBS (0.1 % Tween 20 + TBS) 용액을 상온에서 2시간 동안 실시한 다음 iNOS, COX-2, IκBα, p-IκBα, β-actin에 대한 1차 항체와 반응시킨 후 2차 항체인 horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit or anti-mouse IgG를 반응시키고 ECL detection reagents (Millipore, MA, USA)를 사용하여 단백질의 발현정도를 확인하였다.
2-4. Cytokine (TNF-α, IL-6) 측정
LPS (500 ㎍/㎖)로 RAW 264.7 cell을 자극하기 전 뚝새풀 추출물을 30 분 동안 전처리하였다. Pro-inflammatory cytokine의 염증매개물질의 생성에 미치는 약물의 효과를 검증하기 위해서 LPS로 자극한 후 24 시간 뒤 이들 염증매개와 관련된 cytokine을 세포 상층액에서 상기 명시된 ELISA kit의 protocol 대로 ELISA법으로 정량하였다.
2-5. 통계처리
본 실험에서 얻은 결과에 대해서는 평균치±표준편차(mean±S.D.)로 나타내었으며, 대조군과 각 실험군과의 평균의 차이는 Student's t-test로 분석하여 p-value 값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다.
<실험결과>
3-1. 뚝새풀 추출물(DS)이 RAW 264.7 cell의 세포생존율에 미치는 영향
DS의 세포독성에 대해 알아보기 위해 MTS 분석법을 이용하여 세포생존율을 측정하였다.
그 결과 도 1에 도시된 바와 같이, DS를 10, 50, 100, 200, 500 ㎍/㎖의 농도로 처리하였을 때 500 ㎍/㎖ 농도에서 DS에 의한 RAW 264.7 cell에서 세포독성이 관찰되었다.
3-2. 뚝새풀 추출물(DS)이 RAW 264.7 cell에서 LPS로 유도된 NO 생성에 미치는 영향
DS가 NO 생성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 DS를 50, 100, 200 ㎍/㎖의 농도로 세포에 처리하여 생성되는 NO 양을 측정하였다. DS를 전 처리하고 LPS로 자극하여 24 시간 후에 세포 상층액에서 NO의 생성을 측정한 결과,
도 2에 도시된 바와 같이, LPS만 처리한 군에서는 LPS 자극없이 DS 단독 처리군과 비교하여 NO의 생성량이 현저하게 증가하였으며, DS를 100, 200 ㎍/㎖ 농도로 전처리하고 LPS를 처리한 실험군에서는 농도 의존적으로 유의성 있게 NO의 생성을 억제하였다.
3-3. 뚝새풀 추출물(DS)이 RAW 264.7 cell에서 LPS로 유도된 iNOS 발현에 미치는 영향
NO 생성 억제기작에 관한 iNOS 단백질의 관련성을 조사하기 위하여 immunoblot 분석을 이용하여 세포질 내에서의 iNOS 단백질 발현량을 조사하였다.
그 결과 도 3에 도시된 바와 같이, LPS 처리시에는 iNOS 단백질이 발현이 강하게 유도되었으나, LPS에 DS 50 ㎍/㎖ 이상 처리한 실험군에서는 LPS에 의한 iNOS의 발현량이 농도 의존적으로 현저히 감소되는 것을 관찰할 수 있었다.
3-4. 뚝새풀 추출물(DS)이 RAW 264.7 cell에서 LPS로 유도된 COX-2 발현에 미치는 영향
Pro-oxidant나 pro-inflammatory stimuli에 의해 MEKK-1, NF-κB의 활성화를 경유하여 생성되는 COX-2는 prostaglandin 합성을 증가시켜 염증반응에 있어서 중추적 역할을 한다.
실험결과, 도 4에 도시된 바와 같이, LPS 처리시에는 COX-2 발현량이 강하게 유도되었으나, 50, 100, 200 ㎍/㎖ DS 전처리로 LPS에 의한 COX-2 발현량이 농도 의존적으로 현저히 줄어들었다.
3-5. 뚝새풀 추출물(DS)이 RAW 264.7 cell에서 LPS로 유도된 p-IκBα 발현에 미치는 영향
바이러스, 박테리아 감염시 유도되는 염증반응에 의해 활성화되는 NF-κB는 iNOS나 TNF-α 유전자의 발현에 관련된다. 정상상태에서 NF-κB는 세포질에서 inhibitory molecule인 IκBα, IκBβ, IκBε, p105, p100 등과 결합하여 비활성형으로 존재하지만, LPS의 자극에 의해 NFκB signaling cascade가 활성화 되면, NFκB가 핵 이동(Nuclear translocation)하여 COX-2, iNOS, BclXL, cIAPs 등의 전사를 유도한다.
실험결과 도 5에 도시된 바와 같이, IκBα의 phosphorylated form을 측정하여 IκBα 활성에 의한 NF-κB 기전을 확인하였다. LPS 처리시에는 p-IκBα 발현이 유도되었으나, 50, 100, 200 ㎍/㎖ DS의 전처리는 LPS에 의한 p-IκBα 발현량을 억제시켰다.
3-6. 뚝새풀 추출물(DS)이 TNF-α, IL-6 발현에 미치는 영향
DS가 RAW 264.7 cell에서 LPS로 유도 되는 각종 전염증성 및 염증성 cytokine들의 발현에 대한 영향을 조사하기 위하여 전염증성 및 염증성 cytokine의 생성을 조사하였다. DS를 전처리한 후 LPS로 자극하여 24시간 후에 세포 상층액을 ELISA 방법으로 측정한 결과,
도 6의(a),(b)에 도시된 바와 같이, DS의 100, 200 ㎍/㎖ 농도에서 TNF-α를 농도 의존적으로 유의성 있게 억제하였고, IL-6는 50, 100, 200 ㎍/㎖의 농도에서 농도 의존적으로 유의성 있게 억제하였다.
실험결과로부터, 염증성 질환에 대한 뚝새풀 추출물의 유의적 효과를 요약하면 다음과 같다.
1. 대식세포는 능동 및 수동 면역반응에서 매우 중요한 역할을 하며, NO, prostaglandins(PGs) 그리고 pro-inflammatory cytokines 을 포함한 다양한 염증 매개물질을 조절하며, 이 중 NO 형성은 박테리아를 죽이거나 종양을 제거시키는 중요한 역할을 하지만, 병리적인 원인에 의한 과도한 NO 형성은 염증을 유발시키게 되며 조직의 손상, 유전자 변이 및 신경 손상 등을 유발한다는 사실에 기초하여 DS가 RAW 264.7 세포에서 LPS에 의해 유도된 NO의 생성을 저해함을 확인하였다.
또한 Western blot으로 분석한 결과 DS에 의한 iNOS의 발현 억제는 NO 형성 억제와 유사한 경향을 나타냄으로 NO 형성 억제는 iNOS의 발현저해를 경유한 것임을 알 수 있었다.
2. 다수의 항염증 약물들의 작용기전은 prostaglandin 합성을 억제하며 이는 COX-2의 생성 및 효소 활성저해에 의한 것으로, COX는 COX-1과 COX-2로 구분되는데, 다양한 세포에서 각각 다른 발현 경향을 나타낸다. COX-1은 위 및 신장기능의 유지, 혈소판의 형성에 필요한 prostaglandin을 합성하는 반면에, 상대적으로 COX-2는 동물이나 인간의 염증반응 부위에서 발현된다. 따라서 COX-2에 의한 prostaglandin의 합성은 염증반응을 매개하는 것으로 여겨지고 있다.
또한 Western blot을 이용하여 COX-2 단백질의 발현을 확인한 결과 DS는 LPS에 의해 형성되는 COX-2를 유의성 있게 감소시켰다.
3. 염증매개물질인 TNF-α와 IL-6는 in vivo 및 in vitro에서 모두 염증반응을 조절하는 물질로 알려져 있으며, 이러한 cytokine들은 서로 상호작용이 있는 것으로 알려져 있고, LPS등의 염증 자극 물질에 의해 생성이 유도된다고 보고되었다. DS는 LPS에 의해 유도된 TNF-α의 생성을 100 ㎍/㎖에서부터 유의성 있게 감소시켰으며 IL-6의 생성도 농도 의존적으로 유의성 있게 저해하였다.
4. LPS는 RAW 264.7 세포에서 NF-κB를 활성화 시켜 염증성 사이토카인의 분비, COX-2, iNOS의 활성화를 유도한다고 알려져 있는데, 본 실험에서 DS에 의한 TNF-α 분비억제, COX-2, iNOS의 활성 억제에 대한 기전으로 NF-κB 경로를 확인하기 위하여 세포내 NF-κB 억제 단백질인 Iκ-Bα의 활성을 관찰하였다.
그 결과 DS를 처리 했을 때 농도 의존적으로 Iκ-Bα인산화 반응이 억제되었으며 이 결과는 COX-2의 발현억제, NO와 TNF-α의 분비억제 반응 기작에 NF-κB의 핵 이동(Nuclear Translocation)이 DS에 의해 억제됨을 간접적으로 시사하는 것이라 할 수 있다.
즉, 뚝새풀 추출물이 대식세포를 매개로한 염증반응의 작용기전 연구에 중요한 기초 자료가 될 수 있고, 향 후 염증성 질환의 예방과 치료에 효과적으로 사용할 수 있을 것이다.
비록 본 발명이 상기에서 언급한 바람직한 실시예와 관련하여 설명되었지만, 본 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다른 다양한 수정이나 변형이 가능할 것이다. 따라서, 첨부된 청구범위는 본 발명의 진정한 범위 내에 속하는 그러한 수정 및 변형을 포함함은 물론이다.
Claims (3)
- 뚝새풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환 개선용 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 뚝새풀 추출물은 에탄올 추출물인 것을 특징으로 하는 염증성 질환 개선용 조성물.
- 제 2항에 있어서,
상기 뚝새풀 추출물은 음건한 뚝새풀 100g을 100 부피% 에탄올 5L에 투입하여 3 시간씩 두 번 추출한 후, 250 mesh와 whatman 여과지로 여과하고, 여과액을 45℃에서 감압 농축하여 에탄올을 증발시키고 동결건조하여 얻은 것을 특징으로 하는 염증성 질환 개선용 조성물.
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2013
- 2013-11-08 KR KR1020130135435A patent/KR101546021B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20120128597A1 (en) * | 2008-08-16 | 2012-05-24 | Forschungszentrum Borstel | Composition for prevention and treatment of allergic and/or inflammatory diseases |
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