KR101542507B1 - Hiv-1 - -1 - Google Patents
Hiv-1 - -1 Download PDFInfo
- Publication number
- KR101542507B1 KR101542507B1 KR1020130051346A KR20130051346A KR101542507B1 KR 101542507 B1 KR101542507 B1 KR 101542507B1 KR 1020130051346 A KR1020130051346 A KR 1020130051346A KR 20130051346 A KR20130051346 A KR 20130051346A KR 101542507 B1 KR101542507 B1 KR 101542507B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- pcr
- hiv
- primer
- gene
- seq
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명의 HIV-1 감염 또는 ADIS 환자의 바이러스 유래 항레트로바이러스제 관련 내성유전자 증폭을 위한 프라이머 세트 및 이를 포함하는 프리믹스 조성물을 사용하면 기존에 비해 저렴한 비용으로, 종래에는 검출할 수 없었던 넓은 범위의 HIV-1 관련 내성유전자 염기서열을 분석할 수 있다.The use of the primer set and the premix composition for amplification of HIV-1 infection or antiviral-derived antiretroviral-related resistance gene of ADIS according to the present invention can provide a wide range of HIV -1-related resistance gene sequences can be analyzed.
Description
본 발명은 HIV-1 감염인 혈장에서 추출된 핵산으로부터 항레트로바이러스제 관련 내성유전자 증폭을 위한 프라이머 세트 및 이를 포함하는 프리믹스 조성물에 관한 것이다.
The present invention relates to a primer set for amplification of an antiretroviral-related resistance gene from a nucleic acid extracted from plasma, which is an HIV-1 infection, and a premix composition containing the primer set.
HIV-1 감염인 및 에이즈환자에 있어 항레트로바이러스제 병합요법 중 치료경과 모니터링을 위해 항레트로바이러스제 내성검사 결과가 에이즈감염인 진료병원에서는 유용한 지침으로 활용되고 있는 실정이다. 과거 스탠포드 대학에서 확립한 인 하우스(in house) 방법을 활용한 항레트로바이러스제 내성검사가 국립보건연구원에서 수행되고 있으며, 이외 바이로시퀀스 키트(ViroSeq kit)가 일부 대학병원 또는 임상검사센터에서 이용되고 있다.In HIV-1-infected and AIDS patients, antiretroviral resistance test results are used as useful guidelines in HIV-infected hospital for monitoring progress of antiretroviral therapy. The National Institutes of Health is conducting an antiretroviral resistance test using the in house method established by Stanford University in the past. In addition, the ViroSeq kit is used in some university hospitals or clinical examination centers have.
하지만, 기존에 사용되고 있는 인 하우스 방법의 경우 실험자에 따라 재현성의 문제가 발생할 수 있다는 단점이 있고, 실험이 미숙한 경우 PCR이 원활히 수행되지 않으며, 샘플에 따라 검출되는 빈도가 차이가 나는 문제점이 있었다.However, in the conventional in house method, there is a disadvantage that reproducibility may occur depending on the experimenter, and when the experiment is immature, the PCR is not smoothly performed and the frequency of detection is different according to the sample .
나아가, 상용화된 키트의 경우 너무 높은 단가의 문제로 인해 현재 해당 검사항목에 대한 의료보험 수가로는 해결이 되지 않는 상황이라 문제가 되고 있는 상황이다. 이에 본 발명자들은 기존의 인 하우스 방법보다 검출률도 높고 실험자 변경에 따른 재현성 문제를 해결함과 동시에, 바이로시퀀스 키트에 비해서는 비용 면에서도 절감 효과가 큰 HIV-1 내성유전자 증폭을 위한 프리믹스 키트를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
Furthermore, in the case of commercialized kits, the problem of too high a unit price has not been solved because the number of medical insurance for current inspection items can not be solved. Therefore, the present inventors have found that a pre-mix kit for HIV-1 resistant gene amplification, which has a higher detection rate than that of the conventional in-house method and solves the reproducibility problem due to the change of the experimenter, Thereby completing the present invention.
본 발명의 목적은 HIV-1의 목적 유전자에 특이적인 프라이머를 사용하여 RT-PCR 및 2nd PCR을 수행함으로써 기존의 방법보다 우수한 HIV-1 약제내성유전자를 증폭하는 방법을 제공하는 것이다.An object of the present invention is to provide a method for amplifying an HIV-1 drug resistance gene superior to the conventional method by performing RT-PCR and 2nd PCR using a primer specific to a target gene of HIV-1.
본 발명의 다른 목적은 상기 HIV-1 바이러스 유래 항레트로바이러스제 내성 유전자를 증폭하기 위한 프리믹스 조성물 및 목적 유전자 증폭용 키트를 제공하는 것이다.
It is another object of the present invention to provide a premix composition for amplifying the HIV-1 viral antiretroviral resistance gene and a kit for amplifying a target gene.
본 발명의 일 구체예에서는 서열번호 1 및 서열번호 2를 포함하는 HIV-1 감염인 유래 항레트로바이러스제 관련 내성유전자 증폭을 위한 RT-PCR용 프라이머 세트를 제공한다.In one embodiment of the present invention, there is provided a primer set for RT-PCR for the amplification of antiretroviral-related resistance gene derived from HIV-1 infection comprising SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO:
본 발명의 일 구체예에서는 서열번호 3 및 서열번호 4를 포함하는 HIV-1 감염인 유래 항레트로바이러스제 관련 내성유전자 증폭을 위한 cDNA 증폭용 2nd PCR 프라이머 세트를 제공한다.In one embodiment of the present invention, there is provided a 2 nd PCR primer set for cDNA amplification for amplification of antiretroviral-related resistance gene derived from HIV-1 infection comprising SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4.
본 발명의 일 구체예에서는 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트 또는 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트를 포함하는 HIV-1 약제내성유전자 증폭용 PCR용 프리믹스 조성물을 제공한다.In one embodiment of the present invention, there is provided a primer set for SEQ ID NO. 1 and SEQ ID NO. 2, or a primer set for SEQ ID NO. 3 and SEQ ID NO. 4 for a PCR for HIV-1 drug resistance gene amplification.
본 발명의 일 구체예에서는 서열번호 1 및 서열번호 2의 RT-PCR용 프라이머 세트로 cDNA를 합성하는 단계; 및 서열번호 3및 서열번호 4의 PCR 프라이머 세트로 목적유전자를 증폭하는 단계를 포함하는 HIV-1 바이러스의 유전자를 증폭시키는 방법을 제공한다. 상기 구체예에서, 상기 목적 유전자는 gag-pol 유전자인 것을 특징으로 하는 HIV-1바이러스의 유전자를 증폭시키는 방법을 제공한다. 상기 구체예에서, 상기 cDNA 합성 단계는 50℃에서 30분간 실시하고, 사전-변성은 94℃에서 10분간 실시하며, 어닐링 단계는 55℃에서 20초간 실시하는 것을 특징으로 하는, HIV-1 유전자를 증폭시키는 방법을 제공한다. 상기 구체예에서, 상기 목적 유전자의 증폭 단계는 1차 RT-PCR 생성물 2ul를 사용하고, 어닐링 단계는 60℃ 또는 65℃에서 30초간 실시하는 것을 특징으로 하는 HIV-1 유전자를 증폭시키는 방법을 제공한다.In one embodiment of the present invention, there is provided a method of amplifying cDNA comprising the steps of: synthesizing cDNA with a primer set for RT-PCR of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2; And a step of amplifying the target gene with the PCR primer set of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4. In this embodiment, there is provided a method for amplifying a gene of HIV-1 virus, wherein the target gene is a gag-pol gene. In this embodiment, the cDNA synthesis step is carried out at 50 ° C for 30 minutes, the pre-modification is carried out at 94 ° C for 10 minutes, and the annealing step is carried out at 55 ° C for 20 seconds. Amplification method. In this embodiment, the amplification step of the target gene is carried out by using 2ul of the first RT-PCR product, and the annealing step is carried out at 60 ° C or 65 ° C for 30 seconds. do.
본 발명의 일 구체예에서는 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머를 포함하는 RT-PCR용 프라이머 세트로 cDNA를 합성 단계; 및 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머를 포함하는 2nd PCR 프라이머 세트로 HIV-1 목적유전자의 증폭 단계를 포함하고, 상기 증폭된 HIV-1 유전자를 염기서열 분석하여 항레트로바이러스제에 대한 내성 분석용 시료를 제공하는 방법을 제공한다. 상기 구체예에서, 상기 항레트로바이러스제는 병용요법으로 사용되는 것으로서 단백질분해효소억제제, 핵산계열 역전사효소억제제 및 비핵산계열의 역전사효소억제제로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 항레트로바이러스제에 대한 내성 분석용 시료를 제공하는 방법을 제공한다. In one embodiment of the present invention, cDNA is synthesized with a primer set for RT-PCR including the primers of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2; And an amplification step of HIV-1 gene of interest with a 2 nd PCR primer set comprising the primers of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, wherein the amplified HIV-1 gene is subjected to base sequence analysis and then analyzed for resistance to antiretroviral agents The method comprising the steps of: In the above embodiments, the antiretroviral agent is used as a combination therapy and is any one or more selected from the group consisting of a protease inhibitor, a nucleic acid-based reverse transcriptase inhibitor and a non-nucleic acid-based reverse transcriptase inhibitor. The method comprising the steps of:
"바이오마커"는 질병의 진행 또는 치료의 효과를 측정하기 위해 이용될 수 있는 특이적 생물 특성, 생화학적 특징 또는 양상의 분자 지표이다. 단백질 및 핵산은 예시적인 바이오마커이다. 특히, 핵산은 혈액, 소변 및 뇌척수액을 비롯한 대부분의 체액에서 확인되었으며, 질병을 위한 진단 바이오마커로 사용하기 위해 성공적으로 적용되었다. A "biomarker" is a molecular indicator of a specific biological characteristic, biochemical characteristic or aspect that can be used to measure the progress of a disease or the effect of treatment. Proteins and nucleic acids are exemplary biomarkers. In particular, nucleic acids have been identified in most body fluids, including blood, urine and cerebrospinal fluid, and have been successfully applied for use as diagnostic biomarkers for disease.
현재까지 다양한 레트로바이러스(retrovirus)를 측정하는 방법이 개발되어 왔는데, 이러한 방법들은 크게 세 가지로 분류될 수 있다. 첫 번째 방법은 역전사 효소(reverse transcriptase) 활성도 혹은 닷 블럿 혼성화(dot blot hybridization) 반응이나 반-정량적 RT-PCR (semi-quantitative RT-PCR) 방법을 이용하여 바이러스의 게놈 RNA 양을 측정함으로써 세포 배양 상등액 내 바이러스의 양을 측정하는 방법이다. 두 번째 방법은 레트로바이러스에 의해 도입된 유전자의 표적세포 내 발현을 측정하여 간접적으로 바이러스의 농도를 측정하는 방법이다. 이와 같은 방법에서는 유전자가 도입된 세포와 그렇지 않은 세포를 구별할 수 있는 다양한 표지 유전자를 이용하여 특정 약물이 포함된 배양액에서 표적세포를 선택적으로 배양하여 콜로니(colony)의 수를 계산하거나 표적세포를 염색하여 감염된 세포의 수를 결정함으로써 바이러스의 농도를 측정한다. 세 번째 방법은 표적세포의 게놈 내로 삽입된 레트로바이러스 게놈 DNA의 양을 측정하여 레트로바이러스의 농도를 측정하는 방법이다. 이를 위해 일반적으로 서던 분석법(Southern blot analysis)이 이용되고 있다. 이 방법은 레트로바이러스의 감염성을 측정할 수 있으며 혼성화 반응에 사용하는 탐침(probe)를 선택함으로써 삽입된 유전자에 관계없이 일반적인 레트로바이러스의 농도를 측정하는데 적용할 수 있다는 장점이 있지만, 정확한 정량성을 얻기 힘들며 시간이 많이 소요되고 번거롭다는 단점을 지닌다.
To date, various methods have been developed for measuring retroviruses, which can be classified into three broad categories. The first method is to measure the amount of genome RNA of virus using reverse transcriptase activity or dot blot hybridization reaction or semi-quantitative RT-PCR method, And measuring the amount of virus in the supernatant. The second method is indirectly measuring the concentration of the virus by measuring the expression of the gene introduced by the retrovirus into the target cell. In this method, target cells are selectively cultured in a culture medium containing a specific drug using various marker genes capable of distinguishing between a cell into which a gene is introduced and a cell not containing the gene, thereby calculating the number of colonies, And the concentration of the virus is determined by determining the number of infected cells by staining. The third method is to measure the retrovirus concentration by measuring the amount of retroviral genomic DNA inserted into the genome of the target cell. Southern blot analysis is generally used for this purpose. This method has the advantage of being able to measure the infectivity of retroviruses and selecting the probe used for the hybridization reaction to be able to measure the concentration of general retrovirus regardless of the inserted gene, It is difficult to obtain, time consuming and troublesome.
본 발명의 프리믹스 키트를 이용한 HIV-1 유래 내성 유전자 증폭 방법은 기존의 인 하우스 방법에 비해 비용이 감소되고, 검출 범위가 확장되었으며, 기존의 인 하우스 방법으로는 증폭되지 않는 샘플의 경우에도 본 발명의 프리믹스 키트를 이용할 경우 HIV-1 내성 유전자가 일부 샘플의 경우 증폭된다.
The HIV-1-derived resistant gene amplification method using the premix kit of the present invention has a reduced cost and extended detection range compared with the conventional in house method, and even in the case of a sample which is not amplified by the conventional in house method, Of the HIV-1 resistant gene is amplified for some samples.
도 1은 HIV-1 감염 환자로부터 채취한 시료에 대하여 기존의 인 하우스 방법에 의한 결과 및 본 발명에 의해 제작된 프리믹스 방법을 수행하여, 기존의 방법으로는 검출되지 않은 7개 샘플 중 4개가 본 발명에 의한 방법을 통해 검출됨을 보여주는 결과이다.
도 2는 기존의 인 하우스 방법에 의한 RT-PCR 산물을 사용하여 본원 발명 2nd PCR을 수행한 결과로서, 목적유전자가 일부 (4,5번, 1.5Kb)만 약하게 증폭되고 7개 샘플 모두에서 제대로 증폭되지 못함을 나타낸 결과이다.FIG. 1 shows the result of the conventional in house method and the premix method produced by the present invention for a sample collected from a patient infected with HIV-1, and 4 out of 7 samples Is detected through the method of the present invention.
FIG. 2 shows the results of the 2 nd PCR of the present invention using RT-PCR products obtained by the conventional In house method. As a result, only a small part of the target gene (4,5, 1.5 Kb) It is the result that it can not be properly amplified.
환자 유래 Patient origin HIVHIV -- 1으로부터From 1 HIVHIV -1 목적 유전자의 증폭-1 Target gene amplification
HIV-1에 감염된 환자의 시료(혈장) 중에서 기존의 인 하우스 방법으로 목적 유전자가 증폭되지 않았던 시료를 선별하였다. 시료로부터 HIV-1 RNA를 추출하기 위해서, Abbott 사의 m2000sp 시스템(m2000sp; Abbott molecular Inc., Des Plaines, IL, USA) 또는 QIAamp Viral RNA mini kit (QIAGEN, USA)를 사용하여 매뉴얼에 따라 시료로부터 핵산을 분리하였다. RT-PCR(서열번호 1 및 2) 및 2nd PCR(서열번호 3 및 4)에 사용한 프라이머의 서열은 하기 표 2에 나타내었다. Among the samples (plasma) of patients infected with HIV-1, samples which did not amplify the target gene by the conventional in house method were selected. In order to extract HIV-1 RNA from the samples, nucleic acid was extracted from the samples according to the manual using the Abbott molecular mass spectrometer (m2000sp; Abbott molecular Inc., Des Plaines, IL, USA) or QIAamp Viral RNA mini kit (QIAGEN, USA) . Sequence of the primer used for RT-PCR (SEQ ID NO: 1 and 2), and 2 nd PCR (SEQ ID NOS: 3 and 4) were represented in Table 2 below.
인하우스existing
In house
RT-PCR
(RT-F-Outer)MAW26
(RT-F-Outer)
(RT-R-Outer)RT-21
(RT-R-Outer)
2 nd PCR
(PCT-F-Inner)PRO1
(PCT-F-Inner)
(PCT-R-Inner)RT-20
(PCT-R-Inner)
발명germinal
invent
번호order
number
RT-PCR
RT-PCR(Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction) 및 2nd PCR 반응은 KNIH-OJ One-step RT PCR (HIV-1)키트 및 KNIH-OJ One-step PCR (HIV-1)키트를 사용하여 하기 표 3 내지 표6의 조건에 따라 수행하였다. RT-PCR (Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction) and 2 nd PCR reactions were carried out using KNIH-OJ One-step RT PCR (HIV-1) kit and KNIH-OJ One-
40
35
35
- 10X 반응 완충액 믹스
- 2.5 mM dNTP 혼합물
- - 중합효소(1 unit)2X PreMIX (w /
- 10X Reaction Buffer Mix
- 2.5 mM dNTP mixture
- - Polymerase (1 unit)
(10 pmol / ul)Primer F of SEQ ID NO: 3
(10 pmol / ul)
(10 pmol / ul)The primer R of SEQ ID NO: 4
(10 pmol / ul)
상기와 표 3 내지 표 6에 따라 RT PCR 및 2nd PCR을 수행하여 도 1(M:1kb ladder, 1~7:임상주 샘플, N:음성대조군)과 같은 결과를 수득하였다. 도 1에 나타난 바와 같이, 기존의 인 하우스 방법으로는 목적 유전자 1.3kb가 증폭되지 않았지만, 본원 발명의 변경된 프라이머(목적 유전자 1.5kb)를 활용하여 제작된 프리믹스를 활용하면, 기존의 방법으로는 검출되지 않은 7개 샘플 중 4개가 증폭됨을 확인하였다. 또한, 기존의 인 하우스 방법으로 RT-PCR을 수행하고 난 후, 합성된 cDNA에 대하여 2nd PCR을 수행하였으며, 7개 시료에서 목적 유전자의 대부분이 제대로 증폭되지 못함을 확인하였다(도1, 2). RT PCR and 2 nd PCR were performed according to the above Tables 3 to 6 to obtain the same results as in Fig. 1 (M: 1 kb ladder, 1 to 7: clinical sample, N: negative control). As shown in FIG. 1, in the conventional In house method, the target gene of 1.3 kb was not amplified. However, when a premix produced using the modified primer of the present invention (target gene of 1.5 kb) is used, And four of the seven non-amplified samples were amplified. In addition, RT-PCR was performed using the conventional in house method, and 2 nd PCR was performed on the synthesized cDNA, and it was confirmed that most of the target gene was not amplified correctly in 7 samples (FIGS. 1 and 2 ).
하기의 표 7은 기존의 인 하우스 방법과 본원 발명의 방법을 비교한 것이다.Table 7 below compares the existing Inhouse method with the method of the present invention.
division
1 st PCR
Reverse transcription
Pre-denaturation
싸이클
40
Cycle
Final height
keep
2 nd PCR
1 st PCR product
Pre-denaturation
싸이클
35
Cycle
Final height
keep
지금까지 예시적인 실시예을 참조하여 본 발명을 기술하여 왔지만, 본 발명의 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명의 범주를 벗어나지 않고서도 다양한 변화를 실시할 수 있으며 그의 요소들을 등가물로 대체할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 또한, 본 발명의 본질적인 범주를 벗어나지 않고서도 많은 변형을 실시하여 특정 상황 및 재료를 본 발명의 교시내용에 채용할 수 있다. 따라서, 본 발명이 본 발명을 실시하는데 계획된 최상의 양식으로서 개시된 특정 실시예로 국한되는 것이 아니며, 본 발명이 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시예를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.While the present invention has been described with reference to exemplary embodiments, it will be understood by those skilled in the art that various changes may be made and equivalents may be substituted for elements thereof without departing from the scope of the invention. It will be possible. In addition, many modifications may be made to adapt a particular situation and material to the teachings of the invention without departing from the essential scope thereof. Accordingly, it is intended that the invention not be limited to the particular embodiment disclosed as the best mode contemplated for carrying out this invention, but that the invention will include all embodiments falling within the scope of the appended claims.
<110> KOREA CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION <120> Primer set for the amplifying antiretroviral drug resistance-related HIV-1 gene and Premix Composition with the primer set <130> IPDB49720 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> HUMAN <400> 1 ttggctgaag caatgagcca agt 23 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> HUMAN <400> 2 tgcttctgta tttctgctat taag 24 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> HUMAN <400> 3 aaagggctgt tggaaatgtg g 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> HUMAN <400> 4 tctctctgtt ttctgccagt t 21 <110> KOREA CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION <120> Primer set for the amplifying antiretroviral drug resistance-related HIV-1 gene and Premix Composition with the primer set <130> IPDB49720 <160> 4 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> HUMAN <400> 1 ttggctgaag caatgagcca agt 23 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> HUMAN <400> 2 tgcttctgta tttctgctat taag 24 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> HUMAN <400> 3 aaagggctgt tggaaatgtg g 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> HUMAN <400> 4 tctctctgtt ttctgccagt t 21
Claims (9)
서열번호 3의 센스 프라이머 및 서열번호 4의 안티센스 프라이머를 포함하는 HIV-1 감염인 유래 항레트로바이러스제 관련 내성유전자 증폭을 위한 cDNA 증폭용 2차 PCR 프라이머 세트를 포함하는 2차 PCR용 프리믹스 조성물
을 포함하는 HIV-1 감염인 유래 항레트로바이러스제 관련 내성유전자 증폭용 PCR 프리믹스 조성물.
A primer composition for RT-PCR comprising a primer set for RT-PCR for amplification of an antiretroviral-related resistance gene derived from an HIV-1 infection comprising a sense primer of SEQ ID NO: 1 and an antisense primer of SEQ ID NO: 2; And
A primer composition for secondary PCR comprising a sense primer of SEQ ID NO: 3 and an antisense primer of SEQ ID NO: 4 and a second PCR primer set for cDNA amplification for amplification of an antiretroviral-related resistance gene derived from HIV-1 infection
Wherein the anti-retroviral agent is selected from the group consisting of HIV-1 and HIV-1.
제 3항의 cDNA 증폭용 2차 PCR 프라이머 세트로 목적유전자를 증폭하는 단계를 포함하는 HIV-1 유전자를 증폭시키는 방법.
Synthesizing cDNA with the primer set for RT-PCR according to claim 3; And
A method for amplifying an HIV-1 gene comprising the step of amplifying a target gene with a second PCR primer set for cDNA amplification of claim 3.
상기 목적 유전자는 gag-pol 유전자인 것을 특징으로 하는 HIV-1 유전자를 증폭시키는 방법.
5. The method of claim 4,
Wherein the target gene is a gag-pol gene.
상기 cDNA 합성에서 역전사 반응 단계는 50℃에서 30분간 실시하고, 사전-변성은 94℃에서 10분간 실시하며, 어닐링 단계는 55℃에서 20초간 실시하는 것을 특징으로 하는, HIV-1 유전자를 증폭시키는 방법.
5. The method of claim 4,
In the cDNA synthesis, the reverse transcription step is carried out at 50 ° C for 30 minutes, pre-denaturation is carried out at 94 ° C for 10 minutes, and the annealing step is carried out at 55 ° C for 20 seconds. Way.
상기 목적 유전자의 증폭 단계는 1차 RT-PCR 생성물 2㎕를 사용하고, 어닐링 단계는 60℃ 또는 65℃에서 30초간 실시하는 것을 특징으로 하는 HIV-1 유전자를 증폭시키는 방법.
5. The method of claim 4,
Wherein the amplification step of the target gene is performed using 2 1 of the first RT-PCR product, and the annealing step is performed at 60 캜 or 65 캜 for 30 seconds.
제 3항의 cDNA 증폭용 2차 PCR 프라이머 세트로 HIV-1 목적유전자의 증폭 단계를 포함하고,
상기 증폭된 HIV-1 유전자를 염기서열 분석하여 항레트로바이러스제에 대한 내성 분석용 시료를 제공하는 방법.
Synthesizing cDNA with the primer set for RT-PCR according to claim 3; And
Amplifying the target gene for HIV-1 with a second PCR primer set for cDNA amplification of claim 3,
Wherein the amplified HIV-1 gene is subjected to sequencing analysis to provide a sample for analysis of resistance to an antiretroviral agent.
상기 항레트로바이러스제는 병용요법으로 사용되는 것으로서, 단백질분해효소억제제, 핵산계열 역전사효소억제제 및 비핵산계열의 역전사효소억제제로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 항레트로바이러스제에 대한 내성 분석용 시료를 제공하는 방법.
9. The method of claim 8,
The antiretroviral agent is used as a combination therapy and is any one or more selected from the group consisting of a protease inhibitor, a nucleic acid-based reverse transcriptase inhibitor and a non-nucleic acid-based reverse transcriptase inhibitor. / RTI >
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020130051346A KR101542507B1 (en) | 2013-05-07 | 2013-05-07 | Hiv-1 - -1 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020130051346A KR101542507B1 (en) | 2013-05-07 | 2013-05-07 | Hiv-1 - -1 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20140132177A KR20140132177A (en) | 2014-11-17 |
KR101542507B1 true KR101542507B1 (en) | 2015-08-20 |
Family
ID=52453275
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020130051346A KR101542507B1 (en) | 2013-05-07 | 2013-05-07 | Hiv-1 - -1 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
KR (1) | KR101542507B1 (en) |
-
2013
- 2013-05-07 KR KR1020130051346A patent/KR101542507B1/en active IP Right Grant
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
R. Gonzalez 등. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY. Vol. 42, No. 7, 페이지 2907-2912 (2004)* |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR20140132177A (en) | 2014-11-17 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6574703B2 (en) | Method for detecting Helicobacter pylori DNA in stool samples | |
US8945833B2 (en) | Method for determining drug resistance mutations in any of the non-structural protein regions NS3 to NS5B of hepatitis C virus (HCV) for genotypes 1 to 6 | |
WO2014139330A1 (en) | Rapid genotyping analysis and kits thereof | |
WO2018035860A1 (en) | Multiplex taqman probe qpcr assay kit and method for simultaneous assay and quantitative analysis of four blood-borne viruses | |
CN111118138A (en) | Kit and method for detecting polymorphism of folate metabolism ability genes MTHFR and MTRR | |
WO2009061640A3 (en) | Hepatitis b virus (hbv) specific oligonucleotide sequences | |
CN114214455B (en) | Quick quantitative primer probe for hepatitis B virus DNA and CRISPR/Cas12b detection system thereof | |
RU2016136727A (en) | SET OF OLIGONUCLEOTIDE PRIMERS, PROBES AND METHOD FOR IDENTIFICATION OF THE 35DELG Mutation OF THE GJB2 GENE BY THE METHOD OF ALLEY-SPECIFIC PCR AMPLIFICATION IN HEREDITARY NONSYNDROMAL DEAF | |
KR101605524B1 (en) | A primer set for analyzing a base sequence of an antiretroviral drug-resistant gene derived from HIV-1-infected individuals | |
CN110819709A (en) | Method for detecting CYP2C9 and VKORC1 gene polymorphism by fluorescent quantitative PCR (polymerase chain reaction) | |
KR101542507B1 (en) | Hiv-1 - -1 | |
CN110863040A (en) | Method for detecting CYP3A5 gene polymorphism by fluorescent quantitative PCR | |
JP5548357B2 (en) | Method for detecting Aspergillus fumigatus-related bacteria | |
KR102332856B1 (en) | Primer set for loop-mediated isothermal amplification reaction for detecting Hepatitis E virus, and use thereof | |
KR20130075760A (en) | Sets of primers and taqman mgb probes for real-time pcr-based assays to discriminate ginseng cultivars | |
JP7065976B2 (en) | Diagnosis method of scrub typhus using multi-copy gene | |
CN113151599A (en) | Primer group, reagent, kit and detection method for detecting novel coronavirus | |
CN113549709A (en) | Primer pair, probe and kit for detecting SARS-CoV-2 by utilizing nested RPA technology and application thereof | |
CN110819708A (en) | Method for detecting ALDH2 gene polymorphism by fluorescent quantitative PCR | |
CN110373503B (en) | Complete set of nucleic acid, kit and detection method for detecting Hancheng virus by RPA | |
RU2720252C1 (en) | Set of primers for identification of rna strains puumala orthohantavirus, common in the republic of tatarstan | |
RU2799797C2 (en) | Method of obtaining molecular str markers of the human y chromosome for identifying an unknown individual and determining biological relationship by multiplex amplification, and a kit of oligonucleotides for implementing the method | |
RU2795016C1 (en) | OLIGONUCLEOTIDES FOR DETECTION OF MUTATION S:delVYY143-145 OF SARS-CoV-2 | |
JP2019140997A (en) | Primer set for detecting trichophyton gene by lamp method, kit containing the same and method for detecting trichophyton using the same | |
KR20130110811A (en) | Method for detecting mutations in drug-resistant related genes of hiv using restriction fragments mass polymorphism |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A201 | Request for examination | ||
E902 | Notification of reason for refusal | ||
E90F | Notification of reason for final refusal | ||
E701 | Decision to grant or registration of patent right |