KR101539021B1 - 박테리아 ａｔｐ 합성효소 결합 부분 - Google Patents

Abstract

본 발명은 분리된 돌연변이 atpE 단백질 및 상기 돌연변이 atpE 단백질로부터 분리된 ATPase 결합 부분의 규명을 제공한다. 본 발명은 또한, 관련 핵산(nucleic acids), 벡터(vectors), 숙주세포(host cells), 약학적 조성물 및 제품을 제공한다. 본 발명은 또한, 시험 화합물이 atpE 단백질, 즉, 본 발명의 ATPase 결합 부분과 반응하는 지를 결정하는 방법과 특히, 항균제(antimicrobials)로서, 항마이코박테리아제(antimycobacterial agent)로서, 더욱 자세하게는 대상에서 결핵(tuberculosis, TB)을 치료하기 위한, 시험 화합물을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

Description

박테리아 ＡＴＰ 합성효소 결합 부분{A BACTERIAL ATP SYNTHASE BINDING DOMAIN}

본 발명은 분리된 돌연변이 atpE 단백질 및 상기 돌연변이 atpE 단백질을 이용한 ATPase 결합 부분의 규명에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 관련 핵산(nucleic acids), 벡터(vectors), 숙주세포(host cells), 약학적 조성물 및 제품에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 시험 화합물이 atpE 단백질, 즉, 본 발명의 ATPase 결합 부분과 반응하는 지를 결정하는 방법과 특히, 항균제(antimicrobials)로서, 항마이코박테리아제(antimycobacterial agent)로서, 더욱 자세하게는 대상에서 결핵(tuberculosis, TB)을 치료하기 위한, 시험 화합물을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

전세계적으로, 에이즈(AIDS)에 감염된 성인의 경우, 결핵(TB)이 사망(200만-300만명/년)의 주요한 원인이 되고 있으며, 가난과 질병의 극복을 저해하는 결정적인 역할을 하고 있다.(1) 질병의 재발에 기여하는 여러 요소들은 많은 나라에서 수행되고 있는 항-TB 프로그램을 수행하는 데 어려움, 면역력이 약화된 사람(주로 HIV 감염에 기인) 수의 현저한 증가, 결핵이 풍토병인 지역에서 사람들의 이동을 들 수 있다. 결핵과 HIV 모두 감염된 사람(현재 성인 1100만명)은 치사율과 전이율 모두 높은 것으로 알려져 있다.(2,3) 게다가, 결핵은 HIV에 감염된 사람들의 주요한 사망 원인이 되고 있다.(4)

비록, 1차 항결핵 약 요법이 90%이상의 치료 효과를 기대할 수 있기는 하나, 적절한 의학적 지원과 결핵 치료 프로그램이 이루어지지 않았을 때, 환자의 순응도(compliance)가 낮아질 수 있고, 약에 대한 저항성이 발생할 수 있다.(5) TB의 다제내성(MDR, Multidrugresistance) 균주가 치료를 실질적으로 어렵게한다.(6) 결핵치료제개발국제연맹(Global Alliance for TB Drug Development)에서 임의의 새로운 치료제는 기존의 치료제보다 다음의 세가지 장점 중에 적어도 하나의 장점을 제공할 수 있어야 한다고 권하고 있는데, 그 첫째는 결핵의 치료 기간을 단축 혹은, 간소화할 수 있고, 둘째는, 다제내성결핵에 대한 치료의 효율성을 높일 수 있고, 마지막으로는, 잠복 상태의 결핵의 치료 효과를 높일 수 있어야 한다는 것이다. 상기와 같은 새로운 약은 환자의 순응도(compliance)를 크게 향상시켜, 세계보건기구(WHO)의 직접 감독 치료, 단기 과정(Directly Observed Treatment Short-course, DOTs)과 같은, 결핵 치료 프로그램의 비용을 줄일 수 있게 된다(7).

현재 예비 임상 개발 중에 있거나, 임상 개발 중에 있는 새로운 항결핵제 후보는 기존에 존재하는 약의 그룹(예를 들면, 목시플록사신)에 속하는 것이거나, 1차 약제의 유사체, 예를 들면 MJH-98-1-81(이소니아지드로부터의 것), 옥사졸리디논 및 리파펜틴(리팜핀의 밀접한 유사체)과 같이 기존에 존재하는 약의 유사체인 경우가 많다.(8) 이러한 새로운 약물이 유력한 효과가 있을지라도, 상기와 같이 유사 화합물은 기존의 약물들과 같은 기작에 의존하기 때문에, 저항성에 대한 임시적 인 해결책만을 제공할 뿐이다.(9) 일반적으로, 항균제는 특이한 기작을 통하여 박테리아의 대사 작용을 저해함으로써, 박테리아의 복제(replication)를 억제시킨다. 예를 들어, 이소니아지드는 세포벽의 주요 성분인 마이콜산(mycolic acids)을 합성하는 효소 기작을 방해하는 한편, 리팜피신(rifampicin)은 DNA에서 RNA로 전사(transcription)시키는 박테리아의 기작을 방해한다. 따라서, 지금까지 알려진 약제에 비해 상이한 항마이코박테리아 특이적 측면의 세포 성장과 복제를 표적으로 하는 항결핵 화합물을 찾아내기 위한 새로운 방법을 개발하는 것이 시급한 실정이다.

[발명의 요약]

본 발명은 특히, 서열번호 1, 2, 3, 4 및 5로부터 선택된 아미노산 서열에 의해 암호화된 돌연변이 atpE 단백질, 특히 서열번호 6, 7, 8, 9 및 10으로 부터 선택된 상기 돌연변이 atpE 단백질을 암호화하는 분리된 핵산, 본 발명의 핵산(instant nucleic acid)을 포함하는 벡터(vector)를 제공한다. 특정 구체예에서, 돌연변이 atpE 단백질은 서열번호 2에 의해 암호화되며, 상기 단백질을 암호화하는 분리된 핵산은 서열번호 7으로 구성된다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 발현 벡터(expression vector)를 포함하고 있는 숙주 세포를 함유하는 숙주-벡터 시스템(host-vector system)을 제공한다.

본 발명은 또한, 돌연변이 atpE 단백질을 포함하는, 분리된 세포(isolated cell)를 제공하는데, 여기서, 상기 단백질은 세포 내에서 항균제 저항성을 유발하는 단백질이다.

본 발명은 또한, 항균 화합물을 찾아내는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음과 같은 단계로 구성된다.

(a) 생리적 환경 하에서 atpE 단백질을 발현하는 세포와 시험 화합물을 접촉시키는 단계;

(b) 시험 화합물이 atpE 단백질과 상호작용 하는지를 결정하는 단계;

본 발명은 또한, 시험 화합물이 atpE 단백질과 상호작용할 수 있는 가능성을 판단하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음을 포함한다.

(a) 분자 모델링 기술(molecular modeling techniques)을 이용하여 atpE 단백질의 삼차원 구조 생성;

(b) 컴퓨터 수단을 이용하여 시험 화합물과 상기 atpE 단백질의 삼차원 구조의 조정 조작(fitting operation) 수행;

(c) 상기 조정 조작(fitting operation)의 결과를 분석하여 atpE 단백질의 삼차원 구조와 시험 화합물의 회합 정량화;

본 발명은 또한, ATPase에서 F₀ 부분의 결합 부분을 제공하는 목적을 갖는데, 상기 F₀ 부분의 결합 부분은 하나의 C 서브유닛(subunit)에서 Ala²⁴, Gly²⁷, Phe⁵³, Val⁵⁷, Gly⁵⁸, Glu⁶¹, Tyr⁶⁴ 및 Phe⁶⁵과, 하나의 A 서브유닛에서 Ser¹⁸², Leu¹⁸³, Ser¹⁸⁴, Leu¹⁸⁵ 및 Arg¹⁸⁶을 포함하고, 상기 아미노산은 표 3, 4 또는 5에 나타낸 원자 좌표를 갖는다.

본 발명은 ATPase의 F₀ 부분과 상호작용하는 화합물을 확인하고, 항균제 화합물로 효능이 있는지를 확인하는 방법, 특히 항마이코박테리아 화합물을 확인하는 방법에 있어서 상기 결합 부분의 용도를 제공한다.

따라서, 본 발명의 목적은 ATPase의 F₀ 부분, 특히, 저항성-유발 돌연변이 부위 또는 본 발명의 결합 부분과 상호작용하는 화합물을 대상에 투여하는 것을 포함하여, 미생물에 기초하여 감염된 대상을 치료하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명은 또한, 상기 임의의 스크리닝 방법을 이용하여 atpE 단백질과 상호작용하는 약제를 대상에 투여하는 것을 포함하여, 결핵균에 감염된 대상을 치료하는 방법을 제공한다. ATPase의 F₀ 부분, 특히, atpE 단백질과 상호작용하는 화합물을 이용하는 것을 포함하는 치료방법에서, ATPase의 F₀ 부분, 특히, atpE 단백질과 상호작용한다고 알려진 화합물은 배제될 것이다. 특히, 개시된 임의의 치료방법에서, (11)에 나타낸 DARQ J 화합물의 사용이 배제될 것이다.

본 발명은 또한, 세포에서 atpE 단백질과 상호작용하는 약제 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 마지막으로, 본 발명은 포장재 및 약제를 포함하는 제품을 제공하는 데, (a) 상기 약제는 세포에서 atpE 단백질과 상호작용하는 것이고, (b) 상기 포장재는 대상에서 박테리아 감염을 치료하기 위한 약제의 사용에 대해 설명하는 표지를 포함한다. 본 발명의 특정 구체예에서는, 항균약제를 제조하는데, DARQ J의 용도를 제공한다.

본 발명의 상기 및 추가 측면이 이하 보다 상세히 기술될 것이다.

표 1. 다른 마이코박테리아 종의 성장을 90% 저해하는 대표적인 DARQ 화합물(J)의 최소저해농도(MIC)이다. 다른 표시가 없으면, 실험된 균주의 수, n=1이다.

표 2. DARQ J 화합물의 결합 부분 근처의 아미노산,

표 3. 야생형 및 DARQ J 돌연변이 결핵 균주로부터 분리된 DARQ J 화합물 결합 부분 근처의 아미노산에 대한 원자 좌표,

표 4. 야생형 결핵균에서 DARQ J 화합물의 결합 부분에 대한 원자 좌표,

표 5. DARQ J 돌연변이 결핵균에서 DARQ J 화합물의 결합 부분에 대한 원자 좌표,

표 6. 결핵균의 돌연변이 atpE 단백질(서열번호 2)에 대한 원자 좌표,

표 7. 결핵균의 야생형 atpE 단백질(서열번호 1)에 대한 원자 좌표,

도 1. 이하에서, J 또는 DARQ J라고 지칭하는 R207910의 절대입체형상구조,

도 2. 결핵균(M. tuberculosis) 및 치구균(M. smegmatis) 돌연변이의 atpE 단백질 서열을 정렬한 것. Mtb_S : 결핵균 약물-감수성 균주인 H37Rv의 atpE(1-81), 수탁번호: Swiss-Prot Q10598(서열번호 1); Mtb_R : 결핵균 약물-저항성 균주인 BK12의 atpE(1-81), 서열번호 2; Msm_S : 치구균 약물-감수성 균주의 atpE(1-86) 유전자 연구 협회(Institute for Genome research로부터 얻은 아미노산 서열(서열번호 3); Msm_R09(서열번호 4) 및 R10(서열번호 5) : 치구균 약물-저항성 균주의 atpE(1-86), 상기 아미노산 서열은 자체적으로(in-house) 얻음; Human : 호모 사피엔스(homo sapiens)의 ATP5G3(66-142), 수탁번호 : Ensemble ENSP00000284727. 상부의 숫자 : 결핵균과 치구균의 atpE. 하부의 숫자 : 호모 사피엔스의 ATP5G3(66-142). 명암은 BlOSUM62 matrix를 이용하여 측정된 아미노산 상동성을 나타낸다(검은색은 높은 상동성을 갖는 것을 의미하며, 회색은 중간의 상동성을 갖는 것을 의미한다). 화살표는 약물-저항성 균주에서 발견되는 점돌연변이의 위치를 나타낸다.

도 3. DARQ J, 이소니아지드 및 DCCD의 존재하에서, 결핵균 전체 세포의 ATP-측정, 야생형 및 DARQ J 돌연변이 결핵균을 대상으로 526㎚에서 측정된 옥시루시페린의 상대 발광 유니트,

도 4. 리본은 C-서브유닛(A사슬, K사슬, L사슬)과 A-서브유닛(M사슬)을 나타내며, 이는, DARQ J 화합물에 대한 결합 부분을 함께 생성한다.

정의

본 발명에서 사용된 각각의 용어들은 다음과 같은 의미를 갖는다.

"atpE 단백질"은 SwissProt에서 Q10598로 나타낸 결핵균(M.tuberculosis)에 대한 ATPase 복합체의 F₀ 서브유닛의 C 사슬(C chain), 혹은 상기 결핵균 염기 서열과 적어도 70, 80, 90, 95, 97 또는 99%의 상동성을 갖는 단백질을 의미한다.

ATPase(ATPase), ATP 합성효소(ATP synthase) 또는 F₀F₁ATPase(F₀F₁ATPase)라고도 불리는 "F₁F₀ATPase(F₁F₀ATPase)"는 ATP의 합성과 가수 분해를 촉매하는 거대 다중서브유닛 복합체(large multisubunit complex)를 의미한다. F₀F₁ATPase는 F₁과 F₀ 두개의 부분으로 구성되어 있는데, F₁ 부분은 막의 외부에 위치하며, 촉매부위(catalytic site)를 갖고 F₀ 부분은 이중막을 가로질러 존재하며, 양성자 기공(proton pore)을 갖는다. ATPase는 양성자의 전기화학 구배에 의한 에너지를 이용하여 ATP 합성을 유도하는 미토콘드리아의 내막, 엽록체의 틸라코이드 막 및 박테리아의 원형질 막에 존재한다.

"투여(Administering)"는 전달 방식을 나타내는데, 해당 분야의 숙련자에 알려진 다양한 방법의 전달 시스템을 따라 수행할 수 있다. "투여"는 예를 들어, 정맥내(intravenously), 심장막(pericardially), 경구(orally), 이식(via implant), 점막(transmucosally), 경피(transdermally), 근육내(intramuscularly), 피하(via subcutaneously), 수막내(intrathecally), 림프내(intralymphatically), 상처부위내(intralesionally), 또는 상복부(epidurally)를 통하여 수행할 수 있다. 또한, 투여는 예를 들어, 한번, 수회 및/또는 1 이상의 연장된 기간동안 수행할 수 있다.

"숙주세포(Host cells)"는 박테리아 세포(bacterial cells), 효모 세포(yeast cells), 곰팡이 세포(fungal cells), 곤충 세포(insect cells) 그리고 포유동물 세포(mammalian cells)를 포함하지만, 이에 한정된 것은 아니다. 박테리아 세포는 종래에 알려진 인산 칼슘 침전을 이용하는 방법(calcium phosphate precipitation), 전기 천공법(electroporation), 미세주입법(microinjection)을 통하여 형질감염되도록 할 수 있으나, 이에 한정된 것은 아니다.

atpE 단백질에서 사용된 "분리된(Isolated)"이라는 용어는 atpE 단백질이 포함된 막 제제 상태이거나, atpE 단백질이 주위의 다른 단백질들에 간섭받지 않고 원래의 기능을 유지하고 있는 상태인 것을 의미한다. 이는 F₀F₁ATPase(F₀F₁ATPase)의 F₀ 부분을 포함하는 막 제제 상태인 것을 의미하며, 특히 본 발명에 따른 돌연변이 atpE 단백질을 포함하는 F₀ 부분을 포함하는 막 제제 상태인 것을 의미한다.

"박테리아 세포(Bacterial cell)"는 어떠한 종류의 박테리아 세포도 적용이 가능하다. 박테리아 세포는 정상 세포(normal), 비정상 세포(abnormal) 및 형질전환된 세포(transformed)를 포함할 수 있으나, 이에 한정된 것은 아니다. 그 일 예로, 마이코박테리아(mycobacteria)를 들 수 있으며, 더욱 상세하게는 결핵균(Mycobacterium tuberculosis); 치구균(Mycobacterium smegmatis); 코리네박테리아(corynebacteria); 노카르디아(nocardia); 연쇄상구균(streptococcus), 포도상구균(staphylococcus) 및 장구균(enterococcus)과 같은 그람양성 박테리아(gram-positive bacteria); 또는 대장균(Escherichia coli), 헤모필러스 인플루엔자 (Heamophilus influenzae) 및 헬리코박테리아 파일로리(Helicobacter pylori)와 같은 그람 음성 박테리아(gram negative bacteria)를 예로 들 수 있다.

"핵산(nucleic acid)"과 폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"는 본 발명에서 상호호환적으로 사용되며, 각각의 용어는 디옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotides) 및/또는 리보뉴클레오티드(ribonucleotides)의 중합체를 의미한다. 상기 디옥시리보뉴클레오티드 및/또는 상기 리보뉴클레오티드는 자연적으로 생성된 것 또는, 그의 합성 유사체일 수 있다.

"생리적 환경(physiological conditions)"이란 주어진 세포에 대해, 세포의 생화학적 환경을 정상적으로 구성하는 환경을 의미한다. 세포의 생화학적 환경이란, 세포가 통상적으로 노출되는 몇몇 또는 모든 단백질분해효소(protease)를 포함할 수 있으며, 이에 한정된 것은 아니다. 또한, 상기 생리적 환경은 생체내(in vivo) 상태일 수 있으나, 이에 한정된 것은 아니다.

"폴리펩티드(polypeptide)" "펩티드(peptide)" 및 "단백질(protein)"은 본 발명에서 상호호환적으로 사용되며, 상기 각각의 용어는 아미노산 잔기의 중합체(polymer of amino acid residues)를 의미한다. 아미노산 잔기는 자연적으로 생성된 것 또는, 그의 합성 유사체일 수 있다. 폴리펩티드, 펩티드 및 단백질은 또한 글리코실화(glycosylate), 지질 부가(lipid attachment), 황산화(sulfation), 히드록실화(hydroxylation) 그리고 ADP 리보실화(ADP-ribosylation)와 같은 변형(modification)이 된 형태의 것을 포함한다.

"대상(Subject)"은 어떠한 동물도 가능하며, 예를 들어, 포유동물(mammal)이나, 조류(bird), 소(cow), 말(horse), 양(sheep), 돼지(pig), 개(dog), 고양이(cat), 마우스(mouse) 또는 랫(rat)과 같은 설치류(rodent), 칠면조(turkey), 닭(chicken), 영장류(primate)를 포함할 수 있으나, 이에 한정된 것은 아니다. 본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 상기 대상은 인간(human being)이다.

"치료(Treating)"는 대상의 병을 낫게 하거나, 병의 진행 방향을 반전시키거나, 병의 진행 속도를 감소시키거나, 증상을 줄이거나, 그 밖의 다른 개선 사항는 경우를 포함할 수 있으나, 이에 한정된 것은 아니다.

"벡터(Vector)"는 종래에 알려진 어떠한 종류의 벡터를 사용하여도 무방하다. 상기 벡터는 플라스미드 벡터(plasmid vectors), 코스미드 벡터(cosmid vectors) 및 박테리오파지 벡터(bacteriophage vectors)를 포함하나, 이에 한정된 것은 아니다.

"후보물질(Candidate substance)" 및 "시험 화합물(Test compound)"이라는 용어는 본 발명에서 상호호환적으로 사용하며, 일 예로, 생물학적 반응 변형제로서 atpE 단백질과 같이 다른 부분과 반응한다고 믿어지는 물질을 일컫는다. 예를 들어, 대표적인 후보물질은 atpE 단백질과 상호작용하여 ATPase의 활성을 변형시킨다고 믿어지는 물질을 들 수 있다. 본 발명의 방법을 이용하여 조사될 수 있는 바람직한 후보물질로는 펩티드(peptides), 효소(enzymes), 효소 기질(enzyme substrates), 보조인자(co-factors), 당(sugars), 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides), 저분자 화학물질(chemical compounds small molecules) 및 단일클론항체(monoclonal antibodies)를 포함할 수 있지만, 이에 한정된 것은 아니다.

"조절(modulate)"은 정상 혹은 돌연변이 atpE 단백질의 화학적, 생물학적 활성이나 특성의 증가, 감소 혹은 다른 어떠한 변형을 나타낸다.

"상호작용(Interact)"은 분자들 사이에 결합(binding)하려는 상호작용을 포함하여, 분자들 사이에 나타나는 상호 작용을 말한다. 이러한 상호작용은 예를 들어, 실제로 단백질-단백질, 단백질-핵산 사이에 나타날 수 있다. 상기와 같은 상호작용은 예를 들어, 이스트 투-하이브리드 어세이(yeast two-hybrid assay), 면역침전법(immunoprecipitation), 섬광근접접촉법(SPA; scintillation proximity assay) 혹은 필터 결합 어세이(filter binding assays)와 같은 종래에 알려진 방법들을 이용하여 탐지할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "원자 좌표(atomic coordinates)" 또는 "구조 좌표(structure coordinates)"는 단백질 데이터 뱅크(PDB: Protein Data Bank)에서 원자 위치를 묘사하는 수학적인 좌표를 말하며, 여기서, 상기 원자 위치는 원자의 X, Y, Z 및 B축의 위치를 포함한다. 해당 분야의 숙련된 기술자는 결정학에 의해 결정된 구조 좌표의 세트가 표준 에러 없이 존재하지 않는다는 것을 이해한다. 본 발명의 목적을 위하여, 표 3, 4, 5, 6 또는 7의 원자 좌표에 상당하는 비-수소 원자 위치상에 중첩될 때, 비-수소 원자의 제곱 평균 편차가 1.5Å미만인 임의의 소스로부터 ATP 합성효소 구조 좌표의 임의의 세트는 충분히 일치하거나 유사한 것으로 간주된다. 보다 바람직한 구체예에서, 비-수소 원자의 제곱 평균 편차가 0.75Å미만인 임의의 소스로부터 ATP 합성효소용 좌표의 임의의 세트는 표 3, 4, 5, 6 또는 7의 원자 좌표에 상당하는 비-수소 원자 위치상에 중첩될 때, 충분히 일치하거나 유사한 것으로 간주된다.

[발명의 구체예]

돌연변이 atpE 단백질

본 발명은 분리된 돌연변이 atpE 단백질, 보다 자세히는 박테리아 atpE 단백질, 더욱 자세히는 마이코박테리아 atpE 단백질, 더더욱 자세하게는 결핵균(M. tuberculosis) 또는 치구균(M. smegmatis)의 atpE 단백질을 제공한다. 상기 돌연변이는 점돌연변이(single point mutation), 삽입(insertions) 또는 결실(deletions)중에서 선택된다. 본 발명의 일구체예에서, 상기 돌연변이는 20에서 40번 사이에 위치한 아미노산, 보다 자세하게는, 30에서 40번 사이에 위치한 아미노산의 적어도 하나의 지점에서 점돌연변이가 일어났을 때 발생하며, 특히, 34번에 위치한 아미노산에서 점돌연변이가 일어난 경우 발생하며, 본 발명의 일구체예에서, 상기 돌연변이는 60에서 75번 사이에 위치한 아미노산, 보다 자세하게는 62번에서 73번 사이에 위치한 아미노산의 적어도 하나의 지점에서 점돌연변이가 일어났을 때 발생하며, 특히 69번에 위치한 아미노산에서 점돌연변이가 일어난 경우 발생하며, 상기 아미노산 위치 번호는 도 2를 참조한 것이다. 본 발명의 다른 구체예에서 분리된 돌연변이 atpE 단백질은 도 2에 나타낸 Mtb_R(서열번호 2번), Msm_R09(서열번호 4번) 및 Msm_R10(서열번호 5번) 또는 상기 단백질의 아미노산 서열들과 적어도 70, 80, 90, 95, 97 혹은 98%의 상동성을 갖는 아미노산 서열들로부터 선택된다.

본 발명은 또한, 상기 돌연변이 atpE 단백질을 암호화하는 분리된 핵산을 제공한다. 본 발명의 일구체예에 따르면, 예를 들어 저널(J. Biol . Chem, 1994, Vol.269(10),p.7285-7289)에서 언급된 것처럼, 상기 핵산은 F₀ 부분을 암호화하고 있는 모든 유전자들로 구성되며, 상기 저널에서는 본 발명에 따른 돌연변이 atpE 단백질을 암호화하고 있는 유전자들이 하나의 프로모터에 의하여 전사된다고 기재되어 있다. 상기 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있으며, Mtb_R(서열번호 7), Msm_R09(서열번호 9) 및 Msm_R10(서열번호 10)을 암호화하는 핵산 또는, Mtb_R(서열번호 7), Msm_R09(서열번호 9) 및 Msm_R10(서열번호 10)을 암호화하는 핵산 중 어느 하나와 적어도 70, 80, 90, 95, 97 혹은 98%의 상동성을 갖는 핵산으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 DNA인 것이 바람직하다.

핵산 및 폴리펩티드의 상동성 퍼센트는 의문 서열과 기준 서열을 비교할 수 있는 상용화된 알고리즘들을 이용하여 측정할 수 있다. 상동성을 측정하기 위하여 사용할 수 있는 프로그램들(National center for biotechnology information에 의해 제공)로는, BLAST, gapped BLAST, BLASTN 그리고 PSI-BLAST가 있으며, 이것은 디폴트 파라미터와 함께 사용될 수 있다.

알고리즘 GAP (Genetics Computer Group, Madison, WI)은 정합의 수를 최대화하고 차이의 수를 최소화하는 2개의 완전한 서열을 정렬하는 Needleman 및 Wunsch 알고리즘을 사용한다. 일반적으로, 차이 생성 패널티 = 12 및 차이 연장 패널티 = 4를 갖는, 디폴트 파라미터가 사용된다.

핵산 서열이나 그의 일부와 의문 서열 간의 최고의 전체 정합을 결정하기 위한 다른 방법은 Brutlag et al (Comp. App . Biosci., 6; 237-245 (1990))의 알고리즘에 기초한 FASTDB 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있다. 프로그램은 전체적 서열 정렬을 제공한다. 상기 서열 정렬의 결과는 상동성 퍼센트(%)로 나타낸다. 상동성 퍼센트를 계산하기 위한 DNA 서열 혹은 더 짧은 염기 상의 비교 대상 뉴클레오티드의 FASTDB 검색에서 사용되는 적절한 파라미터는: Matrix=Unitary, k-tuple=4, Mismatch penalty=1, Joining Penalty=30, Randomization Group Length=0, Cutoff Score=1, Gap Penalty=5, Gap Size Penalty=0.05, and Window Size=500 또는 뉴클레오티드 염기에서 더 짧은 길이의 의문 서열이다. 아미노산 정렬의 상동성 퍼센트 및 유사성을 계산하기 위한 적절한 파라미터는: Matrix=PAM 150, k-tuple=2, Mismatch penalty=1, Joining Penalty=20, Randomization Group Length=0, Cutoff Score=1, Gap Penalty=5, Gap Size Penalty=0.05, and Window Size=500 또는 뉴클레오티드 염기에서 더 짧은 길이의 의문 서열이다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 핵산(instant nucleic acid)을 포함하는 벡터를 제공한다. 상기 벡터의 일 예로 플라스미드 벡터(plasmid vector)를 들 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 플라스미드 벡터(instant plasmid vector)를 갖는 숙주 세포로 구성된 숙주-벡터 시스템을 제공한다. 상기 세포는 원핵 생물 또는 진핵 생물일 수 있으며, 일 예로, 상기 숙주 세포는 박테리아 세포, 보다 상세히는 결핵균(M. tuberculosis)이나 치구균(M. smegmatis)과 같은 마이코박테리아 세포일 수도 있다.

본 발명은 또한, 세포 내에서 항균제에 저항성을 갖도록 유도하는 돌연변이 atpE 단백질을 포함하는, 분리된(isolated) 세포를 제공한다. 본 발명의 구체예에서, 상기 분리된 세포는 돌연변이 마이코박테리아 atpE 단백질로 형질전환된 치구균 세포일 수 있으며, 상기 돌연변이 마이코박테리아 atpE 단백질은 아미노산 20-40번, 더욱 자세하게는 30-40번, 특히 34번, 60-75번, 더욱 자세하게는 62-73번, 특히 69번의 아미노산에 돌연변이가 발생한 것일 수 있으며, 상기 아미노산 위치 는 도 2에 상당하는 것이다.

스크리닝 방법

본 발명은 또한, 항균 화합물을 찾아내는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음과 같은 단계를 포함한다.

(a) 생리적 환경 하에서 atpE 단백질을 발현하는 세포와 시험 화합물을 접촉

시키는 단계;

(b) 시험 화합물이 atpE 단백질과 상호작용 하는지를 결정하는 단계

본 발명의 구체예에서, 상기 방법에서 사용된 atpE 단백질은 박테리아 atpE 단백질, 더욱 상세하게는 마이코박테리아 단백질로 구성되며, 상기 atpE 단백질은 돌연변이 atpE 단백질 뿐만 아니라 정상 atpE 단백질 모두를 지칭한다. 본 발명의 구체예에서, 상기 방법에서 사용된 마이코박테리아 atpE 단백질은 본 발명에 따른 돌연변이 마이코박테리아 atpE 단백질로 구성된다. 상기 어세이의 구체예에서는, 본 발명에 따른 돌연변이 atpE 단백질로 형질전환된 숙주 세포가 사용되며, 또한, 시험 화합물과 상기 atpE 단백질의 상호작용은 상기 돌연변이 atpE 단백질로 구성된 F₁F₀-ATPase의 효소 활성을 억제하는 정도를 측정함으로써, 알아낼 수 있다. F₁F₀-ATPase 활성의 억제는 종래에 알려진 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 피루브산 키나제(pyruvate kinase)와 젖당 히드로게나아제(lactate hydrogenase) 반응을 통하여 NADH의 산화와 ADP의 생성을 커플링시킴과 동시에, F₁F₀-ATPase로 구성된 시스템에 기질인 ATP를 첨가하고, 효소 활성의 억제도를 측정함으로써 알 수 있다.

상기 어세이의 일구체예에 의하면, 상기 atpE 단백질은 결합 어세이(binding assay)로 측정될 수 있다. 결합 어세이는 경쟁적 또는 비경쟁적으로 수행할 수 있다. 상기와 같은 어세이는 많은 양의 화합물들이 폴리펩티드와 결합할 수 있는지를 신속하게 스크리닝하는데, 적용될 수 있다.

본 발명은 분리된 atpE 단백질과 시험 화합물이 결합하는지 아닌지 확인하고 잠재적인 항균성 조성물을 찾기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 다음과 같은 단계를 포함한다.

(a) atpE 단백질에 결합한다고 알려진 화합물의 존재 및 부재 하에서, 정상적으로 atpE 단백질을 발현하지 않는 atpE 단백질 발현 세포들과 시험 화합물을 접촉시키는 단계;

(b) atpE 단백질에 결합한다고 알려진 화합물을 기준 물질로 이용하여, atpE 단백질에 시험 화합물이 회하는지 결정;

시험 화합물 또는 atpE 단백질과 결합한다고 알려진 화합물(이후 기준 물질이라 명명함)의 결합은 단백질-리간드 상호작용의 연구를 위한 종래의 방법들을 이용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 상기와 같은 결합은 표지된 기질 또는 기준 물질을 이용하여 측정될 수 있다. 상기 시험 화합물 또는 기준 물질 특히, 화합물 J(도 1)는 종래에 알려진 방법, 즉, 방사능 물질, 형광물질 또는 효소를 이용하여 표지할 수 있다. 상기 언급한 방법의 구체예에서, 기준 물질, 즉, atpE 단백질과 결합한다고 알려져 있는 화합물은 식별가능하게 표지된다. 그리고 상기 표지는 시험 화합물이 atpE 단백질과 결합하는지 여부를 알아내는 데 사용된다. 상기 기준 물질은 방사성 표지, 형광성 표지 또는 효소를 이용하여 표지되며, 가장 바람직하게는 방사성 표지된다.

본 발명의 다른 구체예에 의하면, 상기 바인딩 어세이는 세포 조성물 즉, 상기에서 정의된 atpE 단백질로 구성된 세포 추출물, 세포의 일부분, 세포 기관을 대상으로 수행된다. 특히, 상기 결합 어세이는 세포 조성물, 예를 들면, 상기에서 정의된 atpE 단백질로 구성된 막 제제, 이를 테면, 돌연변이 마이코박테리아 atpE 단백질로 형질전환된 치구균으로부터 얻은 막 제제를 대상으로 할 수 있으며, 상기 치구균 형질전환에 사용된 돌연변이 마이코박테리아 atpE 단백질은, 20-40번의 아미노산, 보다 자세하게는, 30-40번, 특히, 34번, 또는, 60-75번, 보다 자세하게는 62-73번, 특히 69번의 아미노산에서 적어도 한번의 점돌연변이가 일어난 것이다. 또한, Mtb_S(서열번호 1번) 또는 Mtb_R(서열번호 2번)에서 상기 아미노산의 위치는 14-34번 위치, 보다 자세히는 24-34번 위치, 특히, 28번 위치, 또는 54-69번 위치, 56-67번 위치, 특히 63번 아미노산 위치를 말한다.

한 구체예에서, 바인딩어세이는 막 제제을 이용하여 수행한다. 이러한 막 제제를 통상의 필터-결합 에세이(예: Brandel 필터 에세이 장치 사용) 또는 고효율 신틸레이션 프록시미티형 결합 에세이(scintillation proximity binding assay)(SPA and Cytostar-T flashplate technology; Amersham Pharmacia Biotech)를 사용하여 방사선-표지된 atpE 리간드(³H로 표지된 DARQs)의 결합 및 결합 부분에 대한 경쟁자에 의해 방사선-리간드의 치환을 검출할 수 있다. 방사능은 96-, 384-, 1536- 마이크로티티르 웰 포맷으로부터 신속하게 측정할 수 있는 Packard Topcount, 또는 유사 기기를 사용하여 측정할 수 있다. SPA/Cytostar-T 기술은 특히 고효율 스크리닝으로 개선시킬 수 있고 따라서 이 기술이 표준 리간드를 치환할 수 있는 화합물에 대한 스크린으로서 사용하기 위해 적절하다.

자연적 상태와 유사한 환경에서 리간드와 atpE 단백질의 결합을 연구하기 위한 또다른 접근법에서 Biacore 장치(Biacore)에서 이용되는 표면 플라스몬 공명효과를 이용한다. 막 제제 또는 전체 세포내 atpE 단백질은 Biacore의 바이오센서 침에 부착될 수 있고, 리간드의 결합을 화합물들의 존재 및 부재하에 조사하여 결합 부분의 경쟁자를 확인할 수 있다.

분자 모델화

본 발명은 또한, 시험 화합물이 atpE 단백질과 상호작용할 잠재성을 측정하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 다음을 포함한다.

(a) 분자 모델링 기술(molecular modeling techniques)을 이용하여 atpE 단백질의 삼차원 구조 생성;

(b) 컴퓨터 수단을 이용하여 시험 화합물과 상기 atpE 단백질의 삼차원 구조의 조정 조작(fitting operation) 수행;

(c) 상기 조정 조작(fitting operation)의 결과를 분석하여 atpE 단백질의 삼차원 구조와 시험 화합물의 회합 정량화;

수용체와 효소 구조 모델 생성 및 이용에 적합한 하드웨어 또는 소프트웨어를 포함하는 분자 모델링 기술은 종래에 알려져 있다. 수많은 컴퓨터 프로그램들은 컴퓨터 모델링, 모델 생성 및 컴퓨터적인 식별의 과정을 통하여 본 발명에서 atpE 단백질과 잠재적으로 상호작용하는 조성물들의 선택 및 측정에 유용하게 이용될 수 있으며, 매우 적합하다. 분자 모델화 연구에 유용할 수 있는 프로그램은 예를 들어, GRID([Oxford University, UK]로부터 이용 가능), MCSS([Accelrys, Inc., San Diego, CA]로부터 이용 가능), AUTODOCK(Oxford Molecular Group으로부터 이용 가능), FLEX X ([Tripos, St. Louis. MO]로부터 이용 가능), DOCK ([University of California, San Francisco, CA]로부터 이용 가능), CAVEAT ([University of California, Berkeley]로부터 이용 가능), HOOK ([Accelrys, Inc., San Diego, CA]로부터 이용 가능)를 포함하며, MACCS-3D ([MDL Information Systems, San Leandro, CA]로부터 이용 가능), UNITY ([Tripos, St. Louis.MO]로부터 이용 가능) 및 CATALYST ([Accelrys, Inc., San Diego, CA]로부터 이용 가능)와 같은 3D 데이타베이스 시스템을 포함한다. 잠재적인 후보 기질은 또한, LUDI ([Biosym Technologies, San Diego, CA]로부터 이용 가능), LEGEND ([Accelrys, Inc, San Diego, CA]로부터 이용 가능) 및 LEAPFROG ([Tripos, St. Louis.MO]로부터 이용 가능)와 같은 소프트웨어 포장재를 이용하여 새롭게 다시 컴퓨터로 설계될 수 있다. 전문 컴퓨터 소프트웨어는 화합물 변형 에너지 및 정전기 상호작용을 평가하는 기술분야에서 입수용이하다. 이러한 용도로 고안된 프로그램의 예로는 Gaussian 92, AMBER, QUANTA/CHARMM 및 Insight II/Discover가 있다. 이러한 컴퓨터 측정 및 모델링 기술은 예컨대 실리콘 그래픽스 워크스테이션(Silicon Graphics workstation), Sun Microsystems 등을 포함한 적합한 하드웨어로 수행이 가능하다. 이러한 모델링 기술, 방법, 하드웨어 및 소프트웨어 포장재가 대표적이지만 일부일 뿐이다. 종래에 알려진 다른 모델링 기술들 또한 본 발명에 적용될 수 있다. 예를 들어, 문헌(N.C. Cohen, Molecular Modeling in Drug Design, Academic Press (1996))을 참고할 수 있다.

본 발명의 구체예에서, atpE 단백질의 삼차원 구조는 대장균의 Ile28, Glu61 및 Ile63의 원자 좌표 +/- 10Å 이하, 특히 5Å이하인 상기 아미노산 골격 원자의 제곱근 평균 편차를 이용하여 알아낼 수 있다.

본 발명의 목적을 달성하기 위한 실시예에서는, atpE 단백질의 삼차원 구조를 제공한다. 표 6 및 7은 식별번호 1 및 식별번호 2에서 제공된 야생형 atpE 단백질 및 돌연변이 atpE 단백질의 원자 좌표를 나타낸다. 이에 따라, 일 구체예에서, atpE 단백질의 삼차원인 구조는 표 6 또는 표 7의 원자 좌표로부터 알아낼 수 있다. 특히, 구체예에서 atpE 단백질의 삼차원 구조는 표 7의 원자 좌표를 이용하여 알아낼 수 있다. DARQ J 화합물은 탈양성자화된 형태에서 C-서브유닛의 Glu⁶¹ 과 A-서브유닛의 Arg¹⁸⁶이 상호작용하는 것을 방해한다. 그러므로 본 발명의 목적은 시험 화합물이 atpE 단백질과 상호작용할 지 잠재성을 확인하기 위한 방법에 있어서, 표 6 또는 표 7의 원자 좌표를 이용하는 방법을 제공하는 것이다.

결합 부분

본 발명의 다른 구체예에 따르면, ATPase의 F₀부분에 위치하는 결합 부분 특성화를 제공한다. 이러한 결합 부분은 DARQ J 화합물과 결합할 수 있는 것으로 확인되었으며, 본 발명에서는 상기와 같은 결합 부분이 결핵균과 치구균의 atpE 단백질에서 저항성-유발 돌연변이 부분으로 여기에서 제공된 부분과 일치하는 것을 발견하였다(17). 이에 따라, 본 발명은, atpE 단백질에서 저항성-유발 돌연변이 부위로 확인되었으며, ATPase의 F₀부분에 위치한 결합 부분을 제공한다. 상기 저항성-유발 돌연변이 부위는 Mtb_S(서열번호 1) 또는 Mtb_R(서열번호 2)의 번호를 참고로, 14-34번 아미노산 위치, 특히 24-34번 아미노산 위치 및 53-69번 아미노산 위치, 특히 56-67번 아미노산 위치이다.

다른 구체예에 따르면, 결합 부분은 표 3, 4 또는 5의 원자 좌표에 상당하는 하나의 C-서브유닛에서 Ala²⁴, Gly²⁷, Phe⁵³, Val⁵⁷, Gly⁵⁸, Glu⁶¹, Tyr⁶⁴ 및 Phe⁶⁵; 그리고, 하나의 A-서브유닛에서 Ser¹⁸², Leu¹⁸³, Leu¹⁸⁵ 및 Arg¹⁸⁶(표 3, 4 및 5에서 Ser 206, Leu 207, Leu 209 및 Arg 210를 코드하는 A-서브유닛); 또는 표 3, 4 또는 5의 원자 좌표에 상당하는 비-수소 원자 위치에 중첩시켰을 때, 1.5Å, 보다 바람직하게는 0.75Å보다 작은 비-수소 원자의 제곱근 평균 편차를 갖는 동족인 구조 좌표를 포함한다. 보다 자세하게 설명하면, 결합 부분은 표 3, 4 또는 5의 원자 좌표를 갖는, 첫번째 C-서브유닛에서 Ala²¹, Gly²⁵; 그리고 두번째 C-서브유닛에서 Ala²⁴, Gly²⁷, Phe⁵³, Phe⁵⁴, Val⁵⁷, Gly⁵⁸, Glu⁶¹, Tyr⁶⁴, Phe⁶⁵; 세번째 C-서브유닛에서 Met¹⁷, Gly¹⁹, Gly²⁰, Ala²¹, Ile²², Gly²³, Ala²⁴, Gly²⁵, Ile²⁶, Gly²⁷, Asp²⁸, Gly²⁹, Ala³¹, Phe⁵³, Thr⁵⁶, Val⁵⁷, Gly⁵⁸, Leu⁵⁹, Val⁶⁰, Glu⁶¹, Ala⁶², Ala⁶³/Pro⁶³, Tyr⁶⁴, Phe⁶⁵; 및 하나의 A-서브유닛에서 Leu¹⁸³, Leu¹⁸⁵ 및 Arg¹⁸⁶; 아미노산에 대한 원자 좌표 또는 표 3, 4 또는 5의 원자 좌표에 상당하는 비-수소 원자 위치에 중첩시켰을 때, 1.5Å, 보다 바람직하게는 0.75Å보다 작은 비-수소 원자 제곱 평균 편차를 갖는 동족인 구조 좌표를 포함한다. 더욱 자세하게, 결합 부분은 표 3, 4 또는 5의 원자 좌표를 갖는, 첫번째 C-서브유닛에서 Ala²¹, Gly²⁵; 그리고 두번째 C-서브유닛에서 Ala²⁴, Gly²⁷, Phe⁵³, Phe⁵⁴, Val⁵⁷, Gly⁵⁸, Glu⁶¹, Tyr⁶⁴, Phe⁶⁵; 세번째 C-서브유닛에서 Met¹⁷, Gly¹⁹, Gly²⁰, Ala²¹, Ile²², Gly²³, Ala²⁴, Gly²⁵, Ile²⁶, Gly²⁷, Asp²⁸, Gly²⁹, Ala³¹, Phe⁵³, Thr⁵⁶, Val⁵⁷, Gly⁵⁸, Leu⁵⁹, Val⁶⁰, Glu⁶¹, Ala⁶², Ala⁶³/Pro⁶³, Tyr⁶⁴, Phe⁶⁵; 및 하나의 A-서브유닛에서 Leu¹⁸³, Leu¹⁸⁵ 및 Arg¹⁸⁶; 아미노산에 대한 원자 좌표를 포함한다. 특히, 결합 부분은 표 3의 원자 좌표에 상당하는, 첫번째 C-서브유닛에서 Ala²¹, GIy²⁵; 그리고 두번째 C-서브유닛에서 Ala²⁴, Gly²⁷, Phe⁵³, Phe⁵⁴, Val⁵⁷, Gly⁵⁸, Glu⁶¹, Tyr⁶⁴, Phe⁶⁵; 세번째 C-서브유닛에서 Met¹⁷, Gly¹⁹, Gly²⁰, Ala²¹, Ile²², Gly²³, Ala²⁴, Gly²⁵, Ile²⁶, Gly²⁷, Asp²⁸, Gly²⁹, Ala³¹, Phe⁵³, Thr⁵⁶, Val⁵⁷, Gly⁵⁸, Leu⁵⁹, Val⁶⁰, Glu⁶¹, Ala⁶², Ala⁶³/Pro⁶³, Tyr⁶⁴, Phe⁶⁵; 및 하나의 A-서브유닛에서 Leu¹⁸³, Leu¹⁸⁵ and Arg¹⁸⁶; 아미노산에 대한 원자 좌표를 포함한다.

이에 따라, 본 발명의 목적은 상기의 원자 좌표를 이용하여 시험 화합물이 atpE 단백질과 상호 작용할 잠재성을 컴퓨터 스크리닝 프로그램들을 이용하여 측정하는 것이다. 본 발명의 한 구체예에서는 시험 화합물이 atpE 단백질과 상호작용할 가능성을 측정하는 방법을 제공하며, 이러한 방법은 다음을 포함한다; - 분자 모델링 기술(molecular modeling techniques)을 이용하여 atpE 단백질의 삼차원 구조 생성; - 컴퓨터 수단을 이용하여 시험 화합물과 상기 atpE 단백질의 삼차원 구조의 조정 조작(fitting operation) 수행; - 상기 조정 조작(fitting operation)의 결과를 분석하여 atpE 단백질의 삼차원 구조와 시험 화합물의 회합 정량화; 다른 구체예에 따르면, 결합 부분의 삼차원 구조는 표 3, 4 또는 5의 원자 좌표, 또는, 표 3, 4 또는 5의 원자 좌표에 상당하는 비-수소 원자 위치에 중첩시켰을 때, 1.5Å, 보다 바람직하게는 0.75Å보다 작은 비-수소 원자 제곱근 평균 편차를 갖는 동족인 구조 좌표를 이용하여 알아낼 수 있다. 구체예에 따르면, 삼차원 구조는 표 3, 4 또는 5의 원자좌표에 상당하는, A 사슬의 Ala²¹, GIy²⁵; K 사슬의 Ala²⁴, Gly²⁷, Phe⁵³, Phe⁵⁴, Val⁵⁷, Gly⁵⁸, Glu⁶¹, Tyr⁶⁴, Phe⁶⁵; L 사슬의 Met¹⁷, Gly¹⁹, Gly²⁰, Ala²¹, Ile²², Gly²³, Ala²⁴, Gly²⁵, Ile²⁶, Gly²⁷, Asp²⁸, Gly²⁹, Ala³¹, Phe⁵³, Thr⁵⁶, Val⁵⁷, Gly⁵⁸, Leu⁵⁹, Val⁶⁰, Glu⁶¹, Ala⁶², Ala⁶³/Pro⁶³, Tyr⁶⁴, Phe⁶⁵; M 사슬의 Ser²⁰⁶, Leu²⁰⁷, Leu²⁰⁷, Arg²¹⁰; 아미노산의 원자 좌표를 이용하여 알아낼 수 있다.

이 스크리닝에서, 결합 부분의 적합성의 질은, 모양 상보성 또는 추정되는 상호작용 에너지에 의해 판단될 수 있다(Meng, E.C. et al., J. Coma. Chem. 13:505-524(1992)).

결합 부분의 용도

본 발명에 따른 atpE에 결합하여 기능적 활성을 증진하거나 저해하는 화합물의 설계는 일반적으로 두가지 인자를 고려하여야 한다. 첫번째, 화합물은 물리적 및 구조적으로 atpE와 연관이 있어야 한다. atpE 단백질과 화합물의 결합에서 비-공유 분자 상호작용, 즉, 수소결합, 반 데르 발스 및 소수성 상호작용은 중요한 역할을 한다. 둘째, 화합물은 형태가 atpE와 결합하는 것을 허용한다는 것을 추정할 수 있어야 한다. 화합물의 특정 부분이 atpE와의 결합에 직접적으로 참여하지 않더라도, 이들 부분은 여전히 분자의 전체 형태에 영향을 준다. 차례로, 이것은 결합 친화도, 치료 효능, 약물-유사 특성 및 잠재성에 중요한 영향을 갖는다. 이러한 형식적인 요구사항은 전체적인 3차원 구조 및 atpE의 활성 부위 또는 다른 영역의 전체 또는 일부에 관한 화학적 실체 또는 화합물의 방향, 또는 atpE 단백질과 직접 상호작용하는 수개의 화학적 실체를 포함하는 화합물의 작용기 사이의 공간을 포함한다.

잠재력있고, 예측되는 저해 작용제, 길항제 또는 리간드 또는 다른 화합물의 atpE에 대한 결합 효과는 이의 실제 합성에 앞서 컴퓨터 모델링 기술의 사용으로 분석되고 시험될 수 있다. 만약, 주어진 화합물의 이론적인 구조가 이것과 atpE사이의 불충분한 상호작용 및 결합을 제시한다면, 화합물의 합성 및 시험은 생략될 수 있다. 그러나, 만약 컴퓨터 모델링에서 강한 상호작용을 나타낸다면, 분자는 그 후, atpE와의 상호작용 능력에 대하여 합성되고 시험 될 수 있다. 이러한 방법으로 효력이 없는 화합물의 합성은 피할 수 있다. 어떤 경우, 비활성 화합물이 모델링에서 예측되어 합성되고, 그 후, 시험되어 atpE의 특이 영역과 상호작용하는 화합물에 대한 SAR(구조-활성 관계)를 개발할 수 있다. 해당 분야의 숙련자는 화학적 실체 단편, 화합물 또는 제제가 atpE, 보다 바람직하게는 각각의 결합주머니 또는 atpE의 활성 부위와 결합하는 능력을 스크린하는 몇몇 방법을 사용할 수 있다. 이 방법은 예를 들면, atpE 또는 리간드와 착물화한 atpE의 원자 좌표에 기반한 활성 부위의 컴퓨터 스크린의 시각적 검사에 의해 시작될 수 있다. 선택된 화학적 실체, 화합물 또는 제제는 그 후, 다양한 방향으로 위치되거나, atpE의 각각의 결합주머니 내에 도킹된다(dock). 도킹은 Quanta 및 Sybyl과 같은 소프트웨어, 이어서 에너지 최소화 및 표준 분자 기계 포스필드(forcefield), 예를 들어 CHARMM 및 AMBER을 사용하여 달성될 수 있다.

특화된 컴퓨터 프로그램도 또한 화학적 실체를 선택하는 방법에서 보조할 수 있다. 이들은 제한없이: GRID(Goodford,P.J., "A Computational Procedure for Determining Energetically Favorable Binding Sites on Biologically Important Macromolecules," J. Med. Chem. 28:849-857(1985), available from Oxford University, Oxford, UK); MCSS(Miranker, A. and M. Karplus, "Functionality Maps of Binding sites: A Multiple Copy Simultaneous Search Method." Proteins: Structure, Function and Genetics 11:29-34(1991), available from Molecular Simulations,Burlington, Mass); AUTODOCK (Goodsell, D.S. and A.J. Olsen, "Automated Docking of Substrates to Proteins by Simulated Annealing" Proteins: Structure. Function, and Genetics 8:195-202(1990), available from Scripps Research Institute, La Jolla, CA); and DOCK (Kuntz, I.D. et al., "A Geometric Approach to Macromolecule-Ligand Interactions," J. Mol. Biol. 161:269-288(1982), available from University of California, San Francisco, CA)을 포함한다.

다양한 작용기 특성을 가진 프루브와 고분자 표면 사이의 가능한 상호작용 부위를 결정하는 프로그램인 GRID와 같은 소프트웨어는 유사한 저해 단백질 또는 화합물의 구조를 결정하는 표면 부위를 분석하도록 사용된다. 분자상의 적절한 저해 그룹(예를 들어, 양자화된 일차 아민)을 프루브로 가진 GRID 계산은, 접근 가능한 적절한 에너지 등고선 레벨에 있는 접근 가능한 위치에서 잠재력 있는 핫스폿(hotspot)을 확인하도록 사용되었다. 프로그램 DOCK는 활성 부위 또는 리간드 결합 부위를 분석하고, 보완적인 입체적 특성을 가진 리간드를 제시하도록 사용될 수 있다.

적절한 화학적 실체, 화합물 또는 제제가 한번 선택되면, 이들은 단일 리간드 또는 화합물 또는 저해제 또는 작동기로 조립될 수 있다. 집합체(assembly)는 단편들의 각각의 3차원 이미지에 대한 관계의 시각적 검사로 진행될 수 있다. 이후, Quanta 또는 Sybyl과 같은 소프트웨어를 사용하여 수동 모델을 형성하였다.

각각의 화학적 실체, 화합물 또는 제제를 연결하는 것을 돕는 유용한 프로그램은 제한없이, 다음과 같은 프로그램을 포함한다.; CAVEAT(Bartlett, P.A. et al., "CAVEAT: A Program to Facilitate the Structure-Derived Design of Biologically Active Molecules." In Molecular Recognition in Special Pub., Royal Chem. Soc., 78, pp. 82-196 (1989)); 3D Database systems such as MACCS-3D(MDL Information Systems, San Leandro, CA and Martin, Y.C., "3D Database Searching in Drug Design", J Med. Chem. 35: 2145-2154(1992); 및 HOOK(available from Molecular Simulations, Burlington, Mass.). 스크리닝을 위해 약물작용발생단 가설을 시험하고 화합물을 선택하기 위해 3차원 데이터베이스를 찾는 몇가지 방법이 가능하다. 이는 프로그램 CAVEAT(Bacon et al., J. Mol. Biol. 225:849-858(1992))을 포함한다. 예를 들어, CAVEAT은 활성 부위에 이미 위치한 화학적 단편이 어떤 갯수라도 연결하는 "스페이서(spacer)"로 활동할 수 있는 고리 화합물의 데이터베이스를 사용한다. 이는 해당 분야의 숙련자가 단단한 결합에 필요하다고 알려지거나 그렇게 생각되는 단편을 연결하는 가능한 수백가지의 방법을 재빨리 생성할 수 있도록 한다.

atpE의 저해제 작동기, 작용제 또는 길항제를 형성하는 것을 상기 기술되었듯이 한번에 하나의 화학적 실체인 단계적 방법으로 진행하는 대신, 이러한 화합물은 빈 활성 부위 또는 알려진 분자의 일부 부분(들)을 임의로 포함하는 전체 또는 "새로(de novo)"로 설계될 수 있다. 이러한 방법은: LUDI(Bohm, H.-J., "The Computer Program LUDI: A New Method for the De Novo Design of Enzyme Inhibitors", J. ComR. Aid. Molec. Design, 6, pp. 61-78(1992), available from iosym Technologies, San Diego, CA); LEGEND(Nishibata, Y. and A. Itai, Tetrahedron 47:8985(1991), available from Molecular Simulations, Burlington, Mass); 및 LeapFrog(available from Tripos Associates, St. Louis, Mo.)을 포함한다. 예를 들어, 프로그램 LUDI는 수소결합 및 소수성 단편 모두를 위치시키는 상호작용 부위의 목록을 결정할 수 있다. LUDI는 그 후, 단편중으로 4개의 다른 상호작용 부위를 접속시키는 연계기(linker)의 목록을 사용한다. 그 후, 더 작은 "브릿징(bridging)" 기, 예를 들어, - CH2- 및 -COO-는 이러한 단편을 연결하는데 사용된다. 예를 들어. 효소 DHFR에 대하여, 잘 알려진 저해제 메토트렉세이트중 중요 작용기의 위치를 LUDI에 의해 재생성하였다. 또한 Rotstein and Murcko, J. Med. Chem. 36: 1700-1710(1992)을 참고한다.

다른 분자 모델링 기술도 또한 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 예를 들어 Cohen, N.C. et al., "Molecular Modeling Software and Methods for Medicinal Chemistry, J. Med. Chem. 33:883-894(1990)을 참고한다. 또한 Navia, M.A. and M.A. Murcko, "The Use of Structural Information in Drug Design," Current Opinions in Structural Biology, 2, pp. 202-210(1992)를 참고한다.

상기 방법에 의해 어떤 화합물이 설계되거나 선택되면, 화합물이 atpE와 결합하거나 관계하는 친화도가 컴퓨터적 평가 및/또는 화합물 합성 후 생물학적 활성에 의해 최적화되어 측정된다. 저해제 또는 화합물은 전체 결합 에너지에서 유사한 하나 이상의 형태로 atpE와 상호작용할 수 있다. 이런 경우, 결합의 분해 에너지는 유리 화합물의 에너지 및 화합물이 atpE에 결합할 때 관찰되는 형성 평균 에너지 사이의 차이로 취해진다.

atpE와 결합 또는 결합하기 위해 설계되거나 선택된 화합물은 이의 경계 상태에서 바람직하게 atpE와의 반발 정전기 상호작용이 부족하게 되도록 추가로 계산적으로 최적화된다. 이러한 비-보완적(예를 들어 정전기적) 상호작용은 반발 전하-전하, 쌍극자-쌍극자 및 전하-쌍극자 상호작용을 포함한다. 특별히, 저해제 및 atpE간의 모든 정전기 상호작용의 합은 저해제가 결합되었을 때, 바람직하게 결합 엔탈피에 대한 중성적 또는 호의적인 기여를 한다. 약한 결합 화합물은 또한 SAR를 결정하기 위해 이들 방법으로 설계되었다. 예를 들어, 미국 출원 제 60/275,629; 60/331,235; 60/379,617; 및 10/097,249을 참고한다. 화합물 분해 에너지 및 정전기 상호작용을 평가할 수 있는 구체적인 컴퓨터 소프트웨어는 해당분야에서 입수할 수 있다. 이러한 방법을 위해 설계된 프로그램의 예는: Gaussian 92, revision C(M.J. Frisch, Gaussian, Inc., Pittsburgh, Pa., COPYRGT 1992); AMBER, version 4.0(P.A. Kollman, University of California at San Francisco, COPYRGT 1994); QUANTA/CHARMM (Molecular Simulations, Inc., Burlington, Mass. COPYRGT 1994); and Insight II/Discover(Biosysm Technologies Inc., San Diego, Calif. COPYRGT 1994)를 포함한다. 기타 하드웨어 시스템 및 소프트웨어 포장재는 해당 분야의 숙련자들에게 공지될 것이다.

atpE와 결합한 화합물이 상기 기술된 바와 같이 최적으로 선택되거나 설계되면, 치환은 그 후 그것의 결합 특성을 증가시키거나 변형하기 위해 그것의 원자 또는 곁그룹중 생성될 수 있다. 일반적으로 초기 치환은 보존적, 즉, 치환기가 원래의 기와 대략 같은 크기, 모양, 소수성 및 전하를 갖는다. 물론 이것은 해당 분야에서 형태를 바꾸기 위해 공지된 성분을 피하기 위한 것임을 이해하여야 한다. 이러한 치환된 화학적 화합물은 그 후, atpE에의 적합성의 효능을 상기 상세히 기술된 동일한 컴퓨터 방법으로 분석한다.

본 발명은 추가로 시스템, 특히 본원에서 기술된 서열 및/또는 구조 좌표를 포함하는 컴퓨터-기반 시스템을 제공한다. 이러한 시스템은 atpE 또는 ATPase F₀부분의 결합 부위를 위한 적합한 약품 설계를 수행하도록 설계되었다. 여기에서 사용된, "컴퓨터-기반 시스템"은 본 발명의 서열 및/또는 구조 좌표를 분석하기 위해 사용되는 하드웨어 수단, 소프트웨어 수단, 및 자료 저장 수단 등 컴퓨터적 수단을 의미한다. 본 발명의 컴퓨터-기반 시스템의 최소한의 하드웨어 수단은 중앙처리단위(CPU), 입력 수단, 출력 수단 및 자료 저장 수단을 포함한다. 숙련자는 본 발명에 적합한 현재 가능한 컴퓨터-기반 시스템을 즉각 인식할 수 있다.

본 발명의 구조 좌표를 포함하는 데이터베이스는 컴퓨터 판독이 가능한 매체상에 기록되었다. 여기에서 사용된 "컴퓨터 판독이 가능한 매체"는 컴퓨터에 의해 읽힐 수 있고 직접적으로 접근이 가능한 임의의 매체를 의미한다. 이러한 매체는, 제한 없이: 자기저장 매체, 예를 들어 플로피디스크, 하드디스크 저장 매체, 및 자기테이프; 광학 저장 매체, 예를 들어 광학디스크 또는 CD-ROM; 전기저장매체, 예를 들어 RAM 및 ROM; 및 이들 범위의 혼성, 예를 들어 자기/광학 저장매체를 포함한다.

치료 방법

상기에서 언급한 바와 같이, 본 발명은 또한, 미생물에 기초한 감염된 대상을 치료하는 방법에서, 상기에서 언급된 스크리닝 방법 중 어느 것을 이용하여 확인된 화합물을 이용하는 것을 목적으로 한다. 일반적으로, 박테리아 병원체는 그람-양성 또는 그람-음성 병원체로 분류될 수 있다. 그람-양성 및 그람-음성 병원체 모두에 대해 활성을 가진 항생제 화합물은 일반적으로 넓은 스펙트럼의 활성을 가진 것으로 간주된다. 본 발명의 화합물은 그람-양성 및/또는 그람-음성 박테리아 병원체에 대해 활성이 있는 것으로 간주된다. 특히, 본 발명의 화합물은 적어도 하나의 그람-양성 박테리아에 대해, 바람직하게는 일부 그람-양성 박테리아에 대해, 더 바람직하게는 하나 이상의 그람-양성 박테리아 및/또는 하나 이상의 그람-음성 박테리아에 대해 활성이 있다.

그람-양성 및 그람-음성 호기성 및 혐기성 박테리아의 일예는 다음을 포함한다: 스타필로콕시, 예를 들어 S. aureus; 엔테로콕시, 예를 들어 E. faecalis; 스트렙토콕시, 예를 들어 S. pneumoniae, S. mutans, S. pyogens; 바실리, 예를 들어 Bacillus subtilis; 리스테리아, 예를 들어 Listeria monocytogenes; 해모필루스,예를 들어 H. influenza; 모락셀라, 예를 들어 M. catarrhalis; 슈도모나스, 예를 들어 Pseudomonas aeruginosa; 및 에스케리치아, 예를 들어 대장균(E. coli )이 있으며, 그람-양성 병원체, 예를 들어 스타필로콕시, 엔테로콕시 및 스트렙토콕시는 예를 들어 일단 성립된 병원 환경으로부터 처리하기 어렵고 근절하기 어려운 저항성 균주 모두의 발현 때문에 특히 중요하다. 이러한 균주의 일예는 메티실린 저항성 Staphylococcus aureus(MRSA), 메티실린 저항성 코아굴라제 음성 스타필로콕시(MRCNS), 페니실린 저항성 Streptococcus pneumoniae 및 복수의 저항성 Enterococcus faecium이다.

본 발명의 화합물은 또한 저항성 박테리아 균주에 대해 활성을 나타낸다.

본 발명의 화합물들은 F₁F₀ ATP합성효소의 적합한 기능에 기초하여 생존하는 박테리아에 대하여 특히 활성을 갖는다. 어떤 이론에 도약없이, 상기와 같은 화합물들은 F₁F₀ ATP 합성효소를 억제하는 활성을 갖는 것으로 사료되며, 상기 F₁F₀ ATP 합성효소의 억제는, 보다 바람직하게는 F₁F₀ ATP 합성효소의 F₀ 복합체의 억제, 특히, F₁F₀ ATP 합성효소의 F₀ 복합체에서 A 서브유닛의 Arg186 및 C 서브유닛의 Glu61로부터 양성자가 전이되는 것을 억제하는 것이다. 상기에서 언급된 스크리닝 방법들에서 선택된 어느 방법을 이용하여 확인된 화합물들은 그람-양성 박테리아, 보다 자세하게는, 마이코박테리아, 특히, M. africanum , M. avium , M. bovis , M. bovis -BCG, M. chelonae , M. fortuitum, M. gordonae , M. intracellular, M. kansasii , M. microti , M. scrofiilaceum, M. paratuberculosis , M. leprea , 결핵균(M. tuberculosis), M. ulcerans 및 M. ranae에 대하여 활성을 갖는다.

화합물이 박테리아를 치료할 수 있다는 사실을 이전에 또는 이후에 사용될 때는 언제나, 화합물이 하나 이상의 박테리아 균주를 치료할 수 있다는 것을 의미한다. 그러나 항균 화합물으로써 DARQ J의 이용과 관련하여 사용되었을 때, 항균은 마이코박테리아를 제외한 하나 또는 그 이상의 박테리아 균주에 의한 감염을 치료할 수 있다는 것을 의미한다.

본 발명의 화합물에 의해 치료될 수 있는 박테리아 감염은 예를 들어 중추신경계 감염, 외이도 감염, 중이도 감염, 이를테면 급성 중이염, 두개동(crainial sinuses) 감염, 눈 감염, 구강 감염, 이를테면 치아, 치주 및 점막 감염, 상호흡기관 감염, 하호흡기관 감염, 비뇨생식기 감염, 위장 감염, 부인성 감염, 패혈증, 골관절 감염, 피부 및 피부 구조 감염, 박테리아성 심내막염, 화상, 수술의 항박테리아 예방, 및 면역억제 환자, 이를테면 암 화학요법을 하는 환자, 또는 기관이식 환자의 항박테리아 예방을 포함한다.

본 발명은 atpE 단백질과 상호작용하는 약제를 대상에 처리함으로써, 결핵에 감염된 대상을 치료할 수 있는 방법을 제공한다.

약학적 조성물

본 발명은 또한, 세포에서 atpE 단백질과 상호작용하는 약제 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 상기 약제는 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와 함께 약제를 포함하는 조성물로 제조될 수 있다. 제제는 생리학적 기능성 유도체 형태, 예로서 에스테르 또는 염, 예로서 산 부가염 또는 염기성 금속 염, 또는 N 또는 S 옥사이드일 수 있다. 조성물은 투여 수단 및 적절한 경로에 따라 제조될 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제는 경구, 직장, 비강, 흡식, 국소(구강 및 설하 포함), 질내 또는 비경구(피하, 근육내, 정맥내, 진피내, 경막내 및 경질막외 포함) 투여에 적절한 제형으로 사용되는 것을 포함한다. 담체 또는 희석제의 선택은 약제 및 그의 치료 목적에 따라 다른 제안된 투여 경로에 따라 달라질 것이다. 제형은 용이하게 단위 투여 형태로 존재할 수 있고 의약 분야에 잘 공지되어 있는 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 방법은 하나 이상의 부속 성분으로 구성된 담체와 활성 성분을 결합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제제는 액상 담체 또는 미세하게 분할된 고체 담체 또는 둘 모두와 함께 균일하고 밀접하게 혼합하여 합성하고, 필요한 경우 제품으로 성형화하여 제조한다.

고형 조성물의 경우, 통상의 비독성 고형 담체는 예로서, 약제학적 등급의 만니톨, 락토오스, 셀룰로오스, 셀룰로오스 유도체, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 활석, 글루코오스, 수크로오스, 마그네슘 카보네이트 등을 사용할 수 있다. 상기 정의된 바와 같은 활성 화합물은 담체로서, 예를 들면 폴리알킬렌 글리콜, 아세틸화된 트리글리세리드 등을 사용하여 좌제로서 제형화될 수 있다. 액상의 약제학적으로 투여가능한 조성물은 예를 들면 상기 정의된 바와 같은 활성 성분 및 임의의 약제학적 애주번트를 담체 예로서, 물, 덱스트로스 염수 용액, 글리세롤, 에탄올 등에 용해, 분산 등을 시켜 액제 또는 현탁제등을 형성시킴으로써 제조할 수 있다. 원하는 경우, 투여하고자 하는 약제학적 조성물은 또한 최소량의 비독성 보조 물질, 예로서 습윤제 또는 유제, pH 완충제 등, 예로서, 소듐 아세테이트, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 소듐 아세테이트, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레이트 등을 포함할 수 있다. 상기 제제를 제조하는 실질적인 방법은 공지되어 있거나, 본 분야의 기술자에게는 자명한 것이다; 예로서, 문헌[Gennaro et al. , Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania,18th Edition, 1990]을 들 수 있다.

투여하고자 하는 조성물 또는 제제는 치료하고자 하는 대상의 증상을 완화시키기에 유효한 양의 충분한 양으로 활성 화합물(들)을 포함할 것이다.

상기 조성물의 투여되는 용량 및 빈도는 공지된 인자, 예컨대, 사용되는 조성물의 종류, 치료 환경, 치료 환경의 심각성, 환자의 연령, 체중, 성별, 영양 상태, 약물 투여 시간 및 일반적인 신체적 조건, 환자가 병행하여 받고있는 다른 치료 뿐만 아니라, 투여 방법에 따라 특정한 치료의 환경에 따라 달라질 수 있다. 아울러, 효율적인 일일 투여량은, 대상의 반응 및/또는 본 발명의 화합물을 처방하는 의사에 따라서, 낮춰지거나 높일 수 있다.

비독성 담체로부터 구성된 0. 25 내지 95% 범위의 밸런스로 활성 성분을 포함하는 제제 또는 조성물을 제조할 수 있다. 투여 모드에 따라 상기 약학적 조성물은, 0.05-99%의 약학적 조성물, 보다 바람직하게는 0.1-70% 및 1-99.95%, 특히 30-99.9%의 약학적 허용가능한 담체로 구성될 수 있다. 여기서, 상기 퍼센트 수치는 전체 조성물에 기초한 것이다.

경구 투여용으로 약제학적으로 허용가능한 비독성 조성물은 일반적으로 상용된 부형제, 예로서, 약제학적 등급의 만닛톨, 락토오스, 셀룰로오스, 셀룰로오스 유도체, 소듐 크로스카멜로오스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 활석, 글루코오스, 수크로오스, 마그네슘, 카보네이트 등을 혼입하여 제조한다. 상기 조성물은 액제, 현탁제, 정제, 환제, 캡슐제, 분제, 지효성 제제 등의 형태를 취한다. 상기 조성물은 1%-95%의 활성 성분, 더욱 바람직하게 2-50%, 가장 바람직하제 5-8%를 포함할 수 있다.

비경구 투여는 통상 피하, 근육내 또는 정맥내에 의해 것으로 특징화된다. 주사제는 통상의 제형으로, 액상 액제 또는 현탁제, 주사전 액상의 액제 또는 현탁제로서 적절한 고형 형태, 또는 유제로서 제조될 수 있다. 적절할 부형제는 예로서, 물, 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등이다. 또한, 바람직한 경우, 투여하고자 하는 약제학적 조성물은 또한 최소량의 비독성 보조 물질, 예로서 습윤제 또는 유제, pH 완충제 등, 예로서, 소듐 아세테이트, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 소듐 아세테이트 등을 포함할 수 있다.

상기 비경구 조성물 중 포함된 활성 화합물의 퍼센트는 그의 특정 성질, 및 화합물의 활성 및 대상자의 필요에 따라 고도로 달라질 수 있다. 그러나, 액제 중 0.1% 내지 10%의 화합물이 사용될 수 있고, 조성물은 고형이 이후 상기 퍼센트로 희석되는 고형인 경우, 그보다 높을 것이다. 바람직하게, 조성물은 액제중 0.2-2%의 활성제를 포함할 것이다.

마지막으로, 본 발명은 포장재 및 약제를 포함하는 제품을 제공하는 데,

(a) 상기 약제는 세포에서 atpE 단백질과 상호작용하는 것이고,

(b) 상기 포장재는 대상에서 박테리아 감염을 치료하기 위한 약제의 사용에 대해 설명하는 표지를 포함한다. 특히, 항마이코박테리아 제제에서 사용된다.

본 명세서에서 용어 "표준 방법", "표준 프로토콜" 및 "표준 공정"이 분자 생물학 기술과 관련하여 사용될 때 일반 실험실 매뉴얼, 예로서, [Current Protocol in Molecular Biology, editors F. Ausubel et al. , John Wiley and Sons, Inc.1994, or Sambrook, J.,Fritsch, E. F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A laboratory manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 1989]의 프로토콜 및 공정으로서 이해될 것이다.

본 발명은 하기 실험 설명을 참고로 하여 더욱 이해될 것이며, 본 분야의 기술자는 하기 청구범위에서 더욱 전체적으로 기술된 바, 이는 단지 본 발명의 일례라는 것을 이해할 것이다. 추가로, 본 명세서에서 다양한 공개문헌을 인용하다. 공개문헌은 본 발명이 포함하는 본 분야의 상태를 더욱 전체적으로 설명하기 위하여 본 명세서에 참고문헌으로서 인용된다.

[실험예]

본 발명자들은 치구균을 이용하여 실험상에서(in vitro) 몇몇 마이코박테리아에 대응하는 활성을 잠재적으로 갖는 DARQ들 시리즈를 발견하였다.(11) 지금까지, 결핵균, H37Rv에 대하여 0.5㎍/㎖보다 낮은 최소억제농도(MIC)를 갖는 20개 분자의 DARQ 시리즈가 있는 것으로 알려져 있으며, 이들 중 3개는 그 항마이코박테리아 활성을 마우스 모델의 생체내(in vivo)상에서 확인하였다.

구조적으로 및 기계적으로, DARQ들은 플루오로퀴놀론(메톡시퀴놀론을 포함); 및 메플로퀸 및 그 유사체인 4-메틸퀴놀린 및 4-퀴놀릴히드라존를 포함하는 다른 퀴놀린 계; 둘 모두와 매우 다르다(12-16). DARQ들과 다른 퀴놀론 또는 퀴놀린 계 사이의 주요한 구조적 차이점 중 하나는 DARQ 계의 기능화된 (3') 말단 잔기의 특이성에 있다. 덧붙여, 기존의 화학 물질에 대하여 마이코박테리아 교차-내성의 결함을 갖는 것은 다른 기작이 있음을 지시하는 것이다.

이하, J 또는 DARQ J라고 지칭되는 DARQ의 주요한 화합물은 실험상에서 독특하고 유력한 스펙트럼 및 선택적인 항마이코박테리아 활성을 갖는 것으로 알려져 있다.(표 1) 실험실 균주 H37Rv 및 여섯개의 감수성 분리균주에서 측정된 중간 MIC의 수치는 리팜핀 1.00㎍/㎖에 대하여, 0.060㎍/㎖인 것으로 나타났다. J는 1차 결핵균(TB) 약제인 리팜핀, 스트렙토마이신, 에탐부톨 및 피라지나마이드; 그리고 2차 결핵균(TB) 약제인 목시플록사신과 실험상에서 유사한 효능을 나타낸다. 이소니아지드에 대하여 저항성을 갖는 8개의 임상적 분리체의 중간 MIC 수치는 0.010㎍/㎖인 것으로 나타났다. 상용화되고 있는 항-결핵균 제제에 대한 교차-내성의 결함은, J가 MDR-TB 균주에 대하여 활성을 보유하고 있을 가능성을 제안한다. 실제로, BACTEC^TM 배양 시스템에서, MDR-TB 균주가 고정된 농도의 J에 노출되었을 때, 박테리아 성장의 명확한 농도-의존적 억제가 관찰된다. MDR-TB의 30개의 분리체 중 13개(43%)에서, 0.100㎍/㎖ 농도의 J에 대한 감수성을 갖는 것으로 나타났으며, 17개(57%)에서 0.010㎍/㎖ 농도의 J에 감수성을 갖는 것으로 나타났다. BACTEC^TM 시스템을 이용하여 시험된 약-저항성 균주들 10개 중 오직 1개의 균주만이 높은 감수성(0.010㎍/㎖ 미만의 MIC)를 갖는 것으로 나타났으며, 한편 모든 균주들은 0.100㎍/㎖ 농도의 J에 대하여 감수성을 갖는 것으로 나타났다.

또한, 다른 마이코박테리아 종들, 예를 들면, 자연적으로 다른 많은 항결핵균제에 대하여 저항성을 갖고 있는 종들과 Mycobacterium avium complex (MAC), Mycobacterium abcessus , Mycobacterium fortuitum 및 Mycobacterium marinum과 같은 균들에 대한 기회 감염뿐만 아니라, Mycobacterium bovis 및 Mycobacterium kansasii를 포함하는 마이코박테리아 종들에 대하여 강력한 활성을 갖는 것으로 나타났다(표 1).

놀랍게도, J의 활성은 마이코박테리아에 특이성을 갖는 것으로 보여진다. J는 코리네박테리움(MIC 4.00㎍/㎖) 및 노카디아(MIC > 4.00㎍/㎖)와 같은 마이코박테리아와 유사한 종들에 대하여 거의 활성을 갖지 않으며, 그람 양성 Streptococcus pneumoniae , Staphylococcus aureus - 메티실린 내성 균주들(MIC>32㎍/㎖) 포함 - 그리고 Enterococcus faecalis 또는 그람 음성 Escherichia coli, Haemophilus influenzae 및 Helicobacter pylori.를 포함한, 다른 종들에 대하여는 활성을 갖지 않는 것으로 나타난다. 로그 상에 있는 결핵균을 MIC의 100배 농도로 처리하고 12일 경과하면, 박테리아 수가 10³만큼 로그 감소하는 것으로 나타났으며, 이는 J가 실험상에서 살균 활성을 갖고 있음을 말한다. 정지 상의 결핵균에서 J의 효과는 아직 알려지지 않았다.

돌연변이의 분리, 교차-내성 및 약의 타겟 가정

마이코박테리아의 저항성을 연구하여, 약의 타겟을 명확하게 하고, 작용 기작을 제안하는 것을 목적으로 삼았다. 결핵균과 치구균의 저항성 돌연변이들은 J의 억제 농도에서 실험상의 선택에 의해 얻었으며, 이는,

-마이코박테리아에서 저항성 돌연변이들의 비율을 정량화하고(대조군으로서 리팜핀),

-저항성 돌연변이(퀴놀론에 대한 교차-/비교차- 저항성을 포함)의 저항성 패턴을 측정하고,

-기작을 알아내기 위함이다.

선택 실험에서, 결핵균 및 치구균 각각에서 J에 대한 감소된 감수성을 갖는 돌연변이 비율은 각각 MIC x 4에서, 5x10^-7 및 2x10^-8, MIC x 8에서 5x10^-8 및 1x10^-8으로 나타났다.(온라인 텍스트 참고) 결핵균의 경우, 상기와 같은 비율은 리팜핀(10^{- 7} 에서 10^-8)에 저항성을 갖는 돌연변이의 비율과 비교할 만하며, 이는 J에 대한 저항성이 자연적으로 발생하는 일이 매우 드문 것이라는 것을 나타낸다. 덧붙여 설명하면, J에 대한 저항성을 갖는 결핵균은, 항결핵균제인 이소니아지드, 리팜핀, 스트렙토마이신, 아미카신, 에탄부톨 및 목시플록사신 등에 대한 저항성이 바뀌지 않고 남아있다. J에 대한 감소된 감수성을 갖는 결핵균 및 치구균 돌연변이의 분석은 DNA 돌연변이가 없음을 보여준다.

J에 대한 감소된 감수성을 갖는 결핵균 및 치구균 돌연변이에 대한 분석을 수행한 결과, 전형적으로 퀴놀론 저항성이 발달하는 염기 서열이며 DNA 자이레이스 부분인 gyrA 및 gyrB에 돌연변이가 발생하지 않은 것으로 나타났다. 이로써, J의 분자적 타겟과, 플루오로퀴놀론의 분자적 타겟이 다른 것을 알 수 있다.

J의 분자 타겟을 결정하고, 반응을 추측하는 연구는 결핵균과 치구균의 감수성 및 저항성 균주에서 저항성을 유발하는 돌연변이들을 확인하고 비교 및 대조하는 것이다. 저항성 결핵균주인 BK12 및 치구균의 모균주 뿐만 아니라 2개의 저항성 치구균주인 R09 및 R10의 유전자의 염기 서열은 거의 밝혀져 있다. 우리는 결핵균과 치구균의 감수성 및 저항성 균주의 유전자 염기 서열을 비교 분석함으로써, 저항성을 유발하는 돌연변이들을 확인하였다(도 2). 우리는 세개의 독립적인 돌연변이 모두에 영향을 미치는 유일한 유전자를 보여주며, 상기 돌연변이는 ATP 합성효소 F₀ 서브유닛의 한 부분인 atpE를 암호화하는 야생형 유전자에 대응된다. 상기와 같은 사실들로부터, atpE는 돌연변이 균주에서 J에 대한 저항성을 갖도록 하며, J는 새로운 결핵균 타겟 즉, ATP 합성효소의 양성자 펌프를 저해하는 것을 알 수 있다.

상보성 연구는 마이코박테리아에서 atpE 유전자 산물이 J의 타겟이 된다는 사실로부터 직접적인 추론을 하여, 돌연변이 atpE 유전자가 J에 대한 저항성을 유발한다는 것을 보여준다. ATP 합성효소 오페론의 모든 유전자는 유기적 방법으로 발현되어야 한다는 사실, 예를 들면, F₀부분을 암호화하는 모든 유전자들이 같은 위치에서 발현되어야 한다는 것과 같은 사실을 제공하기 위하여, 우리는 치구균의 저항성 균주(D32V) 오페론의 F₀부분을 증폭시키고, PCR 과정을 통하여 추가적인 돌연변이가 발생하지 않은 클론들을 선택하였다. 야생형 치구균은 선택된 돌연변이 F₀단편을 포함하는 플라스미드로 형질전환되었다. 이것은 세포들이 저항성 치구균 균주인 R09(D32V) MIC와 일치하는 농도의 J에 대하여 저항성을 갖게 한다. 더욱이, 플라스미드가 이러한 형질전환체들로부터 다시 분리되고, atpE 유전자의 염기서열을 분석하면, 돌연변이 대립 유전자(D32V)가 남아있는 것으로 보인다.

결핵균에서 ATP 생산에 DARQ J이 미치는 실제적인 영향은 J가 마이코박테리아의 세포에 존재하는 ATP에 미치는 영향을 측정함으로써 알 수 있으며, 이는 로크사의 ATP 바이오루미네슨스 루시퍼레이즈 어세이 키트 HS Ⅱ를 이용하여 측정할 수있다. 이러한 어세이는 ATP에 의해 D-루시페린이 옥시루시페린으로 전환되는 것에 근거를 두어 측정되며, 이는, 526㎚에서 측정될 수 있다.

간단하게 설명하면, 전체 ATP에 대한 DARQ J의 영향은 야생형 및 돌연변이형 결핵균 균주에서 시험되었다. ATP 합성효소의 저해제라고 알려진 DCCD는 양성 대조군으로 이용되었고, 특정 세포 벽 조성물의 생합성을 저해하며, ATP 합성에 관여하지 않는 이소니아지드는 음성 대조군으로 이용되었다.

도 3을 참조하면, 야생형 결핵균을 DARQ J로 처리하면, 투여량에 따라 이러한 박테리아에서 ATP 생산이 감소되는 것을 알 수 있다. 반면에, 이소니아지드는 ATP 생산에 아무런 영향이 없다. 상기에서 언급한 바와 같이, 이러한 박테리아를 높은 농도의 DARQ J에 노출시키면, 결핵균의 디아릴퀴놀린에 대한 저항성 돌연변이가 유발된다. 이러한 저항성 결핵균을 DARQ J로 치료할 때, 이러한 박테리아는 이러한 화합물의 최소억제농도(MIC)의 100배의 농도로 처리하여도, 그 ATP 생산이 감소되지 않는다. 반면, DCCD는 이러한 균주에서 ATP 생산을 저해할 수 있는 것으로 보아, DARQ J와 DCCD는 다른 결합 포켓(pocket)을 갖는 것으로 추정된다.

DARQ J 결합 부위의 컴퓨터 모델링 및 확인

DCC 및 DARQ J의 다른 모드를 연구하기 위하여, 컴퓨터를 이용하여 야생형 및 DARQ J 돌연변이형 결핵균의 ATP 합성효소 3D 모델을 생성하였다. 표 4 및 5에 제공된 원자 좌표는 공고된 아미노산 서열 P63691 및 AJ865377의 3D 구조의 모델 준비에 의하여 산출되었다. 실제적인 DARQ J 결합 부위는 A 및 C 서브유닛의 접촉 부위, 더욱 자세하게는, 표 3, 4 또는 5를 참조하여, A 서브유닛의 'Arg 210' 및 C 서브유닛의 'Glu 61'에 위치하는 것이 발견되었다. 이는 상기에서 언급된 결핵균 및 치구균의 감수성 및 저항성 균주에서 저항성-유발 돌연변이의 스크리닝에서 관찰된 결과와 일치한다.

이러한 모델은 ATPase 구조의 A- 및 C 나선의 관계적인 위치 적합도 및 아미노산 골격(back-bone)과 곁사슬의 내부적인 긴장을 최소화하는 방향으로 결정된 위치에 근거를 둔다. 상기와 같은 기하학은 수많은 분자 역학 시뮬레이션 사이클 및 다른 유기체에서 공지된 일반적인 사슬 기하학으로부터 출발하는 분자의 역학적 완화에 의하여 얻는다[E- Coli PDB entry code 1C17 - V.K. Rastogi and M.E. Girvin, Nature, 402, 263-268 (1999)]. 분자 역학 및 기하학적 완화는 둘다 MMFF94s [Halgren, T.A. (1996), J. Comput. Chem., 17, 490-519]에 근거를 둔 역장 파라미터화로 수행되나, 종래 분자 역학 소프트웨어의 어떠한 형태[Berendsen, H.J.C., van der Spoel, D. and van Drunen, R., Comp. Phys. Comm. 91 (1995), 43-56; Lindahl, E., Hess, B. and van der Spoel, D., J. MoI. Mod. 7 (2001) 306-317.] 로도 수행될 수 있으며, 적절한 기하학적 적합도[J. W. Ponder and F. M. Richards, J. Comput. Chem., 8, 1016-1024 (1987).]로도 수행될 수 있다.

표 3, 4 및 5에서 산출된 좌표는 이러한 효소들에서 MTB ATPase 활성을 억제하는 것으로 판단되는 부분(30 옹스트롬 반지름 부피)이라 예상된 구조의 부분으로 구성되며, 이는 제안된 억제 모드와 생물학적 어세이에서 점돌연변이에 의해 유발되는 저항성을 토대로 예상할 수 있다.

검토

DARQ J는 기준 물질의 MIC보다 낮거나 비슷한 항결핵제의 새로운 화학적 집단의 구성원이다. 그것은 인간에게 중요한 비전형적인 종들; MAC, M. kansasii, M. fortuitum 및 M. abscessus의 신속성장균을 포함하는 마이코박테리아에 대한 특이성에서 독특한 스펙트럼을 갖는다. 이러한 항-마이코박테리아-특이적 스펙트럼은 MAC에 대하여 활성이 없는 이소니아지드의 스펙트럼과 다르다. J의 임상학적 이용은 결핵균과 마이코박테리아 감염의 치료에 높은 특이성을 갖는다. J가 마이코박테리아가 아닌 균을 억제하지 못하는 것은 넓은 스펙트럼을 갖는 항생제와 비교하였을 때, 다른 박테리아 종들에 저항성을 유발할 위험이 낮고, 선택의 압력을 받지 않는 것으로 해석된다(9).

J의 타겟과 기작은 다른 항결핵균제의 그것과 다르다. 다른 박테리아와 진핵생물의 ATP합성효소, 특히 ATPase의 F₀서브유닛의 C사슬의 염기서열의 비교는, 야생형과 돌연변이 결핵균의 ATP합성효소의 3D 모델링과 함께 항박테리아 스펙트럼의 특이성보다 낮은 범위, 안전한 프로필을 위한 이론적 근거를 제공한다.

마이코박테리움 ATPase에 대하여 수행되는 역학적 연구는 A와 C서브유닛의 접촉부위(A서브유닛의 'Arg210'아미노산, C서브유닛의 'Glu61'근처)에 구멍(표 3의 원자 좌표에 상당하는 결합부위)가 존재함을 보여준다. 표 4 및 5는 이 부위 근처의 원자들의 다양성 및 그들의 평균 위치를 연구한 두개의 좌표를 제공한다. DARQ J 저해제는 상호작용하는 두개의 아미노산을 방해함으로써, 이 두개의 아미노산을 포함하는 정상적인 양성자 전이 단계를 방해할 수 있다. DARQ J의 입체 특이성은 예상된 결합부위의 불균형으로부터 이해될 수 있다.; 활성을 갖는 키랄 거울상 이성질체는 이 구멍을 수용하며, 다른 폼의 화합물과 ATPase의 변형체는 잘 매치되지 않는다.

여기서 제공된 결합 부위는 DCCD(DARQ는 효소의 막부분에 위치하며, DCCD의 결합은 세포내에서 90 옹스트롱 떨어진 곳에서 발생한다; C.Gibbons, M.G.Montgomery, A.G.W. Leslie, J.E. Walker, Nat.Struct.Biol.,7,1055 (2000)에서 공지된 Bovine ATPase crystal인 "1E79"의 PDB 구조에 근거함)와 비교하여 ATPase 시스템의 전체적으로 다른 부분에 있다. 게다가, 다제내성결핵균 ATPase의 DCCD 타입 억제에 속하는 원자들은 결합부위(효소의 막 부분을 가로질러 존재)의 좌표 표에 리스트된 부분에 존재하지 않고, 상호적으로, 효소의 이러한 부분은 공지된 "1E79"구조(세포내측부위를 보여줌)에서 나타나지 않는 DARQ J의 억제모드 부분에 속한다. 결합부위의 이러한 차이는 실험상의 ATP 생성 어세이에서 관찰되는 결핵균의 다른 반응을 설명해준다.

상기와 같은 사실에도 불구하고, 미토콘드리아의 ATPase DCCD에 대한 연구는 효소의 F₀부분의 지방친화성 환경에서 산성 아미노산 근처에 위치한 다른 결합 부위 는 제안한다.(Sebald W, Machleidt W, Wachter E., Proc Natl Acad Sci U S A. 1980 Feb;77(2):785-789.) 이러한 미토콘드리아의 ATPase 결합 부위는 마이코박테리움 종 결합 부분의 유사체로 판단될 수 있다.

이와 동시에, 새로운 기작을 타겟으로 삼는 것은 저항성 돌연변이 결핵균주가 J에 교차-저항을 갖고 효과적인 치료를 수행하는 것이 가능하도록 한다. 실험상의 연구에서 J는 적어도 결핵균의 다제내성 분리체에 대하여, 심지어, 넓은 4-약 저항성을 갖는 결핵균의 다제내성 분리체, 정상적인 야생형 범-감수성을 갖는 결핵균 균주에 대하여 높은 항균 효과를 갖는다. 존재하는 항-결핵균 약제에 교차-내성이 없음을 명확히 하는 이러한 관찰은 매우 중요하다. ATPase의 막 부분에서 결합 포켓을 규명하는 이러한 연구 결과는 새로운 항-박테리아 화합물, 특히, 이러한 개체들에서 ATP 합성을 타겟으로 삼는 항-마이코박테리아 화합물의 발전이 가능하도록 한다.

[참조 문헌]

SEQUENCE LISTING <110> Janssen Pharmaceutica N.V. <120> Mutant atpE proteins <130> PRD2323p <150> EP 04104720.0 <151> 2004-09-28 <150> US 60/620500 <151> 2004-10-20 <160> 12 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 81 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 1 Met Asp Pro Thr Ile Ala Ala Gly Ala Leu Ile Gly Gly Gly Leu Ile 1 5 10 15 Met Ala Gly Gly Ala Ile Gly Ala Gly Ile Gly Asp Gly Val Ala Gly 20 25 30 Asn Ala Leu Ile Ser Gly Val Ala Arg Gln Pro Glu Ala Gln Gly Arg 35 40 45 Leu Phe Thr Pro Phe Phe Ile Thr Val Gly Leu Val Glu Ala Ala Tyr 50 55 60 Phe Ile Asn Leu Ala Phe Met Ala Leu Phe Val Phe Ala Thr Pro Val 65 70 75 80 Lys <210> 2 <211> 81 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 2 Met Asp Pro Thr Ile Ala Ala Gly Ala Leu Ile Gly Gly Gly Leu Ile 1 5 10 15 Met Ala Gly Gly Ala Ile Gly Ala Gly Ile Gly Asp Gly Val Ala Gly 20 25 30 Asn Ala Leu Ile Ser Gly Val Ala Arg Gln Pro Glu Ala Gln Gly Arg 35 40 45 Leu Phe Thr Pro Phe Phe Ile Thr Val Gly Leu Val Glu Ala Pro Tyr 50 55 60 Phe Ile Asn Leu Ala Phe Met Ala Leu Phe Val Phe Ala Thr Pro Val 65 70 75 80 Lys <210> 3 <211> 86 <212> PRT <213> Mycobacterium smegmatis <400> 3 Met Asp Leu Asp Pro Asn Ala Ile Ile Thr Ala Gly Ala Leu Ile Gly 1 5 10 15 Gly Gly Leu Ile Met Gly Gly Gly Ala Ile Gly Ala Gly Ile Gly Asp 20 25 30 Gly Ile Ala Gly Asn Ala Leu Ile Ser Gly Ile Ala Arg Gln Pro Glu 35 40 45 Ala Gln Gly Arg Leu Phe Thr Pro Phe Phe Ile Thr Val Gly Leu Val 50 55 60 Glu Ala Ala Tyr Phe Ile Asn Leu Ala Phe Met Ala Leu Phe Val Phe 65 70 75 80 Ala Thr Pro Gly Leu Gln 85 <210> 4 <211> 86 <212> PRT <213> Mycobacterium smegmatis <400> 4 Met Asp Leu Asp Pro Asn Ala Ile Ile Thr Ala Gly Ala Leu Ile Gly 1 5 10 15 Gly Gly Leu Ile Met Gly Gly Gly Ala Ile Gly Ala Gly Ile Gly Val 20 25 30 Gly Ile Ala Gly Asn Ala Leu Ile Ser Gly Ile Ala Arg Gln Pro Glu 35 40 45 Ala Gln Gly Arg Leu Phe Thr Pro Phe Phe Ile Thr Val Gly Leu Val 50 55 60 Glu Ala Ala Tyr Phe Ile Asn Leu Ala Phe Met Ala Leu Phe Val Phe 65 70 75 80 Ala Thr Pro Gly Leu Gln 85 <210> 5 <211> 86 <212> PRT <213> Mycobacterium smegmatis <400> 5 Met Asp Leu Asp Pro Asn Ala Ile Ile Thr Ala Gly Ala Leu Ile Gly 1 5 10 15 Gly Gly Leu Ile Met Gly Gly Gly Ala Ile Gly Ala Gly Ile Gly Val 20 25 30 Gly Ile Ala Gly Asn Ala Leu Ile Ser Gly Ile Ala Arg Gln Pro Glu 35 40 45 Ala Gln Gly Arg Leu Phe Thr Pro Phe Phe Ile Thr Val Gly Leu Val 50 55 60 Glu Ala Ala Tyr Phe Ile Asn Leu Ala Phe Met Ala Leu Phe Val Phe 65 70 75 80 Ala Thr Pro Gly Leu Gln 85 <210> 6 <211> 246 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 6 atggacccca ctatcgctgc cggcgccctc atcggcggtg gactgatcat ggccggtggc 60 gccatcggcg ccggtatcgg tgacggtgtc gccggtaacg cgcttatctc cggtgtcgcc 120 cggcaacccg aggcgcaagg gcggctgttc acaccgttct tcatcaccgt cggtttggtt 180 gaggcggcat acttcatcaa cctggcgttt atggcgctgt tcgtcttcgc tacacccgtc 240 aagtaa 246 <210> 7 <211> 246 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 7 atggacccca ctatcgctgc cggcgccctc atcggcggtg gactgatcat ggccggtggc 60 gccatcggcg ccggtatcgg tgacggtgtc gccggtaacg cgcttatctc cggtgtcgcc 120 cggcaacccg aggcgcaagg gcggctgttc acaccgttct tcatcaccgt cggtttggtt 180 gaggcgccat acttcatcaa cctggcgttt atggcgctgt tcgtcttcgc tacacccgtc 240 aagtaa 246 <210> 8 <211> 261 <212> DNA <213> Mycobacterium smegmatis <400> 8 atggatctcg atcccaacgc catcatcacg gccggcgccc tgatcggcgg tggattgatc 60 atgggtggcg gcgccatcgg tgccggtatc ggcgacggta tcgcgggtaa cgcgctgatc 120 tcgggtatcg cccgtcagcc cgaggcccag ggccggctgt tcaccccgtt cttcatcacc 180 gtcggtctgg tggaagccgc gtacttcatc aacctggcct tcatggcgct gttcgtcttc 240 gccactcctg gccttcagta a 261 <210> 9 <211> 261 <212> DNA <213> Mycobacterium smegmatis <400> 9 atggatctcg atcccaacgc catcatcacg gccggcgccc tgatcggcgg tggattgatc 60 atgggtggcg gcgccatcgg tgccggtatc ggcgtcggta tcgcgggtaa cgcgctgatc 120 tcgggtatcg cccgtcagcc cgaggcccag ggccggctgt tcaccccgtt cttcatcacc 180 gtcggtctgg tggaagccgc gtacttcatc aacctggcct tcatggcgct gttcgtcttc 240 gccactcctg gccttcagta a 261 <210> 10 <211> 261 <212> DNA <213> Mycobacterium smegmatis <400> 10 atggatctcg atcccaacgc catcatcacg gccggcgccc tgatcggcgg tggattgatc 60 atgggtggcg gcgccatcgg tgccggtatc ggcgtcggta tcgcgggtaa cgcgctgatc 120 tcgggtatcg cccgtcagcc cgaggcccag ggccggctgt tcaccccgtt cttcatcacc 180 gtcggtctgg tggaagccgc gtacttcatc aacctggcct tcatggcgct gttcgtcttc 240 gccactcctg gccttcagta a 261 <210> 11 <211> 753 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 11 atgactgaga ccatcctggc cgcccaaatc gaggtcggcg agcaccacac ggccacctgg 60 ctcggtatga cggtcaacac cgacaccgtg ttgtcgacgg cgatcgccgg gttgatcgtg 120 atcgcgttgg ccttttacct gcgcgccaaa gtgacttcga cggatgtgcc aggcggggtg 180 cagttgtttt ttgaggcgat caccattcag atgcgcaatc aggtcgaaag cgccatcggg 240 atgcggatcg cacccttcgt gctgccgctg gcggtgacca tcttcgtgtt catcctgatc 300 tccaactggc tggcagtcct cccggtgcag tacaccgata aacacgggca caccaccgag 360 ttgctcaaat cggcagcagc ggacatcaat tacgtgctgg cgctggcgct tttcgtgttc 420 gtctgctacc acacggccgg tatttggcgg cgcggtattg tcggacaccc gatcaagttg 480 ctgaaagggc acgtgacgct cctcgcgccg atcaaccttg tcgaagaagt cgccaagcca 540 atctcgttgt cgctccgact tttcggcaac attttcgccg gcggcattct ggtcgcactg 600 atcgcgctct ttccccccta catcatgtgg gcgcccaatg cgatctggaa agcatttgac 660 ctgttcgtcg gcgcaatcca ggccttcatt tttgcgctgc tgacaatttt gtacttcagc 720 caagcgatgg agctcgaaga ggaacaccac tag 753 <210> 12 <211> 250 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 12 Met Thr Glu Thr Ile Leu Ala Ala Gln Ile Glu Val Gly Glu His His 1 5 10 15 Thr Ala Thr Trp Leu Gly Met Thr Val Asn Thr Asp Thr Val Leu Ser 20 25 30 Thr Ala Ile Ala Gly Leu Ile Val Ile Ala Leu Ala Phe Tyr Leu Arg 35 40 45 Ala Lys Val Thr Ser Thr Asp Val Pro Gly Gly Val Gln Leu Phe Phe 50 55 60 Glu Ala Ile Thr Ile Gln Met Arg Asn Gln Val Glu Ser Ala Ile Gly 65 70 75 80 Met Arg Ile Ala Pro Phe Val Leu Pro Leu Ala Val Thr Ile Phe Val 85 90 95 Phe Ile Leu Ile Ser Asn Trp Leu Ala Val Leu Pro Val Gln Tyr Thr 100 105 110 Asp Lys His Gly His Thr Thr Glu Leu Leu Lys Ser Ala Ala Ala Asp 115 120 125 Ile Asn Tyr Val Leu Ala Leu Ala Leu Phe Val Phe Val Cys Tyr His 130 135 140 Thr Ala Gly Ile Trp Arg Arg Gly Ile Val Gly His Pro Ile Lys Leu 145 150 155 160 Leu Lys Gly His Val Thr Leu Leu Ala Pro Ile Asn Leu Val Glu Glu 165 170 175 Val Ala Lys Pro Ile Ser Leu Ser Leu Arg Leu Phe Gly Asn Ile Phe 180 185 190 Ala Gly Gly Ile Leu Val Ala Leu Ile Ala Leu Phe Pro Pro Tyr Ile 195 200 205 Met Trp Ala Pro Asn Ala Ile Trp Lys Ala Phe Asp Leu Phe Val Gly 210 215 220 Ala Ile Gln Ala Phe Ile Phe Ala Leu Leu Thr Ile Leu Tyr Phe Ser 225 230 235 240 Gln Ala Met Glu Leu Glu Glu Glu His His 245 250

Claims (34)

14-34번 아미노산 또는 54-69번 아미노산 중 어느 하나에 위치하는 적어도 하나의 점 돌연변이를 포함하는 서열번호 1; 및

20-40번 아미노산 또는 60-75번 아미노산 중 어느 하나에 위치하는 적어도 하나의 점 돌연변이를 포함하는 서열번호 3 중에서 선택되는 폴리펩타이드 서열을 포함하는 단리된 돌연변이 atpE 단백질.

제1항에 있어서, 28번 아미노산 또는 63번 아미노산에 위치하는 적어도 하나의 점 돌연변이를 포함하는 서열번호 1의 폴리펩타이드 서열을 포함하는 단리된 돌연변이 atpE 단백질.

제1항에 있어서, 폴리펩타이드 서열이 서열번호 2에 도시된 Mtb_R, 서열번호 4에 도시된 Msm_R09, 또는 서열번호 5에 도시된 Msm_R10으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 단리된 돌연변이 atpE 단백질.

제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩타이드를 사용하여, ATPase의 F₀ 부분과 상호작용하는 화합물을 확인하고 상기 화합물의 항미생물제(anti-microbial) 화합물로서의 잠재성(potential)에 대해 확인하는 방법.

(a) 분자 모델링 기술(molecular modeling techniques)을 이용하여 제1항에 기재된 폴리펩타이드의 삼차원 구조를 생성하고;

(b) 컴퓨터 수단을 이용하여 시험 화합물과 상기 폴리펩타이드의 삼차원 구조 간의 피팅(fitting) 조작을 수행하고;

(c) 상기 피팅 조작의 결과를 분석하여 시험 화합물과 상기 폴리펩타이드의 삼차원 구조의 결합(association)을 정량화하는 것을 포함하는, atpE 단백질과 상호작용하는 시험 화합물의 잠재성을 평가하는 방법.

제5항에 있어서, 삼차원 구조가, 하기 표 3, 4 또는 5 중 어느 하나의 원자 좌표 또는 1.5Å 미만의 비-수소 원자의 제곱근 평균 편차를 포함하는 동족인 구조 좌표를 이용하여,

서열번호 1 또는 2의 넘버링을 참조로 할 경우, 하나의 C 서브유닛의 Ala²⁴, Gly²⁷, Phe⁵³, Val⁵⁷, Gly⁵⁸, Glu⁶¹, Tyr⁶⁴ 및 Phe⁶⁵ 아미노산; 및

서열번호 12의 넘버링을 참조로 할 경우, 하나의 A 서브유닛의 Ser¹⁸², Leu¹⁸³, Leu¹⁸⁵ 및 Arg¹⁸⁶ 아미노산에 의해 생성되는 방법.

[표 3]

[표 4]

[표 5]

제5항에 있어서, 삼차원 구조가,

서열번호 1 또는 2의 넘버링을 참조로 할 경우,

하기 표 3, 4 또는 5 중 어느 하나의 A 사슬의 Ala²¹, Gly²⁵ 아미노산;

하기 표 3, 4 또는 5 중 어느 하나의 K 사슬의 Ala²⁴, Gly²⁷, Phe⁵³, Phe⁵⁴, Val⁵⁷, Gly⁵⁸, Glu⁶¹, Tyr⁶⁴, Phe⁶⁵ 아미노산;

하기 표 3, 4 또는 5 중 어느 하나의 L 사슬의 Met¹⁷, Gly¹⁹, Gly²⁰, Ala²¹, Ile²², Gly²³, Ala²⁴, Gly²⁵, Ile²⁶, Gly²⁷, Asp²⁸, Gly²⁹, Ala³¹, Phe⁵³, Thr⁵⁶, Val⁵⁷, Gly⁵⁸, Leu⁵⁹, Val⁶⁰, Glu⁶¹, Ala⁶², Ala⁶³/Pro⁶³, Tyr⁶⁴, Phe⁶⁵ 아미노산; 및

서열번호 12의 넘버링을 참조로 할 경우, 하기 표 3, 4 또는 5 중 어느 하나의 M 사슬의 Ser¹⁸², Leu¹⁸³, Leu¹⁸⁵, Arg¹⁸⁶ 아미노산의 원자 좌표를 이용하여 생성되는 방법.

[표 3]

[표 4]

[표 5]

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하기 표 6에 나타난 atpE 단백질의 14-34번 또는 54-69번 아미노산의 구조 좌표, 또는 1.5Å 미만의 비-수소 원자의 제곱근 평균 편차를 포함하는 동족인 구조 좌표에 의해 정의되는 ATPase의 F₀ 부분의 결합 부위(binding site)를 포함하는, 단리되고 정제된 폴리펩타이드.

[표 6]

제20항에 있어서, 결합 부위가,

서열번호 1 또는 2의 넘버링을 참조로 할 경우, 하나의 C 서브유닛의 Ala²⁴, Gly²⁷, Phe⁵³, Val⁵⁷, Gly⁵⁸, Glu⁶¹, Tyr⁶⁴ 및 Phe⁶⁵ 아미노산; 및

서열번호 12의 넘버링을 참조로 할 경우, 하나의 A 서브유닛의 Ser¹⁸², Leu¹⁸³, Leu¹⁸⁵ 및 Arg¹⁸⁶ 아미노산을 포함하는 것인, 단리되고 정제된 폴리펩타이드.

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제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 단리된 돌연변이 atpE 단백질을 암호화하는 단리된 핵산.

제24항에 따른 핵산을 포함하는 벡터.

제25항에 따른 벡터를 갖는 숙주 세포.

a) atpE 단백질을 발현하는 세포와 시험 화합물을 생리적 조건하에서 접촉시키고;

b) 시험 화합물이 atpE 단백질과 상호작용하는지를 결정하는 것을 포함하되,

상기 atpE 단백질은 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 돌연변이 atpE 단백질인, 항미생물제(anti-microbial) 화합물을 확인하는 방법.

a) atpE 단백질에 결합한다고 알려진 화합물의 존재 및 부재 하에서, atpE 단백질을 발현하는 세포와 시험 화합물을 접촉시키고;

b) atpE 단백질에 결합한다고 알려진 화합물을 기준 물질로 이용하여, 시험 화합물이 atpE 단백질에 결합하는지를 결정하는 것을 포함하되,

상기 atpE 단백질은 제20항 또는 제21항에 따른 폴리펩타이드를 포함하는 돌연변이 atpE 단백질인, 시험 화합물이 단리된 atpE 단백질에 결합하는지를 확인하는 방법.

제28항에 있어서, atpE 단백질에 결합한다고 알려진 화합물이 검출가능하게 표지되고, 하기 구조의 화합물로 구성된 것을 특징으로 하는 방법:

.

제28항에 있어서, a) 단계가 atpE 단백질에 결합한다고 알려진 화합물의 존재 및 부재 하에서, atpE 단백질을 포함하는 세포 조성물과 시험 화합물을 접촉시키는 것으로 이루어지는 방법.

a) atpE 단백질에 결합한다고 알려진 화합물의 존재 및 부재 하에서, atpE 단백질을 포함하는 세포 조성물과 시험 화합물을 접촉시키고;

b) atpE 단백질에 결합한다고 알려진 화합물을 기준 물질로 이용하여, 시험 화합물이 atpE 단백질에 결합하는지를 결정하는 것을 포함하되,

상기 atpE 단백질은 제20항 또는 제21항에 따른 폴리펩타이드를 포함하는 돌연변이 atpE 단백질이고,

상기 세포 조성물이 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 단리된 돌연변이 atpE 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 갖는 숙주 세포로부터 얻은 막 제제(membrane preparation)로 구성되는 것인,

시험 화합물이 단리된 atpE 단백질에 결합하는지를 확인하는 방법.

(a) 분자 모델링 기술을 이용하여 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 돌연변이 atpE 단백질의 삼차원 구조를 생성하고;

(b) 컴퓨터 수단을 이용하여 시험 화합물과 상기 돌연변이 atpE 단백질의 삼차원 구조 간의 피팅(fitting) 조작을 수행하고;

(c) 상기 피팅 조작의 결과를 분석하여 시험 화합물과 상기 돌연변이 atpE 단백질의 삼차원 구조의 결합(association)을 정량화하는 것을 포함하는,

제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 돌연변이 atpE 단백질과 상호작용하는 시험 화합물의 잠재성을 평가하는 방법.

제32항에 있어서, atpE 단백질의 삼차원 구조가, E. coli(단백질 데이터베이스 1Q01)의 Ile28, Glu61, Ile63의 원자 좌표 +/- 10Å 이하인 상기 아미노산 골격 원자의 제곱근 평균 편차를 이용하여 생성되는 방법.

제32항에 있어서, atpE 단백질의 삼차원 구조가 하기 표 6에 따른 원자 좌표 +/- 1.5Å 이하인 상기 아미노산 골격 원자의 제곱근 평균 편차를 이용하여 생성되는 방법.

[표 6]

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