JP2012210210A - 細菌のatp合成酵素の結合ドメイン - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 特定のアミノ酸配列において少なくとも1つの点突然変異を含むポリペプチドの単離された変異体atpEタンパク質を使用することにより、それに関連する核酸、ベクター、宿主細胞、製薬学的組成物および製品等も提供される。
【選択図】 なし
Description
a)atpEタンパク質を発現する細胞を、生理学的条件下で試験化合物と接触させる段階、および
b)該試験化合物がatpEタンパク質と相互作用するかどうかを決定する段階
を含んでなる。
(a)分子モデル化技術を使用して、atpEタンパク質の三次元構造を生成させること;
(b)コンピュータによる手段を使用して、試験化合物と、atpEタンパク質の三次元構造の間のフィッティング操作を実施すること;および
(c)前記フィッティング操作の結果を解析して、試験化合物のatpEタンパク質の三次元構造との会合を定量化すること
を含んでなる。
表1 多様なミコバクテリウム種の増殖を90%阻害した、リードDARQ化合物(J)の最小阻害濃度(MIC)。試験した株の数は別の方法で示されない限りn=1であった。
定義
別の方法で本明細書に明らかに提供されるところを除き、本出願で使用されるところの以下の用語のそれぞれは、下に示される意味するところを有する。
0部分より構成される。ATPアーゼは、細菌の形質膜、葉緑体のチラコイド膜、およびミトコンドリアの内膜で見出され、そこでそれらはプロトンの電子化学的勾配のエネルギーを使用してATP合成を駆動する。
tuberculosis)およびスメグマ菌(Mycobacterium smegmatis)、コリネバクテリウム、ノカルジア類、例えば連鎖球菌、ブドウ球菌および腸球菌のようなグラム陽性細菌、若しくは例えば大腸菌(Escherichia coli)、インフルエンザ菌(Heamophilus influenzae)およびヘリコバクター ピロリ(Helicobacter pylori)のようなグラム陰性細菌により例示される細胞を制限なしに包含する。
くは鳥類のようないかなる動物も意味している。好ましい態様において、被験体はヒトである。
変異体atpE(または「変異atpE」という)タンパク質
本発明は、単離された変異体atpEタンパク質、とりわけ細菌のatpEタンパク質、より具体的にはミコバクテリウムのatpEタンパク質、なおより具体的にはヒト結核菌(M.tuberculosis)若しくはスメグマ菌(M.smegmatis)のatpEタンパク質を提供する。突然変異は単一の点突然変異、挿入若しくは欠失から選択される。本発明の一態様において、突然変異は、図2の配列アライメントに示されるところのアミノ酸20ないし40、とりわけ30ないし40のいずれか1つ、好ましいアミノ酸34の、若しくはアミノ酸60ないし75の、とりわけ62ないし73のいずれか1
つ、好ましくはアミノ酸69に位置する最低1個の点突然変異よりなる。さらなる一態様において、単離された変異体atpEタンパク質は、図2に示されるところのMtb_R(配列番号2)、Msm_R09(配列番号4)およびMsm_R10(配列番号5)、または前述のアミノ酸配列のいずれかに対する最低70、80、90、95、97若しくは98%の配列同一性を有するアミノ酸配列のから選択される。
ヌクレオチド塩基中のクエリ配列長さのいずれか短い方、である。
本発明はさらに、抗菌化合物の同定方法を提供し、前記方法は
(a)atpEタンパク質を発現する細胞を、生理学的条件下で試験化合物と接触させる段階;
(b)該試験化合物がatpEタンパク質と相互作用するかどうかを決定する段階
を含んでなる。
a)atpEタンパク質を発現する細胞(こうした細胞は前記atpEタンパク質を通常は発現しない)を、atpEタンパク質を結合することが既知の化合物の存在および非存
在下に試験化合物と接触させること、
b)atpEタンパク質に結合することが既知の化合物を参照として使用してatpEタンパク質への試験化合物の結合を測定すること
を含んでなる。
本発明はさらに、atpEタンパク質と相互作用する試験化合物の潜在能力の評価方法
を提供し、前記方法は;
(a)分子モデル化技術を使用してatpEタンパク質の三次元構造を明確に表すこと;(b)コンピュータによる手段を使用して、試験化合物とatpEタンパク質の三次元構造との間のフィッティング操作を実施すること;および
(c)前記フィッティング操作の結果を解析して、atpEタンパク質の三次元構造との試験化合物の会合を定量化すること
を含んでなる。
。DARQ J化合物は、その脱プロトン化された形態のAサブユニットのArg186のCサブユニットのGlu61との相互作用を阻害する。従って、atpEタンパク質と相互作用する試験化合物の潜在能力の評価方法における表6若しくは7の原子座標の使用を提供することが、本発明の一目的である。
別の態様において、本発明は、ATPアーゼのF0部分の結合部位の特徴を提供する。DARQ J化合物を結合することが可能であると同定されたこの結合部位は、ヒト結核菌(M.tuberculosis)およびスメグマ菌(M.smegmatis)のatpEタンパク質中の耐性を賦与する突然変異部位として上で同定された領域と一致することが見出された(17)。これゆえに、本発明は、それがatpEタンパク質の耐性を賦与する突然変異部位を含んでなることを特徴とするATPアーゼのF0部分の結合部位を提供する。本明細書で使用されるところの耐性を賦与する突然変異部位は、Mtb_S(配列番号1)若しくはMtb_R(配列番号2)の番号付けを参照として採用して、atpEタンパク質のアミノ酸14ないし34、とりわけ24ないし34、およびアミノ酸53ないし69、とりわけ56ないし67を指す。
le26、Gly27、Asp28、Gly29、Ala31、Phe53、Thr56、Val57、Gly58、Leu59、Val60、Glu61、Ala62、Ala63/Pro63、Tyr64、Phe65、ならびにAサブユニットのアミノ酸Leu183、Leu185およびArg186よりなり;前記アミノ酸は表3の原子座標を有する。
本発明のatpEに結合するか、その機能的活性を促進するか若しくは阻害する化合物の設計は、一般に、2種の因子の考慮を必要とする。第一に、該化合物はatpEと物理的かつ構造的に会合することが可能でなければならない。atpEの化合物との会合において重要な非共有分子相互作用は、水素結合形成、ファンデルワールスおよび疎水性相互作用を包含する。第二に、化合物は、それがatpEと会合することを可能にするコンホメーションをとることが可能でなければならない。化合物のある部分がatpEとの会合に直接参画しなくてもよいとは言え、それらの部分はなお、該分子の全体的コンホメーションに影響しうる。これは、順に、結合親和性、治療的有効性、薬物様の質および効力に対する大きな影響を有しうる。こうしたコンホメーションの要件は、atpEの活性部位若しくは他の領域の全部若しくは一部分に関しての化学的実体若しくは化合物の全体的な三次元構造および幾何学的配置、またはatpEと直接相互作用する数種の化学的実体を含んでなる化合物の官能基間の間隔を包含する。
に防ぎうる。しかしながら、コンピュータモデル化が強い相互作用を示す場合には、該分子を合成しかつatpEと相互作用するその能力について試験しうる。この様式で、無効の化合物の合成を回避しうる。いくつかの場合には、モデル化で予測される不活性化合物を合成しかつその後試験してatpEの特定の領域と相互作用する化合物のSAR(構造活性相関)を作成する。当業者は、いくつかの方法の1つを使用して、化学的実体のフラグメント、化合物若しくは剤をatpEおよびより具体的にはatpEの個々の結合ポケットすなわち活性部位と会合するそれらの能力についてスクリーニングしうる。この方法は、例えば、atpE若しくはリガンドと複合体形成したatpEの原子座標に基づくコンピュータスクリーニングでの活性部位の目視検査により開始しうる。選択された化学的実体、化合物若しくは剤をその後、多様な幾何学的配置に配置しうるか、若しくはatpEの個々の結合ポケット内にドッキングしうる。ドッキングは、QuantaおよびSybylのようなソフトウェア、次いでCHARMMおよびAMBERのような標準的分子の力学上の力場(mechanics forcefield)を用いるエネルギー最小化および分子動力学を使用して達成しうる。
Computer Program LUDI:A New Method for the De Novo Design of Enzyme Inhinitors”,J.ComR.Aid.Molec.Design、6、pp.61−78(1992)、Biosym Technologies、カリフォルニア州サンディエゴから入手可能);LEGEND(Nishibata,Y.とA.Itai、Tetrahedron 47:8985(1991)、Molecular Simulations、マサチューセッツ州バーリントンから入手可能);およびLeapFrog(Tripos
Associates、ミズーリ州セントルイスから入手可能)を包含する。例えば、LUDIプログラムは、水素結合形成および疎水性フラグメントの双方が位置するべき相互作用部位の一覧を決定し得る。LUDIはその後、リンカーのライブラリーを使用して、4個までの異なる相互作用部位を断片に結合する。その後、――CH2−および――COO――のようなより小さい「結合」基を使用してこれらの断片を結合する。例えば、酵素DHFRについて、公知の阻害剤メトトレキセート中の重要な官能基の配置がLUDIにより再現された。RotsteinとMurcko、J.Med.Chem.36:1700−1710(1992)もまた参照されたい。
for Medicinal Chemistry、J.Med.Chem.33:883−894(1990)を参照されたい。Navia,M.A.とM.A.Murcko、“The Use of Structural Information in Drug Design,”Current Opinions in Structural Biology、2、pp.202−210(1992)もまた参照されたい。
コンピュータで読み取り可能なデータ記憶媒体」は、コンピュータにより直接読み取り若しくはアクセスし得るいかなる媒体も指す。こうした培体は、限定されるものでないが:フロッピーディスク、ハードディスク記憶媒体および磁気テープのような磁気記憶媒体;光ディスク若しくはCD−ROMのような光学式記憶媒体;RAMおよびROMのような電気的記憶媒体;ならびに磁気/光学式記憶媒体のようなこれらの範疇のハイブリッドを挙げることができる。
上で既に挙げられたとおり、微生物に基づく感染症を伴う被験体の処置方法において、前述のスクリーニング方法のいずれかを使用して同定される化合物の使用を提供することもまた、本発明の一目的である。一般に、細菌性病原体はグラム陽性若しくはグラム陰性いずれかの病原体に分類しうる。グラム陽性およびグラム陰性双方の病原体に対する活性をもつ抗菌化合物は、一般に広範囲の活性を有するとみなされる。本発明の化合物は、グラム陽性および/若しくはグラム陰性の細菌性病原体に対し活性とみなされる。とりわけ、本化合物は、最低1種のグラム陽性細菌、好ましくは数種のグラム陽性細菌、より好ましくは1種若しくはそれ以上のグラム陽性細菌および/または1種若しくはそれ以上のグラム陰性細菌に対し活性である。
ellulare)、M.カンサシイ(M.kansasii)、M.ミクロティ(M.microti)、M.スクロフラセウム(M.scrofulaceum)、パラ結核菌(M.paratuberculosis)、らい菌(M.leprea)、ヒト結核菌(M.tuberculosis)、M.ウルセランス(M.ulcerans)およびM.ラネ(M.ranae)により引き起こされる感染症に対しとりわけ活性である。
本発明はさらに、細胞中でatpEタンパク質と相互作用する剤および製薬学的に許容できる担体を含んでなる製薬学的組成物を提供する。こうした剤は、製薬学的に許容できる担体若しくは希釈剤と一緒になって剤を含んでなる組成物に処方しうる。剤は、エステル若しくは塩のような、酸付加塩若しくは塩基金属塩、またはN若しくはSオキシドのような生理学的に機能的な誘導体の形態にあることができる。組成物はいかなる適する投与経路および手段のためにも処方しうる。製薬学的に許容できる担体若しくは希釈剤は、経口、直腸、鼻、吸入可能、局所(頬側および舌下を包含する)、膣若しくは非経口(皮下、筋肉内、静脈内、皮内、クモ膜下腔内および硬膜外を包含する)投与に適する製剤で使用されるものを包含する。担体若しくは希釈剤の選択はもちろん、剤およびその治療目的に依存しうる提案される投与経路に依存することができる。製剤は、便宜的には単位投薬形態物で提示されることができ、また、製薬学の技術分野で公知の方法のいずれによっても製造しうる。こうした方法は、有効成分を1種若しくはそれ以上の付属成分を構成する担体との連合にもたらす段階を包含する。一般に、製剤は、有効成分を液体担体若しくは微粉化した固体担体または双方との連合に均一かつ緊密にもたらすこと、およびその後必要な場合は生成物を造形することにより製造する。
ンオレエートなどのような非毒性の補助物質もまた含有しうる。こうした投薬形態物の実際の製造方法は当業者に既知であるか若しくは明らかであろう;例えば、Gennaroら、Remington’s Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Company、ペンシルバニア州イーストン、第18版、1990を参照されたい。
in Molecular Bioloty、編者F.Ausubelら、John Wiley and Sons,Inc.1994、若しくはSambrook,J.、Fritsch,E.F.およびManiatis,T.、Molecular Cloning:A laboratory manual、第2版、Cold Spring
Harbor Laboratory Press、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、1989のような通常の実験室手引書に見出されるプロトコルおよび手順として理解されるべきである。
スメグマ菌(Mycobacterium smegmatis)を代理物として使用して、われわれは、数種のミコバクテリウムに対する強力なin vitro活性をもつ一連のDARQを発見した(11)。今日まで、DARQ系列の20種の分子がヒト結核菌(Mycobacterium tuberculosis)H37Rvに対し0.5μg/mlより下の最小阻害濃度(MIC)を有し、また、これらの3種について、抗ミコバクテリウム活性がin vivoマウスモデルで確認された。
る)、ならびにメフロキンならびにそのアナログ4−メチルキノリンおよび4−キノリルヒドラゾンを包含する他のキノロン分類の双方と非常に異なる(12−16)。DARQと他のキノロン若しくはキノリン分類の間の主要な構造上の差違の1つは、DARQ分類により担持される官能性化された側(3’)鎖の特異性である。加えて、既存の化学分類とのミコバクテリウムの交差耐性の欠如が異なる作用機序を指摘する。
ピロリ(Helicobacter pylori)を包含する他の生物体に対し活性でなかった。対数期増殖にあるヒト結核菌(M.tuberculosis)の100×MICのJの濃度への曝露は、12日後に細菌数の103対数の減少をもたらし、Jがin vitroで殺菌活性を有することを示した。静止期の結核桿菌に対するJの影響は未だ研究されていない。
ミコバクテリウム耐性を検討することにより、われわれは分子薬物標的を同定しかつ作
用機序を提案することを目的とした。ヒト結核菌(M.tuberculosis)およびスメグマ菌(M.smegmatis)の耐性変異体を、
−ミコバクテリウム中の耐性変異体の比率を定量化する(対照としてリファンピンを用いて)
−耐性変異体の耐性パターン(キノロンに対する交差/非交差耐性を包含する)を評価する
−作用機序を検討する
ため、阻害濃度のJでのin vitro選択により導き出した。
DCCDおよびDARQ Jの異なる作用様式をさらに検討するため、野性型およびDARQ J変異体双方のヒト結核菌(M.tuberculosis)のATP合成酵素のコンピュータ生成される3Dモデルを生成した。表4および5に提供される原子座標は、公表されたアミノ酸配列P63691およびAJ865377の3D構造のモデルを作成することにより計算した。実際のDARQ J結合部位は、AおよびCサブユニットの接触領域、より具体的には、表3、4若しくは5で称されるところのAサブユニットのアミノ酸「Arg210」およびCサブユニットの「Glu61」周辺に位置することが見出された。これは、上述されたヒト結核菌(M.tuberculosis)およびスメグマ菌(M.smegmatis)の感受性および耐性株での耐性を賦与する突然変異のスクリーニングについて見られた結果とよく一致する。
−519]を用いて実施したが、しかし、いずれかの従来技術の分子動力学ソフトウェア[Berendsen,H.J.C.、van der Spoel,D.とvan Drunen,R.、Comp.Phys.Comm.91(1995)、43−56;Lindahl,E.、Hess,B.およびvan der Spoel,D.、J.Mol.Mod.7(2001)306−317.]、次いで適する配置最適化[J.W.PonderとF.M.Richards、J.Comput.Chem.、8、1016−1024(1987)]を使用し得た。
DARQ Jは、参照化合物のMICに等しいか若しくはそれより小さいMICをもつ、抗TB薬の新たな化学的分類の1メンバーである。そのスペクトルは、ヒトで重要な異型の種;MAC、M.カンサシイ(M.kansasii)ならびに迅速増殖体M.フォルツイタム(M.fortuitum)およびカメ結核菌(M.abscessus)を包含するミコバクテリウムに対するその特異性において独特である。この抗ミコバクテリウム特異的スペクトルは、MACに対する活性を有しないイソニアジドのものと異なる。Jの臨床使用はTBおよびミコバクテリウム感染症の処置に高度に標的を定めることができる。ミコバクテリウム以外を阻害するJの不能は、より広範なスペクトルをもつ抗生物質と比較した場合に、他の細菌種で発生するより小さい選択圧および耐性のより低いリスクになるはずである(9)。
れた「1E79」構造(細胞内部分のみ示す)に存在しない。結合部位のこの差違は、in vitro ATP産生アッセイで観察されたヒト結核菌(M.tuberculosis)の異なる応答を説明しうる。
Natl Acad Sci U.S.A.1980年2月;77(2):785−789により、該酵素のF0領域の親油性環境の1酸性アミノ酸の周囲に位置する別の結合部位を示唆している。ミトコンドリアのATPアーゼのこの結合位置は、ミコバクテリウム属(Mycobacterium)種についてここで記述されるものに類似とみなし得る。
Claims (28)
- アミノ酸14ないし34またはアミノ酸54ないし69のいずれか一の位置に少なくとも1つの点突然変異を含む配列番号1およびアミノ酸20ないし40またはアミノ酸60ないし75のいずれか一の位置に少なくとも点突然変異を含む配列番号3から選ばれるポリペプチド配列を含んでなる単離された変異atpEタンパク質。
- アミノ酸28またはアミノ酸63に位置する少なくとも点突然変異を含む配列番号1からなる群より選ばれるポリペプチド配列を含んでなる請求項1に記載の単離された変異atpEタンパク質。
- bu配列番号2に示されるMtb_R、配列番号4に示されるMsm_R09および配列番号5に示されるMsm_R10から選ばれる請求項1または2に記載の単離された変異atpEタンパク質。
- ATPアーゼのF0部分と相互作用する化合物、および抗菌化合物としてのそれらの潜在能力の同定方法における、請求項1ないし3のいずれか1つに記載のタンパク質の使用。
- atpEタンパク質と相互作用する試験化合物の潜在能力の評価方法であって、
(a)請求項1ないし3のいずれかの1つに記載のatpEタンパク質の結合部位の三次元構造を生成させるための分子モデル化技術、
(b)計算手段を使用して試験化合物と該結合部位の三次元構造の間のフィッティング操作を実施すること、および
(c)前記フィッティング操作の結果を解析して、試験化合物の該結合部位の三次元構造との関連性を定量化すること
を含んでなる、上記方法。 - 三次元構造が、表3、4若しくは5のいずれかの原子座標、または1.5Å未満の水素以外の原子の二乗平均偏差を含んでなる相同な構造座標を使用して、1個のCサブユニットの少なくともアミノ酸Ala24、Gly27、Phe53、Val57、Gly58、Glu61、Tyr64およびPhe65、ならびに1個のAサブユニットのアミノ酸Ser182、Leu183、Leu185およびArg186を伴い生成される、請求項5に記載の方法。
- 三次元構造が、表3、4若しくは5のいずれかのA鎖のアミノ酸Ala21、Gly25;表3、4若しくは5のいずれかのK鎖のアミノ酸Ala24、Gly27、Phe53、Phe54、Val57、Gly58、Glu61、Tyr64、Phe65:表3、4若しくは5のいずれかのL鎖のアミノ酸Met17、Gly19、Gly20、Ala21、Ile22、Gly23、Ala24、Gly25、Ile26、Gly27、Asp28、Gly29、Ala31、Phe53、Thr56、Val57、Gly58、Leu59、Val60、Glu61、Ala62、Ala63/Pro63、Tyr64、Phe65;ならびに表3、4若しくは5のいずれかのM鎖のアミノ酸Ser182、Leu183、Leu185およびArg186の原子座標を使用して生成される、請求項5に記載の方法。
- 請求項1ないし3のいずれか1つに記載のatpEタンパク質と耐性を賦与する突然変異部位において相互作用する化合物を活性成分とする微生物に基づく感染症を伴う被験体の処置用の製薬学的製剤。
- 耐性を賦与する突然変異部位が、配列番号1に示されるMtb_S若しくは配列番号2に示されるMtb_Rの番号付けを参照として採用して、atpEタンパク質のアミノ酸14ないし34およびアミノ酸53ないし69を指す、請求項8に記載の製薬学的製剤。
- 表6若しくは7のいずれかのatpEタンパク質のアミノ酸14−34若しくは54−69の構造座標、または1.5Å未満の水素以外の原子の二乗平均偏差を含んでなる相同な構造座標によって規定されるATPaseのF0部分におえる結合部位を含んでなる単離、精製されたポリペプチド。
- 結合部位が、Cサブユニットの少なくともアミノ酸Ala24、Gly27、Phe53、Val57、Gly58、Glu61、Tyr64およびPhe65、ならびに1個のAサブユニットのアミノ酸Ser182、Leu183、Leu185、Arg186を含んでなる、請求項10記載の単離、精製されたポリペプチド。
- 請求項10または11に記載のポリペプチドの結合部位と相互作用する化合物を活性成分として含んでなる微生物に基づく感染症を伴う被験体の処置用の製薬学的製剤。
- 請求項5ないし7のいずれかの1に記載の方法を使用して同定された化合物を活性成分として含んでなる微生物に基づく感染症を伴う被験体の処置用の製薬学的製剤。
- 感染症がグラム陽性細菌により引き起こされる、請求項13に記載の製薬学的製剤。
- 感染症がミコバクテリウムにより引き起こされる、請求項13に記載の製薬学的製剤。
- 感染症がM.アフリカヌム(M.africanum)、トリ結核菌(M.avium)、ウシ結核菌(M.bovis)、ウシ結核菌−BCG(M.bovis−BCG)、カメ結核菌(M.chelonae)、M.フォルツイタム(M.fortuitum)、M.ゴルドネ(M.gordonae)、M.イントラセルラレ(M.intracellulare)、M.カンサシイ(M.kansasii)、M.ミクロティ(M.microti)、M.スクロフラセウム(M.scrofulaceum)、パラ結核菌(M.paratuberculosis)、らい菌(M.leprea)、ヒト結核菌(M.tuberculosis)、M.ウルセランス(M.ulcerans)およびM.ラネ(M.ranae)からなる群より選択される微生物により引き起こされる、請求項13に記載の製薬学的製剤。
- 請求項13に記載の製薬学的製剤であって、中枢神経系の感染症、外耳感染症、急性中耳炎のような中耳の感染症、硬膜静脈洞の感染症、眼の感染症、歯、歯肉および粘膜の感染症のような口腔の感染症、上気道感染症、下気道感染症、泌尿生殖器感染症、胃腸感染症、産婦人科感染症、敗血症、骨および関節の感染症、皮膚および皮膚構造の感染症、細菌性心内膜炎、火傷、手術の抗菌的予防、ならびに癌化学療法を受領している患者若しくは臓器移植患者のような免疫抑制患者における抗菌的予防を処置するための、製薬学的製剤。
- 請求項1ないし3のいずれかの1つに記載の単離された変異atpEタンパク質をコードする単離された核酸分子。
- 請求項18に記載の核酸分子を含んでなるベクター。
- 請求項19に記載のベクターを担持する宿主細胞。
- 抗菌化合物の同定方法であって、
a)atpEタンパク質を発現する細胞を、生理学的条件下で試験化合物と接触させる工程、および
b)該試験化合物がatpEタンパク質と相互作用するかどうかを決定する工程を含んでなり、かつ、atpEタンパク質が請求項1ないし3のいずれかの1つに記載の変異atpEタンパク質である、ことを特徴とする上記方法。 - 単離されたatpEタンパク質に試験化合物が結合するかどうかの同定方法であって、a)atpEタンパク質を発現する細胞(こうした細胞は前記atpEタンパク質を通常は発現しない)を、atpEタンパク質を結合することが既知の化合物の存在および非存在下で試験化合物と接触させる工程、
b)atpEタンパク質に結合することが既知の化合物を参照として使用して、atpEタンパク質への該試験化合物の結合を測定する工程を含んでなり、かつ、atpEタンパク質が請求項10または11に記載のポリペプチドを含む変異atpEタンパク質である、ことを特徴とする上記方法。 - atpEタンパク質に結合することが既知の化合物が、検出可能に標識されており、図1に記載された化合物からなる、請求項22に記載の方法。
- 工程a)が、atpEタンパク質を含む細胞組成物を、atpEタンパク質を結合することが既知の化合物の存在および非存在下で試験化合物と接触させることよりなる、請求項22に記載の方法。
- 細胞組成物が、請求項20に記載の細胞から得られる膜調製物よりなる、請求項24に記載の方法。
- 請求項1ないし3のいずれか1つに記載のatpEタンパク質と相互作用する試験化合物の潜在能力の評価方法であって、
a)分子モデル化技術を使用して請求項1ないし3のいずれか1つに記載のatpEタンパク質の三次元構造を明確に表すこと、
b)計算手段を使用して、試験化合物と請求項1ないし3のいずれか1つに記載のatpEタンパク質の三次元構造の間のフィッティング操作を実施すること、および
c)前記フィッティング操作の結果を解析して、請求項1ないし3のいずれか1つに記載のatpEタンパク質の三次元構造との試験化合物の会合を定量化すること
を含んでなる、上記方法。 - atpEタンパク質の三次元構造が、大腸菌(E.coli)(タンパク質データベース1Q01)のIle28、Glu61およびIle63の原子座標+/−10Åを超えない前記アミノ酸のバックボーン原子の二乗平均偏差を使用して生成される、請求項26に記載の方法。
- atpEタンパク質の三次元構造が、表6若しくは7の原子座標+/−1.5Åを超えない前記アミノ酸のバックボーン原子の二乗平均偏差を使用して生成される、請求項26に記載の方法。
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