KR101536037B1

KR101536037B1 - 아포리포단백질을 포함하는 항체-약물 결합체

Info

Publication number: KR101536037B1
Application number: KR1020120125519A
Authority: KR
Inventors: 권대혁; 신재윤
Original assignee: 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2012-02-24
Filing date: 2012-11-07
Publication date: 2015-07-13
Also published as: KR20130097628A

Abstract

본 발명은 약물을 포집할 수 있고, 약물 포집시 리포단백질의 외부로 노출되는 친수성 영역의 하나 이상의 아미노산 잔기가 시스테인으로 치환된 변이 리포단백질, 상기 변이 리포단백질의 3차원 구조 내부에 약물이 포집되어 있는 나노구조체, 상기 나노구조체의 제조방법 및 상기 나노구조체와 항체가 결합된 항체-약물 결합체(Antibody-drug conjugate, ADC)에 관한 것이다. 본 발명의 ADC는 종래의 복합체에 비하여 현저하게 많은 수의 약물이 항체에 결합된 형태로 제조될 수 있어 약물의 치료효과가 우수할 뿐만 아니라, 치료효과가 약하거나 또는 낮은 수용성을 나타내지만 안전성이 우수한 약물을 사용할 경우에도 우수한 치료효과를 나타낼 수 있어 치료안전성을 향상시킬 수 있고, 약물의 화학적 구조를 변형시키지 않아 약물의 변형에 의하여 유발될 수 있는 위험성을 배제할 수 있으며, 복잡한 결합반응이 수반되지도 않으므로, 효과적인 약물치료제의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

아포리포단백질을 포함하는 항체-약물 결합체{Antibody-drug conjugate comprising apolipoprotein}

본 발명은 아포리포단백질을 포함하는 항체-약물 결합체에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 약물을 포집할 수 있고, 약물 포집시 리포단백질의 외부로 노출되는 친수성 영역의 하나 이상의 아미노산 잔기가 시스테인으로 치환된 변이 리포단백질, 상기 변이 리포단백질의 3차원 구조 내부에 약물이 포집되어 있는 나노구조체, 상기 나노구조체의 제조방법, 상기 나노구조체와 항체가 결합된 항체-약물 결합체 및 상기 결합체의 제조방법에 관한 것이다.

항체(antibody)는 현재 진단용, 치료용으로 널리 사용되고 있다. 지금은 항체가 하나의 치료용 약물로 인정받고 있다. 현재까지, FDA의 승인을 받은 28개의 치료용 항체는 광범위한 질병 치료제 (예. 이식거부반응, 암, 자가면역질환과 염증, 심장질환, 전염성 감염 등)로 사용되고 있다. 최근에는 기존의 항체의 효능을 향상시키기 위해 소위 antibody-drug conjugate(ADC; 도 1)라 불리는 항체와 약물의 결합체가 개발되고 있다. ADC를 이용함으로써 단클론 항체의 특이성과 약물의 세포독성을 결합함으로써 두 구성요소의 좋은 점을 조합 가능하기 때문이다.

전통적인 화학 요법(chemotherapy)에서 항암제는 빠르게 증식하는 세포를 죽일 뿐, 정상 세포와 종양 세포 또는 종양 조직을 차별화 하지 못한다. 화학 요법으로 인한 비 종양 특이적(non-tumor specific) 전신 독성 (systemic toxicity)과 세포독성 때문에 항암제의 치료지수(therapeutic index)와 치료영역(therapeutic window)이 낮다. 이는 암 치료에서 세포독성 약물의 결점이다. 또한, 장기 치료 시 항암제에 대한 내성을 야기시킬 수 있어 세포독성 약물이 암 세포만 타겟팅하여 사멸시키는 향상된 치료요법이 절실히 요구되고 있다.

세포독성 약물과는 달리, 종양 세포의 표면에 있는 특정 항원에 결합하는 단클론 항체는 종양에 특이적으로 결합하므로 비 종양 특이적 전신 독성을 낮추는 대안 치료요법이다. 실제로, 암 세포의 표면에 우선적 또는 독점적으로 발현되는 항원들이 확인되었고 종양과 관련된 항원에 특이적으로 결합하는 단클론 항체를 제작 및 생산할 수 있으며, 이러한 항체가 종양 세포와 결합되면 세포 사멸 효능을 발휘한다. 이러한 항체는 대부분 상당히 약한 항종양 활성를 가지고 있어 종종 항암제와 함께 사용하여야만 항체의 세포사멸 효능을 향상시킬 수 있다. 치료용 약물로서 항체는 화학약물과 비교하여 장점을 가지고 있지만 소수의 항체만이 암 치료용으로 유용한 이유는 대부분의 항체가 표적을 인식하는 능력만을 지니며 암세포를 죽이는 효능은 그다지 높지 않기 때문이다.

이러한 이유로 항체의 장점인 암세포를 타겟팅하는 능력과 항암약물의 장점인 세포를 사멸시키는 능력을 조합하려는 기술인 ADC(Antibody-drug conjugate)의 개발이 이루어지고 있다. ADC를 위해서는 약물, 항체, 그리고 항체와 약물을 연결하는 링커가 필요하다. 치료용으로 사용할 ADC에는 다음과 같은 성질이 필요하다. 첫째, 약물이 부착된 ADC는 원래의 항체와 같은 특성이 필요하다. 즉, 약물 부착 여부와 상관없이 항원을 잘 인식하는 능력을 보유하고 있어야 한다. 둘째, 혈류에 안정하여 약물이 항체로부터 떨어져 나오지 않아야 한다. 약물이 쉽게 항체로부터 유리되면 정상적인 조직에 피해를 입힐 수 있기 때문이다.

약물을 항체에 부착시키기 위해서 일반적으로 사용되는 링커(linker)는 산성에 민감한 하이드라존(hydrazones), 프로티아제에 민감한 펩티드, 환원제에 민감한 디설피드(disulfide) 및 티오스터(thioster) 등이 있다.

그러나, 지금까지 개발된 대부분 ADC는 IgG 골격에 최대 8개 이하의 약물이 항체의 라이신(lysine) ε-아미노기(amino group)에 공유 결합(covalent conjugate)하게 되므로, 이처럼 적은 수의 약물로도 항암효과를 나타내기 위하여는 일반적인 항암제보다도 강력한 세포독성을 나타내는 약물을 사용하여야 하고, 약물에 따라서는 항체에 결합가능하도록 약물의 화학적 구조를 변형시켜야 하며, 상기 약물은 소수성 효과(hydrophobic effect)에 의하여 항체가 침전되지 않도록 높은 수용성을 나타내어야 하고, 항체의 항원인식 부위가 변형될 가능성을 방지하기 위하여 결합반응을 최소화하여야 할 필요성이 있었으나, 이러한 조건을 만족시키는 ADC는 보고되지 않고 있는 실정이다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 소량의 약물로도 항암효과를 나타낼 수 있는 ADC를 개발하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 분리된 리포단백질의 3차원 구조 내부에 2~8개 분자 아닌 수백개 분자의 약물을 포집할 수 있을 뿐만아니라, 약물 포집시 리포단백질의 외부로 노출되는 친수성 영역의 하나 이상의 아미노산 잔기가 시스테인으로 치환된 변이 리포단백질을 제조하여 용이하게 항체와 결합 또는 다른 리포단백질과 하나 이상 연결할 수 있어서, 항체와 약물의 결합에 의해 상승된 항암효과를 나타낼 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 약물을 포집할 수 있고, 약물 포집시 리포단백질의 외부로 노출되는 친수성 영역의 하나 이상의 아미노산 잔기가 시스테인으로 치환된 변이 리포단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 변이 리포단백질의 3차원 구조 내부에 약물이 포집되어 있는 나노구조체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 나노구조체의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 리포단백질 및 항체가 직접 또는 링커를 통해 연결되어 있고, 분리된 리포단백질의 3차원 구조 내부에 약물이 포집되어 있는 것인 항체-약물 결합체(Antibody-drug conjugate, ADC)를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체-약물 결합체(Antibody-drug conjugate, ADC)의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 약물을 포집할 수 있고, 약물 포집시 리포단백질의 외부로 노출되는 친수성 영역의 하나 이상의 아미노산 잔기가 시스테인으로 치환된 변이 리포단백질을 제공한다.

본 발명의 용어 "변이 리포단백질"이란, 지질 또는 그의 유도체가 공유결합 또는 비공유결합에 의하여 결합될 수 있고, 3차원적 구조의 내부에 목적하는 약물을 포집할 수 있으며, 가용성 상태로 존재하는 리포단백질에 있어서, 약물의 포집시에 외부로 노출된 친수성 영역의 아미노산 잔기가 시스테인으로 치환되도록 변이된 리포단백질을 의미한다.

천연의 리포단백질은 내부에 목적하는 약물을 포집할 수 있는 3차원적 구조를 갖는데, 상기 3차원적 구조에 약물이 포집될 경우, 외부로 노출되는 친수성 영역에는 시스테인이 존재하지 않는다. 본 발명에서 제공하는 변이 리포단백질은 약물을 포집하여 나노구조체를 형성할 수 있고, 상기 형성된 나노구조체들이 상호 결합하거나 또는 항체와 결합할 수 있도록 상기 친수성 영역의 아미노산 잔기를 시스테인으로 치환한 형태를 갖는다. 이때, 상기 변이 리포단백질은 리포단백질에 존재하는 상기 친수성 영역의 아미노산 잔기가 시스테인으로 치환된 형태일 수 있는데, 바람직하게는 상기 친수성 영역의 염기성 아미노산 잔기가 시스테인으로 치환된 형태일 수 있고, 보다 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 리포단백질의 98번 아미노산 잔기, 166번 아미노산 잔기, 203번 아미노산 잔기, 230번 아미노산 잔기 등이 시스테인으로 치환된 형태일 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 3 내지 5의 아미노산 서열로 구성된 형태일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

또한, 리포단백질은 바람직하게는 아포리포단백질 A, 아포리포단백질 B, 아포리포단백질 C, 아포리포단백질 E 등이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 ApoA-I, ApoA-II, ApoA-IV, ApoA-V, ApoB48, ApoB100, ApoC-I, ApoC-II, ApoC-III, ApoC-IV 등의 아포리포단백질이 될 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 ApoA-I이 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

상기 변이 리포단백질은 치환된 시스테인을 통하여 항체와 결합하거나 또는 상기 리포단백질이 상호 결합될 수 있는데, 이때 시스테인을 통하여 직접적으로 결합될 수도 있고, 링커를 통하여 간접적으로 결합될 수도 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 용어 "항체(antibody)"란, 면역글로불린(immunoglobulin)이라고도 하고, 면역계 내에서 항원의 자극에 의하여 생성되며, 특정한 항원과 특이적으로 결합하여 림프와 혈액을 떠돌며 항원항체반응을 일으키는 물질을 의미하는데, 상기 항체는 전체 항체(whole) 형태일 수도 있고, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수도 있다. 전체 항체는 각각 2개의 전체 길이의 경쇄 및 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab')₂ 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv단편을 생성하는 재조합 기술은 국제공개 특허 WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 및 WO 88/09344에 개시되어 있다. 이중쇄 Fv(dsFv)는 디설파이드 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되어 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하며 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')₂ 단편을 얻을 수 있다) 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다. 본 발명에서 상기 항체는 특별히 이에 제한되지 않으나, 단클론항체가 될 수 있다.

본 발명의 용어, "단일클론 항체"란 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체 분자를 의미하는데, 상기 단일클론 항체는 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다. 상기 단일클론 항체는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 IgG, IgM, IgA, IgE, IgD, IgT, IgY, 단일쇄 항체 등의 천연형 항체; 항원에 대한 항체의 해리 상수값을 저하시키거나, 인간화 항체와 같이 체내에서 항체에 대한 거부반응을 감소시키거나 또는 항체의 안정성을 증대시키기 위하여 천연형 항체의 일부를 변이시킨 형태의 변이항체; 상기 천연형 항체의 일부를 포함하도록 구성된 재조합 항체 등이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 IgG 등의 천연항체, 항원에 대한 항체의 해리 상수값을 저하시키도록 변이된 변이항체, 항원과 직접적으로 결합하는 상보성 결정영역(CDR, complementarity determining region)을 포함하는 재조합 항체, 항체 단편 등이 될 수 있다.

본 발명의 용어, "항체 단편"은 항원결합능력을 가지는 단편, 예를 들면, Fab', F(ab')₂, Fab, Fv 및 rIgG를 포함하는, 항체의 항원 결합 형태를 포함한다. 상기 항체단편은 IGF-R1과 결합할 수 있는 scFv(Single-chain variable fragment) 도메인 일 수 있다.

본 발명의 용어 “scFv”는 완전한 항원-인식 및 항원-결합 부위를 갖는 최소 항체 단편을 의미하며, 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하고, 여기서 이 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬에 존재한다.

본 발명의 용어, "면역세포(immunocyte)"란 항체를 만드는 세포를 의미하는데, 통상적으로 B 세포, 자연 살상 세포(Natural killer cell, NK cell) 또는 T 세포 등이 될 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 면역세포는 항체의존성 세포독성 메커니즘에 작용하는 자연 살상 세포 또는 T 세포를 의미할 수 있다.

본 발명의 용어, "링커(linker)"란 기본적으로는 두개의 서로 다른 융합 파트너(예를 들어, 생물학적 고분자 등)를 수소 결합, 정전기적 상호작용, 반데르 바알스력, 이황화 결합, 염 브릿지, 소수성 상호작용, 공유결합 등을 이용하여 연결할 수 있는 연결체를 의미하는데, 바람직하게는 생리학적 조건 또는 다른 표준 펩타이드 조건(예를 들면, 펩타이드 정제 조건, 펩타이드 저장 조건)하에서 적어도 하나의 이황화 결합에 참여할 수 있는 적어도 하나의 시스테인을 가질 수 있으며, 단순히 각각의 융합 파트너를 연결하는 역할 이외에도, 융합파트너 사이에 일정한 크기의 간격을 부여하는 역할을 수행하거나 또는 융합체에 유연성 또는 강직성을 제공하는 힌지의 역할을 수행할 수도 있다. 본 발명에서 상기 링커는 특별히 이에 제한되지는 않으나, 항체와 나노구조체 또는 항체와 항체를 연결할 수 있는 화합물이 될 수 있고, 바람직하게는 티올기를 통하여 항체와 나노구조체 또는 항체와 항체를 연결할 수 있는 화합물이 될 수 있으며, 보다 바람직하게는 티올기를 통하여 항체와 나노구조체를 연결할 수 있도록 NHS(N-hydroxysuccinimide ester)와 말레이미드 그룹(maleimide group)으로 구성되어 있고 상기 그룹은 각각 일차 아민(primary amine) 및 티올기와 공유결합 할 수 있으며, 가장 바람직하게는 상기 링커는 m-말레이미도벤조일-설포숙신이미딜 에스테르(m-MaleimidoBenzoyl-SulfoSuccinimidyl ester)(제품명: sulfo-MBS(Thermo Scientific))가 될 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 변이 리포단백질의 3차원 구조 내부에 약물이 포집되어 있는 나노구조체를 제공한다.

본 발명의 용어 "나노구조체"란, 상기 변이 리포단백질이 목적하는 약물을 포집한 형태로 구성된 단백질-약물 복합체를 의미하는데, 상술한 바와 같이 상기 변이된 리포단백질의 외부에 존재하는 친수성 영역의 아미노산 잔기가 시스테인으로 치환되어 있기 때문에, 상기 시스테인을 통하여 각 나노구조체가 1:1 또는 1:다수로 상호 결합할 수 있고, 상기 나노구조체가 항체와 결합할 수도 있다.

또한, 본 발명에서 제공하는 나노구조체는 상기 변이 리포단백질이 아닌 변이되지 않은 리포단백질을 이용하여도 제조할 수 있다. 예를 들어, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 아포리포단백질 A의 3차원 구조 내부에 약물이 포집된 나노구조체가 될 수도 있다.

본 발명의 변이된 리포단백질로서 사용되는 ApoA-I의 경우 내부에 공극을 3쌍의 헬릭스로 감싸는 3차원적 구조를 갖는다(도 9). 도 9는 ApoA-I의 3차원적 구조를 나타내는 개략도이다. 상기 공극에 포집될 수 있는 목적 약물의 양은 상기 약물의 구조 및 분자량에 따라 달라질 수 있어 특별히 이에 제한되지는 않으나 한 분자의 리포단백질 당 약 100분자의 약물을 포집할 수 있다(도 10).

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명자들은 ApoA-I 단백질의 염기성 아미노산인 아르기닌을 시스테인으로 치환하여 변이된 ApoA-I을 제조하고(도 4), 상기 변이된 ApoA-I과 항암약물을 이용하여 항암약물이 포집된 나노구조체를 제조하였다(도 5).

상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 나노구조체의 제조방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명의 나노구조체의 제조방법은 (ⅰ) 목적하는 약물을 콜릭산 나트륨과 같은 계면활성제를 포함하는 완충용액에 용해 또는 분산시켜서 상기 계면활성제와 목적하는 약물이 결합된 미셀구조체를 형성하는 단계; 및 (ⅱ) 본 발명에 따른 변이 리포단백질과 상기 미셀구조체를 1:50 내지 1:200(몰비)로 혼합하고 임의적으로 희석하여 나노구조체를 형성하는 단계를 포함한다. 이때, 상기 완충용액은 특별히 이에 제한되지 않으나, 나노구조체 형성 완충용액(Tris-HCl 중 콜릭산 나트륨, pH 6~7)이 될 수 있고, 나노구조체를 형성한 후에, 형성된 나노구조체를 포함하는 반응물을 AKTA FPLC 크기 배제 크로마토그래피에 적용하여 나노구조체를 정제하는 단계를 추가로 포함할 수도 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 리포단백질 및 항체가 직접 또는 링커를 통해 연결되어 있고, 분리된 리포단백질의 3차원 구조 내부에 약물이 포집되어 있는 것인 항체-약물 결합체(Antibody-drug conjugate, ADC) 및 그의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 용어 "항체-약물 결합체(Antibody-drug conjugate, ADC)"란, 약물과 연결된 항체 또는 그의 단편으로 구성되는 질환의 표적치료에 사용될 수 있는 면역결합체(immunoconjugate) 형태의 치료제를 의미하는데, 상기 항체는 ADC가 표적세포에 결합할 수 있게 하고, 때로는 상기 항체를 통하여 표적세포의 내부로 유입되어 상기 ADC에 포함된 약물이 상기 유입된 세포로부터 분비되도록 할 수도 있다. 상기 ADC는 종래의 치료제에 비하여 항체를 이용하여 목적하는 세포에 대한 적중율이 우수하기 때문에 부작용이 낮고, 적용범위가 광범위하다는 장점이 있다. 본 발명의 목적상 상기 ADC는 약물이 포집된 리포단백질과 항체가 직접적으로 또는 링커를 통하여 결합된 형태일 수 있다(도 1). 도 1은 본 발명에서 제공하는 ADC의 구조를 나타내는 개략도이다. 항체와 변이리포단백질의 경우 항체의 일차 아민과 변이리포단백질의 티올기를 연결할 수 있는 링커를 통하여 연결되고, 상기 변이리포단백질과 변이리포단백질은 티올기를 통하여 연결되도록 구성될 수 있다. 특히, 상기 티올기를 두 개씩 갖고 있는 변이 리포단백질은 또다른 리포단백질과 연결될 수 있기 때문에, 하나의 항체에 결합될 수 있는 리포단백질의 수는 제한되지 않고, 약물을 포집한 리포단백질의 투여경로에 적합한 수준의 크기가 되도록 하나의 티올기를 포함하는 리포단백질을 이용함으로써, 리포단백질의 수를 조절할 수도 있다.

또한, 본 발명의 목적상 상기 ADC는 그에 포함된 다양한 약물의 종류에 따라, 각 약물의 용도에 부합하는 예방 또는 치료에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 ADC에 포함되는 약물은 항암제일 수 있는데, 상기 항암제는 특별히 이에 제한되지 않으나, DNA 알킬화제(DNA alkylating agent)인 메클로에타민(mechloethamine), 클로람부실(chlorambucil), 페닐알라닌(phenylalanine), 무스타드 (mustard), 사이클로로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 카르무스틴(carmustine: BCNU), 로무스틴(lomustine: CCNU), 스트렙토조토신(streptozotocin), 부설판(busulfan), 티오테파(thiotepa), 및 카보플라틴(carboplatin) 등을 들 수 있으며, 바람직하게는 시스플라틴(cisplatin)이다. 또한, 본 발명에서 사용될 수 있는 항암제는 항암 항생제(anti-cancer antibiotics)인 닥티노마이신(dactinomycin: actinomycin D), 독소루비신(doxorubicin: adriamycin), MTX(methotrexate), SF(Sorafenib), EpoB(Epothilone B), 다우노루비신(daunorubicin), 이다루비신(idarubicin), 미토산트론 (mitoxantrone), 플리카마이신(plicamycin), 미토마이신(mitomycin) 및 C 블레오마이신(C Bleomycin) 등이 될 수 있다.

아울러, 상기 항체-약물 결합체(Antibody-drug conjugate, ADC)는 (a) 상기 변이된 리포단백질 또는 아포리포단백질의 3차원 구조 내부에 약물을 포집시켜 단백질 내부에 약물이 포집된 형태의 구조체를 형성하는 단계; 및, (b) 상기 구조체에 항체를 결합시키는 단계에 의하여 제조될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명자들은 항체를 링커로서 사용되는 sulfo-MBS(Thermo Scientific)를 결합시킨 다음, 상기 결합체에 상기 나노구조체를 가하여 결합시키고, 크로마토그래피에 의하여 상기 항체-링커-나노구조체가 결합된 형태의 ADC를 제조하였다(도 5).

한편, 다른 약물을 사용할 경우에도, 나노구조체를 제조할 수 있는지를 확인하기 위하여, DX(doxorubicin), MTX(methotrexate), SF(Sorafenib) 또는 EpoB(Epothilone B)를 각각 ApoA-I을 가하여, 각 약물과 apoA-I으로 구성된 나노구조체를 제조하고, 이들의 크기를 비교한 결과, 약물이 포함되지 않은 ApoA-I과 별다른 차이를 나타내지 않았으므로, 상기 약물들 역시 ApoA-I에 포집됨을 알 수 있었다(도 12).

본 발명의 ADC는 종래의 복합체에 비하여 현저하게 많은 수의 약물이 항체에 결합된 형태로 제조될 수 있어 약물의 치료효과가 우수할 뿐만 아니라, 치료효과가 약하거나 또는 낮은 수용성을 나타내지만 안전성이 우수한 약물을 사용할 경우에도 우수한 치료효과를 나타낼 수 있어 치료안전성을 향상시킬 수 있고, 약물의 화학적 구조를 변형시키지 않아 약물의 변형에 의하여 유발될 수 있는 위험성을 배제할 수 있으며, 복잡한 결합반응이 수반되지도 않으므로, 효과적인 약물치료제의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 본 발명에서 제공하는 ADC의 구조를 나타내는 개략도이다.
도 2는 두 개의 티올기를 갖도록 변이된 ApoA-I 단백질을 발현시킬 수 있는 발현벡터 pNFXexApoA-1의 개열지도이다.
도 3은 한 개의 티올기를 갖는 변이된 아포리포단백질을 발현시킬 수 있는 발현벡터 pNFXexApoA-1 dimer의 개열지도이다.
도 4는 환원조건 및 비환원조건에서 분석한 전기영동결과를 나타내는 사진이다.
도 5는 항암 약물로 구성된 나노구조체 분획을 나타내는 크로마토그램이다.
도 6은 Sulfo-MBS의 기본 구조를 나타내는 개략도이다.
도 7a는 ADC 반응물을 superose 12 10/300GL컬럼을 이용하여 크기별로 분획한 결과를 나타내는 크로마토그램이다.
도 7b는 상기 분획물을 환원적 조건(RE)과 비환원적 조건(NR)으로 전기영동을 통해 분석한 결과를 나타내는 사진이다.
도 7c는 ADC 반응물을 AKTA FPLC desalting column을 사용하여 분획한 결과를 나타내는 크로마토그램 및 전기영동사진이다.
도 8은 항암약물과 항체로 구성된 ADC에 항암약물이 포집되어 있는지를 확인한 HPLC 분석결과이다.
도 9는 ApoA-I의 3차원적 구조를 나타내는 개략도이다.
도 10은 변이 ApoA-I 단백질과 항암약물의 비율에 따른 나노구조체의 크기변화를 나타내는 크로마토그램이다.
도 11은 본 발명에 따라 제조된 ADC를 각종 암세포에 투여하여 암세포의 사멸능을 분석한 그림이다.
도 12는 DX(doxorubicin), MTX(methotrexate), SF(Sorafenib) 또는 EpoB(Epothilone B)와 ApoA-I를 반응시켜 제조한 각각의 나노구조체의 크기를 비교한 그래프이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 변이된 apolipoprotein A-I의 제조

pET 단백질 발현 시스템을 기반으로 구성된 pNFXex ApoA-I 플라스미드를 중합효소연쇄반응 (PCR, polymerase chain reaction)을 이용하여 아미노산 서열 98 또는 203번의 염기성 아미노산(basic amino acid)인 아르기닌을 시스테인으로 치환하여 각각의 변이 ApoA-I 단백질을 발현시킬 수 있는 발현벡터 pNFXexApoA-1을 제작하였다(도 2). 이때, 상기 PCR은 95℃ 30초 및 18 cycle(95℃ 30초, 55℃ 30초 및 72℃ 2분)의 조건으로 수행하였다. 도 2는 두 개의 티올기를 갖도록 변이된 ApoA-I 단백질을 발현시킬 수 있는 발현벡터 pNFXexApoA-1의 개열지도이다.

상기 제조된 발현벡터 pNFXexApoA-1에 제한효소(NdeI, Not I 또는 HindIII)를 처리하여 절단하고, T4 ligase와 In-fusion 키트(In-Fusionⓡ HD Cloning kit)를 이용하여 상기 절단부위에 정상적인 ApoA-I 유전자를 삽입함으로써 하나의 티올기를 갖도록 변이된 ApoA-I 단백질을 발현시킬 수 있는 발현벡터 pNFXexApoA-1 dimer를 제작하였다(도 3). 도 3은 한 개의 티올기를 갖는 변이된 아포리포단백질을 발현시킬 수 있는 발현벡터 pNFXexApoA-1 dimer의 개열지도이다.

이어, 상기 제작한 각각의 발현벡터 pNFXexApoA-1 또는 pNFXexApoA-1 dimer를 E. coli BL21(DE3)에 도입하여 각각의 형질전환체를 제조하였다. 상기 제조된 각 형질전환체를 50㎍/㎖ 암피실린을 포함하는 10㎖ LB배지에서 37℃조건하에서 12시간 동안 배양하여 배양물을 수득하였으며, 상기 배양물을 동일한 600㎖ LB 배지에 접종시켜 상기 각각의 형질전환체를 대량으로 배양하였다. 상기 배양된 각각의 형질전환체에서 각각의 변이된 ApoA-I 단백질의 발현을 유도하기 위하여, 0.5mM IPTG(isopropyl thiogalactoside)를 배지에 첨가하여 1시간 동안 배양하고, 상기 배양온도를 28℃로 감소시킨 조건에서 5시간 동안 추가로 배양하여 각각의 배양물을 수득하였다.

상기 수득한 각 배양물에 포함된 각각의 변이된 ApoA-I 단백질을 하기의 방법으로 회수하였다: 구체적으로, 상기 수득한 각 배양물을 원심분리하여 각각의 형질전환체를 수득하고, 이를 40mM Tris-HCl 완충(buffer)용액에 현탁시킨 후, 초음파를 처리하여 각 형질전환체를 파쇄함으로써, 각각의 세포파쇄물을 수득하였다. 상기 수득한 각 세포파쇄물을 원심분리하여 각각의 상등액을 수득하고, 이를 고성능 Ni-세파로스™(Quagen)에 적용하고, 세척완충액(40mM Tris-HCl, 0.3M NaCl, 20mM 이미다졸)으로 세척한 다음, 용리완충액(40mM Tris-HCl, 0.3M NaCl, 1M 이미다졸)을 이용하여 각각의 용리액을 수득하였다. 수득한 각 용리액을 40mM Tris-HCl 완충용액으로 투석하여 염이 제거된 시료를 수득하고, 상기 수득한 시료를 동일한 완충용액(40mM Tris-HCl)의 조건하에서 AKTA FPLC desalting column(Amersham Bioscience) 크로마토그래피에 적용하였으며, 이로부터 각각의 변이된 ApoA-I 단백질을 회수하였다.

상기 회수한 각각의 변이된 ApoA-I 단백질의 농도를 측정하고, 이에 근거하여 SDS-PAGE를 이용한 환원(reduced)조건 및 native PAGE를 이용한 비환원(non-reduced)조건에서 각각의 변이된 ApoA-I의 순도 및 크기(molecular weight)를 분석하였다(도 4). 도 4는 환원조건 및 비환원조건에서 분석한 전기영동결과를 나타내는 사진으로서, 도 4의 M레인은 마커를 나타내고 A는 표준형(wild type) ApoA-I 단백질(서열번호 1)을 나타내며, 98은 98번 아미노산이 시스테인으로 치환된 변이된 ApoA-I 단백질(서열번호 3)을 나타내고, 166은 166번 아미노산이 시스테인으로 치환된 변이 ApoA-I 단백질(서열번호 4)을 나타내며, 203은 203번 아미노산이 시스테인으로 치환된 변이 ApoA-I 단백질(서열번호 5)을 나타내고, 230은 230번 아미노산이 시스테인으로 치환된 변이 ApoA-I 단백질(서열번호 6)을 나타낸다. 도 4에서 보듯이 표준형 ApoA-I 단백질(A레인)과 비교하여 각각의 변이 ApoA-I 단백질을 비교한 결과, 비 환원적 조건에서는 이황화결합(disulfide bond)에 의해 형성된 다양한 크기의 밴드로서 각각의 변이 ApoA-I 단백질을 확인할 수 있었다.

실시예 2: 재조합 변이 ApoA -I을 이용한 나노구조체 의 제조

항암약물이 포집된 나노구조체를 제조하기 위해 항암약물(paclitaxel(CAS # 33069-62-4, sigma))을 메탄올에 13mM의 농도로 용해시키고, 이를 이용하여 나노구조체를 제조하였다.

구체적으로, 상기 항암약물이 용해된 메탄올에 질소가스 및 진공상태에서 순차적으로 건조시켜서 메탄올을 완전히 제거하여 항암약물 결정을 수득하고, 이를 나노구조체 형성 완충용액(100 mM Tris-HCl 중 100mM 콜릭산 나트륨, pH7.4)에 용해시킨 다음, 항암약물로 구성된 나노구조체를 유도하기 위해 상기 항암약물이 용해된 완충용액을 초음파로 처리하여 항암약물의 결정형태를 분산시켜 나노구조체 형성 완충용액에 첨가된 콜릭산 나트륨과 서로 결합된 미셀(micelle)구조의 형성을 유도함으로써 안정화시켰다. 이어, 각각의 변이된 Apo A-I 단백질과 미셀구조를 형성한 항암약물의 비율이 1:100(몰비)이 되도록 혼합하고, 이를 희석하여 콜릭산을 제거한 다음, AKTA FPLC 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)에 적용하여 항암약물이 포함된 나노구조체를 분획(fractionation)하고 선별하고, 선별된 분획을 HPLC를 이용하여 정량하여 수득율을 확인하였다(도 5 및 표 1). 도 5는 항암 약물로 구성된 나노구조체 분획을 나타내는 크로마토그램이다.

항암약물이 포집된 나노구조체의 수득율

	초기약물농도(㎍/㎖)	나노구조체에 포집된 최종약물농도(㎍/㎖)	수득률(%)
나노구조체	1400	924	66

상기 표 1에서 보듯이, 약 66%의 수득률로 항암약물이 포집된 나노구조체를 제조할 수 있었다.

실시예 3: ADC 의 제조

상기 제조된 항암약물을 포함하는 나노구조체와 항체를 링커를 이용하여 연결시켜서 ADC를 제조하였다.

본 발명에서 제조된 나노구조체는 위치 지정 돌연변이 (Site-directed mutagenesis)를 통해 티올기(thiol group)을 갖는 시스테인(cysteine)으로 치환된 아미노산서열로 구성되고, 상기 티올기와 효율적으로 연결됨과 동시에 항체에 연결될 수 있는 링커로서 sulfo-MBS(Thermo Scientific)를 사용하였다. 상기 sulfo-MBS는 NHS(N-hydroxysuccinimide ester) 및 말레이미드 그룹을 포함하고, 상기 각 group은 각각 일차아민(primary amine) 및 티올기와 공유결합(covalent conjugation)을 형성한다(도 6). 도 6은 Sulfo-MBS의 기본 구조를 나타내는 개략도이다.

항체와 나노구조체를 서로 결합시키기 위해서, 우선 항체와 링커인 sulfo-MBS를 서로 결합시키고자 하였다. 구체적으로, 준비된 항체를 결합완충용액(conjugation buffer, PBS 중 5mM EDTA, pH 7.2)에 용해시키고, 링커인 sulfo-MBS를 가하여, 항체와 sulfo-MBS의 혼합비가 1:10(몰비)이 되도록 하고, 4℃에서 2시간동안 반응시켰다. 상기 반응액을 AKTA FPLC desalting column(Amersham Bioscience)을 사용한 크로마토그래피에 적용하여 항체와 sulfo-MBS가 결합된 결합체 분획을 수득하고, 상기 결합체 분획에 상기 실시예 2에서 제조한 항암약물이 포집된 나노구조체를 가한다음, 4℃에서 24시간동안 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 반응물을 superose 12 10/300GL컬럼을 이용하여 크기별로 분획하고, 이들 분획을 환원적 조건(RE)과 비환원적 조건(NR)으로 전기영동을 통해 분석하였다(도 7a 및 도 7b). 도 7a는 ADC 반응물을 superose 12 10/300GL컬럼을 이용하여 크기별로 분획한 결과를 나타내는 크로마토그램이고, 도 7b는 상기 분획물을 환원적 조건(RE)과 비환원적 조건(NR)으로 전기영동을 통해 분석한 결과를 나타내는 사진으로서, 녹색선으로 표시된 부분은 ADC를 나타내고, 청색선으로 표시된 부분은 항체를 나타내며, 적색선으로 표시된 부분은 항암약물이 포집된 나노구조체를 나타낸다. 도 7a 및 도 7b에서 보듯이, 항체와 나노구조체에 비하여 상대적으로 거대분자량을 가지는 ADC를 확인할 수 있었으므로, 상기 ADC는 항체와 나노구조체가 결합된 형태임을 확인할 수 있었다.

또한, 상기 반응물을 AKTA FPLC desalting column을 사용한 크로마토그래피에 적용하여 항체-링커-나노구조체가 결합된 결합체(ADC) 분획을 수득하고, 이를 비환원(non-reduced)조건으로 SDS-PAGE를 이용하여 확인하였다(도 7c). 도 7c는 ADC 반응물을 AKTA FPLC desalting column을 사용하여 분획한 결과를 나타내는 크로마토그램 및 전기영동사진이다. 도 7c에서 보듯이, 제조된 ADC는 크로마토그램 상에서 약 200Kda 크기를 나타냄을 확인할 수 있었다.

한편, 상기 제조된 ADC에 나노구조체가 결합되었는지의 여부를 확인하기 위하여 HPLC를 이용하였다(도 8). 도 8은 항암약물과 항체로 구성된 ADC에 항암약물이 포집되어 있는지의 여부를 확인한 HPLC 분석결과로서, Drug STD는 대조군으로서 항암약물의 표준용액을 분석한 결과를 나타내고, ADC는 상기 항암약물이 포집된 ADC를 분석한 결과를 나타낸다. 도 8에서 보듯이, 표준용액의 HPLC 분석피크와 동일한 위치에서 본 발명의 ADC에 포집된 항암약물의 HPLC 분석피크가 검출되었으므로, 본 발명의 ADC가 항암약물이 포집된 나노구조체를 포함하며, ADC의 제조 도중 약물의 변성이 일어나지 않음을 확인할 수 있었다.

이에, 상기 ADC에 포집된 항암약물의 함량을 측정하기 위하여, 1400㎍/㎖ 농도의 항암약물을 ADC에 가하여 반응시키고, 반응액으로부터 ADC를 추출한 다음, 상기 ADC에 포집된 항암약물의 함량을 측정하였다(표 2).

항암약물이 포집된 ADC의 수득율

	초기약물농도(㎍/㎖)	ADC에 포집된 최종약물농도(㎍/㎖)	수득률(%)
ADC	1400	462.8	33

상기 표 2에서 보듯이, ADC에 포집된 항암약물의 농도는 약 462.8㎍/㎖이었으므로, 상기 ADC는 약 33%의 수득률로 항암약물을 포집할 수 있음을 확인하였다.

실시예 4: ADC 에 포집된 항암물질의 함량조절

상기 제조된 ADC에 포집된 항암약물의 양에 따라 상기 나노구조체의 크기가 변화되는지의 여부를 확인하고자 하였다.

즉, 상기 실시예 2에서 사용한 항암약물의 결정을 나노구조체 형성 완충용액(100 mM Tris-HCl 중 100mM 콜릭산 나트륨, pH7.4)에 용해시키고, 초음파로 처리하여 항암약물의 결정형태를 분산시켜서, 상기 콜릭산 나트륨과 항암약물이 결합된 미셀(micelle)구조체를 형성하였다. 그런 다음, 실시예 1에서 제조한 변이 ApoA-I 단백질과 상기 반응액에 포함된 미셀구조체를 1:50, 1:100 및 1:200(몰비)로 혼합하고, 이를 희석하여 콜릭산을 제거한 다음, AKTA FPLC 크기 배제 크로마토그래피에 적용하여 각각의 나노구조체가 용출되는 시점을 비교하여 각 나노구조체의 크기를 비교하였다(도 10). 도 10은 변이 ApoA-I 단백질과 항암약물의 비율에 따른 나노구조체의 크기변화를 나타내는 크로마토그램이다. 도 10에서 보듯이, 항암약물의 함량이 증가할 수록 나노구조체의 크기가 증가함을 알 수 있었다. 이는 하나의 나노구조체에 포집된 항암약물의 함량을 조절할 수 있고, 이처럼 하나의 나노구조체에 포집된 항암약물의 함량을 조절할 경우 이에 의하여 나노구조체의 크기가 변화된다는 점을 시사하는 것으로 분석되었다.

실시예 5: ADC 를 이용한 암세포의 사멸

상기 실시예 3에서 제조된 ADC의 암세포 사멸능을 확인하였다.

본 발명에서 제시된 ADC의 효능을 조사하기 위하여 유방암 세포주 2종을 대상으로 ADC의 세포 사멸능을 확인하였다. MCF-7은 HER2 유전자를 낮은 수준에서 발현하는 것으로 알려져 있으며 SK-Br-3은 HER2 유전자를 높은 수준으로 발현하는 것으로 알려져 있다. 또한, 이들에 대한 항체인 Trastuzumab (INN; trade name Herceptin)은 HER2 유전자를 발현하는 세포에 대해 사멸능이 있는 것으로 알려져 있다. 항암 약물로서는 파클리탁셀을 이용하였다.

상기의 세포를 배양한 후 약물을 처리하고 24시간 또는 48시간 후에 MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)를 이용하여 살아남아 있는 세포(즉 cell viability)를 측정하였다. 도 11에 도시된 바와 같이, 파클리탁셀(PTX)은 HER2를 낮은 수준으로 발현하고 있는 MCF-7 세포에 대해서는 48시간 후에 약 40%의 사멸능을 보였으나 HER2를 과발현하고 있는 SK-Br-3 세포는 거의 사멸하지 못하였다. HER2에 대한 항체인 Herceptin 은 HER2를 과발현하는 SK-Br-3를 약 40% 수준으로 사멸하였다. 실시예 3에 따라 제조된 ADC(항체로서 Herceptin, 약물로서 paclitaxel를 이용)를 처리한 경우 세포의 사멸능은 획기적으로 증가하여 90%이상의 세포들이 사멸되었다. 따라서, paclitaxel과 같은 항암제나 Herceptin과 같은 항암 항체와 같은 종래 기술에 의해서는 매우 낮은 암세포의 사멸도를 본 발명에 따른 ADC에 의해 획기적으로 증가시킬 수 있음을 증명하였다.

실시예 6: 파클리탁셀 이외의 약물을 포함하는 나노구조체의 제조 및 특성 평가

상기 실시예 2의 나노구조체 제조시에 사용된 파클리탁셀 이외의 약물을 포함하는 나노구조체를 제조하고, 상기 제조된 각각의 나노구조체가 Apo A-I의 내부에 약물이 포집된 형태로 구성되는지를 확인하고자 하였다.

실시예 6-1: 파클리탁셀 이외의 약물을 포함하는 나노구조체의 제조

항암약물로서 파클리탁셀 대신에 DX(doxorubicin), MTX(methotrexate), SF(Sorafenib) 또는 EpoB(Epothilone B)를 사용하고, Apo A-I 단백질과 미셀구조를 형성한 항암약물의 비율을 1:200(몰비)으로 하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 2와 동일한 방법을 이용하여 파클리탁셀 이외의 약물을 포함하는 각각의 나노구조체를 제조하였다.

실시예 6-2: 파클리탁셀 이외의 약물을 포함하는 나노구조체의 크기분석

상기 실시예 6-1에서 제조한 각각의 나노구조체의 크기를 약물을 포집하지 않은 ApoA-I의 크기와 비교하였다(도 12). 도 12는 DX(doxorubicin), MTX(methotrexate), SF(Sorafenib) 또는 EpoB(Epothilone B)와 ApoA-I를 반응시켜 제조한 각각의 나노구조체의 크기를 비교한 그래프이다. 도 12에서 보듯이, 각각의 서로 다른 약물이 포집된 4종의 나노구조체는 약물을 포집하지 않은 ApoA-I과 크기면에서 거의 동일함을 알 수 있었다.

이는 나노구조체가 DX, MTX, SF 또는 EpoB를 포함할 경우에도, 파클리탁셀과 유사하게, ApoA-I의 내부에 포집된 형태로 구성됨을 의미하는 것으로 분석되었다.

<110> SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY Foundation for Corporate Collaboration <120> Antibody-drug conjugate comprising apolipoprotein <130> PA120886/KR <150> KR10-2012-0019344 <151> 2012-02-24 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 258 <212> PRT <213> ApoA-I <400> 1 Met His His His His His His Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser Ile Asp 1 5 10 15 Asp Pro Pro Gln Ser Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val 20 25 30 Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe 35 40 45 Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn 50 55 60 Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly 65 70 75 80 Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly 85 90 95 Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val 100 105 110 Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu 115 120 125 Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly 130 135 140 Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly 145 150 155 160 Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr 165 170 175 His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg 180 185 190 Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His 195 200 205 Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro 210 215 220 Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe 225 230 235 240 Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn 245 250 255 Thr Gln <210> 2 <211> 777 <212> DNA <213> ApoA-I <400> 2 atgcatcacc atcaccatca cggcctggtg ccgcgcggca gcatcgatga tccgccgcag 60 agtccatggg atcgcgtgaa ggacctggcc actgtgtacg tggatgtgct caaagacagc 120 ggcagagact atgtgtctca gtttgaagga tccgccttgg gcaaacaatt gaaccttaag 180 ctgctggaca actgggacag cgtgacgtcc accttcagca agctgcgcga acagctcggc 240 cctgtgaccc aggaattctg ggataacctg gaaaaggaga cagagggcct gcgccaggag 300 atgagcaagg atctggagga ggtgaaggcc aaggtgcagc cgtacctgga cgacttccag 360 aagaagtggc aggaggagat ggagctctac cgccagaagg tggagccgct gcgcgcagag 420 ctgcaggagg gcgcgcgcca gaagctgcac gagctgcaag agaagctgag cccactgggc 480 gaggagatgc gcgaccgcgc gcgcgcccat gtcgacgcgc tgcgcacgca tctggcgccg 540 tacagcgacg agctgcgcca gcgcttagcg gcgcgccttg aggctctcaa ggagaacggc 600 ggggcccgcc tggccgagta ccacgccaag gccaccgagc atctgagcac gctcagcgag 660 aaggccaagc cggcgctcga ggacctgcgc caaggcctgc tgccggtgct ggagagcttc 720 aaggtcagct tcctgagcgc tctggaagag tacactaaga agcttaacac ccagtga 777 <210> 3 <211> 258 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ApoA-I mutant <400> 3 Met His His His His His His Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser Ile Asp 1 5 10 15 Asp Pro Pro Gln Ser Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val 20 25 30 Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe 35 40 45 Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn 50 55 60 Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly 65 70 75 80 Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly 85 90 95 Leu Cys Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val 100 105 110 Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu 115 120 125 Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly 130 135 140 Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly 145 150 155 160 Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr 165 170 175 His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg 180 185 190 Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His 195 200 205 Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro 210 215 220 Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe 225 230 235 240 Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn 245 250 255 Thr Gln <210> 4 <211> 258 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ApoA-I mutant <400> 4 Met His His His His His His Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser Ile Asp 1 5 10 15 Asp Pro Pro Gln Ser Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val 20 25 30 Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe 35 40 45 Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn 50 55 60 Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly 65 70 75 80 Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly 85 90 95 Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val 100 105 110 Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu 115 120 125 Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly 130 135 140 Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly 145 150 155 160 Glu Glu Met Arg Asp Cys Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr 165 170 175 His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg 180 185 190 Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His 195 200 205 Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro 210 215 220 Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe 225 230 235 240 Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn 245 250 255 Thr Gln <210> 5 <211> 258 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ApoA-I mutant <400> 5 Met His His His His His His Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser Ile Asp 1 5 10 15 Asp Pro Pro Gln Ser Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val 20 25 30 Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe 35 40 45 Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn 50 55 60 Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly 65 70 75 80 Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly 85 90 95 Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val 100 105 110 Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu 115 120 125 Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly 130 135 140 Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly 145 150 155 160 Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr 165 170 175 His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg 180 185 190 Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala Cys Leu Ala Glu Tyr His 195 200 205 Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro 210 215 220 Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe 225 230 235 240 Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn 245 250 255 Thr Gln <210> 6 <211> 258 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ApoA-I mutant <400> 6 Met His His His His His His Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser Ile Asp 1 5 10 15 Asp Pro Pro Gln Ser Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val 20 25 30 Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe 35 40 45 Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn 50 55 60 Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly 65 70 75 80 Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly 85 90 95 Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val 100 105 110 Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu 115 120 125 Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly 130 135 140 Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly 145 150 155 160 Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr 165 170 175 His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg 180 185 190 Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His 195 200 205 Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro 210 215 220 Ala Leu Glu Asp Leu Cys Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe 225 230 235 240 Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn 245 250 255 Thr Gln

Claims

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서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 아포리포단백질 A-I에서 98번 아미노산 잔기, 166번 아미노산 잔기, 203번 아미노산 잔기 및 230번 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기가 시스테인으로 치환된, 변이된 아포리포단백질 A-I.
제2항에 있어서,
상기 치환된 시스테인을 통하여 항체와 연결될 수 있는 것인 변이된 아포리포단백질 A-I.
제2항에 있어서,
상기 치환된 시스테인을 통하여 둘 이상의 변이된 아포리포단백질 A-I이 상호 연결될 수 있는 것인 변이된 아포리포단백질 A-I.
삭제
제2항에 있어서,
서열번호 3 내지 5로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 것인 변이된 아포리포단백질 A-I.
제3항 또는 제4항에 있어서,
이황화 결합 또는 링커를 통해 연결되는 것인 변이된 아포리포단백질 A-I.
제7항에 있어서,
상기 링커는 일차아민과 공유결합할 수 있는 NHS(N-hydroxysuccinimide ester), 티올기와 공유결합할 수 있는 말레이미드 그룹(maleimide group) 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 변이된 아포리포단백질 A-I.
제8항에 있어서,
상기 링커는 m-말레이미도벤조일-설포숙신이미딜 에스테르(m-MaleimidoBenzoyl-SulfoSuccinimidyl ester)인 것인 변이된 아포리포단백질 A-I.
제2항 내지 제4항 또는 제6항 중 어느 한 항의 변이된 아포리포단백질 A-I 내부에 약물이 포집되어 있는, 변이된 아포리포단백질 A-I과 약물의 복합체인 나노구조체.
제10항에 있어서,
둘 이상의 변이된 아포리포단백질 A-I이 치환된 시스테인을 통하여 서로 연결되어 있는 것인 나노구조체.
(ⅰ) 목적하는 약물을 미셀 형성가능한 계면활성제를 포함하는 완충용액에 용해 또는 분산시켜서 상기 계면활성제와 목적하는 약물이 결합된 미셀구조체를 형성하는 단계; 및
(ⅱ) 제2항 내지 제4항 또는 제6항 중 어느 한 항의 변이된 아포리포단백질 A-I과 상기 미셀구조체를 1:50 내지 1:200(몰비)로 혼합하여 변이된 아포리포단백질 A-I 내부에 약물이 포집되어 있는 나노구조체를 형성하는 단계를 포함하는, 변이된 아포리포단백질 A-I 내부에 약물이 포집된, 변이된 아포리포단백질 A-I과 약물의 복합체인 나노구조체를 제조하는 방법.
제12항에 있어서,
계면활성제는 콜릭산 나트륨인 것인 방법.
제12항에 있어서,
상기 완충용액은 나노구조체 형성 완충용액(Tris-HCl 중 콜릭산 나트륨, pH 6~8)인 것인 방법.
제12항에 있어서,
형성된 나노구조체를 포함하는 반응물을 크기 배제 크로마토그래피에 적용하여 나노구조체를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
아포리포단백질 A-I 및 항체가 직접 또는 링커를 통해 연결되어 있고,
상기 아포리포단백질 A-I의 내부에 약물이 포집되어 있는 형태의 항체-약물 결합체(Antibody-drug conjugate, ADC).
제16항에 있어서,
아포리포단백질 A-I은 천연 단백질 또는 변이된 단백질인 것인 항체-약물 결합체(Antibody-drug conjugate, ADC).
제16항에 있어서,
아포리포단백질 A-I의 내부에 포집되어 있는 약물은 100개 분자 단위 또는 그 이상의 스케일인 것인 항체-약물 결합체(Antibody-drug conjugate, ADC).
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제17항에 있어서,
상기 아포리포단백질 A-I은 제2항 내지 제4항 또는 제6항 중 어느 한 항의 변이된 아포리포단백질 A-I인 것인 항체-약물 결합체(Antibody-drug conjugate, ADC).
제20항에 있어서,
둘 이상의 변이된 아포리포단백질 A-I이 치환된 시스테인을 통하여 서로 연결되어 있는 것인 항체-약물 결합체(Antibody-drug conjugate, ADC).
제16항에 있어서,
약물을 계면활성제와 반응시켜서 미셀구조체를 형성하고, 상기 미셀구조체의 계면활성제를 아포리포단백질 A-I으로 치환하여 아포리포단백질 A-I의 내부에 약물을 포집시킨 것인 항체-약물 결합체(Antibody-drug conjugate, ADC).
제17항에 있어서,
서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 아포리포단백질 A-I에서 98번 아미노산 잔기, 166번 아미노산 잔기, 203번 아미노산 잔기 및 230번 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기가 시스테인으로 치환된, 변이된 아포리포단백질 A-I의 내부에 약물이 포집되어 있는, 변이된 아포리포단백질 A-I과 약물의 복합체 형태인 나노구조체와 항체가 결합된 것인 항체-약물 결합체(Antibody-drug conjugate, ADC).
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(a) 아포리포단백질 A-I의 내부에 약물을 포집시켜 단백질 내부에 약물이 포집된 형태의 구조체를 형성하는 단계; 및,
(b) 상기 구조체에 항체를 결합시키는 단계를 포함하는, 제16항의 항체-약물 결합체의 제조방법.
제26항에 있어서, 상기 아포리포단백질 A-I은 제2항 내지 제4항 또는 제6항 중 어느 한 항의 변이된 아포리포단백질 A-I인 것인 제조방법.