KR101533469B1 - Ｒａｓ의 Ｔｈｒ-144번과 Ｔｈｒ-148번의 인산화의 감지를 통한 암 진단 방법, 항암제 스크리닝 및 약효테스트 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 Ras를 이용한 암 진단 방법 및 항암제 스크리닝 방법에 관한 것이다. Ras는 거의 대부분의 암에서 그의 이상이 발견되고 있는 중요한 원발암 유전자로서, Ras를 이용한 암 진단 및 항암제 스크리닝 방법은 다양한 암에 적용될 수 있어 매우 중요한 의미를 갖는다. 본 발명에 따르면 Ras의 Thr144 및 Thr148 위치에서의 인산화 여부를 조사하여 각종 암의 발생 여부를 조기에 판단할 수 있으며, 이러한 메커니즘을 이용하여 우수한 항암 효과를 갖는 항암제를 스크리닝하거나 항암제의 약효를 테스트할 수 있다.

Description

Ｒａｓ의 Ｔｈｒ-144번과 Ｔｈｒ-148번의 인산화의 감지를 통한 암 진단 방법, 항암제 스크리닝 및 약효테스트 방법{Methods for cancer diagnosis, anti-cancer drug screening, and test of drug effectiveness on the basis of phoshorylation of Ras at Thr-144 and Thr-148}

본 발명은 Ras를 이용한 암 진단 방법 및 항암제 스크리닝 방법에 관한 것이다.

Ras 단백질은 GDP/GTP 변환에 의해 그의 활성이 조절되는 작은 구아닌 뉴클레오티드 결합 단백질이다(I. R. Vetter, A. Wittinghofer, Science 294, 1299-1304 (2001)). 비가수분해적인 GTP-결합 돌연변이를 통한 Ras의 비정상적인 활성은 인간의 암 발생의 중요한 요인으로(J. L. Bos, Cancer Res. 49, 4682-2689(1989)), 대부분의 암에서 Ras의 변이를 발견할 수 있다. H-, N- 및 K-Ras 아이소 폼은 아미노산서열에서 높은 유사성을 공유하며, 기능적 특이성을 결정하는 카복시 말단의 고가변 영역을 통해서 다양성을 갖게 된다(K. Wennerberg, K. L. Rossman, C. J. Der, J. Cell Sci. 118, 843-846 (2005)). Ras 활성은 여러 메카니즘에 의해 조절되는데, GTP- 와 GDP- 결합형태의 치환을 통한 활성화 조절, 세포 막으로 의 이동 여부를 결정하는 지질 결합 조절을 포함한다(S. Schubbert, K. Shannon, G. Bollag, Nat. Cancer Rev. 7, 295-308 (2007)). Ras 단백질 trafficking은 모노- 및 디-유비퀴틴화에 의해서도 영향을 받는 것으로 알려져 있다(N. Jura, E. Scotto-Lavino, A. Sobczyk, D. Bar-Sagi, Mol. Cell.21, 679-687 (2006)). 그러나, 그러한 유비퀴틴화를 조절하는 메커니즘과 Ras 유비퀴틴화에 따른 세포 혹은 개체에 대한 생리학적 결과는 알려져 있지 않다.

본 발명은 원발암 유전자인 Ras를 이용한 새로운 암 진단 방법 및 항암제 스크리닝 방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 원발암유전자인 Ras의 Thr144 및 Thr148 위치에서의 인산화 여부를 조사하는 것을 포함하는 Ras의 단백질 수준을 분석하는 방법을 제공한다.

본 발명에 의해 밝혀진 바에 따르면, H-Ras의 세포 내 수준은 폴리 유비퀴틴화된 H-Ras의 프로티아좀에 의한 단백질 분해에 의해 조절되며 이는 GSK3β 의존적으로 일어난다. H-Ras의 폴리유비퀴틴화가 β-TrCP 에 의해 매개되기 위해서는 GSK3β에 의해 H-Ras가 인산화 되어야 하며, H-Ras의 Thr144 및 Thr148 부위가 인산화 된다. 하기 실시예들은 원발암유전자인 H-Ras의 단백질 수준의 안정성 조절이 세포 증식, 암의 발생과 상관관계가 있음을 보여주고 있다. 예를 들어 H-Ras의 Thr144 및 Thr148 부위에 돌연변이나 H-Ras의 Thr144 및 Thr148 부위의 인산화를 조절하는 GSK3β 혹은 Wnt/beta-catenin 신호전달계의 유전자들의 돌연변이 등 이상이 일어나 H-Ras의 폴리유비퀴틴화가 일어나지 않는다면 그에 따라 H-Ras의 단백질 분해가 이루어지지 않아 암이 발생할 수 있다. 반면 H-Ras의 Thr144 및 Thr148 부위에 인산화가 일어나면, Ras에 암을 일으키는 형태의 돌연변이 (12, 13, 61 돌연변이)가 일어나더라도 암이 발생되지 않을 수 있다. 따라서 H-Ras의 Thr144 및 Thr148 위치에서의 인산화 여부를 조사하여 H-Ras의 단백질 수준을 분석함으로써 암을 진단할 수 있다. H-Ras는 음성적인 Wnt/β-catenin 신호를 통해 E3-라이게이즈 유비퀴틴연결효소인 β-TrCP에 의해 유비퀴틴화되어 단백질체적인 조절을 받는다. Axin과 GSK3β에 의해 H-Ras에 β-TrCP가 결합하여 분해를 유도시킨다. 본 발명은 Ras의 트레오닌 144번과 148번이 GSK3β에 의해 인산화 되는 것을 생체외 인산화 검사 후 LC/MC-MS/MS 기계분석을 통해 밝혔다. Wnt/β-catenin 신호를 통한 GSK3β의 조절이 H-Ras의 인산화와 유비퀴틴화에 중요하다는 것을 인산화 된 형태와 인산화 될 수 없는 형태의 돌연변이체를 GSK3β 정상 세포와 넉아웃 세포에 발현 후 조절을 통해 보여주었다. Wnt/β-catenin 신호를 통한 H-Ras의 인산화는 인산화된 H-Ras를 특이적으로 인식하는 토끼 다클론성 항체를 통해 확인되었다. GSK3β의 인산화를 통한 H-Ras의 불안정화는 류신 61번이 치환된 발암성 Ras에 의해 유도되어지는 세포증식과 세포암화도 β-TrCP와 Wnt/β-catenin 신호전달계를 통한 단백질 조절 및 폴리유비퀴틴화의 조절을 통해 억제할 수 있다는 것을 밝혔다. 또한 H-Ras와 다른 아이소 형태의 K-Ras와 N-Ras도 인산화가 되는 Thr 잔기가 보존되어 있고, β-TrCP에 의해 단백질 조절 및 폴리 유비퀴틴화가 조절되는 등의 같은 기작을 통해 분해되는 것을 확인하였다.

Ras의 Thr144 및 Thr148에서의 인산화 여부를 조사하기 위해서는 공지의 기술을 이용할 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서는, Ras의 Thr144 및 Thr148에서의 인산화 여부의 조사를 Ras의 Thr144 및 Thr148 인산기를 특이적으로 인식하는 항체를 이용한 항원항체 반응을 통해 수행하는 방법을 제공한다. 상기 항체는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체일 수 있다. 예컨대, Ras의 Thr144 및 Thr148의 인산기를 특이적으로 인식하는 모노클로날 항체는 당업계에 통상적인 모노클로날 항체 제작 방법을 통해 제작하여 사용할 수 있다. 상기 모노클로날 항체에 마커가 표지된 2차 항체를 처리하거나 상기 모노클로날 항체에 직접 마커를 컨쥬게이션시키면 마커에 의해 쉽게 Ras의 Thr144 및 Thr148의 인산기 존재 여부를 조사할 수 있게 된다. 이러한 마커로는 방사선 동위원소, 발광 물질, 발색 반응 효소 등을 이용할 수 있을 것이다. 예를 들어, GFP, YFP, RFP, BFP 등과 같은 형광단백질을 마커로 사용하여 표지하는 경우 다양한 형광측정법을 통해 상기 모노클로날 항체의 양을 측정함으로써 Ras의 Thr144 및 Thr148에서의 인산화 여부를 판단할 수 있다. 다르게는, Ras의 Thr144 및 Thr148의 인산기를 특이적으로 인식하는 모노클로날 항체를 Ras에 처리하고 ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent assay) 방법을 사용하여 발색반응시킴으로써 정량분석하여 수행할 수 있다. 이 경우 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase, AP) 또는 호올스래디쉬 퍼록시다제(horseradish peroxidase, HRP) 등의 효소가 컨쥬게이션된 2차 항체 및 이들의 기질을 사용하여 발색반응시킴으로써 정량분석하거나, 아니면 직접 Ras의 Thr144 및 Thr148의 인산기를 특이적으로 인식하는 모노클로날 항체에 AP 또는 HRP 효소 등이 컨쥬게이션된 것을 사용하여 정량분석할 수도 있다.

한 구체예에서, 상기 항체는 Ras의 140번 내지 152번의 아미노산을 포함하고 Thr144와 Thr148 잔기가 인산화되어 있는 Ras 펩타이드에 대한 항체일 수 있다. 하기 실시예에서는 keyhole limpet hemocyanin (KLH) carrier 단백질이 붙어있는 H-Ras의 Thr144 및 Thr148이 인산화된 펩타이드(residues 140-152 PYIEpTSAKpTRQGV)를 토끼에 찔러 항체를 형성시키고, 희생시켜 토끼의 혈액으로부터 정제한 p-Ras 항체를 Ras의 Thr144 및 Thr148 위치에서의 인산화 여부를 감지할 수 있는 항체로서 사용하였다.

본 발명은 또한 Ras의 Thr144 및 Thr148의 인산기를 특이적으로 인식하는 항체를 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다. 상기 암 진단용 조성물에 포함되는 항체는 상기 언급한 Ras의 140번 내지 152번의 아미노산을 포함하고 Thr144와 Thr148 잔기가 인산화되어 있는 Ras 펩타이드에 대한 항체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 항체는 공지의 방법으로 제작된 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체일 수 있다. 상기 조성물은 항체 외에도, 항체의 구조를 안정하게 유지시키는 증류수 또는 완충액을 포함할 수 있다. 상기 암 진단용 조성물을 이용하면 Ras의 Thr144 및 Thr148 인산기를 특이적으로 인식하는 항체의 양을 분석함으로써 Ras의 Thr144 및 Thr148 위치에서의 인산화 여부를 보다 쉽게 조사하고, Ras의 단백질 수준을 분석할 수 있게 된다.

또한 본 발명은 Ras의 Thr144 및 Thr148의 인산기를 특이적으로 인식하는 항체를 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다. 상기 암 진단용 키트에 포함되는 항체는 상기 언급한 Ras의 140번 내지 152번의 아미노산을 포함하고 Thr144와 Thr148 잔기가 인산화되어 있는 Ras 펩타이드에 대한 항체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 항체는 공지의 방법으로 제작된 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체일 수 있다. 상기 암 진단용 키트는 Ras의 Thr144 및 Thr148의 인산기를 특이적으로 인식하는 항체 외에도 상기 항체나 그에 대한 2차 항체에 컨쥬게이션되어 있는 마커를 탐지할 수 있는 기질을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, AP 또는 HRP 효소 등이 마커로서 컨쥬게이션되어 있는 경우 이들의 기질을 추가로 포함할 수 있다. 상기 암 진단용 키트는 예를 들어, Ras의 Thr144 및 Thr148의 인산기를 특이적으로 인식하는 모노클로날 항체가 96-웰 플레이트에 부착되어 있고, 상기 모노클로날 항체나 그에 대한 2차 항체에 컨쥬게이션되어 있는 마커를 탐지할 수 있는 기질이 별도로 포장되어 있는 형태일 수 있다. 이 경우 진단 대상으로부터 얻은 세포 또는 조직 파쇄물 샘플 등과 상기 기질을 96-웰 플레이트에 가하고, 마커를 발현시켜 모노클로날 항체의 부착 정도를 정량분석함으로써 Ras의 단백질 수준을 확인하고 암을 진단할 수 있다.

본 발명은 또한 후보물질과 Ras를 접촉시키고, Ras의 Thr144 및 Thr148 위치에서의 인산화 여부를 조사하고, 상기 후보물질이 인산화를 저해하는지 또는 촉진하는지를 판단하는 것을 포함하는 항암제 스크리닝 방법을 제공한다. Ras의 Thr144 및 Thr148 위치에서의 인산화 여부에 따라 Ras의 유비퀴틴화와 단백질 수준이 결정되는 바, 후보물질이 인산화를 저해하는 경우 Ras의 단백질 수준을 높이므로 암 발생을 일으키는 발암물질이라고 판단할 수 있고, 반대로 후보물질이 인산화를 촉진하는 경우 Ras의 단백질 분해를 촉진하므로 암을 억제하는 항암제라고 판단할 수 있다.

본 발명의 한 구체적인 예에서, 후보 물질이 인산화를 저해하는지 또는 촉진하는지를 판단하는 것은 Ras의 Thr144 및 Thr148의 인산기를 특이적으로 인식하는 항체를 이용한 항원항체 반응을 통해 수행될 수 있다. 상기 항체에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다. 후보 물질이 인산화를 저해하는지 또는 촉진하는지를 판단하는 것은 예를 들어, Thr144 및 Thr148의 인산기를 특이적으로 인식하는 모노클로날 항체가 부착되어 있는 플레이트에 후보물질과 상기 모노클로날 항체나 그에 대한 2차 항체에 컨쥬게이션되어 있는 마커를 탐지할 수 있는 기질을 가하고 마커를 발현시켜 모노클로날 항체의 부착 정도를 정량분석함으로써 판단할 수 있게 된다.

마찬가지의 원리에 의해 본 발명은 후보물질을 세포 또는 인간을 제외한 동물에 처리하고, Ras의 Thr144 및 Thr148 위치에서의 인산화 여부를 조사하고, 상기 후보물질이 인산화를 저해하는지 또는 촉진하는지를 판단하는 것을 포함하는 항암제 스크리닝 방법을 제공한다. 본 발명의 스크리닝 방법에서, 후보물질은 통상적인 선정방식에 따라 항암제로서의 가능성을 지닌 것으로 추정되거나 또는 무작위적으로 선정된 개별적인 핵산, 단백질, 기타 추출물 또는 천연물, 화합물 등이 될 수 있다.

본 발명은 또한 Ras의 Thr144 및 Thr148의 인산기를 특이적으로 인식하는 항체를 포함하는 항암제 스크리닝용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 항체 외에도, 항체의 구조를 안정하게 유지시키는 증류수 또는 완충액을 포함할 수 있다. 상기 항암제 스크리닝용 조성물을 이용하면 각 후보물질의 처리에 따른 Ras의 Thr144 및 Thr148의 인산기를 특이적으로 인식하는 항체의 양을 분석함으로써 Ras의 Thr144 및 Thr148 위치에서의 인산화 여부를 보다 쉽게 조사하고, 상기 후보물질이 인산화를 저해하는지 또는 촉진하는지를 쉽게 분석할 수 있게 된다. 상기 항체는 앞서 설명한 바와 같다.

본 발명은 또한 항암제를 인간을 제외한 동물에 처리하고, Ras의 Thr144 및 Thr148 위치에서의 인산화 여부를 조사하고, 상기 항암제가 인산화를 저해하는지 또는 촉진하는지를 판단하는 것을 포함하는 항암제의 약효를 검증하는 방법을 제공한다. Thr144 및 Thr148위치에서의 인산화 여부를 조사하고, 상기 항암제가 인산화를 저해하는지 또는 촉진하는지를 판단하는 과정은 앞서 설명한 항암제 스크리닝 방법과 동일하다.

본 발명은 또한 Ras의 Thr144 및 Thr148의 인산기를 특이적으로 인식하는 항체를 제공한다. 상기 항체는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체일 수 있다. H-Ras의 Thr144 및 Thr148의 인산기를 특이적으로 인식하는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체는 당업계에 통상적인 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체 제작 방법을 통해 제작하여 사용할 수 있다. 한 구체예에서, 상기 항체는 앞서 설명한 Ras의 140번 내지 152번의 아미노산을 포함하고 Thr144와 Thr148 잔기가 인산화되어 있는 Ras 펩타이드에 대한 항체일 수 있다.

Ras는 거의 대부분의 암에서 그의 이상이 발견되고 있는 중요한 원발암 유전자로서, Ras를 이용한 암 진단 및 항암제 스크리닝 방법은 다양한 암에 적용될 수 있어 매우 중요한 의미를 갖는다. 본 발명에 따르면 Ras의 Thr144 및 Thr148 위치에서의 인산화 여부를 조사하여 각종 암의 발생 여부를 조기에 판단할 수 있으며, 이러한 메커니즘을 이용하여 우수한 항암 효과를 갖는 항암제를 스크리닝하거나 항암제의 약효를 테스트할 수 있다.

도 1은 H-Ras가 GSK3β에 의해(도1A), β-TrCP와 Axin에 의해(도1B) 폴리유비퀴틴화가 증가됨을 확인하고, GSK3β와 Axin의 siRNA에 의해 폴리유비퀴틴화가 반대로 감소함을 보여주는 이뮤노블럿 결과를 나타낸다.
도 2는 정제된 히스텍과 융합된 H-Ras(His-H-Ras)가 GSK3β에 의해 인산화 되는 것을 생체외 인산화 검사를 통해 보여주며(도 2A), H-Ras에 GSK3β 인산화의 보존적 서열이 존재한다는 것을 보여준다(도 2B).
도 3은 H-Ras가 GSK3β에 의해 144번과 148번 트레오닌이 인산화되는 것을 인산화가 일어난 H-Ras를 분리하여 수행한 액체 크로마토그래피-질량분석법(LC-tandam MS/MS 방법)에 의해 찾은 결과를 보여준다.
도 4는 GSK3β 정상 세포와 넉아웃 세포에서 H-Ras 야생형과 61번 류신 치환에 의해 활성화(암 유발형태)된 H-Ras와 또 각각의 T144/T148 잔기가 인산화된 형태(트레오닌 잔기들을 구르타믹산으로 치환)또는 인산화될 수 없는 형태의 돌연변이(트레오닌 잔기를 알라닌으로 치환) 의 경우, β-TrCP에 의한 H-Ras 조절(도 4A, 도 4B) 여부를 보여주는 이뮤노블롯 결과와, 세포학적 분석결과(도 4C)를 보여준다.
도 5는 H-Ras 야생형과 T144/T148 잔기가 인산화된 형태의 돌연변이의 경우 β-TrCP에 의한 H-Ras 단백질분해(도 5A)와 폴리유비퀴틴화(도 5B)가 촉진되며, 반대로 Wnt3a에 의해서는 감소함을 보여주는 이뮤노블럿 결과이다.
도 6은 인산화된 H-Ras 단백질을 인식하는 항체가 인산화가 일어나지 않는 돌연변이 H-Ras를 감지하지 못하는 반면, 인산화된 H-Ras를 특이적으로 검출함을 보여주고(도 6A), GSK3β에 의해 H-Ras의 인산화가 증가함을(도 6B) 동일한 항체를 이용한 이뮤노블롯 결과로 보여 주는 그림이다.
도 7은 61번 류신 치환에 의해 활성화된 H-Ras에 T144/T148 잔기가 인산화되지 못하는 돌연변이를 추가적으로 도입한 경우 β-TrCP나 Axin에 의해 세포증식(도 7A)이나 암화(도 7B)가 조절되지 않음을 보여준다.
도 8은 K-Ras와 N-Ras 도 H-Ras와 마찬가지로, ALLN의 처리에 의해 과발현시킨 Ras단백질의 폴리유비퀴틴화가 증가함을 보여주며(도 8A), β-TrCP에 의해 단백질양적인 감소(도 8B)가 일어남을 보여주는 이뮤노블럿 결과이다.
도 9는 H-, K-, N-Ras의 단백질양이 GSK3β 정상 세포보다 GSK3β 유전자가 넉아웃 세포에서 증가함을 보여주는 이뮤노블럿 결과를 나타낸다(도 9A). H-Ras에 있는 GSK3β 에 의해 인산화 되는 아미노산 서열이 K-, N-Ras에도 보존되어 있음을 보여준다(도 9B).

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본발명의 개시가 완전하도록 하고, 본발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

[실시예]

실시예 1. GSK3β에 의한 Ras 단백질의 폴리유비퀴틴화 확인

GSK3β가 Ras 단백질의 양을 조절할 수 있는지 확인하고자, GSK3β를 증폭시킨 군과 GSK3β를 siRNA를 이용해 감소시킨 군에서의 Ras의 단백질양 및 폴리유비퀴틴화의 변화를 관찰하였다. 먼저, 인간 H-Ras cDNA를 인간배아세포 (HEK293)에서 역-PCR 방법을 이용하여 증폭하여 얻었고, EcoRI/HindIII 사이트를 이용하여 pcDNA 3.1 (invitrogen) 벡터에 넣어 pcDNA3.1-H-Ras-Myc를 제작하였다. 유사한 방법으로 pcDNA3.1-GSK3β-V5를 제작하였다. HEK293 세포를 각각 pcDNA3.1-H-Ras-Myc와 pcDNA3.1-GSK3β-V5, GSK3β를 타겟팅하는 siRNA로 형질전환시켰다. 형질전환 24시간 후 12시간 동안 프로테아좀 저해제인 ALLN을 세포들에 처리하여 배양한 후 세포 분해물을 항-pan-Ras 항체로 면역침전시키고, IPL(immunoprecipitated lysates)을 항-Flag 항체로 면역블롯을 수행하여 폴리유비퀴틴화된 H-Ras 단백질을 탐지하였다. 전세포분해물 중의 GSK3β, Pan-Ras, Myc-HRas 및 α-튜불린은 이뮤노블롯팅에 의해 탐지하였다. GSK3β(유전자은행 어세션 번호: NM_002093)의 siRNA 서열은 5'-CACUGAUUAUACCUCUAGU-3' 과 5'-CACUGUAACAUAGUCCGAU-3'이다. GFP siRNA( 5'-GCAUCAAGGUGAACUUCAA-3')는 대조군으로 사용하였다. 모든 siRNA는 삼천리 제약에서 합성하였다.

또한, GSK3β 정상 세포와 넉아웃 세포를 pcDNA3.1-H-Ras, 및/또는 pcDNA3.1-Flag-β-TrCP, pDEST40-Axin1, pCS4-3xHA-Ub로 형질전환시키고 24시간 후 ALLN을 세포들에 12시간 동안 처리하여 배양하여 실험하였다.

다음으로는, HEK293 세포를 pcDNA3.1-H-Ras,및/또는 pCS2-MT-Axin, pSUPER-Axin siRNA, pcDNA3.1-GSK3b-V5, GSK3β에 대한 siRNA, pCS4-3xFlag-Ub로 형질전환시키고 24시간 후 ALLN을 12시간 동안 세포들에 처리하여 배양한 후, 위와 같은 방법에 따라 면역침전 및 이뮤노블롯팅을 수행하였다.

도 1은 GSK3β와 Axin의 과발현이나 siRNA를 사용해서 GSK3β와 Axin이 H-Ras의 폴리유비퀴틴화에 미치는 영향을 확인한 결과를 보여준다. 그 결과 도 1A와 같이 아무 처리를 하지 않았을 때 Ras가 약간 유비퀴틴화가 이루어지는 것을 볼 수 있지만, GSK3β siRNA에 의해 그 효과가 줄어들고 GSK3β 과발현을 통해 H-Ras의 폴리유비퀴틴화가 엄청나게 증가하는 것을 보여준다. 즉, Ras의 폴리유비퀴틴화가 GSK3β를 통해서 일어난다는 것을 보여주는 결과이다. 이러한 결과를 바탕으로 도 1B에서는 GSK3β 정상 세포와 넉아웃 세포를 이용하여 Axin과 β-TrCP 과발현을 통해 H-Ras의 폴리유비퀴틴화에 미치는 영향을 확인해 보았을 때, GSK3β 정상 세포에서는 Axin과 β-TrCP에 의해 H-Ras의 폴리유비퀴틴화가 증가하지만, GSK3β 넉아웃 세포에서는 그 효과가 나타나지 않는 것으로 보아 Axin과 β-TrCP에 의한 효과가 GSK3β를 통한 것임을 알 수 있다. 이러한 조절기작에서 Axin의 역할을 밝히고자 도 1C에서는 Axin의 과발현과 siRNA를 통해 Axin을 조절한 결과 앞에서의 결과와 마찬가지로, GSK3β, Axin 에 의해 H-Ras의 폴리유비퀴틴화가 증가하였으며 각각의 siRNA에 의해 폴리유비퀴틴화가 감소한다는 것을 확인할 수 있었고, 이때 동시에 Axin에 의해 GSK3β와 H-Ras의 친화성이 영향을 받고 있음을 확인할 수 있었다. Axin이 과발현 되게 되면 GSK3β와 H-Ras의 친화성이 증가되고 Axin이 넉다운되면 둘의 친화성이 감소하는 것을 관찰함을 통해 Axin이 GSK3β와 H-Ras의 친화성에 영향을 미침으로써 H-Ras의 인산화 및 폴리유비퀴틴화를 증가시키고 단백질 수준에서의 조절에 중요한 역할을 하는 것을 알 수 있다.

실시예 2. GSK3β에 의한 Ras 단백질의 인산화

E. coli C41 (a BL21[DE3] derivative cells)로부터 발현시켜 Ni-nitrilotriacetic (NTA)-Sepharose 비드를 이용해 His-H-Ras를 정제하고, 글루타티온 비드를 이용하여 GST-H-Ras와 GST-β-catenin 단백질을 각각 정제하였다. 2 mg 의 정제된 His-H-Ras, GST-H-Ras, 또는 1 mg 의 GST-β-catenin을 200 ng의 재조합 사람 GSK3β 단백질, 10 mM ATP, 그리고 10 mCi 의 [g-³²P]ATP을 포함한 20 ml 인산화 버퍼 (50 mM Tris-cl (pH 7.5), 10 mM MgCl₂, 1 mM dithiothreitol (DTT))에 넣고 30℃에서 4시간 반응시켰다. 그런 다음 5x SDS 샘플 버퍼를 넣고 95℃에서 5분간 끓여 샘플을 준비하였으며, 이 샘플을 10% SDS-PAGE 젤을 통해 내린 후 젤을 말려서 자기방사법으로 인산화된 단백질을 감지해 내었다. 정제된 GST-H-Ras와 His-H-Ras와 GST-β-catenin을 GSK3β와 반응하여 생체외 인산화 검사를 하였을 때 대조군과 비교해 인산화가 일어난 것을 알 수 있다. 인산화 된 H-Ras, β-catenin, GSK3β을 화살표로 표시하였다 (도 2A). GSK3β에 의해 인산화 되는 잘 알려진 모티프인 'S/TXXXS/T'가 H-Ras의 Thr144와 Thr148의 위치에 'TSAKT'의 형태로 존재함을 확인하였고, 이미 알려진 다른 GSK3β의 기질과 마찬가지로 H-Ras에도 GSK3β 인산화의 보존적 서열이 존재한다는 것을 보여준다(도 2B).

실시예 3. GSK3β에 의한 Ras 단백질의 인산화 부위 확인

액체 크로마토그래피/질량분석기(LC-MC/MS)를 이용하여 GSK3β에 의한 H-Ras의 인산화 부위를 확인하고자 하였다. E. coli C41 (a BL21[DE3] derivative cells)로부터 발현시켜 Ni-nitrilotriacetic (NTA)-Sepharose 비드를 이용해 정제한 4 mg의 정제된 His-H-Ras와 400 ng 의 재조합 사람 GSK3β 단백질과 20 mM ATP를 40 ml 인산화 버퍼(50 mM Tris-cl (pH 7.5), 10 mM MgCl₂, 1 mM dithiothreitol (DTT))에 넣고 30℃에서 4시간 반응시켰다. 그런 다음 5x SDS 샘플 버퍼를 넣고 95℃에서 5분간 끓여 샘플을 준비하였으며, 이 샘플을 10% SDS-PAGE 젤에 내려 젤 상에서 샘플을 분리시킨 후 H-Ras의 밴드만 잘라내었다. 25ng/ml 트립신을 이용하여 젤에서 H-Ras의 펩타이드를 추출하였고, LC-MC/MS 방법을 통해 H-Ras의 Thr144와 Thr148의 위치가 인산화 되었음을 확인하였다.

도 3은 H-Ras가 GSK3β에 의해 144번과 148번 트레오닌이 인산화 되는 것을 인산화가 일어난 H-Ras를 분리하여 수행한 액체 크로마토그래피-질량분석법(LC-tandam MS/MS 방법)에 의해 찾은 결과를 보여준다.

실시예 4. β-TrCP 에 의한 Ras 단백질의 폴리유비퀴틴화에 관여하는 GSK3β 에 의한 H-Ras의 인산화 역활 확인

액체 크로마토그래피-질량분석법을 통해 밝혀진 Thr 144번과 148번 위치가 GSK3β에 의해 인식되어 H-Ras를 인산화시킴으로써 단백질 조절에 영향을 주는지 알아보기 위해 pcDNA3.1-H-Ras와 pMT3-H-Ras^L61 그리고 pEGFP-C3-H-Ras 이 세 가지 플라스미드의 Thr 144번과 148번을 각각 알라닌 또는 글루탐산으로 치환시킨 H-Ras가 돌연변이된 플라스미드를 이용하여 다음과 같은 몇 가지 실험을 수행하였다. H-Ras의 점 돌연변이 (T144/148A , T144/148E)는 PCR을 기반으로 한 돌연변이 방법으로 만들었다. 돌연변이들은 유전자 서열분석방법을 이용하여 확인하였다.

먼저 GSK3β 정상 세포와 넉아웃 세포를 이용하여 인산화 된 형태와 인산화 될 수 없는 형태의 H-Ras 돌연변이가 β-TrCP에 의해 조절되는지를 확인하였다. GSK3β 정상 세포와 넉아웃 세포에 pcDNA3.1-H-Ras (Wt, T144/148A, T144/148E)로 형질전환시켰다. 형질전환 24시간 후, 세포를 분해하고, 세포분해물을 항-Myc 항체 또는 항-α-튜불린 항체로 이뮤노불롯팅을 수행하였다. 그 결과, 도 4A에서 볼 수 있는 바와 같이, 야생형 H-Ras의 경우 GSK3β가 존재하여 H-Ras를 인산화 시킬 수 있는 GSK3β 정상 세포에서만 β-TrCP에 의한 조절이 관찰되었으며, GSK3β 넉아웃 세포에서는 β-TrCP에 의한 H-Ras 단백질 조절이 관찰되지 않았다. GSK3β에 의해 인산화 될 수 없는 T144/148A 돌연변이의 경우에는 GSK3β 정상 세포와 넉아웃 세포 모두에서 β-TrCP에 의한 단백질 조절효과가 없었고 인산화된 형태의 T144/148E의 돌연변이의 경우 GSK3β 정상 세포와 넉아웃 세포 모두에서 β-TrCP에 의해 조절되고 있음을 확인할 수 있었다. 또한, β-TrCP가 없는 상황에서도 단백질 수준에서의 조절이 강하게 일어나고 있음을 관찰할 수 있었다.

또한, 류신 61번이 치환되어 강한 발암성의 성격을 지니는 Ras 에 돌연변이를 일으킨 pMT3-H-Ras^L61 (Wt, T144/148A, T144/148E) 를 GSK3β 정상 세포와 넉아웃 세포에 형질전환 시키고, 24시간 후 세포를 분해하고, 세포분해물을 항-pan-Ras 항체 또는 항-α-튜불린 항체로 이뮤노불롯팅을 수행하였다. 그 결과, 도 4B로부터 알수 있는 바와 같이, 류신 61번이 치환된 Ras의 경우 GSK3β 정상 세포에서만 β-TrCP에 의한 조절이 관찰되고, GSK3β 넉아웃 세포에서는 β-TrCP에 의한 H-Ras 단백질 조절이 관찰되지 않았다. GSK3β에 의해 인산화 될 수 없는 T144/148A 돌연변이의 경우에는 GSK3β 정상 세포와 넉아웃 세포 모두에서 β-TrCP에 의한 단백질 조절효과가 없었고 인산화된 형태의 T144/148E의 돌연변이의 경우 GSK3β 정상 세포와 넉아웃 세포 모두에서 β-TrCP에 의해 조절되고 있음을 확인할 수 있으며, β-TrCP가 없는 상황에서도 강한 단백질 수준에서의 조절이 일어나고 있음을 관찰할 수 있었다. 이는 야생형 H-Ras와 류신 61번이 치환되어 강한 발암성의 성격을 지니는 Ras가 같은 조절기작을 통해 조절되고 있음을 밝힌 것으로 이는 발암성 Ras도 GSK3β에 의한 Thr144와 Thr148 위치의 인산화 조절을 통해 단백질 수준이 조절되고 있음을 보여주는 결과이다.

추가로, GSK3β에 의한 Thr144와 Thr148 위치의 인산화 조절에 의한 H-Ras의 단백질 수준에서의 조절을 가시화하기 위해 GSK3β 정상 세포와 넉아웃 세포를 젤라틴으로 코팅한 글라스 위에서 하루 동안 키웠다. 그런 다음 상기 세포들을 pEGFP-C3-H-Ras (Wt, T144/148A, T144/148E)로 형질전환 시키고, 24시간 동안 키운 후에 세포를 PBS로 씻어 주고 4% 파라포름알데히드 용액을 사용하여 세포를 글라스 위에 고정하였다. DAPI를 이용하여 세포핵을 염색한 후 형광현미경을 통해 가시화하였다. 형광을 발현하는 세포를 형광 현미경을 통해 사진을 찍었다. 관찰 결과 도 4C에서 볼 수 있듯이, H-Ras 야생형의 경우 GSK3β 정상세포와 비교해 보았을 때, GSK3β 넉아웃 세포에서 발현이 증가되어 있는 것을 확인할 수 있었고, 인산화가 될 수 없는 돌연변이의 경우 GSK3β 정상과 넉아웃 세포에 상관없이 강하게 발현되고 있는 반면, 인산화된 형태의 돌연변이의 경우 세포에 상관없이 심하게 조절 받고 있는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 5. GSK3β에 의한 H-Ras의 인산화에 Wnt/beta-catenin 신호전달계가 미치는 영향

GSK3β에 의해 인식되어 H-Ras가 인산화 됨으로써 단백질 조절 뿐 만 아니라 H-Ras의 폴리유비퀴틴화에도 영향을 주는지 알아보고자 했다.

H-Ras의 폴리유비퀴틴화 실험에 앞서, HEK293 세포에서도 H-Ras의 야생형, 돌연변이가 같은 조절기작으로 β-TrCP에 의해 조절되고 있는지 확인하고자 하였다.

먼저, HEK293세포에 pcDNA3.1-H-Ras(Wt, T144/148A, T144/148E)로 형질전환시켰다. 형질전환 24시간 후, 세포를 분해하고, 세포분해물을 항-Myc 항체 또는 항-α-튜불린 항체로 이뮤노불롯팅을 수행하였다. 그 결과 도 5A(위쪽 그림)에서 확인할 수 있는 것과 같이, HEK293 세포에서 β-TrCP에 의한 H-Ras 야생형, 인산화된 형태, 인산화 될 수 없는 형태의 단백질 조절은 GSK3β 정상세포에서와의 조절과 마찬가지로, H-Ras 야생형, 인산화된 형태의 돌연변이의 경우 β-TrCP에 의해 단백질 수준에서의 조절이 일어나고 있으며, 인산화 될 수 없는 형태의 돌연변이의 경우 β-TrCP에 의한 H-Ras 단백질 조절을 관찰 할 수 없었다.

앞의 여러 결과에서 확인할 수 있듯이 인산화된 형태의 돌연변이의 경우에는 단백질 그 자체만으로도 심각한 조절을 받고 있어 발현이 매우 약하게 되고 있어서 이를 프로테아좀 저해제인 ALLN을 처리하여 단백질 분해를 저해하여 발현이 증가되는 것을 확인하고자 다음과 같이 실험하였다.

HEK293세포에 인산화된 형태의 돌연변이인 pcDNA3.1-H-Ras-T144/148E 를 형질전환시키고 24시간 후 프로테아좀 저해제인 ALLN을 12시간 동안 처리하였다. 그 후, 세포를 분해하고, 세포분해물을 항-Myc 항체 또는 항-α-튜불린 항체로 이뮤노불롯팅을 수행하였다.

그 결과 도 5A 아래쪽 그림에서 확인할 수 있듯이, 인산화된 형태의 돌연변이가 프로테아좀 저해제 처리에 의해 단백질의 분해가 저해되어 단백질 발현이 증가되어 있음을 확인할 수 있었다.

다음으로는 이러한 단백질 조절을 받고 있는 H-Ras의 야생형, 인산화된 형태, 인산화 될 수 없는 형태의 돌연변이의 폴리유비퀴틴화를 확인해 보았다. 이를 위해, HEK293 세포를 pcDNA3.1-H-Ras, pcDNA3.1-H-Ras-T144/148A, 또는 pcDNA3.1-H-Ras-T144/148E 및/또는 pcDNA3.1-GSK3β-V5, pCS4-3xHA-Ub로 형질전환시켰다. 24시간 후, ALLN을 세포들에 12시간 동안 처리하여 배양하였다. 필요한 경우 Wnt/beta-catenin 신호전달계를 활성화시키는 Wnt3a를 3시간 동안 처리하여 Ras의 야생형과 돌연변이의 폴리유비퀴틴화에 어떤 영향을 미치는지 관찰하고자 하였다. 세포분해물을 항-Myc 항체로 면역침전시키고, IPLs 및 WCLs를 항-HA항체 또는 항-β-TrCP, 항-α-튜불린 항체로 분석하였다.

그 결과, 도 5B에서도 볼 수 있는 것처럼 H-Ras의 야생형의 경우 GSK3β에 의해 H-Ras의 폴리유비퀴틴화, β-TrCP와의 결합력도 강해졌으며, 반대로 Wnt3a의 처리에 의해 저해되고 있음을 확인할 수 있다. H-Ras의 인산화 된 형태의 돌연변이의 경우 폴리유비퀴틴화가 매우 증가해 있으며, β-TrCP와의 결합력도 가장 강하다는 것을 관찰 할 수 있으며, H-Ras가 인산화 될 수 없는 형태의 돌연변이의 경우 GSK3β나 Wnt3a에 의한 영향을 거의 받지 않고 있으며 β-TrCP와의 결합력도 매우 약하다는 것을 알 수 있다.

실시예 6. p-Ras 항체를 통한 GSK3β 에 의한 H-Ras의 Thr144와 Thr148 인산화감지

H-Ras의 Thr144와 Thr148 인산화를 감지할 수 있는 항체 제작을 위해 keyhole limpet hemocyanin (KLH) carrier 단백질이 붙어있는 H-Ras의 인산화된 펩타이드(residues 140-152 PYIEpTSAKpTRQGV) 를 토끼에 찔러 항체를 형성시키고, 희생시켜 토끼의 혈액으로부터 p-Ras 항체를 정제하였다. 이렇게 만들어진 p-Ras 항체가 특이적으로 인산화된 Ras만을 검출하는지 확인하기 위해서 HEK293 세포에 야생형 Ras (pcDNA3.1-H-Ras)와 인산화가 될 수 없는 형태의 돌연변이 (pcDNA3.1-H-Ras-T144/148A)를 형질전환 시킨 후 세포 분해물을 p-Ras 항체로 이뮤노블럿팅 하였다.

그 결과 도 6A에서 볼 수 있는 바와 같이, p-Ras항체가 야생형 Ras는 검출할 수 있지만, 인산화가 될 수 없는 형태의 돌연변이는 검출하지 못하는 것으로 나타났다. 이는 이 p-Ras항체가 특이적으로 작용하여, 인산화되는 야생형 H-Ras만 감지됨을 보여주고 있다.

그 다음으로는 Ras의 인산화가 GSK3β에 의해 증가되는지 확인해 보기 위해 HEK293 세포에 야생형 H-Ras (pcDNA3.1-H-Ras) 또는 류신 61번 이 치환되어 발암성인Ras (pMT3-H-Ras^L61) 및/또는 pcDNA3.1-Flag-β-TrCP, pcDNA3.1-GSK3β-V5 를 형질전환 시키고, 세포분해물을 p-Ras 항체로 이뮤노블럿팅 하였다.

그 결과 도 6B에서 볼 수 있는 바와 같이, Ras의 인산화가 GSK3β에 의해 증가하였음을 확인할 수 있다.

실시예 7. β-TrCP에 의한 H-Ras의 단백질 조절이 세포 증식과 암화에 미치는 영향 확인

위와 같은 H-Ras의 단백질 조절 작용 기작이 세포의 증식과 암화에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.

GSK3β 정상세포와 넉아웃 세포를 pMT3-H-Ras^L61 (Wt 또는 T144/148A), pcDNA3.1-Flag-β-TrCP, 및/또는 pCS-MT-Axin으로 형질전환시켰다. 세포증식을 확인하기 위해 4개의 96웰 플레이트의 각각 3개 웰에 세포를(1 ㅧ 10³개) 플레이팅 하고, 0, 24, 48, 72시간이 될 때 CCK-8 실험법을 통해 분광 광계도를 이용하여 흡광도를 측정하여 확인하였다. 측정되어진 흡광도를 바탕으로 그래프를 그리고, 독립적으로 실험한 세 번의 실험값을 통해 표준편차를 계산해 내어 그래프에 나타내었다.

그 결과 도 7A에서 볼 수 있는 바와 같이, 류신 61번 이 치환되어 발암성인 Ras의 경우 GSK3β 정상세포에서는 β-TrCP 또는 Axin의 과발현에 의해 세포 증식이 감소하지만, GSK3β 넉아웃 세포에서는 조절이 일어나지 않았고, T144/148A의 인산화되지 못하는 돌연변이의 경우 β-TrCP 또는 Axin 과발현에 의해 두 세포 모두에서 세포 증식이 조절되지 않았다.

또한, 세포암화를 확인해 보기 위해서 동일한 실험조건으로 형질전환 된 세포를 연간천이 채워진 96well 플레이트의 각 3개 웰에 세포(1 ㅧ 10³개)를 플레이팅하고, 800 ㎍/㎖의 G418을 넣어준 DMEM 배지에서 20일 동안 배양하면서 셀렉션하였다. 배양액은 3-4일에 한번 간격으로 교체하였다. 일정 크기에 다다른 세포의 수를 센 후 그래프를 그렸다. 콜로니 수는 Image pro 5.1 프로그램(MediaCybernetics)을 이용하여 세었다.

그 결과, 도 7B에서 볼 수 있는 바와 같이, 류신 61번 이 치환되어 발암성의 Ras의 경우 GSK3β 정상세포에서는 β-TrCP 또는 Axin의 과발현에 의해 세포 암화가 감소하지만, GSK3β 넉아웃 세포에서는 조절이 일어나지 않았고, T144/148A의 인산화되지 못하는 돌연변이의 경우 β-TrCP 또는 Axin 과발현에 의해 두 세포 모두에서 암화가 조절되지 않았다. 따라서 GSK3β에 의한 H-Ras의 T144/148의 인산화 여부에 의한 β-TrCP 또는 Axin에 의해 조절되는 H-Ras의 단백질 분해가 세포 증식, 암화에도 중요한 역할을 함을 알 수 있었다.

실시예 8. H-, K-, N-Ras 의 폴리유비퀴틴화와 β-TrCP에 의한 단백질 조절 확인

H-Ras 뿐만 아니라 다른 아이소 형태의 K-, N-Ras도 폴리유비퀴틴화가 일어나고 단백질 분해 기작에 의해 조절될 수 있는지를 확인해보기 위해 HEK293 세포에 pcDNA3.1-H-, K-, N-Ras 및 pCS4-3xFlag-Ub을 형질전환시키고, 24시간 후 ALLN을 세포들에 12시간 동안 처리하여 배양한 후, 위와 같은 방법에 따라 면역침전 및 이뮤노블럿팅을 수행하였다. 그 결과 H-, K-, N-Ras 모두 폴리유비퀴틴화를 통해 프로테아좀에 의해 단백질 양이 조절됨을 확인하였다(도 8A).

그 다음으로는 아이소 형태의 Ras가 모두 β-TrCP에 의해 조절될 수 있는지 확인해 보기 위해 HEK293 세포에 pcDNA3.1-Flag-β-TrCP를 농도별로 형질전환 시키고, 세포분해물을 항-Myc 항체 또는 항-β-TrCP, 항-α-튜불린 항체로 이뮤노블롯팅을 하였다. 그 결과 도 8B에서 확인할 수 있는 바와 같이 β-TrCP가 더 많이 발현될수록 H-, K-, N-Ras 의 단백질 양이 모두 점차적으로 더 감소하는 것을 관찰 할 수 있었다.

실시예 9. GSK3β에 의한 H-, K-, N-Ras 단백질 조절 확인

H-, K-, N-Ras 모두 폴리유비퀴틴화를 통해 프로테아좀에 의해 단백질 양이 조절되며 β-TrCP에 의해 단백질 양이 조절됨을 확인하였기 때문에, 이 아이소 형태의 Ras가 GSK3β에 의해 단백질 양이 조절되고 인산화 될 수 있는지 확인해 보기 위해 GSK3β 정상세포와 넉아웃 세포에 pcDNA3.1-H-,K-,N-Ras를 형질전환 시킨 후 세포 용해액을 얻어 항-Myc 과 항-α-튜불린으로 특정단백질 검출법을 수행하였다.

그 결과 도 9A에서 확인할 수 있는 것처럼, GSK3β 정상세포에 비해 H-, K-, N-Ras의 단백질 양이 GSK3β 넉아웃 세포에서 증가되어 있는 것을 확인할 수 있었다.

이처럼 H-Ras 뿐만 아니라 K-, N-Ras도 GSK3β 의존적인 β-TrCP에 의한 동일한 조절기작으로 통해 단백질이 양적으로 조절되고 폴리유비퀴틴화 되고 있는 것으로 보아, H-Ras에 존재하고 있는 GSK3β 인산화의 보존적 서열이 K-, N-Ras에도 존재하는지 확인해 보았다.

그 결과, 도 9B에서 확인할 수 있는 것처럼, GSK3β 인산화의 보존적 서열 'S/TXXXS/T' 가 H-, K-, N-Ras에 잘 보존 되어져 있는 것을 확인할 수 있었고, 이는 H-, K-, N-Ras 모두 GSK3β 에 의한 Thr144와 Thr148 인산화의 조절이 세포증식이나 암화 생물학적인 기능에 중요한 역할을 할 것이라고 생각할 수 있다.

대장암 치료에 새로운 효과적인 EGFR (epidermal growth factor receptor)억제제인 아바스틴, 어비툭스, 리툭산 등 단세포항체 치료제가 개발되면서 이 치료제들이 항암제 마켓에 성장 동력이 될 것으로 분석된 바 있었다. 하지만 최근들어 이 고가의 항암제가 작용하지 않는 환자들이 발견되기 시작하여 문제로 대두되었고, 이 항암제에 내성을 보이는 환자들을 분석해 본 결과 KRas 유전자에 변이가 있는 환자들의 경우 EGFR억제제로서 역할을 하고 있는 항암제의 경우는 작용을 하지 못한다는 사실을 확인하게 되었다. 이는 KRas가 EGFR의 하위단계에 위치하고 있기 때문에, EGFR을 억제하더라도, 하위단계의 KRas가 변이에 의해 발암성을 띄게 되면 계속적으로 하위단계를 활성화시킴으로써 암이 계속 진행되기 때문이다. 이러한 문제가 크게 대두되고 있는 이유는 대장암 환자 약 10명 중 4명이 K-ras 변이유전자를 가지고 있으며 이러한 변이는 중증으로 진행될수록 더욱 많이 발견되고 있어, 대장암 발병 증가와 함께 이러한 미충족 욕구는 새로운 항암제 개발의 필요성을 증가시키고 있는 실정이다. 이러한 상황에서, 본 발명을 통해 밝힌 아생형 뿐만 아니라 발암성을 띄는 Ras의 단백질 수준에서의 조절과, 그 조절기작 또한 조절에 있어 중요한 아미노산 위치를 밝힌 본 발명의 내용은 새로운 항암제 개발에 있어 중요한 의미를 가진다고 할 수 있다.

Claims (16)

1. Ras의 Thr144와 Thr148의 인산기를 특이적으로 인식하는 항체를 이용한 항원항체 반응을 통하여, Ras의 Thr144와 Thr148 위치에서의 인산화 여부를 조사하는 것을 포함하고,
   상기 항체는 Ras의 140번 내지 152번의 아미노산을 포함하고 Thr144와 Thr148 잔기가 인산화되어 있는 Ras 펩타이드에 대한 항체인 것을 특징으로 하는 Ras의 단백질 수준을 분석하는 방법.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. Ras의 Thr144와 Thr148의 인산기를 특이적으로 인식하는 항체를 포함하는 암 진단용 조성물로,
   상기 항체는 Ras의 140번 내지 152번의 아미노산을 포함하고 Thr144와 Thr148 잔기가 인산화되어 있는 Ras 펩타이드에 대한 항체이고,
   상기 암은 Ras의 돌연변이에 의하여 야기되는 암인 것을 특징으로 하는 암 진단용 조성물.
   
5. 삭제
6. Ras의 Thr144와 Thr148의 인산기를 특이적으로 인식하는 항체를 포함하는 암 진단용 키트로,
   상기 항체는 Ras의 140번 내지 152번의 아미노산을 포함하고 Thr144와 Thr148 잔기가 인산화되어 있는 Ras 펩타이드에 대한 항체이고,
   상기 암은 Ras의 돌연변이에 의하여 야기되는 암인 것을 특징으로 하는 진단용 키트.
   
7. 삭제
8. 후보물질과 Ras를 접촉시키고, Ras의 Thr144와 Thr148의 인산기를 특이적으로 인식하는 항체를 이용한 항원항체 반응을 통하여 Ras의 Thr144와 Thr148 위치에서의 인산화 여부를 조사하고, 상기 후보물질이 인산화를 저해하는지 또는 촉진하는지를 판단하는 것을 포함하며,
   상기 항체는 Ras의 140번 내지 152번의 아미노산을 포함하고 Thr144와 Thr148 잔기가 인산화되어 있는 Ras 펩타이드에 대한 항체인 것을 특징으로 하는 항암제 스크리닝 방법.
   
9. 삭제
10. 삭제
11. 후보물질을 세포 또는 인간을 제외한 동물에 처리하고, Ras의 Thr144와 Thr148의 인산기를 특이적으로 인식하는 항체를 이용한 항원항체 반응을 통하여 Ras의 Thr144와 Thr148 위치에서의 인산화 여부를 조사하고, 상기 후보물질이 인산화를 저해하는지 또는 촉진하는지를 판단하는 것을 포함하며,
    상기 항체는 Ras의 140번 내지 152번의 아미노산을 포함하고 Thr144와 Thr148 잔기가 인산화되어 있는 Ras 펩타이드에 대한 항체인 것을 특징으로 하는 항암제 스크리닝 방법.
    
12. 삭제
13. 삭제
14. 항암제를 인간을 제외한 동물에 처리하고, Ras의 Thr144와 Thr148의 인산기를 특이적으로 인식하는 항체를 이용한 항원항체 반응을 통하여 Ras의 Thr144와 Thr148 위치에서의 인산화 여부를 조사하고, 상기 항암제가 인산화를 저해하는지 또는 촉진하는지를 판단하는 것을 포함하며,
    상기 항체는 Ras의 140번 내지 152번의 아미노산을 포함하고 Thr144와 Thr148 잔기가 인산화되어 있는 Ras 펩타이드에 대한 항체인 것을 특징으로 하는 항암제의 약효를 검증하는 방법.
15. 삭제
16. 삭제

Images