CN105200077B - Btrc基因的过表达试剂及其制备和应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了BTRC基因的过表达试剂及其制备和应用方法。选择pcDNA3.1空白载体构建BTRC的过表达载体，酶切pcDNA3.1载体并将BTRC序列插入，得到用于真核表达BTRC的载体质粒。本发明证实在鼻咽癌细胞株中下调BTRC基因的表达可以促进鼻咽癌细胞的侵袭转移；通过设计并构建BTRC基因的过表达载体，成功地在鼻咽癌细胞中表达BTRC基因，可以有效地抑制鼻咽癌细胞的侵袭与转移能力，为鼻咽癌治疗提供了新途径。

Description

BTRC基因的过表达试剂及其制备和应用方法

技术领域

本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及BTRC基因的过表达试剂及其制备和应用方法。

背景技术

鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma,NPC)是我国南方地区常见的头颈部恶性肿瘤，由鼻咽粘膜上皮发生恶性转化而来，大多数为低分化鳞状细胞癌，恶性程度高且发病部位隐蔽，特别是发生在咽隐窝和鼻咽顶部的患者早期症状不明显，因而难以早期发现，误诊误治率较高；另外鼻咽癌极易发生转移，初诊患者颈部淋巴结转移率高达80％。放射治疗是目前鼻咽癌临床上最常用的治疗手段，60～70％的患者能取得较好的疗效，但仍有20～30％的患者会出现复发和转移。复发和转移是临床上导致鼻咽癌患者死亡的主要因素之一，且放化疗对治疗鼻咽癌的复发、转移效果不理想，因此，筛选新的鼻咽癌早期转移及预后判断的分子标记物，对于鼻咽癌的临床治疗有着重要的指导意义，同时相比较传统的放化疗手段，生物治疗的方法更适合复发和转移鼻咽癌的治疗，其中基因疗法对防治鼻咽癌的复发、转移具有更重要而广阔的临床应用前景，筛选鼻咽癌基因治疗的靶点也同样意义重大。

我们通过基因芯片技术，筛选到了BTRC基因(GenebankGene ID:8945；参考序列：NM_033637.3)在鼻咽癌中表达下调。迄今为止有关BTRC与鼻咽癌发生发展中的作用的关系及其在鼻咽癌病人的早期筛查、辅助诊断或者疗效预测等方面均没有文献报道。我们通过研究表明，BTRC在鼻咽癌组织中的表达水平与鼻咽癌的侵袭转移及预后密切相关，鼻咽癌组织中BTRC基因表达水平较低的患者更容易复发和转移，因而生存时间较BTRC基因表达水平高的患者更短。表明BTRC基因可以作为鼻咽癌辅助诊断、疗效预测及预后判断等的分子标记，针对BTRC设计专用荧光实时定量PCR引物、原位杂交探针及免疫组织化学检测试剂盒等，用于检测鼻咽癌组织中BTRC的表达水平有望为临床上对鼻咽癌进行复发和转移的预测提供参考。

此外，我们在鼻咽癌细胞中转染人工合成的BTRC基因干扰序列(siRNA)以抑制BTRC基因的表达，证实在鼻咽癌细胞株中下调BTRC基因的表达可以促进鼻咽癌细胞的侵袭转移；通过设计并构建BTRC基因的过表达载体，成功地在鼻咽癌细胞中表达BTRC基因，可以有效地抑制鼻咽癌细胞的侵袭与转移能力；通过一系列研究，申请人进一步证实了BTRC基因编码一个名为β-TrCP(beta-transducin repeat containing E3ubiquitin proteinligase)的E3泛素蛋白连接酶(E3ubiquitin protein ligase)，β-TrCP是细胞内蛋白经泛素化途径降解过程中的关键酶之一，可较特异地调控它的底物β-catenin和Snail经泛素化途径降解，从而维持β-catenin和Snail这两个蛋白在细胞中的含量。β-catenin、Snail是细胞上皮-间质转换(epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程中的关键调控因子，而上皮-间质转换又是肿瘤细胞发生侵袭转移的最为关键的第一步。因此，申请人通过研究证实了鼻咽癌细胞中BTRC表达下调，导致其编码的β-TrCP蛋白量减少，β-TrCP的底物β-catenin和Snail的降解减慢，造成β-catenin和Snail在细胞内聚集，推动了鼻咽癌细胞的上皮-间质转换，使鼻咽癌细胞具备更强的侵袭与转移能力，从而表现为鼻咽癌患者的复发转移，最终导致患者死亡。在鼻咽癌细胞中通过基因工程的手段重新表达BTCR，则可以明显地抑制鼻咽癌细胞的侵袭与转移能力。因此，BTRC基因以及其下游包括β-catenin和Snail在内的细胞上皮-间质转换相关信号通路又可以成为鼻咽癌基因治疗的潜在靶点，特别是BTRC过表达载体在鼻咽癌的基因治疗中具有重要的应用前景。将BTRC基因过表达载体负载到多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒上制成纳米基因转运体，多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒可保护BTRC基因过表达载体免受核酸酶降解，延长作用时间，且有更高的转染效率。进而为制备防治鼻咽癌的复发和转移的制剂提供新的途径。

发明内容

本发明的目的之一是提供BTRC基因的过表达试剂。

本发明的目的之二是提供BTRC基因的过表达试剂的制备方法。

本发明的目的之三是提供BTRC基因的过表达试剂的应用方法。

BTRC基因的过表达试剂的制备方法，制备能够表达BTRC基因的表达载体。选择pcDNA3.1空白载体构建BTRC的过表达载体，酶切pcDNA3.1载体并将BTRC序列插入，得到用于真核表达BTRC的载体质粒。

构建pcDNA3.1–BTRC真核载体步骤如下：

1)以鼻咽癌细胞HNE2的cDNA为模板，利用TaKaRa LA酶进行PCR扩增SEQNO：1所示的全长BTRC编码区序列，BTRC编码区序列扩增引物如下：

上游引物：5’-ATGGACCCGGCCGAGGCGGT-3’

下游引物：5’-TTATCTGGAGATGTAGGTGTATGTT-3’

在上、下游引物的5’端分别加上限制性内切酶Nhe I和EcoR I识别位点及保护碱基后，引物序列如下：

上游：5’-AGGAGCTAGCATGGACCCGGCCGAGGCGGT-3’，下划线部分为Nhe I识别位点，

下游：5’-ATGCGAATTCTTATCTGGAGATGTAGGTGTATGTT-3’，下划线部分为EcoR I识别位点；

2)PCR扩增，BTRC编码区序列，PCR反应条件如下：

PCR反应步骤

返回到第2步，共进行39次反应循环；

3)将PCR产物电泳、胶回收目的片段后经Nhe I和EcoR I双酶切后电泳，再次胶回收；

4)pcDNA3.1质粒经Nhe I和EcoR I双酶切后电泳胶回收目的片段；

5)以T4DNA连接酶连接4)和5)步胶回收产物，即可得到可用于真核表达BTRC的载体质粒。

将上述方法制备得到的包含BTRC编码区序列的pcDNA3.1真核表达质粒转化感受态大肠杆菌，以扩增质粒。

还能将表达载体负载到多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒上制成纳米球。

多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒是运用OP-10、环己烷、氨水的微乳液自组装技术进行硅纳米颗粒的合成，并利用硅纳米颗粒的表面能和离子静电作用进行多聚赖氨酸表面修饰，制备得到。

BTRC基因的过表达试剂，是由上述的方法制备得到的。

所述的BTRC基因的过表达试剂的应用方法，用于制备防止鼻咽癌复发和转移的制剂。

所述的BTRC基因的过表达试剂的应用方法，用于制备BTRC基因表达产物β-TrCP的底物β-catenin和Snail的降解的制剂。具体是用于制备抑制上皮-间质转换制剂。该制剂促进BTRC基因的表达能使上皮细胞的标志物ZO-1、E-cadherin和Claudin-1的表达升高，而间质细胞的标志物ZEB1、N-cadherin、Vimentin及Slug的表达降低。

本发明证实在鼻咽癌细胞株中下调BTRC基因的表达可以促进鼻咽癌细胞的侵袭转移；通过设计并构建BTRC基因的过表达载体，成功地在鼻咽癌细胞中表达BTRC基因，可以有效地抑制鼻咽癌细胞的侵袭与转移能力。进而为制备防治鼻咽癌的复发和转移的制剂提供新的途径。

附图说明

图1为利用基因芯片技术从6例正常鼻咽上皮组织和10例鼻咽癌组织中筛选得到的差异表达基因图谱；

共筛选得到差异表达基因2461个，其中在鼻咽癌中表达上调的基因与1677个，在鼻咽癌中下调的基因有784个；N代表正常鼻咽上皮组织，T代表鼻咽癌组织。

图2为基因芯片数据中BTRC基因在正常鼻咽上皮组织和鼻咽癌组织中的表达情况，BTRC基因在鼻咽癌组织中的表达明显下调(P＝0.001)；

N代表正常鼻咽上皮组织，T代表鼻咽癌组织。

图3为利用荧光实时定量PCR技术验证了BTRC基因在正常鼻咽上皮组织和鼻咽癌组织中的表达情况，BTRC基因在鼻咽癌组织中的表达明显下调(P<0.05)；

N代表正常鼻咽上皮组织(共9例)，T代表鼻咽癌组织(共28例)。

图4为免疫组织化学方法检测BTRC在鼻咽癌及正常鼻咽上皮中的表达情况；

正常鼻咽上皮(Non-tumor NPE)中BTRC表达水平较高(positive)，而在106例鼻咽癌(NPC)中有48例检测到BRTC的低表达(Low)，其余58例为高表达(high)。

图5为原位杂交检测BTRC在鼻咽癌及正常鼻咽上皮中的表达情况；

原位杂交的结果与免疫组织化学结果具有很高的一致性。

图6为鼻咽癌中BTRC的表达与鼻咽癌患者预后的关系；

鼻咽癌中BTRC的表达与鼻咽癌患者的预后密切相关，BTRC高表达(High)的患者不论无病生存时间(Disease free survival,DFS，左)还是总的生存时间(Overallsurvival,OS，右)都要明显长于BTRC低表达(Low)的患者。

图7为在鼻咽癌细胞HNE2、5-8F和C666-1中导入BTRC过表达载体(BTRC OE)和RNA干扰序列(siBTRC)后，实时荧光定量PCR方法检测了鼻咽癌细胞中BTRC的表达情况(mRNA水平)，导入BTRC过表达载体后，BTRC基因的表达显著升高(左)，而导入RNA干扰序列后，BTRC基因的表达显著降低(右)，NC为阴性对照(negative control)。

图8为在鼻咽癌细胞HNE2、5-8F和C666-1中导入BTRC过表达载体(BTRC OE)和RNA干扰序列(siBTRC)后，Western bloting方法检测了鼻咽癌细胞中BTRC的表达情况(蛋白水平)，导入BTRC过表达载体后BTRC基因的表达显著升高(左)，而导入RNA干扰序列后BTRC基因的表达显著降低(右)，NC为阴性对照(negative control)。

图9为在鼻咽癌细胞HNE2、5-8F和C666-1中导入BTRC过表达载体(BTRC OE)和RNA干扰序列(siBTRC)后，细胞穿膜(transwell)实验证实，人为促进BTRC的表达后，能穿过基质胶膜的鼻咽癌细胞数目显著降低，表明细胞侵袭能力减弱，相反，人为降低BTRC的表达后，能穿过基质胶膜的鼻咽癌细胞数目显著增加，表明细胞侵袭能力增强，NC为阴性对照(negative control)。

图10为在鼻咽癌细胞HNE2、5-8F和C666-1中导入BTRC过表达载体(BTRC OE)和RNA干扰序列(siBTRC)后，细胞划痕实验证实，人为促进BTRC的表达后，鼻咽癌细胞从划痕两边往划痕中央迁移速度明显减慢，划痕愈合的时间延长，表明细胞运动迁移能力降低，相反，人为降低BTRC的表达后，鼻咽癌细胞从划痕两边往划痕中央迁移速度明显提高，划痕愈合的时间缩短，表明细胞运动迁移能力提高，NC为阴性对照(negative control)。

图11为在鼻咽癌细胞HNE2和5-8F中导入BTRC过表达载体(BTRC OE)和RNA干扰序列(siBTRC)后我们检测BTRC基因编码的βTrCP蛋白及底物β-catenin和Snail的表达情况，人为促进BTRC的表达后加速了β-catenin和Snail的降解，细胞中β-catenin和Snail的表达量减少，反之人为降低BTRC的表达后β-catenin和Snail的降解减少，细胞中β-catenin和Snail的表达量增强；与上皮-间质转换(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关蛋白的表达也发生了相应的变化，人为促进BTRC的表达后上皮细胞的标志物ZO-1、E-cadherin和Claudin-1的表达升高，而间质细胞的标志物ZEB1、N-cadherin、Vimentin及Slug的表达降低，表明BTRC可以抑制上皮-间质转换；反之人为降低BTRC的表达后，上皮细胞标志物表达降低，而间质细胞的标志物表达升高，表明BTRC低表达后，细胞由上皮向间质样细胞转换，侵袭转移能力增强。

图12为BTRC基因在鼻咽癌发生发展过程中的作用机制图，BTRC基因可调控上皮-间质转换过程中关键分子β-catenin和Snail的表达，BTRC高表达时β-catenin和Snail容易降解，细胞维持在上皮样状态，不容易发生侵袭转移，当BTRC表达下调时，β-catenin和Snail不容易降解，细胞由上皮样向间质样转换，容易发生侵袭转移，导致患者较快死亡。

具体实施方式

以下结合具体实施方式进一步说明本发明，而非限制本发明。

实施例1，利用基因芯片技术筛选发现BTRC基因在鼻咽癌中表达下调

1.材料与方法：

1)基因芯片：

所用基因芯片为Agilent公司SurePrint G3Human Gene Expression v3 8x60KMicroarray(货号：G4851C)，包含人类27,958个已知基因的探针。

2)主要试剂：

3)总RNA的纯化

收集6例正常鼻咽上皮组织和10例鼻咽癌组织，用Trizol(invitrogen公司产品)抽提总RNA，如果总RNA的纯度不高，会影响探针的标记效率和芯片杂交结果。所以使用QIAGENKit纯化总RNA，详细操作原理和方法见RNeasy Mini Protocol。

①取总RNA≤100μg溶解于100μl RNase free水中，加入350μl Buffer RLT并充分混匀。

②加入250μl无水乙醇，Tip头充分混匀。

③将共计700μl含总RNA的溶液转入套在2ml离心管内的RNeasy柱子内，≥8000g离心30秒，弃去滤过液。

④吸取500μl Buffer RPE到RNeasy mini柱子内，≥8000g离心洗涤30秒，弃去滤过液，再用500μl Buffer RPE在≥8000g离心洗涤2min，弃去滤过液和2ml的套管，将RNeasymini柱子转入一新的1.5ml Eppendorf管中。

⑤吸取40μl RNase free的水，≥8000g离心洗脱1min。

⑥重复步骤⑤一次。

4)cDNA第一链和第二链一步法合成

①取0.2μg RNA于0.2ml离心管中，如下配置反应溶液：

②65℃保温10分钟，冰浴5分钟，注意：提前把5×First Strand Bμffer在80℃预热3-4分钟

③配置如下cDNA合成体系：

④将上述4.7μl mix加入变性后冰浴的RNA中。

⑤用枪头混匀，之后离心。

⑥PCR仪上：

40℃ 2hour

70℃ 15min

move to ice 5min

5)荧光标记cRNA合成

①如下配置Transcription mix：

②加入6μl Transcription mix并混匀

③PCR仪上：40℃2hours。

6)cRNA纯化(QIAGENMini Kit)

用QIAGEN RNeasy Mini kit纯化cRNA，具体方法步骤如下：

①加入84μl RNase free水，加入350μl Buffer RLT并充分混匀。

②加入250μl无水乙醇，Tip头充分混匀。

③将共计700μl含总RNA的溶液转入套在2ml离心管内的RNeasy柱子内，≥8000g离心15-30sec，弃去滤过液。

④吸取500μl Buffer RPE到RNeasy mini柱子内，≥8000g离心洗涤15—30sec，弃去滤过液，再用500μl Buffer RPE在≥8000g离心洗涤2min，弃去滤过液和2ml的套管，将RNeasy mini柱子转入一新的1.5ml Eppendorf管中。

⑤吸取30μl RNase free的水，静置1min,≥8000g离心洗脱1min。

⑥重复步骤5一次。

7)cRNA浓度测定

①cRNA质控：用分光光度计分析RNA浓度。需要在260和280nm测定吸光度来确定样品的浓度和纯度，A260/A280应接近2.0(1.9-2.1之间)

②计算并调整cRNA的含量：

8)荧光分子浓度及掺入率计算:

Cy3-浓度(pmol/μl)＝A552/0.15

Cy3-掺入率(pmol/μg)＝Cy3-浓度/cRNA浓度(μg/μl)

9)cRNA样品片段化和芯片杂交

①按下表配制片段化混合液，然后在60℃温浴30min进行片段化，冰浴1min

②加入2X GEx Hybridization Buffer混匀

③上芯片，65℃17小时，10rpm滚动杂交

10)芯片洗涤

①取出芯片于洗液1中洗涤1分钟

②再将芯片放入洗液2中洗涤1分钟(37℃)

11)芯片扫描:Agilent扫描仪中扫描，分辨率为3μm/5μm，扫描仪自动以100％扫描一次。

12)数据分析：用基因芯片中的内参基因对基因芯片原始数据进行归一化(Normalize)处理后，用SAM软件(Significance Analysis of Microarrays)筛选正常鼻咽上皮与鼻咽癌组织中的差异表达基因，用Genesis软件绘制差异表达基因的表达图谱。

2.结果

利用基因芯片技术，共筛选得到鼻咽癌和正常鼻咽上皮间差异表达基因2461个，其中在鼻咽癌中表达上调的基因与1677个，在鼻咽癌中下调的基因有784个(图1)。

其中BTRC基因在鼻咽癌组织中表达显著下调(P＝0.001,图2)。

实施例2，实时荧光定量PCR法检测证实BTRC基因在鼻咽癌中表达下调

1.材料与方法：

收集9例正常鼻咽上皮组织和28例鼻咽癌组织，用Trizol(invitrogen公司产品)抽提总RNA，2μg RNA用Superscript First-Strand Synthesis System逆转录试剂盒(Invitrogen公司产品)逆转录成cDNA后，用QuantiTect SYBR Green PCR试剂盒(Qiagen公司产品)进行实时荧光定量PCR检测BTRC及内参基因GAPDH的表达。BTRC及GAPDH基因引物均由Invitrogen公司合成，序列如下：

BTRC forward,5’-CCCCTTCTCGAACATACACCT-3’,

BTRC reverse,5’-AGTCTCAAAGCCCTGCTCCT-3’

GAPDH forward,5’-AACGGATTTGGTCGTATTGG-3’,

GAPDH reverse,5’-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3’

实时荧光定量PCR反应体系

实时荧光定量PCR反应步骤

反应结束后确认实时荧光定量PCR的扩增曲线和熔解曲线，各样本BTRC基因的表达强度根据CT值(threshold cycle values)、内参基因(GAPDH)标化后，采用group t-test检验计算P值。

2.结果

BTRC基因在正常对照组织中表达较高，而在大部分鼻咽癌组织中表达下调P<0.05(图3)。

实施例3，免疫组织化学方法检测BTRC编码的βTrCP蛋白在鼻咽癌中的表达

1.材料与方法

1.1免疫组化检测试剂盒及其他主要试剂

BTRC抗体购自Cell Signaling公司；S-P二步法即用型抗鼠或抗兔(Two-Step^TMAnti-Mouse or Rabbit Detection Reagent，HRP)免疫组化检测试剂盒(NovocastraLaboratories，Ltd.)；正常非免疫兔和羊血清购于北京中山生物技术公司。PBS缓冲液(pH7.2－7.4，NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na₂HPO₄ 4.3mmol/L，KH₂PO₄ 1.4mmol/L)；0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液；0.1％胰蛋白酶液；3％甲醇-H₂O₂溶液；组织微阵列切片专用封片胶。RPMI 1640，DMEM，Lipofectamine，Trizol，ssDNA(Invitrogen)；DEPC；Taq酶，蛋白酶K，RNase(DNase free)，胰酶(北京华美)。

1.2免疫组化检测βTrCP蛋白在组织微阵列中的蛋白表达

1)组织石蜡切片经实验前处理后，脱蜡、水化。

2)PBS洗，5min×3。

3)切片入3％H₂O₂中，阻断内源性过氧化物酶，室温30min。

4)PBS洗，5min×3。

5)抗原修复：根据所检测蛋白的部位和抗体说明书推荐修复方法，使用微波或酶消化抗原修复。微波抗原修复时，TMAs切片置于0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液中，缓冲液沸腾后，调节至低火档，修复切片20min。酶消化抗原修复时，滴加0.1％胰蛋白酶液于切片，37℃下消化25min。

6)PBS洗，5min×3。

7)滴加300μl/TMAs片的正常山羊或兔血清封闭，室温30min，甩去多余液体。滴加即用型或浓缩一抗(按抗体说明书按1:50或1:100、1:200不等的比例稀释)300μl/TMAs，保持切片在密封的湿盒中，4℃冰箱内孵育过夜。

8)PBS洗，5min×3。

9)滴加即用型二抗，300μl/TMAs片，室温(25℃以上)1h。

10)PBS洗，5min×3。

11)DAB显色5～20min，显微镜下控制染色程度。

12)入双蒸水中止反应，双蒸水冲洗10min。

13)苏木素染复染2min，温水分化。

14)双蒸水冲洗10～15min。

15)脱水、透明、封片胶封片。

1.3结果观察和检测结果数据库的建立

光学显微镜下对每一例组织标本中的βTrCP蛋白表达进行观察。两位病理学专家分别按以下一种判断标准进行结果计分：(1)根据阳性染色强度判断：细胞无染色为0分；细胞呈浅棕色，记1分；细胞染成棕色，并无背景染色，或深棕色，但背景呈浅棕色，为中等阳性，记2分；细胞呈深棕色，无背景着色，为强阳性，记3分。(2)根据细胞阳性表达数计分：无阳性细胞表达，计0分；阳性表达细胞≤25％，计1分；25％＜阳性细胞数≤50％，计2分；阳性表达细胞数50％以上，为强阳性，计3分。最终计分两者计分结果乘积得分。结果为0～3分定义为低表达，最终计分为4～9分，为高表达。

2结果

正常鼻咽上皮(Non-tumor NPE)中BTRC编码的βTrCP蛋白表达水平较高(positive)，而在106例鼻咽癌(NPC)中有48例检测到βTrCP的低表达(Low)，其余58例为高表达(high)。βTrCP蛋白在正常鼻咽上皮和鼻咽癌中的表达有显著差异(P<0.05，图4)。

实施例4，原位杂交方法检测证实BTRC基因在鼻咽癌中表达下调且与鼻咽癌患者不良预后相关

1.材料方法

1.1设计并合成杂交探针

为了采用原位杂交方法检测BTRC基因的表达情况，我们设计了针对原位杂交检测BTRC表达的寡核苷酸探针及阳性对照(GAPDH)的原位杂交寡核苷酸探针，序列如下：

BTRC探针1：5'-GTCTAAGTGAATTCTTCTCTGGTATTATCT-3'

BTRC探针2：5'-GTACTTGTGTTCCATACCTTTATAGTTCTA-3'

BTRC探针3：5'-ATCTCCAATTAGATTCTATTGTCTCAATGT-3'

GAPDH探针1：5'-CCACTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCCTGG-3'

GAPDH探针2：5'-CAGTAGAGGCAGGGATGATGTTCTGGAGAG-3'

GAPDH探针3：5'-GTCAGAGGAGACCACCTGGTGCTCAGTGTA-3'

采用化学合成方法合成上述设计的各基因特异性寡核苷酸探针序列，合成过程中探针序列中尿嘧啶已标记生物素(bio-U)。

1.2寡核苷酸探针标记试剂盒和原位杂交检测试剂

地高辛寡核苷酸加尾试剂(Dig Oligonucleitide Tailing Kit 2^nd Generation，Roche公司)，抗地高辛-辣根过氧化物酶复合物检测试剂盒(Anti-Digoxigenin-POD，Fabfragments，Roche公司)，增强原位表达检测信号的TSA信号放大系统(TSA^TM BiotinSystem，NEL700试剂盒，PerkinElmer公司)，DAB染色试剂盒(北京中山公司)，20x柠檬酸钠缓冲溶液(saline sodium citrate,SSC)，硫酸葡聚糖(Dextran sulphate)，去离子甲酰胺(Deionized Formamide)，多聚腺苷酸(polyadenylic acid，Poly A)，多聚脱氧腺苷酸(polydeoxyadenylic acid，Poly dA)，变性剪切的蛙精DNA(denatured and shearedsalmon sperm DNA，ssDNA)，酵母转运RNA(yeast t-RNA，tRNA)，二硫苏糖醇(DTT)，50x邓罕氏缓冲液(Denhardts’s solution)，磷酸缓冲液(PBS buffer)，胃蛋白酶K，牛血清白蛋白(BSA)，三乙醇胺(TEA)，TNB Buffer(0.1M Tris-HCl，pH7.5，0.15M NaCL，0.5％BlockingReagent)，TNT Buffer(0.1M Tris-HCl，pH7.5，0.15M NaCL，0.05％Tween 20)，醋酸酐，阻断试剂(Blocking reagent agent，Roche公司)。

1.3其他主要试剂和材料

无水乙醇、90％酒精、70％酒精、50％酒精、松节油、双蒸水、PBS缓冲液(pH7.2～7.4，NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na₂HPO₄ 4.3mmol/L，KH₂PO₄ 1.4mmol/L)；3％甲醇-双氧水溶液(80％甲醇和30％双氧水配置)；0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液(citrate buffer,CB，pH6.0±0.1，9ml 0.1M柠檬酸溶液和41ml 0.1M柠檬酸钠溶液加入450ml蒸馏水中临时配置后再校正工作液pH值)；0.1％胰蛋白酶；苏木素；1％盐酸酒精(1ml浓盐酸+99ml 70％酒精配置)；封片胶(PTS Cure MountⅡ)；专用盖玻片(480×240mm²)定制于郑州玻璃仪器厂。Leica低熔点(58℃)石蜡，国产蜂蜡，无水酒精，二甲苯，10％中性多聚甲醛(0.01mol/L,pH7.4，DEPC双蒸水和PBS缓冲液配制)，苏木素，伊红，中性封片树胶，盖玻片，载玻片。

1.4标记探针

利用3-tailing DIG Olignucleutide Kit进行寡核苷酸探针标记，反应体系如下。

100pmol oligonucleotide+ddH₂O＝9μl(control:control oligonucleutide 5μl+ddH₂O 4μl)

混匀，稍离心。37℃水浴反应30min，加2μl EDTA(0.2M，PH 8.0)中止反应。

1.5寡核苷酸探针标记后纯化

为了增加标记探针的纯度，需对已标记的探针进行纯化，具体操作如下：

1)探针反应混合物(22μl)+2.5μl 4M LiCl+75μl 100％冷乙醇(-20℃).

2)-70℃沉淀60min，or-20℃2h。

3)13.000×g 4℃离心15min。

4)弃上清，用50μl冰冷的70％(V/V)乙醇洗涤。

5)13.000xg 4℃，离心5min。

6)弃上清，真空4℃干燥。

7)用无菌双蒸水重溶探针。

1.6原位杂交检测存档石蜡切片中EBV-miR-BART10的表达

石蜡切片杂交前处理

1)4℃保存的石蜡切片置于58℃烤片30min，熔化表面石蜡。

2)二甲苯依次脱蜡3×5min。

3)梯级酒精洗涤，100％酒精2×2min→95％酒精1×5min→70％酒精1×5min→50％酒精1×5min→DEPC水洗涤2×3min→DEPC-PBS洗涤2×5min。

4)滴加300μl胃蛋白酶K(10μg/ml)于切片上，37℃消化20min。

5)切片入PBS(0.1M PBS+2mg/ml谷氨酸)洗涤1min，中止反应。

6)切片入0.2N HCL，于37℃反应20-30min，增加组织的通透性。

7)切片用4％多聚甲醛(0.1M PBS溶解)后固定10min，室温。

8)为了增加组织阳性杂交强度，对切片进行乙酰处理。切片入0.25％乙酸酐Buffer Ⅰ(0.1M三乙醇胺)，室温10min。

9)1M PBS洗涤2×5min。

预杂交和杂交

预杂交：-20℃保存的预杂交液，先置于37℃孵育60min，预杂交液的用量为50μl，石蜡膜履盖切片，37℃湿盒中预杂交2小时。(预杂交液成份包括：2XSSC，10％Dextransulphate，1X Denhardt’s solution，50mM Phosphate Buffer(PH 7.0)，50mM DTT，250μl，100μg/ml poly A，5μg/ml poly dA，250μg/ml yeast t-RNA，500μg/ml ssDNA，47％Deionized formamide)。

1)移去石蜡膜，甩掉预杂交液，切片置于2×SSC中5min。

2)杂交反应：37℃杂交过夜(18-20h)。每一切片加入250μl杂交液并用石蜡膜履盖。预杂交液中加入相应的探针就成为杂交液。杂交液在预杂交时配制，放置37℃孵育，使探针充分溶解于杂交液中，本实验按500ng/ml探针浓度配制成杂交液。

3)杂交后洗涤，切片浸入2×SSC，10min，揭去石蜡膜。依次于摇床上摇动洗涤，2×SSC(0.5％SDS)，2×15min→0.25×SSC(0.5％SDS)，2×15min。

杂交后显色检测反应

1)采用Anti-Digoxigenin-POD检测地高辛探针与mRNA结合复合物；TSA放大系统增强原位杂交反应显色反应的阳性信号，DAB显色。

2)切片转至TNT缓冲液中，3×5min。

3)滴加TNB阻断缓冲液，300μl/TMAs，室温，30min。

4)吸去多余阻断剂，1:100稀释的Anti-Digoxigenin-POD(TBS+0.1％Triton X-100+1％阻断剂)，室温4小时。

5)TNT Buffer(0.1M Tris-CL，pH7.5，0.15M NaCL，0.05％Tween 20)洗涤，3x5min。

6)切片上滴加信号放大试剂Biotinyl Tyamid，300μl/TMAs，(Biotinyl Tyramid贮存液：Biotinyl Tyramid溶解于0.2ml DMSO，Biotinyl Tyramid工作液：1×稀释液，1:50稀释Biotinyl Tyramid贮存液)，室温10分钟。

7)TNT洗，3×5min。

8)切片滴加SA-HRP(链霉卵白素-辣根过氧化物酶)，300μl/TMAs，室温30min。

9)TNT洗，3×5min。

10)蒸溜水洗涤，1×1min。

11)DAB显色，显微镜下控制显色反应。

12)苏木素复染，

13)酒精梯级脱水，切片干燥。

14)滴加封片胶，相应规格的盖玻片盖片，紫外灯下交联切片1min。

1.7结果判断及标准

应用光学显微镜分别在低倍和高倍镜下进行观察，首先观察目标RNA的阳性表达信号在观察目标细胞内的定位：位于细胞核、细胞浆或细胞膜。

再分别以该检测RNA表达部位阳性信号的强度和阳性表达的细胞数两种标准进行综合评分，判断标准为：(1)依据阳性细胞染色强度判断：a.细胞无染色，记0分；b.细胞染成浅棕色为弱阳性，记1分；c.细胞染成棕色且无背景着色，或细胞染成深棕色并有浅棕色背景为中等阳性，记2分；d.细胞染成深棕色且无背景着色为强阳性，记3分。(2)依据阳性细胞表达数计分：a.无阳性细胞表达，记0分；b.阳性表达细胞数≤25％，记1分；c.25％＜阳性细胞数＜50％，记2分；d.阳性表达细胞数≥50％，记3分。

为了尽量降低评分结果的主观因素，由两位病理学专家分别按上述标准之一各自进行判断和评分，再将两者评分相乘，结果为：①0分者最终计为0分，认为阴性表达；②1分和2分者最终计为1分，认为弱阳性表达；③3分和4分者最终计为2分，认为中等阳性表达；④6分到9分者最终计为3分，认为强阳性表达。

1.8分析和统计软件

应用SPSS13.0统计软件对实验结果进行统计学分析，两两比较用χ²test或Fisherexact test，相关性分析采用Spearmen correlation方法；P＜0.05即差异有统计学意义。生存曲线分析采用Kaplan-Meier method及log-rank test；多变量分析采用Cox’sproportional hazards model；P＜0.05即差异有统计学意义。

2结果

2.1BTRC基因在鼻咽癌中的表达比正常对照组织中的表达显著下调

正常鼻咽上皮(Non-tumor NPE)中BTRC编码的βTrCP蛋白表达水平较高(positive)，而在106例鼻咽癌(NPC)中有48例检测到βTrCP的低表达(Low)，其余58例为高表达(high)。βTrCP蛋白在正常鼻咽上皮和鼻咽癌中的表达有显著差异(P<0.05，图5)。原位杂交检测的结果与免疫组织化学的结果一致。

2.2BTRC基因低表达的鼻咽癌患者预后较差

我们对鼻咽癌组织中BTRC基因的表达与病人的生存时间和状态进行的生存分析，发现鼻咽癌中BTRC的表达与鼻咽癌患者的预后密切相关，即BTRC高表达(High)的患者不论无病生存时间(Disease free survival,DFS)还是总的生存时间(Overall survival,OS)都要明显长于BTRC低表达(Low)的患者(图6)。

实施例5，在鼻咽癌细胞中过表达BTRC基因抑制鼻咽癌的侵袭与转移，而干扰BTRC基因的表达促进鼻咽癌的侵袭与转移，其机制是通过其底物β-catenin和Snail调控细胞上皮-间质转换

1.材料方法

1.1试剂及试剂盒

限制性内切酶Nhe I和EcoR I及T4DNA连接酶等购自TakaRa公司；TRIZOL^TMReagent(Invitrogen)；质粒抽提试剂盒、胶回收试剂盒(OMEGA)；逆转录试剂盒(Promega)；蛋白酶K、DNase I、RNAsin、RNase A(GBICOL公司)。

1.2pcDNA3.1–BTRC真核表达载体的构建

我们选择pcDNA3.1空白载体(来源于Invitrogen公司)构建BTRC的过表达载体。我们选择Nhe I和EcoR I酶切位点用于酶切pcDNA3.1载体并将BTRC序列插入该位点。

构建pcDNA3.1–BTRC真核载体步骤如下：

1)以鼻咽癌细胞HNE2的cDNA为模板，利用TaKaRa LA酶进行PCR扩增全长BTRC编码区(CDS)序列(见序列表)。BTRC编码区序列扩增引物如下：

上游引物：5’-ATGGACCCGGCCGAGGCGGT-3’

下游引物：5’-TTATCTGGAGATGTAGGTGTATGTT-3’

在上、下游引物的5’端分别加上限制性内切酶Nhe I和EcoR I识别位点及保护碱基后，引物序列如下：

上游：5’-AGGAGCTAGCATGGACCCGGCCGAGGCGGT-3’(下划线部分为Nhe I识别位点)

下游：5’-ATGCGAATTCTTATCTGGAGATGTAGGTGTATGTT-3’(下划线部分为EcoR I识别位点)

2)PCR扩增，BTRC编码区序列，PCR反应条件如下：

PCR反应步骤

3)将PCR产物电泳、胶回收目的片段后经Nhe I和EcoR I双酶切后电泳，再次胶回收。

4)pcDNA3.1质粒经Nhe I和EcoR I双酶切后电泳胶回收目的片段。

5)以T4DNA连接酶连接4)和5)步胶回收产物，即可得到可用于真核表达BTRC的载体质粒。

6)将第5)步得到的包含BTRC编码区序列的pcDNA3.1真核表达质粒转化感受态大肠杆菌，以扩增质粒。

1.3BTRC基因的RNA干扰序列(siBTRC)如下：

5'-CCCAGGGACUGGCGCACUCdTdT-3'

由Invitrogen公司通过化学合成法合成。

1.4制备多聚赖氨酸包被的硅纳米颗粒

多聚赖氨酸包被的硅纳米颗粒是运用OP-10/环己烷/氨水微乳液自组装技术进行硅纳米颗粒(silica nanoparticle,SiNP)的合成，并利用硅纳米颗粒的表面能和通过离子静电作用，制备多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒；所述的纳米颗粒可以由以下方法制备得到：

1)将OP-10(壬基酚聚氧乙烯醚)、环己烷和氨水混合，室温搅拌均匀后加入正硅酸异酯(TEOS)，继续搅拌至聚合完成，加入等体积丙酮，超声分散，离心，双蒸水洗涤三次，离心收集沉淀于80℃干燥，研细得硅纳米颗粒(SiNP，粒径范围10-50nm)。其中H₂O与OP-10及H₂O与TEOS的摩尔比为2～10、氨水浓度为1.6～28％、TEOS在环己烷中的摩尔浓度为0.1～3mol/L。

2)将SiNP按0.1～10mg/ml重悬于0.6M NaCO₃溶液中，超声分散，离心，弃上清，再将沉淀物按0.1～10mg/ml重悬于PBS(pH 7.4)中，超声分散，加多聚赖氨酸(终浓度为4～15nmol/mL)，充分混匀，室温混摇；离心，弃上清，沉淀按0.1～10mg/ml重悬于双蒸水中，得到多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒。

3)将改性硅纳米颗粒超声分散，每毫升纳米颗粒悬液加入10～50ug BTRC表达载体或者BTRC的RNA干扰序列(siBTRC)，混合，室温静置使其结合。

1.5细胞培养与转染

鼻咽癌细胞系HNE2、5-8F和C666-1购自中南大学细胞中心，细胞培养所用RPMI1640培基和胎牛血清，及消化细胞所用的胰蛋白酶均为美国Gibco公司产品。

将生长状态良好的鼻咽癌细胞HNE2、5-8F及C666-1按2×10⁵个细胞/孔接种于6孔板中，将6孔板置于37℃，5％CO₂培养箱中，待培养细胞生长至50-70％密度即可开始BTRC表达载体或RNA干扰序列的转染；转染过程如下：

在无菌EP管中加入100μl制备好的携带BTRC真核表达质粒或siBTRC的多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒悬液，与100μl无血清培养基温和混匀；用D-Hank's液洗涤细胞3次；将上述混合物中加入800μl无血清培养基(无抗生素)，温和混匀后加入6孔板中的1个孔；将6孔板置于CO₂培养箱中，37℃培养6小时，然后弃上清，加入完全培养基继续培养过夜。用携带pcDNA3.1空载体的多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒作为实验对照。

1.6实时定量PCR检测过表达或干扰BTRC表达的效果：

细胞转染成功后，抽提总RNA，逆转录，实时荧光定量PCR法检测BTRC表达，方法和步骤同实施例2。

1.7Western blotting检测过表达或干扰BTRC表达的效果及其下游分子的表达：

Western blotting检测BTRC编码的βTrCP蛋白、βTrCP的底物β-catenin和Snail、上皮-间质转换相关分子，包括上皮细胞的标志物ZO-1、E-cadherin、Claudin-1，间质细胞的标志物ZEB1、N-cadherin、Vimentin、Slug，以及内参基因GAPDH表达的抗体购自CellSignaling Technology公司。鼻咽癌细胞转染BTRC真核表达载体或RNA干扰序列后收集细胞，抽提细胞中的总蛋白，常规Western blotting方法检测上述蛋白的表达，GAPDH作为内参基因。

1.8细胞穿膜实验

细胞穿膜((transwell)实验是验证肿瘤细胞侵袭能力的实验方法。Transwell小室(孔径8μm)及基质胶(Matrigel)购自美国BD公司，4％多聚甲醛固定液、结晶紫染液(0.1％g/ml)购自Sigma公司。将Matrigel按1:8稀释，包被在Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30分钟使Matrigel聚合成凝胶。使用前按BD公司说明书进行基质胶膜水化。

在每个Transwell小室上层加入无血清培养基和1×10⁵个转染了BTRC过表达载体或干扰序列(siBTRC)的鼻咽癌细胞，用转染空白载体的细胞作为对照。在Transwell小室下层加入含20％胎牛血清的培养基。细胞继续培养36小时后，用4％多聚甲醛固定液固定，结晶紫染色，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用PBS洗3遍。在显微镜下观察穿过基质胶膜的鼻咽癌细胞。

1.9细胞划痕实验

细胞划痕实验是验证肿瘤细胞迁移能力的实验方法。转染了BTRC过表达载体或干扰序列(siBTRC)的鼻咽癌细胞接种于6孔板，用转染空白载体的细胞作为对照。待细胞密度达到90％时，用200ul pipet在每个6孔板中划一条直线(划痕)，随后在0、8、12、16、24、32、48小时等各个时间点(视不同细胞迁移能力而定)在显微镜下观察划痕愈合情况，拍照，并计算各组细胞迁移速度。

2.结果

2.1在鼻咽癌细胞中成功地过表达或者干扰了BTRC基因的表达

实时荧光定量PCR检测证实，在鼻咽癌细胞HNE2、5-8F和C666-1中转染BTRC过表达载体后，BTRC基因在鼻咽癌细胞中的表达显著升高(图7左)，而鼻咽癌细胞HNE2、5-8F和C666-1中转染BTRC的干扰序列后，BTRC基因在鼻咽癌细胞中的表达显著降低(图7右)，表明BTRC过表达载体或者RNA干扰序列转染成功。

进一步地，我们用Western blotting技术检测了过表达BTRC过表达或者干扰BTRC基因表达后，其编码的蛋白βTrCP的表达，结果与实时荧光定量PCR检测的一致(图8)。

2.2在鼻咽癌细胞中过表达BTRC后细胞侵袭能力降低，干扰BTRC表达后细胞侵袭能力增强

为在鼻咽癌细胞HNE2、5-8F和C666-1中导入BTRC过表达载体(BTRC OE)和RNA干扰序列(siBTRC)后，细胞穿膜(transwell)实验证实，人为促进BTRC的表达后，能穿过基质胶膜的鼻咽癌细胞数目显著降低，表明细胞侵袭能力减弱，相反，人为降低BTRC的表达后，能穿过基质胶膜的鼻咽癌细胞数目显著增加，表明细胞侵袭能力增强(图9)。

2.3在鼻咽癌细胞中过表达BTRC后细胞迁移能力降低，干扰BTRC表达后细胞迁移能力增强

为在鼻咽癌细胞HNE2、5-8F和C666-1中导入BTRC过表达载体(BTRC OE)和RNA干扰序列(siBTRC)后，细胞划痕实验证实，人为促进BTRC的表达后，鼻咽癌细胞从划痕两边往划痕中央迁移速度明显减慢，划痕愈合的时间延长，表明细胞运动迁移能力降低，相反，人为降低BTRC的表达后，鼻咽癌细胞从划痕两边往划痕中央迁移速度明显提高，划痕愈合的时间缩短，表明细胞运动迁移能力提高(图10)。

2.4在鼻咽癌细胞模型中我们证实BTRC通过其底物β-catenin和Snail调控上皮-间质转换，从而影响鼻咽癌的侵袭转移和预后

在鼻咽癌细胞HNE2和5-8F中导入BTRC过表达载体(BTRC OE)和RNA干扰序列(siBTRC)后我们检测BTRC基因编码的βTrCP蛋白及底物β-catenin和Snail的表达情况，人为促进BTRC的表达后加速了β-catenin和Snail的降解，细胞中β-catenin和Snail的表达量减少，反之人为降低BTRC的表达后β-catenin和Snail的降解减少，细胞中β-catenin和Snail的表达量增强；与上皮-间质转换(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关蛋白的表达也发生了相应的变化，人为促进BTRC的表达后上皮细胞的标志物ZO-1、E-cadherin和Claudin-1的表达升高，而间质细胞的标志物ZEB1、N-cadherin、Vimentin及Slug的表达降低，表明BTRC可以抑制上皮-间质转换；反之人为降低BTRC的表达后，上皮细胞标志物表达降低，而间质细胞的标志物表达升高，表明BTRC低表达后，细胞由上皮向间质样细胞转换，侵袭转移能力增强(图11)。

由此，我们初步绘制了BTRC基因在鼻咽癌发生发展过程中的作用机制图(图12)，BTRC基因可调控上皮-间质转换过程中关键分子β-catenin和Snail的表达，BTRC高表达时β-catenin和Snail容易降解，细胞维持在上皮样状态，不容易发生侵袭转移，当BTRC表达下调时，β-catenin和Snail不容易降解，细胞由上皮样向间质样转换，容易发生侵袭转移，导致患者较快死亡。

Claims (7)

1.BTRC基因的过表达试剂在制备防止鼻咽癌复发和转移的制剂上的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的BTRC基因的过表达试剂的制备方法如下：选择pcDNA3.1空白载体构建BTRC的过表达载体，酶切pcDNA3.1载体并将BTRC序列插入，得到用于真核表达BTRC的载体质粒。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，

构建pcDNA3.1–BTRC真核载体步骤如下：

1)以鼻咽癌细胞HNE2的cDNA为模板，利用TaKaRa LA酶进行PCR扩增SEQNO：1所示的全长BTRC编码区序列，BTRC编码区序列扩增引物如下：

上游引物：5’-ATGGACCCGGCCGAGGCGGT-3’

下游引物：5’-TTATCTGGAGATGTAGGTGTATGTT-3’

在上、下游引物的5’端分别加上限制性内切酶NheI和EcoRI识别位点及保护碱基后，引物序列如下：

上游：5’-AGGAGCTAGC ATGGACCCGGCCGAGGCGGT-3’，下划线部分为NheI识别位点，

下游：5’-ATGCGAATTC TTATCTGGAGATGTAGGTGTATGTT-3’，下划线部分为EcoRI识别位点；

2)PCR扩增，BTRC编码区序列，PCR反应条件如下：

PCR反应步骤

返回到第2步，共进行39次反应循环；

3)将PCR产物电泳、胶回收目的片段后经NheI和EcoRI双酶切后电泳，再次胶回收；

4)pcDNA3.1质粒经NheI和EcoRI双酶切后电泳胶回收目的片段；

5)以T4 DNA连接酶连接3)和4)步胶回收产物，即可得到可用于真核表达BTRC的载体质粒。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将得到的包含BTRC编码区序列的pcDNA3.1真核表达质粒转化感受态大肠杆菌，以扩增质粒。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将表达载体负载到多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒上制成纳米球。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，BTRC基因的过表达试剂用于制备抑制上皮-间质转换制剂。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，促进BTRC基因的表达能使上皮细胞的标志物ZO-1、E-cadherin和Claudin-1的表达升高，而间质细胞的标志物ZEB1、N-cadherin、Vimentin及Slug的表达降低。