KR101512684B1 - 플라보노이드의 피부 흡수 증진을 위한 리포좀-셀룰로오스 하이드로겔 복합체 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 리포좀-셀룰로오스 하이드로겔 복합체 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 수난용성 활성물질을 담지하여 피부에 효과적으로 전달할 수 있는 리포좀-셀룰로오스 하이드로겔 복합체 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

Description

플라보노이드의 피부 흡수 증진을 위한 리포좀-셀룰로오스 하이드로겔 복합체 조성물{Liposome-cellulose hydrogel complex composition for enhanced transdermal delivery of flavonoids}
본 발명은 리포좀-셀룰로오스 하이드로겔 복합체 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 수난용성 활성물질을 담지하여 피부에 효과적으로 전달할 수 있는 리포좀-셀룰로오스 하이드로겔 복합체 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
피부는 표피, 진피 및 피하 지방으로 구성되어 있는데, 그 중 표피의 가장 바깥에 존재하는 각질층은 외부 환경과 항상 접촉하고 있기 때문에 자외선, 공해, 미생물 등에 의한 산화적 스트레스에 직접적으로 노출되어 있다. 특히 자외선에 의해 발생하는 활성산소종 (reactive oxygen species, ROS)은 DNA, 지질 및 단백질을 포함하는 생체 분자의 변형을 일으키고 노화를 촉진하는 주원인이 된다. 따라서 각질층에는 이러한 스트레스를 방어할 수 있는 항산화 시스템이 구축되어 있는데 이는 생리적 산화환원 밸런스를 유지하기 위해 매우 중요하다1-4. 체내 항산화 방어망은 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제 (superoxide dismutase, SOD), 카탈라아제(catalase), 글루타치온 퍼옥시다아제(glutathione peroxidase, GSHPx) 등 효소적 항산화제와 비타민 E, 비타민 C, 카로티노이드(carotinoid), 플라보노이드(flavonoid) 등 비효소적 항산화제로 이루어져있다. 이 중 플라보노이드는 자연계에 널리 존재하는 폴리페놀계 화합물로서 항산화, 항염, 항암 활성 등 높은 생리활성을 가지고 있다.
대표적인 플라보노이드 항산화제인 퀘르세틴과 그 배당체인 루틴은 뛰어난 라디칼 소거 활성과 킬레이트 효과 그리고 세포 보호 효과 등이 있는 것으로 보고되어 있다. 하지만 이러한 높은 활성에도 불구하고 열이나 빛에 불안정하고 수용액에 거의 녹지 않는 소수성 물질로서 다양한 분야에 활용하는데 제한이 따르고 있다. 따라서 이러한 단점들을 해결하고 피부 속으로 효과적으로 전달하기 위한 제형 연구가 요구되고 있다. 현재 플라보노이드의 난용성을 해결하고 피부 흡수 증진을 위한 제형 연구들이 많이 진행되고 있지만 막 불안정성이나 낮은 포집 효율, 제형 내 활용도 등의 문제가 제기되고 있어 상기의 문제점을 해결한 제형의 필요가 존재하는 실정이다.
피부 장벽은 각질층 세포 사이의 세포 외 공간을 채우는 지질의 분자 구성으로 인한 기능으로써 피부의 항상성 유지와 온도, 압력, 물리적 자극 및 수화/탈수에 대한 변화로부터 피부를 보호하는 데 매우 중요하다. 하지만 유효 성분을 피부를 통해 전달하고자 할 때 매우 불리하게 작용한다. 약물이 피부를 통과하는 가장 보편적인 경로는 세포 내 경로(inter-cellular pathway)라고 알려져 있다. 하지만 실제 유효 성분이 통과하기 위해서는 각질층 두께의 약 20 배에 해당하는 경로를 지나가야 한다. 따라서 약물의 자체 확산 속도만으로는 피부 투과율이 크게 감소하며 치료학적 농도를 얻기 어렵다. 이를 극복하기 위해서는 생체 친화성의 적절한 시스템이 요구된다.
1차 방어막인 최외각층의 각질층은 피부 수화도가 증가함에 따라 장벽 기능이 감소될 수 있는데 피부 수화 시스템을 개발하면 투과 촉진 제제로써 활용이 가능하다. 이러한 시스템을 이용할 경우 유기 용매 등을 통해 각질층을 붕괴시키는 방법보다 안전성과 효율성 면에서 긍정적인 효과를 거둘 수 있다. 하이드로겔은 물에 팽윤되어 녹지 않고 많은 양의 수분을 함유할 수 있는 3차원 망상 구조의 친수성 고분자로 이루어진 물질이다. 하이드로겔은 수용액에서 팽윤된 이후 열역학적으로 안정하게 존재하고 특유의 친수성과 유연성을 가진다.
셀룰로오스는 환경 친화적이고 생체친화성이 높은 거의 무한한 자원 중 하나로 이를 기반으로 한 다공성 하이드로겔은 독성이나 자극이 없고 생분해성과 높은 팽윤력을 가진다. 화학적으로 가교 결합된 망상 구조로 인해 안정한 구조를 가지고 수 백 ㎛ 크기의 열린 공극 구조로 인해 모세관 현상을 이용한 흡수와 팽윤이 빠르게 일어나는 장점이 있다. 이러한 하이드로겔은 물질을 담지할 때 간단한 혼합만으로 가능하기 때문에 고효율의 전달시스템을 설계하는 것이 가능하고 피부 부착력을 높여 상피 세포를 통한 수분 증발을 막고 피부의 수화 상태를 유지하여 약물 전달 및 피부 보습 유지에 용이하다.
다만, 이러한 하이드로겔만을 사용하는 경우 피부로 흡수되는 양보다 하이드로겔 내 흡착되어 있는 약물의 양이 현저하게 많고 제조시 약물의 양이 많이 필요한 한계가 발견되었다.
셀룰로오스 하이드로겔은 피부 최외각층을 수화시켜 각질층의 장벽 기능을 일시적으로 붕괴하여 퀘르세틴과 루틴의 투과력을 높이는 방법으로 물을 이용하기 때문에 안전성과 효율성이 뛰어나지만 활성 물질이 난용성인 경우 이를 극복하는 데 한계가 있고 각질층 내 축적되는 물질의 양이 소량이기 때문에 각질층 항산화 방어망에 대한 긍정적인 효과를 기대하기 어렵다.
반면, 세라마이드 리포좀은 각질층에 존재하는 각질세포 간 지질과 유사한 구성을 가지고 있기 때문에 세포 간 지질에 쉽게 융합되어 난용성 활성물질과 리포좀을 전달하는 방식으로 피부 내 축적될 가능성이 더 높다. 따라서 지속적으로 물질의 투과를 가능하게 하고 각질층 항산화 방어망에도 긍정적인 효과를 기대할 수 있다. 하지만 리포좀의 지질 친화도만으로는 총 침투량을 높이기에는 한계점이 있으며 실제 화장품과 같은 제형에 적용 시 낮은 유화 안정성 등의 어려움이 있다.
이에 본 발명자들은 상기한 문제점을 개선하기 위하여 리포좀에 활성 물질을 담지하고, 하이드로겔 내로 상기 리포좀을 함입시켜 리포좀-셀룰로오스 하이드로겔 복합체를 발명하였다. 리포좀-셀룰로오스 하이드로겔 복합체는 제조가 쉽고 사용이 용이한 장점이 있으며, 세포간지질에 용이하게 융합되어 피부 내로 난용성 물질의 투과를 촉진시키며, 지속적 물질 투과, 각질층 항산화 어망, 총 침투량 및 화장품 제형 등에 적용할 때에 유화 안정성까지 도모할 수 있다.
따라서 본 발명의 목적은 수난용성 활성물질을 효과적으로 포집하여 화장품 원료 등에 사용할 때에 제품 내에서의 안정성과 분산성이 뛰어나며, 사용시 피부에 전달되어 흡수되는 효과가 우수한 활성물질의 전달체를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 리포좀 용액을 셀룰로오스 다공성 하이드로겔에 함입시킨 리포좀-하이드로겔 복합체 조성물 및 이의 제조방법을 제공한다.
상기 리포좀은 생체 내 세포막을 이루는 지질 이중층의 구성물과 유사한 생체 유사 지질막으로 이루어져 있어 독성이 낮고 뛰어난 생체 친화도를 이용하여 유효 성분을 전달하기 쉬운 장점이 있다. 또한 리포좀은 소포(vesicle)를 구성하는 물질과 제조 조건에 따라 물리적 안정성, 포집 효율, 피부 흡수능 등이 달라진다.
본 발명은 세포간지질에 용이하게 융합될 수 있도록 하기 위하여 각질세포간 지질과 유사한 소포를 만들기 위해 각질세포간 지질의 주성분인 세라마이드, 콜레스테롤과 피부 흡수 증진제로 보고되고 있는 불포화지방산인 올레인산을 사용하였다. 그리고 결정성이 높은 세라마이드의 특성으로 인해 용해도를 높이기 위하여 포스파티딜콜린(phosphatidyl choline)을 첨가하였다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 리포좀-하이드로겔 복합체 조성물은 포스파티딜콜린, 세라마이드, 콜레스테롤 및 올레산을 포함하여 활성물질을 담지하는 리포좀이 셀룰로오스 및 가교제를 포함하는 셀룰로오스 다공성 하이드로겔에 함입된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 리포좀-하이드로겔 복합체 조성물의 제조방법은
a) 포스타티딜콜린, 세라마이드, 콜레스테롤 및 올레산과 활성물질을 유기용매에 용해시키는 단계;
b) 상기 a)의 용해액으로부터 상기 유기용매를 증발시켜 필름을 형성시키는 단계;
c) 상기 b)에서 형성된 필름에 완충용액을 첨가하여 수화시켜 리포좀 용액을 제조하는 단계;
d) 셀룰로오스 및 염기성 수용액을 포함하는 셀룰로오스 용액을 제조하는 단계;
e) 상기 셀룰로오스 용액에 가교제를 첨가하여 가교반응을 진행하고, 건조시켜 셀룰로오스 다공성 하이드로겔을 제조하는 단계; 및
f) 상기 e)에서 제조된 셀룰로오스 다공성 하이드로겔을 상기 c)에서 제조된 리포좀 용액에 넣는 단계를 포함할 수 있다.
상기 활성물질은 수난용성 활성물질로서 피부에 흡수시켜 효과를 나타내기 위한 유효성분으로서, 수난용성 플라보노이드를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 퀘르세틴 또는 루틴을 사용할 수 있다.
상기 퀘르세틴(Quercetin)은 플라보놀 구조로 B-ring에 존재하는 카테콜기(catechol group) 및 C-환에 존재하는 케톤기, A, B, C-환에 있는 페놀성 OH 기가 항산화 활성을 포함하는 다양한 생리 활성을 나타내는데 기여하는 것으로 알려져 있다. 상기 루틴(Rutin)은 퀘르세틴에 당이 2개 결합된 대표적인 퀘르세틴 배당체로 항산화 활성뿐만 아니라 다양한 질환에 효과가 있다. 상기 퀘르세틴과 루틴은 물에 대한 난용성이기 때문에 자체로는 화장품 원료 등으로 사용되는데에 한계가 있다.
상기 셀룰로오스 다공성 하이드로겔에 상기 리포좀을 함입시킬 때에 상기 하이드로겔과 상기 리포좀의 함량은 중량비로 1:10 ~ 1:200일 수 있으며, 1:50인 것이 바람직하다.
본 발명의 일실시예에 따른 리포좀은 당해 분야에 있어서 통상적인 방법에 의하여 제조할 수 있으며, 포스파티딜콜린, 세라마이드, 콜레스테롤 및 올레산과 상기 활성물질을 포함한다.
상기 리포좀은 유기용매에 상기 포스파티딜콜린, 세라마이드, 콜레스테롤 및 올레산과 상기 활성물질을 용해시켜 제조할 수 있으며, 상기 유기용매는 당업계에서 통상적으로 사용되는 것이라면 한정되지 않고 사용될 수 있고, 예를 들어 클로로포름-메탄올을 사용할 수 있다. 제조에 사용한 상기 유기용매를 제거하고 필름을 형성시킨 후, 가수분해로 인한 인지질막 파괴를 방지하기 위하여 인산완충용액 또는 증류수와 같은 완충액에 수화시켜 리포좀 용액 상태로 사용할 수 있다.
상기 리포좀 용액 총 중량에 대하여 상기 포스타티딜콜린 0.40~0.42중량%, 세라마이드 0.08~0.10중량%, 콜레스테롤 0.13~0.27중량% 및 올레산 0.19~0.20중량%를 함유할 수 있다. 상기 세라마이드가 0.10중량%를 초과하는 경우 세라마이드들이 응집하는 문제가 있으며, 상기 콜레스테롤의 함량이 상기 범위를 벗어나 낮은 경우에는 리포좀의 입자 크기가 지나치게 작아지는 문제가 있다.
상기 활성물질이 퀘르세틴인 경우 상기 퀘르세틴은 상기 리포좀 용액 총 중량에 대하여 0.003~0.02중량%로 함유할 수 있으며, 바람직하게는 0.003~0.015중량%로 함유할 수 있다. 상기 퀘르세틴의 함량이 0.015중량%를 초과하는 경우 퀘르세틴이 용해되지 않아 리포좀 내로 포집되지 않으며, 0.003중량% 미만인 경우 활성물질로서의 효능이 미약한 문제가 있다. 또한 상기 활성물질이 루틴인 경우 상기 루틴은 상기 리포좀 총 중량에 대하여 0.001~0.05중량%로 함유할 수 있으며, 바람직하게는 0.001~0.03중량%로 함유할 수 있다. 상기 루틴의 함량이 0.03중량%를 초과하는 경우 루틴이 용해되지 않아 리포좀 내로 포집되지 않으며, 0.001중량% 미만인 경우 활성물질로서의 효능이 미약한 문제가 있다.
상기 리포좀은 리포좀의 안정성 및 활성물질의 리포좀 내 포집 효율 및 활성물질의 방출 후 안정성의 측면에서 상기 포스파티딜콜린:세라마이드가 몰비로 3:1~4:1로 함유하는 것이 바람직하며 상기 범위를 벗어날 경우 리포좀 입자가 깨지거나 세라마이드의 결정성으로 인한 응집이 발생하는 문제가 있다.
또한 포스파티딜콜린:세라마이드:콜레스테롤:올레산의 몰비는 3:1:0.5:1 ~ 4:1:1:1로 함유할 수 있다. 특히, 상기 플라보노이드가 퀘르세틴일 때 상기 리포좀은 상기 포스파티딜콜린:세라마이드:콜레스테롤:올레산을 몰비로 0.8:0.2:0.5:1로 함유하는 것이 바람직하며, 상기 플라보노이드가 루틴일 때 상기 리포좀은 상기 포스파티딜콜린:세라마이드:콜레스테롤:올레산을 몰비로 0.75:0.25:0.5:1로 함유하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일실시예에 따른 상기 셀룰로오스 다공성 하이드로겔은 셀룰로오스 및 염기성 수용액을 포함하는 셀룰로오스 용액; 및 가교제;를 포함하는 혼합용액에서 가교된 것이다.
상기 셀룰로오스 다공성 하이드로겔은
A) 셀룰로오스 및 염기성 수용액을 포함하는 셀룰로오스 용액을 제조하는 단계;
B) 상기 셀룰로오스 용액에 가교제를 혼합하여 혼합용액을 제조하는 단계; 및
C) 상기 혼합용액에서 가교반응을 진행하는 단계를 포함하는 셀룰로오스 다공성 하이드로겔의 제조방법에 의해 제조될 수 있다.
상기 셀룰로오스의 농도는 상기 혼합용액에 있어서 1~3질량/부피%이며, 상기 가교제의 농도는 상기 혼합용액에 있어서 4~12질량/부피%일 수 있다.
상기 A) 단계는
A-1) 상기 셀룰로오스 용액을 -71~-70℃에서 동결시킨 후 해동시키는 단계를 더 포함할 수 있으며,
상기 A-1) 단계는
A-2) 상기 해동된 셀룰로오스 용액에 증류수를 첨가하면서 교반하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 셀룰로오스의 농도는 상기 혼합용액에 있어서 1~3질량/부피%일 수 있으며, 바람직하게는 2질량/부피%일 수 있다. 셀룰로오스의 농도가 상기 범위를 벗어나 낮은 경우 하이드로겔 자체의 강도가 낮고 쉽게 분해되는 특성과 낮은 합성 수율을 갖는 문제가 있다. 상기 가교제의 농도는 상기 혼합용액에 있어서 4~12질량/부피%일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 셀룰로오스의 농도가 상기 혼합용액에 있어서 1~2질량/부피%일 때는 가교제 양에 비례하여 강해지는 분자 간 상호작용에 의해 가교도가 증가하지만, 상기 셀룰로오스의 농도가 3질량/부피%인 경우 가교제 양의 증가에 의해 가교결합 형성이 크게 영향 받지 않는다.
상기 셀룰로오스 농도와 상기 가교제 농도의 비율은 질량/부피%로 1:6~1:12인 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 1:6~1:8, 보다 더 바람직하게는 1:6일 수 있다. 상기 가교제의 비율이 상기 범위를 벗어나 낮아지는 경우 가교결합이 충분히 일어나지 않아 하이드로겔의 수분 흡수능이 열악해지는 문제가 있다.
상기 셀룰로오스는 미정질 셀룰로오스(microcrystalline cellulose), 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 미정질 셀룰로오스를 사용할 수 있다.
상기 가교제는 에피클로로히드린(ephiclorohydrin; ECH), 암모늄퍼설페이트(ammonium persulfate), 디비닐벤젠(divinyl benzene) 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 에피클로로히드린을 사용할 수 있다.
상기 염기성 수용액은 당업계에서 통상적으로 사용되는 것을 사용할 수 있으며, 예를 들어 NaOH를 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 리포좀-셀룰로오스 하이드로겔 복합체는 제조가 쉽고 사용이 용이한 장점이 있다. 본 발명의 일실시예에 따른 셀룰로오스 하이드로겔은 구조 내 많은 기공으로 인해 단시간에 팽윤하면서 손쉽게 많은 물질을 포집할 수 있는 특성을 가지고 있다. 따라서 수분 흡수능이 우수하며, 물질 포집 효율이 뛰어난 동시에 물질 방출이 우수하여 수난용성 활성물질을 효과적으로 담지하고, 피부에 효과적으로 전달할 수 있다. 또한 세포 간 지질에 용이하게 융합되어 피부 내로 난용성 물질의 투과를 촉진시키며, 지속적 물질 투과를 도모하며 피부 차폐 기능으로 인해 상피 세포를 통한 수분 증발을 막고 외부로부터 피부를 보호해주는 역할을 할 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따른 리포좀은 외부 손상으로 인한 피부 장벽 붕괴시 소실된 세포간지질의 지질을 보강하는 역할을 할 수 있으며, 난용성 활성물질을 각질층 내에 저장하여 각질층 항산화 방어망 구축에 도움을 줄 수 있다. 따라서 양 자의 장점을 모두 가지면서도 또한 세라마이드 리포좀이 셀룰로오스 하이드로겔에 침투 및 흡착을 통해 포집된 후 방출될 때에 리포좀의 구조가 그대로 유지되어 포집 전과 방출 후에 소포의 안정성이 유지되며, 활성물질의 피부 총 침투량을 높일 수 있으며 화장품 제형 등에 적용할 때에 유화 안정성까지 도모할 수 있다.
도 1은 리포좀 구성 물질의 몰비에 따른 리포좀 내에 퀘르세틴과 루틴의 포집 효율을 나타낸 것이다.
도 2는 셀룰로오스 하이드로겔 내에 포집된 세라마이드 리포좀의 포집 전 및 방출 후의 평균 입자 크기와 입자 분포를 나타낸 것이다.
도 3은 하이드로겔에 함입된 세라마이드 리포좀을 이용한 퀘르세틴과 루틴의 피부 투과량을 나타낸 것이다.
이하, 시험예 및 실시예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 시험예 및 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 하기 예에 의해 제한되는 것은 아니다.
[기기 및 시약, 통계 처리]
셀룰로오스(microcrystalline, powder), 에피클로로히드린((±)-epichlorohydrin (≥ 99.0 %); ECH), L-α-포스파티딜콜린(L-α-phosphatidyl choline, from egg yolk, ≥ 60 %; Egg PC), 콜레스테롤(≥ 99.0 %; Col), 올레산(oleic acid, ≥ 99.0 %; OA), 퀘르세틴(quercetin), 루틴(rutin)은 Sigma (USA)에서 구입하여 사용하였다. 세라마이드-3은 DS-CERAMIDE Y30 제품을 (주)두산글로넷 (Korea)으로부터 공급받아 사용하였다. 1,3-Butylene glycol, 메탄올, 에탄올, 클로로포름, 아세톤 등 각종 용매는 시판 특급 시약을 정제 없이 사용하였다. 하이드로겔 제조를 위해 교반기는 HSD 120-03P (MISUNG SCIENTIFIC Co., Ltd, Korea) 모델을 사용하였고, 원심분리기는 2236R (GYROZEN Co., Ltd,, Korea) 모델을 사용하였다. 리포좀 제조를 위해 회전증발농축기 (BUCHI, Switzerland)와 probe sonicator (BRANSON, USA)를 사용하였다. 퀘르세틴과 루틴의 농도를 결정하기 위해 UV spectrometer는 Cary 100 (Agilent, USA)을 사용하였고, HPLC는 Shimadzu (Japan) 모델을 사용하였다.
모든 실험은 3회 반복하였고 통계분석은 5 % 유의수준에서 Student′s t-test를 수행하였다.
[참고예 1] 세라마이드 리포좀의 제조
세라마이드 리포좀을 얇은 막 수화법에 의해 제조하였다. L-α-포스파티딜콜린(PC), 세라마이드(Cer), 콜레스테롤(Chol), 올레산(OA) 및 퀘르세틴과 루틴을 하기 표 1 및 표 2의 조성에 따라 용매인 클로로포름-메탄올 (4 : 1) 25 ㎖에 완전히 용해될 때까지 녹인 후 회전증발농축기를 이용하여 용매를 완전히 제거하고 필름을 형성시켰다. 형성된 필름에 리포좀 제조 후 가수분해로 인한 인지질 막 파괴를 막기 위해 pH 7.0 ± 0.5가 유지되도록 인산완충용액(phosphate buffer, PB)을 첨가하여 지질의 상전이 온도 이상에서 1시간 동안 PB에 수화시킨 다음 probe sonicator를 이용하여 균질화시켰다. 그 다음 0.45 ㎛ 필터(Minisart CA 26 mm)를 통과시켜서 보관하였다. 편의상 조성을 달리하는 빈 리포좀의 몰 비를 기준으로 L-a ~ L-h로 명명하였으며, 퀘르세틴과 루틴을 포집한 리포좀은 L-α-포스파티딜콜린(PC), 세라마이드(Cer), 콜레스테롤(Chol), 올레산(OA)의 몰 비가 L-e ~ L-h 에 해당하는 조성을 사용하여 퀘르세틴 또는 루틴을 0.5몰을 함유하도록 하였다.
[시험예 1] 세라마이드 리포좀의 안정성 평가
상기 참고예 1에서 제조한 빈 리포좀과 퀘르세틴 또는 루틴을 포집한 리포좀의 입자 크기 및 분포도를 측정하여 안정성을 평가하였다. 입도분석기는 Otsuka ELS-Z2 (Otsuka Electronics, Japan) 모델을 이용하였고 측정 온도는 25 ℃, 산란각은 165°, 광원은 Ar 레이저를 사용하였다. 리포좀 크기를 제조 직후, 이로부터 1주, 2주 및 3주가 되는 때에 측정하였다. 매 측정에 있어서 70 번씩 3 회 (총 210번) 반복해서 측정한 값의 평균치를 사용하였다.
평균 입자 크기는 누적분석법으로 나타내었고 분포도는 Contin 법으로 해석하여 결과를 하기 표 1 및 표 2에 나타내었다.
샘플 리포좀 조성(몰 비) 평균 입자 크기
(nm)		 입자 크기 분포
PC Cer Chol OA Q R
빈
리포좀		 L-a - 1 1 1 - - 응집(결과 없음)
L-b 1 - 1 1 - - 200.57 ± 83.16* 131.63 ± 47.67
L-c 0.25 0.75 1 1 - - 366.45 ± 5.75 206.15 ± 90.25
L-d 0.5 0.5 1 1 - - 517.49 ± 270.76 564.28 ± 367.98
L-e 0.75 0.25 1 1 - - 240.45 ± 36.12* 187.98 ± 39.88
L-f 0.75 0.25 0.5 1 - - 140.48 ± 8.86* 71.88 ± 16.77
L-g 0.8 0.2 1 1 - - 136.55 ± 12.40* 69.71 ± 5.17
L-h 0.8 0.2 0.5 1 - - 139.49 ± 17.17* 77.31 ± 9.29
* 3주 이상 안정성 유지
상기 표 1의 결과에서, 세포간지질의 조성과 동일한 몰비를 갖는 L-a의 경우 세라마이드의 큰 결정성으로 인해 제조 직후 응집이 관찰되어 입자 크기 및 입자 크기 분포를 측정할 수 없었다. 세라마이드 용해도 개선을 위해 포스파티딜콜린을 배합하였으며, 세라마이드를 포스파티딜콜린으로 완전히 대체한 L-b의 경우 평균 입자 크기가 약 200nm이며 안정성 또한 3 중 이상 지속되는 것을 확인할 수 있다. 포스파티딜콜린:세라마이드의 몰비가 3:1, 4:1인 L-e, L-g에서 3주 이상 안정성이 유지되는 것을 확인할 수 있다. 콜레스테롤은 지질막 내에서 외부 환경으로부터 막을 보호하고 형태를 유지하는 역할을 하나, 지질막 내 함량이 지나치게 증가하면 막의 패킹(packing)이 견고하여 유연성이 감소하게 되기 때문에 물질 포집 효율이나 소포(vesicle)의 피부 침투력이 감소될 우려가 있다. 이에, 3주 이상 안정성이 유지된 L-e, L-g의 조성에 있어서 콜레스테롤의 몰 비를 0.5로 조정한 L-f, L-h 역시 제조하였으며 L-f의 경우 입자 크기 및 분포도가 감소하였으며, L-h의 경우 유의적 차이가 없었으며 양 자 모두 3주 이상 안정성이 유지됨을 확인할 수 있다.
샘플 리포좀 조성(몰 비) 평균 입자 크기(nm) 입자 크기 분포
PC Cer Chol OA Q R
퀘르세틴
포집
리포좀		 L-e 0.75 0.25 1 1 0.5 - 162.09 ± 8.85* 85.70 ± 10.97
L-f 0.75 0.25 0.5 1 0.5 - 131.48 ± 9.31* 70.78 ± 6.00
L-g 0.8 0.2 1 1 0.5 - 161.31 ± 4.40* 68.71 ± 11.29
L-h 0.8 0.2 0.5 1 0.5 - 130.56 ± 2.09* 70.00 ± 2.61
루틴
포집
리포좀		 L-e 0.75 0.25 1 1 - 0.5 152.76 ± 3.89* 87.93 ± 8.60
L-f 0.75 0.25 0.5 1 - 0.5 134.08 ± 4.60* 84.79 ± 4.20
L-g 0.8 0.2 1 1 - 0.5 151.99 ± 5.64* 90.00 ± 9.02
L-h 0.8 0.2 0.5 1 - 0.5 131.48 ± 7.32* 75.68 ± 8.20
* 3주 이상 안정성 유지
상기 표 2의 결과에서, 빈 리포좀 L-e~L-h와 L-α-포스파티딜콜린(PC), 세라마이드(Cer), 콜레스테롤(Chol), 올레산(OA)의 몰 비가 동일한 경우에 있어서 모두 3주 이상 안정성이 유지되었다. 퀘르세틴과 루틴은 구조상 친수성인 리포좀 내부보다 친유성인 리포좀 막 사이에 함께 존재할 가능성이 높기 때문에 리포좀 막의 특성을 변화시킬 수 있다. 대체적으로 입자크기 및 분포도는 감소하는 경향성을 나타내며, 빈 리포좀에서 입자 크기가 증가했던 L-e 조성 조건에서도 입자 크기 및 분포도를 유의적으로 감소시키는 것을 알 수 있다. 또한 입자 크기는 콜레스테롤의 몰 비가 0.5일 때(L-f, L-h) 더 작게 나타났으며, 입자 분포도는 조성에 따른 유의적 차이가 없었다.
[시험예 2] 세라마이드 리포좀 내의 퀘르세틴과 루틴의 포집 효율
상기 참고예 1에서 제조된 표 2의 조성을 갖는 리포좀 용액을 2㎖씩을 취하여 0.45㎛ 필터(Minisart CA 26mm)를 이용하여 포집되지 않은 퀘르세틴 또는 루틴을 제거한 후, 필터를 통과한 리포좀 용액에 EtOH를 과량 넣어 리포좀 막을 파괴하여 포집된 퀘르세틴 또는 루틴을 용출시켰다. EtOH를 회전 증발기를 이용하여 완전히 제거한 후 다시 2㎖ EtOH를 넣어 퀘르세틴 또는 루틴을 녹여 HPLC를 이용하여 퀘르세틴 또는 루틴의 양을 정량하였으며, 하기 수학식 1을 이용하여 리포좀 내 물질의 포집 효율을 계산하여 결과를 도 1에 나타내었다.
Figure 112013053862394-pat00001
도 1의 결과에서, 포스파티딜콜린:세라마이드=4:1인 조건(L-g, L-h)에서는 퀘르세틴과 루틴 간의 유의적 차이가 나타나지 않았으며, 퀘르세틴은 콜레스테롤의 몰비가 1일 때 보다 0.5일 때 포집 효율이 더 높은 경향성을 나타냈으나 루틴의 경우 유의적 차이가 없다. 포스파티딜콜린:세라마이드=3:1인 조건(L-e, L-f)에서는 콜레스테롤의 비율에 관계없이 루틴의 포집 효율이 유의적으로 더 높게 나타났으며, 콜레스테롤의 몰 비가 1일 때 보다 0.5일 때 포집 효율이 더 높았지만 유의적 차이를 나타내지는 않는다. 포집 효율에 있어서 퀘르세틴은 L-d가 가장 우수하며 루틴은 L-h가 가장 우수하게 나타났다. 루틴과 퀘르세틴을 함유한 리포좀의 평균 입자 크기는 각각 130.56 ± 2.09 nm, 134.08 ± 4.60 nm이며, 전반적으로 루틴이 퀘르세틴에 비해 포집 효율이 높은 경향을 나타내며 이는 루틴이 가진 당 구조로 인하여 소수성과 친수성을 동시에 가지고 있어 퀘르세틴에 비해 리포좀 막 사이로 침투가 용이하기 때문인 것으로 보인다.
[참고예 2] 셀룰로오스 하이드로겔의 제조
셀룰로오스 하이드로겔은 D. Ciolacu의 방법을 변형시켜서 제조하였다. 셀룰로오스 파우더 0.5 g을 실온에서 9 % NaOH 용액 13.45 ㎖에 분산시킨 후 -70 ℃에서 24시간 동안 동결시켰다. 동결된 셀룰로오스 용액을 실온에서 해동시킨 다음 계속 교반시키면서 증류수 11.55 mL를 첨가하고 에피클로로히드린((±)-epichlorohydrin; ECH) 3 ㎖를 drop-wise 방식으로 첨가하고, 80 ℃에서 8시간 동안 가교 반응을 진행하여 2질량/부피% 셀룰로오스와 12질량/부피% 하이드로겔을 포함하는 셀룰로오스 하이드로겔을 제조하였다. 반응 종료 후 형성된 셀룰로오스 하이드로겔에 남은 NaOH 용액과 형성된 염을 제거하기 위해서 증류수를 이용하여 세척하였고, 에피클로로히드린를 완전히 제거하기 위해서 아세톤을 이용하여 세척하였다. 시료는 원심분리기를 이용하여 용매를 제거한 후 상온에서 진공 상태로 건조시킨 다음 보관하였다.
[시험예 3] 세라마이드 리포좀의 셀룰로오스 하이드로겔로부터 방출 후 안정성 평가
세라마이드 리포좀이 셀룰로오스 격자 구조 내로 침투했다가 방출되는 과정에서 안정성을 그대로 유지하는지 알아보기 위해서 세라마이드 리포좀이 셀룰로오스 하이드로겔에 포집되기 전과 셀룰로오스 하이드로겔로부터 방출된 후의 안정성을 비교하여 평가하였다.
상기 참고예 2에서 제조된 셀룰로오스 하이드로겔 건조물 0.1 g을 상기 참고예 1에서 표 1의 조성으로 제조된 리포좀 용액 5 ㎖에 넣고 37 ℃에서 24 시간 동안 팽윤시키면서 리포좀을 하이드로겔 내에 침투 및 흡착을 통하여 함입시켜 제조하였다. 리포좀 용액이 포집된 하이드로겔을 인산완충용액(pH 7.4) 5 ㎖에 넣고 37 ℃에서 24시간 동안 리포좀 용액을 다시 방출시켰다. 상기 리포좀 용액이 하이드로겔 내에 포집되기 전과 하이드로겔로부터 방출된 리포좀의 입자 크기 및 분포도를 상기 시험예 1과 동일하게 입도분석기는 Otsuka ELS-Z2 (Otsuka Electronics, Japan) 모델을 이용하였고 측정 온도는 25 ℃, 산란각은 165°, 광원은 Ar 레이저를 사용하여 측정하였다. 리포좀의 크기는 70 번씩 총 3 회 반복해서 측정하였으며, 평균 입자 크기는 누적분석법으로 나타내었고 분포도는 Contin 법으로 해석하여 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2의 결과에서, 리포좀의 모든 조성(L-e~L-h)에서 포집 전과 유사한 입자 크기와 분포를 나타내는 것을 확인할 수 있어, 리포좀이 하이드로겔 내 포집된 다음 방출 후에도 안정성이 양호하게 유지되는 것을 알 수 있다.
[시험예 4] 세라마이드 리포좀-셀룰로오스 하이드로겔 복합 제형의 리포좀의 포집 효율 및 수분 흡수도
셀룰로오스 하이드로겔 내의 세라마이드 리포좀의 포집 효율을 측정하기 위하여 상기 참고예 2에서 제조한 셀룰로오스 하이드로겔 건조물 0.1g을 상기 참고예 1에서 표 2의 조성에 따라 제조한 세라마이드 리포좀 용액 5㎖에 넣고, 37℃에서 24시간 동안 팽윤시켜 리포좀을 하이드로겔 내에 포집하였다. 포집된 리포좀의 양을 확인하기 위하여 리포좀 내의 퀘르세틴과 루틴의 양을 정량하였으며, 퀘르세틴과 루틴의 농도 측정을 위해 포집 후 남아있는 리포좀 용액과 포집 전 리포좀 용액을 각각 HPLC로 정량하였다. 셀룰로오스 하이드로겔 내에 포집된 세라마이드 리포좀 내의 퀘르세틴과 루틴의 농도는 하기 수학식 2를 사용하여 계산하여 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
Figure 112013053862394-pat00002
또한 세라마이드리포좀-세룰로오스 하이드로겔 복합 제형의 수분 흡수도를 평가하기 위하여 상기 참고예 2에서 제조한 셀룰로오스 하이드로겔 건조물 0.1g을 상기 참고예 1에서 표 2의 조성에 따라 제조한 세라마이드 리포좀 용액 5㎖에 넣고, 37℃에서 24시간 동안 팽윤시켰다. 시료의 표면에 남아있는 용액을 제거한 후 무게를 측정하여 하기 수학식 3에 따라 수분흡수도를 계산하여 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
수분 흡수도의 대조군으로서 상기 참고예 2에서 제조한 셀룰로오스 하이드로겔 건조물 0.1g을 20% 1,3-부틸렌글리콜/인산완충용액(pH 7.4; 20% 1,3-BG/PB) 5㎖에 각각 넣고, 37 ± 0.2 ℃에서 24시간동안 팽윤시키며, 표면에 남아있는 용액을 제거한 뒤 중량을 측정하여 하기 수학식 3에 따라 수분흡수능을 계산한 결과로서 684.57 %를 얻었다.
Figure 112013053862394-pat00003
리포좀 조성(몰 비) 포집 효율(%) 수분 흡수도(%)
PC Cer Chol OA Q R
0.75 0.25 1 1 0.5 - 64.53 ± 2.15 658.58 ± 8.04
0.75 0.25 0.5 1 0.5 - 64.74 ± 4.11 656.35 ± 5.11
0.8 0.2 1 1 0.5 - 65.11 ± 3.93 664.53 ± 5.38
0.8 0.2 0.5 1 0.5 - 65.44 ± 3.08 659.05 ± 6.97
0.75 0.25 1 1 - 0.5 65.84 ± 3.82 656.37 ± 6.35
0.75 0.25 0.5 1 - 0.5 63.60 ± 5.54 645.56 ± 9.42
0.8 0.2 1 1 - 0.5 65.85 ± 4.00 659.16 ± 7.54
0.8 0.2 0.5 1 - 0.5 65.16 ± 1.97 651.27 ± 4.10
표 3의 결과에서, 하이드로겔 내에 세라마이드 리포좀 용액(L-e, L-f, L-g, L-h)을 함입시켰을 때 평균적으로 656.36 ± 5.35 %의 수분흡수도를 나타내, 리포좀 용액을 함입시키지 않은 상태의 하이드로겔 자체의 수분 흡수도인 684.57%와 유사한 결과를 나타내며, 리포좀 조성에 따라 유의적 차이가 없는 것을 확인할 수 있다. 하이드로겔의 리포좀 포집 효율은 평균적으로 65.04 ± 0.70 %의 포집 효율을 나타냈으며 리포좀 조성에 따른 유의적 차이가 없었다.
[시험예 5] 세라마이드 리포좀과 셀룰로오스 하이드로겔의 상호작용에 의한 퀘르세틴과 루틴의 피부 침투능
세라마이드리포좀-셀룰로오스 하이드로겔 복합 제형의 퀘르세틴과 루틴의 실제 피부에서 흡수 증진 효과를 나타낼 수 있는지를 확인하기 위하여 하기의 실험을 진행하였다.
경피 흡수능 실험은 9 mm Franz diffusion cell (5 mL receptor volume)과 V6A Stirrer 모델(Permegear, USA)을 이용하여 수행하였다. 실험군으로서 상기 참고예 1의 표 1의 L-e~L-h 조성에 따른 세라마이드 리포좀 용액에 퀘르세틴 또는 루틴을 각각 500μM 담지한 용액 5㎖에 상기 참고예 2에 따라 제조된 건조 셀룰로오스 하이드로겔 0.1g을 넣고 37℃에서 24시간 동안 팽윤시켰다.(HL-e~HL-h)
대조군으로서 인산완충용액(PB)에 퀘르세틴 또는 루틴을 500μM 용해시킨 시료, 퀘르세틴 또는 루틴 500μM를 20% 1,3-부틸렌글리콜/인산완충용액(pH 7.4; 20% 1,3-BG/PB)에 용해시킨 용액에 상기 참고예 2에서 제조된 건조된 셀룰로오스 하이드로겔을 넣어 24시간 포집시킨 시료, 상기 참고예 1에서 제조된 표 1의 빈 리포좀 용액 L-e~L-f에 퀘르세틴 또는 루틴을 500μM을 용해시킨 시료를 사용하였다.
8주령 암컷 ICR hairy mouse의 등을 제모한 후 피부를 적출하여 진피를 제거하지 않고 피하지방만 제거한 후 사용하였다. 상기 피부 (1.5 cm × 1.5 cm)를 각질층 부분이 위를 향하도록 하여 donor와 receptor phase 사이에 고정시켰다. Receptor phase는 물질 용해도 실험을 통해 2 % FANCOLHCO-40 (40 mole ethylene oxide adduct of hydrogenated castor oil.)(in 20 % EtOH) 용액을 사용하였다. 항온수조를 이용하여 cell 온도를 37.0 ± 0.2 ℃로 유지하였고 receptor phase 5 ㎖를 투여한 뒤 교반속도는 150 rpm으로 24시간 동안 일정하게 교반시켰다. 각 시료 0.3 ㎖를 donor의 경표피 표면(0.6362 ㎠)에 가한 후 2, 4, 8, 12, 24 시간 간격(총 5회)으로 매회 0.2 ㎖의 receptor phase를 sampling port를 통해 채취하였고, 즉시 동량의 receptor phase 용액으로 보충하였다. 이 때 채취한 시료는 HPLC를 이용하여 퀘르세틴과 루틴을 정량하였다. 피부에 남아있는 퀘르세틴과 루틴의 양을 측정하기 위해 투과되지 않은 시료를 인산완충식염수(phosphate buffer saline, pH 7.4; PBS)으로 세척하였다. 세척 후 각질층에 스카치 테이프(3M, Korea)를 이용하여 테이프 스트리핑(tape stripping)을 4회 실시하고, 테이프와 남은 피부를 세절하여 각각 EtOH에 넣고 초음파 분쇄기(sonicator, HWASHIN technology Co., Korea)를 이용하여 퀘르세틴과 루틴을 추출하였다. 추출한 퀘르세틴과 루틴은 HPLC를 이용하여 정량하였다. 경피 흡수능을 각질층에 존재하는 물질(퀘르세틴 또는 루틴)의 양(Tape), 각질층 아래 표피 및 진피층에 존재하는 물질의 양(Skin), 피부를 투과한 양(Transdermal)으로 나누어서 정량하여 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3의 결과에서, 인산완충용액을 사용한 대조군(PB)은 적하량 대비 24 시간 후 총 피부 침투율이 퀘르세틴 2.48 %, 루틴 1.89 %로 매우 낮은 피부 흡수능을 보였다. 셀룰로오스 하이드로겔 단독을 사용한 경우(H) 퀘르세틴 31.77 %, 루틴 26.35 %로 인산완충용액 대조군(PB)에 비해 크게 향상된 피부 흡수능을 나타냈지만, 각질층을 포함한 피부에 유효 성분을 저장하는 능력은 리포좀, 하이드로겔-리포좀 시스템에 비해 떨어지는 것을 관찰하였다. 리포좀 단독 시스템에서는 퀘르세틴 L-h 조건을 제외하고 조건별 유의적인 차이가 없었다. 반면, 리포좀-하이드로겔 복합시스템(HL-e~HL-h)은 대조군 및 다른 전달 시스템에 비해 24 시간 피부 침투율이 가장 높게 나타났고 퀘르세틴은 HL-h (67.42 %), 루틴은 HL-f (59.82 %) 조건에서 가장 우수한 피부 침투율을 보였다. 또한, 퀘르세틴이 더 유리한 결과를 보였는데 이는 루틴이 퀘르세틴에 비해 분자량이 크고 상대적으로 지질 친화도가 낮아 피부 지질 사이를 침투하기 좀 더 어려운 배당체 형태이기 때문인 것으로 판단된다.
[시험예 6] 세라마이드 리포좀과 셀룰로오스 하이드로겔의 상호작용에 의한 퀘르세틴과 루틴의 방출 거동
상기 시험예 5에서의 각 시스템에 대하여 Korsmeyer-Peppas 모델을 이용한 하기 수학식 4로 해당 시스템이 활성 물질을 방출할 때의 확산되는 메커니즘을 역학적으로 분석하였다. kr 값을 이용하여 각 시스템으로부터의 퀘르세틴 또는 루틴의 확산 속도를 확인하였고, nr 값을 이용하여 퀘르세틴과 루틴의 피부 내 수송 메커니즘을 검토하였다. 결과는 하기 표 4에 나타내었다. H는 하이드로겔 단독 시스템, HL은 하이드로겔-리포좀 복합시스템을 나타내며, Q는 퀘르세틴, R는 루틴을 담지한 것을 의미한다.
Figure 112013053862394-pat00004
샘플 Korsmeyer-Peppas model 약물 방출 메커니즘
kr nr R2
H-Q 0.53 0.60 0.95 Anomalous transport
HL-e-Q 0.79 0.46 0.97 Quasi-Fickian diffusion
HL-f-Q 0.62 0.55 0.99 Anomalous transport
HL-g-Q 0.66 0.50 0.98 Anomalous transport
HL-h-Q 0.84 0.41 0.99 Quasi-Fickian diffusion
H-R 0.13 0.88 0.98 Anomalous transport
HL-e-R 0.40 0.79 0.99 Anomalous transport
HL-f-R 0.44 0.73 0.97 Anomalous transport
HL-g-R 0.35 0.82 0.98 Anomalous transport
HL-h-R 0.38 0.79 0.94 Anomalous transport
nr<0.5,Quasi-Fickiandiffusion;nr=0.5,Fickiandiffusion;0.5<nr<1,Anomaloustransport;nr=1,Non-FickianCase-IItransport(zero-orderrelease);nr>1,Non-Fickianspecialcase-IItransport
확산 지수 nr에 따르면 0.5 < nr < 1 범위에서는 물질의 확산과 겔의 침식이 동시에 작용하여 물질을 방출하고, 0.5에 가까울수록 물질의 확산으로 인한 방출이, 1에 가까울수록 겔의 침식으로 인한 방출이 좀 더 지배적으로 작용한다. 표 4의 결과에서, 하이드로겔 단독 시스템(H)에 비해 리포좀-하이드로겔 복합 시스템(HL-e, f, g, h)의 경우 확산 속도가 증가하고 퀘르세틴과 루틴의 방출이 물질의 확산에 의한 영향을 더 받는다는 것을 알 수 있다. 또한 24 시간 후 총 피부 침투능이 가장 우수했던 조건에서 가장 빠른 확산 속도를 보인다는 것을 확인하였다.

Claims (6)

  1. 리포좀 용액이 셀룰로오스 다공성 하이드로겔에 함입된 리포좀-하이드로겔 복합체 조성물로서,
    상기 리포좀 용액이 상기 리포좀 용액 총 중량에 대하여 포스타티딜콜린 0.40~0.42중량%, 세라마이드 0.08~0.10중량%, 콜레스테롤 0.13~0.27중량% 및 올레산 0.19~0.20중량%과
    퀘르세틴 및 루틴으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 플라보노이드를 함유하며,
    상기 셀룰로오스 다공성 하이드로겔이 셀룰로오스 및 염기성 수용액을 포함하는 셀룰로오스 용액; 및 가교제;를 포함하는 혼합용액에서 가교된 것이고, 상기 셀룰로오스의 농도는 상기 혼합용액에 있어서 1~3질량/부피%이며, 상기 가교제의 농도는 상기 혼합용액에 있어서 4~12질량/부피%인 것이고,
    상기 가교제는 에피클로로히드린, 암모늄퍼설페이트 및 디비닐벤젠으로 이루어진 군에서 선택되는 것이며,
    상기 염기성 수용액은 pH 7 초과이고 14 이하인 것이고,
    상기 유기용매는 클로로포름, 메탄올 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 리포좀-하이드로겔 복합체 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 리포좀 용액에 있어서의 상기 포스파티딜콜린:세라마이드의 몰비는 3:1~4:1인 것을 특징으로 하는 리포좀-하이드로겔 복합체 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 셀룰로오스는 미정질 셀룰로오스(microcrystalline cellulose), 메틸셀룰로오스 및 에틸셀룰로오스로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 리포좀-하이드로겔 복합체 조성물.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 셀룰로오스 다공성 하이드로겔의 상기 셀룰로오스 농도와 상기 가교제 농도의 비율은 질량/부피%로 1:6~1:12인 것을 특징으로 하는 리포좀-하이드로겔 복합체 조성물.
  6. a) 포스타티딜콜린, 세라마이드, 콜레스테롤 및 올레산과 퀘르세틴 및 루틴으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 플라보노이드를 유기용매에 용해시키는 단계;
    b) 상기 a)의 용해액으로부터 상기 유기용매를 증발시켜 필름을 형성시키는 단계;
    c) 상기 b)에서 형성된 필름에 완충용액을 첨가하여 수화시켜 리포좀 용액을 제조하는 단계;
    d) 셀룰로오스 및 염기성 수용액을 포함하는 셀룰로오스 용액을 제조하는 단계;
    e) 상기 셀룰로오스 용액에 가교제를 첨가하여 가교반응을 진행하고, 건조시켜 셀룰로오스 다공성 하이드로겔을 제조하는 단계; 및
    f) 상기 e)에서 제조된 셀룰로오스 다공성 하이드로겔을 상기 c)에서 제조된 리포좀 용액에 넣는 단계를 포함하며,
    상기 가교제는 에피클로로히드린, 암모늄퍼설페이트 및 디비닐벤젠으로 이루어진 군에서 선택되는 것이며,
    상기 염기성 수용액은 pH 7 초과이고 14 이하인 것이고,
    상기 유기용매는 클로로포름, 메탄올 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 리포좀-하이드로겔 복합체 조성물의 제조방법.
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