KR101511047B1

KR101511047B1 - 점막부착성 나노형상 마이크로 입자

Info

Publication number: KR101511047B1
Application number: KR20130053851A
Authority: KR
Inventors: 최영빈; 박천권
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2012-05-15
Filing date: 2013-05-13
Publication date: 2015-04-10
Also published as: KR20130127934A; US20150133454A1

Abstract

본원은 생분해성 중합체를 포함하며 그 표면에 나노구조가 형성된 점막부착성 나노형상 마이크로 입자에 관한 것이다. 본원에 따른 나노구조가 형성된 마이크로입자는 점막에서의 거주 시간이 길며 표면자극이 최소화된 약물전달체로 치료 약물의 생체이용률 증가를 가져와 약물치료 효과가 증대되고, 약물 투여량의 감소로 비용저하는 물론 및 환자의 편의성이 증대된다.

Description

점막부착성 나노형상 마이크로 입자 {Mucoadhesive Nano-structured microparticles}

본원은 약물 전달을 위한 시스템의 점막부착 기술에 관한 것이다.

약물 제제의 국소 및 전신 투여시 많은 경우 약물이 점막을 통해 흡수되지만, 약물제제가 점막에서 충분한 거주시간 확보를 하지 못하여 약물과 약물이 흡수되는 막 사이의 짧은 접촉시간 및 체액에 의한 제거(washout) 등과 같은 문제점으로 인해 낮은 약물 생체이용도 등의 상당한 제한이 있다.

이러한 문제점으로 인해 다량의 약물을 전달하거나 반복투여가 필요하여, 환자에게 불편함을 주고 있다.

예를 들면 안질환 치료약을 함유하는 점안제는, 주입이 쉽고, 비교적 즉효성이 뛰어나지만, 약물이 쉽게 눈물에 씻겨 약효의 지속성이 떨어지며, 안구표면 표피 장벽을 통한 약물 투과의 어려움 등으로 인하여 약물 생체 이용도가 매우 낮다는 단점이 있다. 특히 액상 제형의 점안 제는 눈물로 인한 제거 기전을 더욱 촉진하여 투여된 점안제의 75% 가량을 거의 바로 잃게 되어 약물의 생체 이용도가 투여량의 5%에도 못 미치는 것으로 알려져 있다(D. Ghate and H.F. Edelhauser, Ocular drug delivery. Expert Opin Drug Deliv 3, 275-287, 2006). 이러한 이유로 점안제는 그 치료 적합성을 위하여 투여량을 늘리거나 하루에 2-3번 이상 일정한 시간 간격을 두고 지속적으로 투여 되어야 하는 경우가 많아 환자에 많은 불편을 초래한다.

미국 특허 제 5942243 호는 동물조직으로의 생물학적 활성 물질의 전달을 위한 점막부착성 조성물에 관한 것으로, 폴리스티렌 마크로 단량체 및 친수성 산성 단량체로 구성된 가소성 그래프트 공중합체를 포함하는 약물 전달 시스템을 개시한다.

유럽 특허 출원 공개공보 제 1652535 호는 반고형의 점막부착 제형에 관한 것으로, 생점착성 물질을 이용한 질 점막 전달 시스템을 개시한다.

하지만, 점막에 보다 오랜 기간 거주하면서 약물을 방출할 수 있는 다양한 시스템의 개발이 필요하며, 이런 경우 적은양의 약으로 높은 생체이용도를 확보할 수 있어 약제비 절감은 물론 약물투여 빈도를 줄여 환자의 수용도도 크게 올릴 수 있을 것이다.

본원은 상기 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로 점막에서의 거주기간이 증가되고 표면자극이 최소화된 약물 전달체를 제공하고자 한다.

한 양태에서 본원은 표면에 나노구조가 형성된, 생분해성 점착제를 포함하는, 점막부착성 나노형상 마이크로 입자를 제공한다. 본원에 따른 마이크로입자는 상기 마이크로 입자는 필요에 따라 확산 조절제를 추가로 포함할 수 있다.

본원에 따른 마이크로입자는 점막에서 부착성을 증가를 하나의 특징으로 하는 것으로, 점막을 포함하는 다양한 조직 예를 들면 안구, 구강, 비강, 항문 또는 질내 점막에 사용될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.

본원에 따른 입자는 사용되는 점막을 포함하는 사용되는 조직의 특성에 맞추어 다양한 제형으로 제조될 수 있으며, 일 구현예에서는 상기 마이크로 입자는 정제 형태로 제조될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.

본원에는 공지된 다양한 상기 생분해성 점착물질이 사용될 수 있으며, 예를 들면 수용성인 셀룰로스 유도체 또는 폴리메타아크릴산 기재의 중합체가 사용될 수 있으며, 예를 들면 상기 생분해성 점착제는 폴리메타아크릴산 기재의 PEG를 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다.

본원에 따른 마이크로입자에 포함될 수 있는 본원에 따른 생분해성 점착제와 접합한 다양한 확산조절제가 사용될 수 있으며, 확산조절제는, 예를 들면 폴리락타이드, 폴리글라이콜라이드, 폴리(락틱-코-글리콜산), 폴리오르토에스테르, 폴리안하이드라이드, 폴리아미노산, 폴리하이드록시부티르산, 폴리카프로락톤, 폴리알킬카보네이트, 에틸 셀룰로즈, 키토산, 전분, 구아검, 젤라틴 또는 콜라겐 또는 이들의 조합을 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다. 본원에 따른 일 구현예에서는 점착제로서 PEG이 사용되고, 상기 확산조절제는 PLGA가 사용될 수 있다.

본원에 따른 마이크로입자에 형성된 나노구조 또는 나노형상은 공지된 다양한 방법으로 제조될 수 있으며, 예를 들면 생분해성 점착제를 전기방사 및 동결밀링 (freeze-milling) 하여 제조될 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.

본원에 따른 나노형상 마이크로 입자는 점막부착능으로 인해 저분자화합물, 단백질약물, 방사선핵종(radionuclide), 핵산기재 약물 또는 그 조합을 서방전달 할 수 있다. 예를 들면 일 구현예에서는 안구 점막에 사용되며, 상기 나노형상 마이크로 입자는 안질환 치료 약물로 항바이러스제, 항균제, 항진균제, 항알러지제, 비스테로이드 소염제, 소염제, 소염 진통제, 소염 효소제, 항생물질, 술파제, 합성 페니실린, 녹내장 치료제, 백내장 치료제, 축동제, 산동제, 국소수렴제, 혈관수축제, 안압상승 방지제, 고안압증 치료제, 표면 마취제, α1-차단제, β-차단제, β1-차단제, 탄산 탈수소 효소 저해제, 국소용 선택 H1-블로커, 부신 피질 호르몬, 비타민 B12, 보효소형 비타민 B2, 항콜린에스테라아제 또는 유기 요오드 제제를 포함할 수 있다.

다른 양태에서 본원은 본원에 따른 나노형상 마이크로 입자를 포함하는 약물 전달용 점막부착 시스템을 제공하며, 점막부착을 통한 약물 전달에 사용되는 기타 당업계의 공지된 성분, 물질, 기타 장치 등을 포함될 수 있다.

본원에 따른 점막부착성 나노형상 마이크로입자는 환자의 수용성과 편의성 측면에서 널리 이용되는 기존의 약물 전달방법의 장점은 그대로 수용하되 단점인 빠른 제거(washout)등으로 인한 낮은 약물 생체이용도를 극복할 수 있도록 점막에서의 표면 거주 시간을 증가시킨 점막 부착형 약물전달 시스템이다. 따라서 약물의 효과적 전달이 가능하며, 표면자극이 최소화된 약물전달체로 치료 약물의 생체이용률 증가를 가져와 약물치료 효과가 증대되고, 약물 투여량의 감소로 비용저하는 물론 환자의 편의성이 증대된다.

도 1a는 본원의 일 실시예에 따른 나노형상 마이크로입자 (NM) (a) 및 그 정제 (b)의 제조방법을 도식적으로 나타낸 것이다. NM의 경우, poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) 용액, 또는 PLGA 및 polyethylene glycol (PEG)의 혼합 용액을 전기 방사하여 나노파이버 시트를 제조하고 철강 임팩터를 이용하여 -196℃에서 14 cycles/s로 왕복 셔틀링을 하여 동결밀링(6770 Freezer Mill, Spex, USA)하였으며, NM으로 탑재된 정제 (dry tablet)의 경우, NM이 현탁된 polyvinyl alcohol (PVA) 수용액 (pH 7.4 PBS 중 2% w/v)을 몰드에 추가 한 후, 수분이 모두 날아가도록 충분히 6시간가량 동결건조 하였다. 이런 방식으로 다공성 PVA 메트릭스를 이용하여 NM으로 탑재된 정제가 형성될 수 있다.
도 1b는 본원의 일실시예에 따라 제조된 생분해성 중합체를 포함하는 마이크로입자의 전자 현미경사진으로 (a) PLGA 로 이루어진 마이크로스피어(MS), (b) PLGA/PEG로 이루어진 마이크로스피어, (c) PLGA로 이루어진 나노구조가 형성된 마이크로입자 (NM), 및 (d) PLGA/PEG로 이루어진 나노구조가 형성된 마이크로입자이다. 기존의 에멀젼 방법으로 제조된 (a) 및 (b)의 마이크로스피어는 표면이 매끈하여 표면적이 넓지 않지만, 본원의 방법에 따라 제조된 (c) 및 (d)와 같은 나노형상 마이크로입자는 거친 표면적을 가지고 있으며 이로 인한 표면적 증대효과를 가져온다. 각 사진의 스케일바는 20 마이크로미터이다.
도 1c는 본원의 나노구조 형성 마이크로입자의 제조에 채용된 나노파이버 시트의 전자현미경 사진으로 (a)는 PLGA이며, (b)는 PLGA와 PEG의 혼합이다. 상기 시트는 플래티늄으로 10분간 스퍼터 코팅된 후 주사전자현미경(SEM; 7401F, Jeol, Japan) 으로 촬영되었다. 스케일바는 20 마이크로미터이다.
도 2a는 PEG가 함유된 PLGA/PEG MS와 PLGA/PEG NM의 크기 분포도를 나타내는 그래프로 크기분포도의 차이가 크게 나지 않고 비슷한 분포도를 나타낸다.
도 2b는 도 2에서 제조된 NM 및 MS의 크기 및 탑재된 Nile Red의 양을 기재한 것으로, 네 가지 형태의 마이크로입자 모두 평균크기는 2 μm이며, Nile Red의 양은 8 μg/ml 정도로 균일함을 나타낸다.
도 3은 마이크로 입자내의 PLGA 및 PEG 존재 유무를 확인하기 위한 것으로, (a)는 각각 가공전(intact) PLGA, PEG와 4가지 마이크로 입자의 GPC (Gel permeation chromatography) 데이터를 나타내는 그래프이고, (b)는 (a)를 수치로 나타낸 것이다. 그래프와 수치에 나타난 바와 같이, PLGA MS와 PLGA NM은 가공전 PLGA에서와 같은 Retention volume에서 피크가 검출되며, 이로부터 PLGA MS와 PLGA NM은 가공전 PLGA의 성분으로만 구성되어있는 것을 확인할 수 있다. 반면에 PLGA/PEG MS와 PLGA/PEG NM의 경우 피크가 가공 전 PLGA와 가공 전 PEG의 2곳에서 발생하게 되며, 이것은 PLGA/PEG MS와 PLGA/PEG NM 모두 PLGA와 PEG가 들어있다는 것을 나타내는 것이다.
도 4는 마이크로입자내 PEG의 양을 정량적으로 확인한 것으로, (a)는 가공전 PLGA, 가공전 PEG의 TGA (Thermogravimetric analysis) 데이터를 나타내고 (b) 는 4가지 마이크로 입자의 TGA 데이터를 나타내고 있다. 도 4의 결과에 의하면 PLGA MS와 PLGA NM은 위의 GPC 결과와 같이 100% PLGA만을 가지고 있지만, PLGA/PEG MS와 PLGA/PEG NM은 모두 약 90%의 PLGA와 약 10%정도의 PEG를 함유하는 것을 나타낸다.
도 5는 본원의 일실시예에 따른, 나일레드로 탑재된 PLGA/PEG NM 정제 (dry tablet)의 형광현미경 및 SEM 사진이다: (a) 상측 (b) 측면의 형광현미경 사진; (c) PLGA/PEG MS 및 (d) PLGA/PEG NM을 포함하는 정제의 표면 SEM 영상; 정제가 pH 7.4 PBS에 완전히 용해되어 현탁된 (f) PLGA/PEG MS 및 (g) PLGA/PEG NM의 형광현미경 사진이다. 스케일바는 20마이크로미터이다.
도 6은 본원의 일실시예에 따른 나노구조가 형성된 4가지의 마이크로 입자가 2가지 다른 제형을 통해서 전달되었을 경우 토끼 눈에서의 거주시간을 나타낸 그래프이다.
도 7 a 및 7 b 는 본원에 따른 제형을 투여한 후 일정 간격을 두고 촬영한, 토끼의 전안 표면에 잔존하는 나일레드로 탑재된 마이크로입자의 형광 사진이다. 7a 는 현탁액을 투여한 경우이고, 7b는 정제를 투여한 경우로, 검은색 및 흰색 화살표는 각각 안구의 위치 및 토끼 눈의 노출된 하부 결막낭을 나타낸다. 스케일바는 5mm이다.
도 8은 본원에 따른 PLGA/PEG NM 정제를 이용한 세포독성 결과로, 본원에 따른 정제가 세포에 독성이 없음을 나타낸다. (세포독성 % = ~ 0.8%)
도 9는 PLGA/PEG NM 정제를 토끼 눈에 처리하여 안전성을 테스트한 결과이다. 영상은 투여 전 (a), 투여 후 1시간 (b), 2시간 (c) 및 24시간 (d)에 수득하였다. 스케일바는 5mm이다. 추적기간 동안 매우 경미한 결막 injection을 제외하고는 유의미한 부작용은 없었다. 결막염은 대측성 정상 (sham) 눈에서 관찰되었으며, 이는 마취동한 눈을 뜬 상태로 두어 이로 인한 건조 때문인 것으로 추측된다. 안압 (IOP)의 변이는 PLGA/PEG NM 정제 투여 후에도 큰 변화는 없었다. IOP 측정 결과는 16.8 ± 1.4 mmHg이었고, 이는 토끼 눈의 경우 정상 값이다.
도 10a 및 10b는 Brimonidine (a)과 Dorzolamide (b)이 각각 탑재된 PVA 정제 (마이크로입자 없음), 및 PLGA MS, PLGA/PEG MS, PLGA NM 및 PLGA/PEG NM의 약물 방출 결과를 나타낸다.
도 11a 및 도 11b는 Brimonidine (a)과 Dorzolamide (b)이 각각 탑재된 각 도면에 표시된 각 제형의 처리 결과, 시간 경과에 따른 토끼의 안압 하강 효과를 나타내는 결과이다. 11a에서 *는 6, 7, 8, 9, 10, 11 및 12 시간째에, PLGA/PEG NM 정제로 처리한 경우, 대조군 및 다른 제형과 비교하여 안압이 통계적으로 유의하게 감소한 것을 나타낸다. (p < 0.05). 도 11b에서 *는 3, 4, 5, 6, 7, 8 및 9시간째에, PLGA/PEG NM 정제로 처리한 경우, 대조군 및 다른 제형과 비교하여 안압이 통계적으로 유의하게 감소한 것을 나타낸다(p < 0.05).
도 12는 Alphagan P 및 PLGA/PEG NM 정제 투여 후, 시간 경과에 따른 토끼의 방수에서의 brimonidine의 농도를 나타낸다. *는 PLGA/PEG NM 정제가 1, 1.5, 2, 3, 5 및 7 h에서 Alphagan P와 비교하여 통계적으로 유의한 농도 차이가 있음을 나타낸다.
도 13은 본원의 일실시예에 따른 나노구조가 형성된 마이크로 입자를 이용한 토끼의 소장에서의 약물 전달 가능성을 나타내는 형광이미지이다. 스케일바는 1cm이다.

본원은 점막부착성 마이크로입자에 관한 것으로, 상기 마이크로 입자는 생분해성 점착제 및 선택적으로 확산조절 재료를 포함하며, 그 표면에 나노구조가 형성되어 있는, 나노형상 마이크로 입자에 관한 것이다.

본원에 사용되는 생분해성 점착제는 점막에 있는 뮤신에 부착되어, 점막에서의 거주시간을 증가시킨다. 이에 더하여 표면에 형성된 나노구조로 인해 비표면적이 증가되어 이러한 친점막성 기능이 시너지적으로 증가하고 또한, 점막 표면과의 마찰력을 증가시켜 마이크로입자의 점막에서의 거주시간이 증가된다. 즉, 본원의 마이크로입자는 점막에서의 거주시간이 증가된 약물 전달체로, 친점액성 기능이 있는 물질을 포함할 수 있으며, 그 표면에 나노구조가 형성되어 있다. 예를 들어 키토산 같은 경우, 약물확산을 제어하는 벽재료 (diffusion-wall material)로 사용되나, 점액부착(mucoadhesive)능이 있다.

본원에서 용어 “나노구조”또는 “나노형상”이란 1000 nm 미만, 예를 들면 약 100nm, 약 50nm, 약 10nm, 약 5nm의 규격 (dimension)을 갖는 구조를 의미하며, 다양한 방법에 의해 형성될 수 있다. 본원에 따른 일 구현 예에서는 나노파이버에 의해 형성된 나노구조를 가진다.

본원의 마이크로입자 표면에는 나노구조가 형성되어 있어, 표면적이 증가한다. 표면적의 증가로 인해 비표면적이 증가하면 안구 표면과의 마찰력이 증가되어 마이크로입자 자체가 눈에서 쉽게 쓸려가는 것을 방지할 수 있다. 또한, 친점액성 재료를 사용 시 비표면적 증가는 입자와 점막 간의 부착력을 시너지적으로 상승시킨다.

이러한 나노구조가 형성된 마이크로입자는 기술 분야에 공지된 방법을 이용하여 구현될 수 있으며, 본원의 한 구현 예에서는 동결 밀링 방법이 사용된다. (Dhital et al., Effect of cryo-milling on starches: functionality and digestibility, Food Hydrocolloids, 24, 152-163, 2010). 또한 도 1a의 기재를 참조할 수 있다.

본원에서 사용된 용어 “점막(mucous membrane)”은 흡착과 분비에 관여하는 표피세포로 내장기관 또는 외부에 노출되는 부위를 둘러쌓고 있는 막을 의미하며, 예를 들면 안구, 구강, 비강, 항문, 및 질내 점막을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다.

본원에서 사용된 용어 “전달”은 원래 위치에서 표적 위치로의 성분 또는 물질의 이동을 의미하는 것으로, 점막에 부착된 마이크로입자로부터 체액으로의 활성 성분의 전달을 포함하는 것이다.

본원에 따른 점막부착성이 증가된 마이크로입자는 다양한 제형으로 제조될 수 있다. 본원에 따른 일 구현 예에서는 정제(dry tablet)로 제조된다. 정제로 전달된 마이크로 입자는 현탁액으로 전달될 때보다 초반 약물 손실을 줄일 수 있고, 서서히 방출되어 많은 마이크로입자가 눈에서 본원에 따른 마이크로 입자를 사용하지 않은 경우와 비교하여, 보다 오래기간 남아있게 되어 그 효과가 더욱 증대된다.

본원에서 사용되는 생분해성 점착제 또는 친점액성 물질은 표면과의 부착성을 증가시키는 물질로, 공지된 것이 사용될 수 있으며 특히 세포 또는 조직을 포함하는 생체에서 분해될 수 있는 생분해성의 수용성 중합체가 사용된다. 이러한 물질의 예로는 셀룰로스 유도체 예컨대 카르복시메틸셀룰로스, 또는 폴리메타아크릴산 기재의 중합체 예를 들면 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리아크릴산, 폴리-2-하이드록시에틸메타크릴산 등을 들 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다. 보다 구체적인 예는 예를 들면 Kharenko et al., Pharmaceutical Chemistry Journal Vol.43, No.4,pp 200-208 (2009)를 참조할 수 있다. 본원 한 구현예에서는 PEG가 사용된다.

본원에서 사용되는 마이크로입자는 필요한 경우 확산조절제를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면 점착제 자체에 확산조절 기능이 있는 경우에는 포함 추가로 확산조절제를 포함하지 않을 수 있다.

확산조절제는 치료약물 즉 활성 성분의 서방형 전달에 사용되는 것으로 확산조절제를 사용하지 않을 경우, 예를 들면 안구 점막에서 약물이 안구의 수분에 의해 바로 방출될 수도 있지만, 확산조절제가 마이크로입자 형태로 눈에 남아서, 약물의 안구내에서의 거주시간을 증가시키고, 이에 따라서 약물의 효용성을 올려주는 역할을 할 수 있다. 이러한 확산조절제는 사용되는 부위에 자극을 주지 않는 안전성이 확보되어야 하며, 특히 안구에 사용되는 경우 눈 내부로 들어가는 것을 방지하기 위해 10 마이크로미터 단위의 크기를 가지고 있어야 한다. 이러한 물질의 예로는 폴리(락틱-코-글리콜산), 폴리락타이드, 폴리글라이콜라이드, 폴리오르토에스테르, 폴리안하이드라이드, 폴리아미노산, 폴리하이드록시부티르산, 폴리카프로락톤, 폴리알킬카보네이트, 에틸 셀룰로즈, 키토산, 전분, 구아검, 젤라틴 또는 콜라겐을 들 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다. 본원의 한 구현예에서는 PLGA가 사용된다.

본원에 따른 나노구조가 형성된 마이크로입자는 점막에 부착되어 생물학적 활성 물질 또는 치료 약물을 서방전달 시킴으로써, 약물 전달에 효과적으로 사용될 수 있다.

본원에서 용어 생물학적 활성 물질은 생물학적 활성을 갖는 물질로 예를 들면 당, 아미노산, 올리고 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드, 핵산, 다른 측면에서 햅텐, 에피토프, 세포, 비타민, 호르몬 등을 포함하는 것이며, 본원에서 용어 약물은 생체로 흡수되어 생체의 기능을 변경하는 것으로 질환의 치료, 예방, 및/또는 진단을 위해 사용되는 화합물을 일컫는 것이다.

다른 측면에서 본원에 따른 마이크로입자는 다양한 점막 조직에의 부착되어 저분자화합물, 단백질약물, 방사선핵종(radionuclide), 핵산기재 약물 또는 그 조합을 서방 전달에 사용될 수 있다.

이러한 본원에 따른 마이크로입자에 탑재된 약물은, 예를 들면 점안액 형태로 전안부 전달에 적합하며, 예를 들면 본원에 따른 나노구조가 형성된 마이크로입자는 공지된 다양한 안질환치료 약물의 전달에 사용될 수 있다.

이러한 안질환 치료약으로는 항바이러스제 (단순 헤르페스에 기인하는 각막염), 항균제 (감염증 : 결막염, 안검염, 각막 종양, 눈물주머니염), 항진균제, 항알러지제 (알러지성 결막염, 화분증, 춘계 카타르), 소염제 (결막염, 표층각막염, 안검연염, 공막염), 비스테로이드 소염제 (알러지성 결막염), 소염진통제, 소염 효소제 (만성 결막염), 항생물질 (감염증 : 트라코마, 결막염, 안검염, 안검연염, 각막염, 맥립종, 각막궤양, 검판선염, 눈물주머니염), 술파제 (트라코마, 결막염, 안검염, 안검연염, 각막궤양, 각막염), 합성 페니실린 (감염증), 녹내장 치료제, 백내장 치료제, 축동제, 산동제, 국소 수렴제, 혈관수축제, 안압상승 방지제, 고안압증 치료제, 표면 마취제, α1-차단제 (녹내증, 고안압증), β-차단제 (녹내장, 고안압증), β1-차단제 (녹내증, 고안압증), 탄산 탈수소 효소 저해제, 국소용 선택 H1-블로커 (알러지성 결막염), 부신 피질 호르몬 (외안부, 전안부의 염증성 질환의 대증요법), 비타민 B12 (안정(眼精) 피로), 보효소형 비타민 B2 (각막염, 안검염), 항콜린에스테라아제 (녹내장, 조절성 내사시, 중증 근무력증), 유기 요오드 제제 (중심성 망막염 등)를 들 수 있다.

또한, 대상 질환으로는, 안감염증 알러지성 결막염, 화분증, 춘계 카타르가 바람직하다.

구체적인 약물 명으로는, 예를 들어, 아시크로빌, 아시타자노라스트 수화물, 아즐렌, 안트라닐산·아스코르브산, 암렉사녹스, 이소프로필우노프로스톤, 이독수리딘, 이부디라스트, 인도메타신, 에피네프린, 에리스로마이신, 브리모니딘, 도르졸라라미드, 염화리조팀, 염산아프라클로니딘, 염산옥시부프로카인, 염산카르테올롤, 염산 시클로펜톨레이트, 염산디 피베프린, 염산세프메녹심, 염산도르졸라미드, 염산필로칼핀, 염산페닐렌푸린, 염산부나조신, 염산베탁소롤, 염산베프놀롤, 염산레보카바스틴, 염산레보부놀롤, 염산로메플록사신, 오플록사신, 카르바콜, 글리틸리틴산 2 칼륨, 글루타티온, 크로모그릭산나트륨, 크로람페니콜, 아세트산히드로코르티존, 아세트산프레드니졸론, 시아노코바라민, 디클로페나크나트륨, 브롬화디스티그민, 브롬화수소산호마트로핀, 질산은, 질산나파졸린, 디요오드스테아르산칼슘, 설프이속사졸, 술베니신나트륨, 덱사메타존, 토부라마이신, 트라니라스트, 트로피카미드, 니프라딜롤, 노르프록사신, 피마리신, 피레녹신, 푸마르산케토티펜, 프라노프로펜, 플라빈아데닌디 뉴클레오티드, 플루오로메톨론, 프레드니졸론, 브롬페낙나트륨 수화물, 페미로라스트칼륨, 헬레니엔, 말레산티모롤, 미오핀, 메타술포벤조산덱사메타존나트륨, 요오드화에코티오페이트, 라타노프로스트, 리드카인, 황산아트로핀, 황산겐타마이신, 황산시소마이신, 황산디베카신, 황산미크로노마이신, 인산덱 사메타존나트륨, 인산베타메타존나트륨, 레보프록사신 등을 들 수 있다.

다른 측면에서 본원은 또한 본원에 따른 나노형상 마이크로 입자를 포함하는 약물 전달용 점막부착 시스템에 관한 것이다. 본원에 따른 점막부착시스템은 점막부착성의 증가로 인해, 점막에서의 거주시간이 증가하여, 다양한 점막 조직을 표적으로 하여, 이에 탑재된 생물학적 활성 물질의 조절된 방출이 가능하다.

이하 본원을 하기 실시예에 의해 구체적으로 설명하나, 본원은 어떤 이유로든 하기 실시예로 제한되는 것은 아니다.

실시예

사용한 물질

Poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA; 50:50; i.v = 0.43 dl/g) 및 polyethylene glycol (PEG; average MW = 6kDa)은 Lakeshore Biomaterials (AL, USA) 및 Acros Organics (NJ, USA)사에서 구입하였다. Polyvinyl alcohol (PVA; average MW = 31 - 50 kDa, 87%-89% hydrolyzed) 및 Nile Red는 Sigma (MO, USA)사에서 구입하였다. Dichloromethane (DCM) 및 아세톤은 JT Baker (NJ, USA)사에서 구입하였다. Dimethylformamide (DMF), Trahydrofurane (THF) 및 phosphate-buffered saline (PBS; pH 7.4)는 각각 Mallinckrodt (MO, USA), Daejung (Korea) 및 Seoul National University Hospital Biomedical Research Institute (Seoul, Korea)에서 구입하였다. Proparacaine hydrochloride (Alcaine; 0.5% ophthalmic solution)는 Alcon-Couvreur (Puurs, Belgium)에서 구입하였다. Ketamine hydrochloride (Ketamine), xylazine (Rompun) 및 acepromazine maleate (Sedaject)는 각각 Yuhan (Seoul, Korea), Bayer (Leverkusen, Germany) 및 Samu Median (Yesan, Korea)사에서 구입하였다.

실시예 1 마이크로스피어(MS) 및 나노구조가 형성된 마이크로 입자(NM)의 제조

마이크로 입자의 모양 및 점액부착 촉진제의 전안부 거주시간에 대한 영향을 평가하기 위하여 4 종류의 상이한 마이크로입자 PLGA MS: PLGA/PEG MS: PLGA NM 및 PLGA/PEG NM를 다음에 기술하는 바와 같이 제조하였다.

상기 마이크로입자에는 정량적 분석을 위해 형광 염색제인 나일레드(Nile Red)를 첨가하였다. 나일레드를 이용한 정량에 있어, 4-5mg의 마이크로입자를 50ml의 아세톤에서 강한 교반 하에 1시간 동안 용해 한 후 형광분광기(FS2, Scinco, Korea)를 이용하여 정량 측정하였다. (Dutta, A. K. et al., J Photochem Photobiol A Chem 1996, 93, 57-64. 참조).

1-1 MS (Spherical microparticle)의 제조

MS는 종전에 공지된 방법대로 제조하였다 (Tadros, T. et al., Adv Colloid Interface Sci 2004, 108-109, 303-18). 요약하면 500 mg PLGA 또는 500 mg PLGA 및 100 mg PEG의 혼합물을 5 ml DCM에 용해하였고, 여기에 5 mg Nile Red를 추가하여 마커로서 사용하였다. 상기 용액을 PVA (20 ml; 1% w/v) 수용액에 분산시킨 후 100 W에서 5초간 초음파처리 하였다 (Model 5 Digital Sonic Dismembrator, Fisher Scientific, PA, USA). 이어 상기 에멀젼을 1% w/v PVA 수용액 80ml에 추가한 후 진공 (~12.5 psi)에서 30분간 100rpm으로 교반하여 용매를 증발시켰다. 이어 현탁액을 여과 (nylon net filter, 11-μm pore, Millipore, USA)하여 10 μm 보다 작은 MS를 수득하였으며, 이는 DI 수로 완전히 세척한 후 동결건조하였다.

1-2 NM의 제조

90 mg PLGA 또는 90 mg PLGA 및 18 mg PEG의 혼합물을 0.3 ml의 용매 혼합물 DCM, DMF 및 THF (3:1:1 = v/v/v)에 용해하였으며, 이는 마커로서 사용하기 위해 0.9 mg Nile Red를 포함하였다. 상기 용액을 하기의 조건에서 30분 동안 전기방사(Nano NC, Korea)하여 나노파이버 시트를 수득하였다: 사용 전압, 20 kV; 콜렉터 거리, 10 cm; 유속; 0.6 ml/h. 이어 시트를 -196℃에서 60분 동안 동결밀링 (6770 Freezer Mill, Spex, USA) 하였다. 이어 형성된 입자를 PVA 수용액 (100 ml; 1% w/v)에 현탁한 후 진공 (~12.5 psi)에서 30분간 100rpm으로 교반하였으며, 이는 MS 에멀젼과 동일한 조건에 노출되게 하기 위해 수행된 것이다. 이어 현탁액을 여과 (nylon net filter, 11-μm pore, Millipore, USA)하여 10 μm 보다 작은 MS를 수득하였으며, 이는 증류수로 완전히 세척한 후 동결건조 하였다.

결과는 도 1 및 도 2에 기재되어 있다. 도 1b에 나타난 바와 같이 (a) 및 (b)는 각각 PLGA와 PLGA/PEG를 에멀젼 방법을 이용해서 만든 표면적이 매끄러운 둥근 형태의 마이크로입자 (microsphere; MS) 이고, 도 1b의 (c) 및 (d)는 각각 PLGA와 PLGA/PEG를 전기 방사하여 만든 후 동결-밀링 방법을 통하여 제조된 표면이 거칠고 표면적이 넓은 나노구조가 형성된 마이크로입자(NM) 이다. MS는 매끈한 표면 (도 1b의 a, b)을 갖는 반면, NM은 뭉친 나노파이버로 구성된 거친 표면을 가진다. (도 1b의 c, d). 초기에 추가된 PEG (20 wt%)는 형태에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.

본원에서는 전안부의 자극을 제거하기 위해 필터를 이용해 직경이 10 μm 보다 작은 입자만을 선별 사용하였으며, 제조된 입자의 평균 직경은 도 2에 기재되어 있다. 도 2에 나타난 바와 같이, 본 실시예에서 사용된 4가지 마이크로입자 (PLGA MS, PLGA/PEG MS, PLGA NM, PLGA/PEG NM) 들은 1.8 - 2.2 μm 크기이며, < 10 μm의 크기가 눈에 자극이 적으며 누관을 통해 제거될 수 있다.

실시예 2 마이크로입자 제형의 제조

마이크로입자는 두 종류의 투약제형 즉 현탁액 및 정제(dry tablet)으로 제조되었다. 이를 위해 0.5 mg의 마이크로입자를 30 μl PBS (pH 7.4)에 균질하게 분산하였다. 정제의 제조를 위해 pH 7.4 PBS 중의 30 μl의 2% w/v PVA 를 0.5 mg 마이크로입자와 현탁한 후, 몰드에 (너비 6.5 mm, 길이 3.5 mm, 높이 2.5 mm) 넣은 후 수분이 모두 증발 하도록 6시간 이상 동결 건조하였다.

다음과 같은 총 8 종류의 상이한 제형이 제조되었다: PLGA MS 현탁액, PLGA/PEG MS 현탁액, PLGA NM 현탁액, PLGA/PEG NM 현탁액, PLGA MS 정제 (tablet), PLGA/PEG MS 정제, PLGA NM 정제 및 PLGA/PEG NM 정제.

실시예 3 마이크로입자의 특성 규명

실시예 1에서 제조된 마이크로입자의 크기 및 형태는 주사전자현미경(SEM; 7401F, Jeol, Japan)을 이용하였다. 마이크로 입자의 크기 분포를 측정하기 위하여, 마이크로입자를 50-μm 어퍼처가 장착된 Coulter counter (Multisizer 4, Beckman Coulter, USA)를 이용하여 분석하였다. NM의 표면적 증가를 조사하기 위하여, MS 및 NM을 표면적 및 다공성 분석기 (TriStar II 3020, Micromeritics, USA)로 분석하였다. 표면적은 Dubinin-Astakhov model (Sakurovs, R., Int J Coal Geol 2012, 90, 156-161) 을 이용하여 0℃에서 상대압력 범위 P/P0 = 0.01 - 0.025에서 CO₂ 흡착/탈착 방법으로 측정하였다. 측정하기 전에 실온에서 > 72 h 동안 시료로부터 가스를 제거하였다. Gel permeation chromatography (GPC) (Liu, X. et al., J Mater Sci Mater Med 2011, 22, 327-337)를 이용하여 나노형상 마이크로입자 중의 PEG 존재 여부를 측정하였다. 마이크로입자를 THF에 녹인 후 0.2 μm 막 필터 (Whatman, Clifton, USA)로 여과한 후 HPLC로 분석하였다 (high performance liquid chromatograph Waters 515, Waters, USA). 조건은 다음과 같다: 유속 1.0 ml/min , 연속적 세 개의 컬럼 사용 (PLgel 5.0 guard; 50 mm X 7.5 mm, MIXED-C; 300 mm X 7.5 mm 및 MIXED-D; 300 mm X 7.5 mm, Polymer Laboratories, Shrewbury, UK), 용출 35℃ THF. GPC 시스템은 사 용전 폴리스티렌 표준물질로 계량하였다. 마이크로입자 중의 PEG 존재여부를 확인하기 위하여 Thermogravimetric analysis (TGA; TGA-Q50, TA Instruments, DE, USA)를 추가로 수행하였다. 마이크로입자 (20 - 30 mg)를 질소기류하에서 플라티넘 팬에 놓은 후 10 ℃ /min의 속도로 온도를 40 ℃에서 600 ℃로 증가시켰다. 온전한 PLGA 및 PEG 분말을 또한 비교를 위해 측정하였다.

결과는 도 3, 4 및 5에 기재되어 있다. 온전한 PLGA 및 PEG 분말의 경우 잔류 피크의 부피가 각각 13.6 ml 및 15.3 ml에서 검출 되었다.

PLGA로만 구성된 마이크로입자 (PLGA MS 및 PLGA NM)의 경우 온전한 PLGA와 동일한 지점에서 단일 피크가 검출된 것으로 보아 PLGA로만 이루어진 것을 알 수 있다. 반면 PLGA 및 PEG의 조합으로 만들어진 입자 (즉 PLGA/PEG MS 및 PLGA/PEG NM) 은 각각 PLGA 및 PEG에서 유래한 두 개의 상이한 피크가 관찰되어 PLGA와 PEG를 각각 함유하고 있는 것을 알 수 있다. TGA 결과로부터 PLGA/PEG MS와 PLGA/PEG NM 중 PEG의 존재를 확인 하였다 (도 4). 온전한 PLGA 및 PEG의 경우 분해에 의한 질량 손실이 각각 130℃ - 370℃ 및 305℃ - 415℃에서 관찰되었다 (도 4a). PLGA (즉 PLGA MS 및 PLGA NM) 만으로 이루어진 마이크로입자의 경우 동일한 온도 범위에서 단일 질량 손실이 나타났다 (도 4b). 반면 PLGA/PEG MS 및 PLGA/PEG NM 는 PLGA 및 PEG 의 존재로 인해 두 개의 연속적인 질량 손실이 관찰되었다 (도 4b). 355℃ - 410℃ 에서의 두 번째 질량 손실에 따르면 PLGA/PEG MS 및 PLGA/PEG NM 모두 유사하게 약 10 wt%의 PEG를 포함하고 있는 것으로 나타났다.

도 5의 a, b는 정제의 형광 영상을 나타내며, 밝은 색은 마이크로 입자에 탑재된 나일레드이다. 정제의 크기는 너비 3mm, 길이 6mm, 높이 2mm이었으며, 일회 안약 투여 부피인 약 30μl의 부피에 해당한다. 도 5의 c, d는 정제 표면의 SEM 영상으로 중합성 매질인 PVA에 마이크로입자가 부착되어 있는 것으로 나타났다. PBS에 침잠시, 다공성 매질은 신속하게 용해 (<1분)되어 매질 속의 형광 마이크로입자를 방출하였다 (도 5의 e, f). 각 NM에서 뭉친 나노파이버는 수용성 매질에서 분해되지 않는 것으로 나타났다.

또한 하기 표 1은 PLGA MS 와 PLGA NM을 0℃에서 C0₂를 이용해 측정 후, Dubinin-Astakhov equation을 이용해서 비표면적을 정량적으로 측정한 것이다. 표에서 나타난 바와 같이 구형의 PLGA MS는 비표면적이 8.13 m²/g 인 것에 비해, 본원에 따른 나노형상의 마이크로입자는 108.78 m²/g 으로 비표면적이 약 13배 증가하였음을 알 수 있다. 이런 비표면적으로 증가로 인하여, 나노형상마이크로입자 자체가 안구 표면과의 마찰력을 크게 증가시켜 안구내에서의 거주시간을 올릴 수 있는 것을 나타낸다.

[표 1]

실시예 4 마이크로입자의 안내 거주 시간 평가

생체내 평가를 위해 눈에 문제가 없는 수컷 3.5 - 4.5 kg의 New Zealand White rabbits (Cheonan Yonam College, Chungheongnam-do, Korea)를 사용하였다. 본 실험은 서울대학병원 의생명연구원 동물실험윤리위원회 (IACUC No. 10-0304)의 승인하여 수행되었다. 동물은 12시간의 명암주기로 물과 사료는 자유롭게 섭취하도록 하면서 온도가 조절되는 방에서 한 마리씩 일반 케이지에서 사육되었다 (온도 21 ± 1°C; 습도 55 ± 1%).

실험을 위해 각 토끼를 케이지에서 꺼내 머리만 노출되는 결박가방에 넣었다. 이어 토끼 한눈의 하부 결막낭 (cul de sac)에 0.5 mg의 마이크로입자를 포함하는 한 방울의 현탁액(30 μl) 또는 정제 1개를 투약하였다. 이어 토끼 눈을 강제로 3분간 감긴 후에 케이지에 다시 넣었다. 투약 10분, 30분, 60분, 90분, 120분후 국소마취제 (30 μl, 알카인 0.5% 점안액, 한국알콘) 를 이용하여 눈을 마취 시킨 후 수술용 스펀지를 사용하여 전안부에 잔존하는 마이크로입자를 수집하였다. 이어 수집된 마이크로입자를 포함하는 수술용 스펀지를 아세톤에 1시간 동안 침잠시켜 나일레드를 추출한 후, 형광분광기(FS2, Scinco, Korea)로 종전에 기술한 바와 같이 정량을 확인하고, 정량을 통해 전안부에 남아있는 마이크로입자의 양을 확인 하였다(Choy, Y. B. et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2008, 49, 4808-4815).

토끼 눈에 잔존하는 나일레드로 탑재된 마이크로입자의 형광영상을 투여하고 10, 30, 60, 90 및 120 분 후에 피하주사로 전신마취 후 (17.5 mg/kg, ketamine, 5 mg/kg, xylazine 및 0.2 mg/kg, acepromazine) (필요한 경우 초기주사의 1/2의 부스터 주사) 수득하였다. 이를 위해 토끼의 눈을 TRITC 여기 필터 (투과 파장 531 - 551 nm)(MF542-20, Thorlabs, USA) 가 장착된 LED lamp (AM-R5 mini, Aimai, Korea)로 조사하면서, 눈의 표면을 Tetramethylrhodamine Isothiocyanate (TRITC) 방출 필터 (594 - 646 nm 투과 파장)(MF620-52, Thorlabs, USA)가 장착된 카메라 (HTC raider, HTC, Taiwan)로 촬영 하였다. 촬영한 영상은 안구의 전안 표면 및 하부 결막낭을 포함하며, 상부 결막낭은 마이크로입자가 관찰되지 않아 포함하지 않았다.

결과는 도 6 및 7에 기재되어 있다. 도 6에 나타난 바와 같이 실시예 2의 각 제형을 토끼 눈의 하부 결막낭에 투여한 후 정해진 간격으로 잔류량을 조사한 결과, 현탁액 중의 모든 마이크로입자는 잔류결과가 좋지 않았다. 10분경에는 약 7-15%의 마이크로입자 만이 잔류하고 있었으며, 30분 후에는 모든 마이크로입자가 제거되었다. MS로 이루어진 정제의 경우는 점착제와 함께 사용 시 잔류량이 현탁액과 비교하여 10분 및 30분에 각각 8%에서 27%와 6%에서 18% 로 증가하였다.

나노구조가 형성된 표면과 정제 제형의 상승효과도 관찰되었다. PLGA NM 정제의 경우 현탁액과 비교하여 전안 잔류량이 투여 후 10분에 9% 에서 44% 증가하였다 (p< 0.001). NM의 거친 표면이 전안 표면과의 마찰을 증가시켜 점액부착(mucoadhesion) 없이도 마이크로입자의 제거를 방해하는 것을 나타낸다. 증가한 표면적 또한 반데르발스 힘에 의해 부착을 증가시킨다.

실험한 제형 중에서 PLGA/PEG NM 정제의 거주시간이 가장 우수한 것으로 나타났다. 잔존하는 마이크로입자의 평균 퍼센트는 10 min, 30 min, 60 min 및 90 min 에 각각 73%, 39%, 19% 및 13% 인 것으로 나타났다 (p < 0.05). PLGA/PEG NM 현탁액과 비교하여, PLGA/PEG NM 정제는 10, 30, 60 및 90 분에서 각각 4.8-, 5.5-, 4.5- 및 4.8-배 증가하였다. 이러한 결과는 PLGA/PEG NM의 부착에 정제 제형이 효과적인 것임을 나타낸다.

도 7의 결과는 도 6과 일치하며, 점액점착 또는 나노구조가 형성된 표면에 의해 마이크로입자의 거주시간이 증가하는 것으로 나타났다. 특히 PLGA/PEG NM 정제의 경우 투여 후 30분 경과되기 까지 상당한 잔류량이 관찰되었으며, 90분경과시까지 관찰되었으며 120분에 완전히 제거되었다. 대부분의 마이크로입자는 하부 결막낭에서 관찰되었는데, 이는 뮤신의 분비 부위와 일치하는 것으로, 뮤신에 의해 점착성이 증가된 것으로 판단된다.

상기 결과는 전안부 점액과 입자의 점착성이 나노구조로 형성된 입자의 넓은 표면적과 함께 시너지적인 효과를 보인 것으로 판단된다. 반면 MS의 경우는 그 증가도가 미미하다. 즉 본원의 입자를 포함하는 정제는 전안부 투여 시 빠르게 녹아 입자만을 전안부에 남겨놓게 되며, 남겨진 입자들은 전안부에 잘 점착되어 그 거주시간이 증가되었다.

실시예 5 안전성 평가

생체내 안전성을 평가하기 위하여, PLGA/PEG NM 정제를 국소투여 한 후, 토끼의 눈을 안과전문의가 현미경 및 external ophthalmic photography로 검사하였다. 안압은 tonometer (Tonopen AVIA, Reichert, NY, USA)를 제조자의 방법대로 사용하여 모니터하였다. 각 동물에 대하여, 왼쪽 눈은 PLGA/PEG NM 정제로 처리하였으며 오른쪽 눈은 처리하지 않았으며, 투여 직전, 투여 후 1 h, 2 h 및 24 h 째에 평가하였다. 총 4마리의 토끼를 사용하였다.

세포독성은 TOX7 키트 (Sigma-Aldrich, USA)를 제조자의 방법대로 사용하여 분석하였다. 요약하면, L929 섬유아세포(Korea Cell line bank, Korea)를 6웰 플레이트에서 5×10⁵ cells/well 의 농도로 배양한 후, 본원에 따른 마이크로입자 (웰당 두 개의 정제)를 추가한 후, 24시간 동안 37℃에서 배양하였다. 이어 배지를 제거한 후, 250Xg에서 4분간 원심분리한 후, 50μl의 상층액을 TOX7를 이용한 분석에 사용하였다. 각 수치는 4개의 독립적인 실험의 결과이며, 양성 대조군으로는 1% Triton-X100 (Sigma, MO, USA)가 사용되었다.

세포독성은 다음 식으로 계산되었다:

세포독성(%)= (정제 시료-방출 배경값)/(양성 대조군-방출 배경값) x 100 %

결과는 도 8 및 9에 기재되어 있다. 도 8에 나타난 바와 같이 본원에 따른 PLGA/PEG NM 정제는 세포 독성이 없는 안전한 것으로 나타났다. 도 9는 PLGA/PEG NM 정제를 토끼 눈에 처리하여 안전성을 테스트한 결과로, 추적기간 동안 매우 경미한 결막염을 제외하고는 유의미한 부작용은 없었다. 결막염은 대측성 정상 (sham) 눈에서 관찰되었으며, 이는 마취동한 눈을 뜬 상태로 두어 이로 인한 건조 때문인 것으로 추측된다. 안압 (IOP)의 변이는 PLGA/PEG NM 정제 투여 후 변화가 거의 없었다. IOP 측정 결과는 16.8 ± 1.4 mmHg이었고, 이는 토끼 눈의 경우 정상 값이다.

통계분석

토끼 눈의 전안 표면에 잔류하는 마이크로입자의 퍼센트는 초기에 눈에 투여된 입자의 양을 기준으로 계산하였다 (즉 투여 당 0.5mg). 8개의 상이한 마이크로입자 제형의 평균 잔류 퍼센트는 ANOVA α = 0.05의 통계적 유의성 및 Tukey’s post hoc test 쌍간 비교를 이용하여 비교 되었다.

실시예 6 마이크로 입자를 사용한 약물 방출 결과

실시예 6-1 BRT 탑재 및 방출 결과

현재 임상에서 널리 사용되는 녹내장약물인 Brimonidine Tartrate 0.15%를 이용한 점안액 “알파간피”는 높은 효과에도 불구하고 하루 3회 점안해 주어야하는 불편함이 있다.

본 실시예에서는 알파간피와 동일한 용량의 Brimonidine Tartrate(BRT) (Nanjing Yuance Industry & Trade Co., Ltd, Nanjing, China)가 포함된 PLGA MS, PLGA/PEG MS, PLGA NM, PLGA/PEG NM을 각각 제작하고, 이것을 이용하여 실시예 2와 같이 정제를 제조하였다. PLGA/PEG MS의 경우 PLGA 500 mg, PEG 625 mg (125%) Brimonidine 50 mg을 DCM 5 ml에 녹인 후, 160W에서 2분 동안 초음파 처리하여 잘 혼합되도록 하였다. 이어 이를 50ml의 PVA 1% (20mM phosphate buffer at pH=12)에 추가한 후, 100W로 30초 동안 초음파처리한 후, 150 rpm 교반 하면서 진공 (-12.5 psi)에서 40분 동안 DCM을 제거하였다. 이어 3500 rpm으로 10분 동안 원심분리후 입자만 동결건조 하였다. PLGA MS의 제조방법은 위와 동일하나 PEG가 포함되지 않았다. 이런 경우 PLGA 대비 125% 인 625 mg 의 PEG가 들어갔지만, 제조과정중 대부분의 PEG는 제거되고, 결론적으로 PLGA 대비 6%의 PEG가 잔존하게 된다. (NMR 측정 결과).

단 Brimonidine은 물에 쉽게 용해되는 약물로 MS는 이중 에멀젼 방법을 통해 제조되는 것이 일반적이나, 본 실시예에서는 PLGA (wall material), PEG (mucoadhesive promotor) 및 Brimonidine을 유기용매 (DCM)에 넣고, 초음파 처리하여 약물과 PEG를 PLGA에 탑재하였다. 즉 Brimonidine은 DCM에 용해되지 않기 때문에 물리적으로 탑재되었다.

PLGA/PEG NM 제조의 경우 PLGA 1g, PEG 60mg, Brimonidine, 50 mg을 넣고, DCM:THF: = 3:1:1로 제조된 용매 3.35 ml를 추가 한 후 tip-to-collector 거리 = 10cm; collector rotation = 100rpm; Needle gague 26G; 및 Feeding rate = 3.0ml/h의 조건으로 전기방사법을 이용하여 제조하였다. 이어 동결밀링은 14 CPS로 (초당 14번 왕복 운동함) 30분을 수행하였다. MS 와 동일하게 PLGA 대비 PEG가 6%로 포함되었다. PLGA NM은 PEG가 결여된 것 이외는 동일하게 제조되었다. 전기방사법을 사용한 경우, PEG 및 약물의 손실이 없는 것으로 나타났다 (결과는 나타내지 않음).

단, 입자의 비표면적의 경우, 실시예 3과 동일하나, C0₂를 대신 N₂를 이용하여 분석하였다. 따라서, 비표면적의 절대적인 수치는 다르지만, 그 차이는 13배로 동일함을 알 수 있다.

제조 결과는 표 2에 기재되어 있다.

[표 2a]

[표 2b]

음성대조군으로는 MS, NM이 모두 들어있지 않는 단순히 Brimonidine Tartrate만을 정제 (PVA 정제) 방식으로 제조된 것이 사용되었다.

상기와 같이 제조된 MS 및 NM을 이용하여 생체외 약물 방출 실험을 수행하였다. 마이크로 입자로 만들어진 정제 1개를 10ml pH 7.4 PBS 완충액에 넣은 후, 시간대 별로 1ml씩 채취한 후, 다음의 조건으로 HPLC (agilent 1260 seires, Agilent technologies, USA)(Column = Poroshell 120 EC-C18, 4.6 X 100 mm, 2.7 um, Mobile phase = 20mM phosphate buffer (pH = 2.5) 80% 및 20% Methanol, Flow rate = 1ml/min. 10μl injection, 248 nm, 온도 = 40℃) 를 이용하여 분석하였다.

결과는 도 10a에 기재되어 있다. 이에 나타난 바와 같이 입자가 포함되지 않은 정제 (PVA tablet)은 약물 확산조절제가 포함되어 있지 않기 때문에 다공성의 PVA 물질이 물에 들어가면서 빠르게 약물이 방출되어서, 10분 이내에 99% 이상의 약물이 방출되었다. PEG의 존재유무에 관계없이 MS 는 10분 내에 23~30 %정도의 초반 burst 약물 방출이 있었으며, 300분까지 서방형으로 전달이 되어서 300분까지 약 70%까지 약물이 방출되었고, NM은 초반 10분 동안 MS보다 많은 28~38 %의 약물을 방출하고 300분까지 70%에 가까운 약물을 방출하였다. 이는 MS보다 넓은 비표면적을 가진 NM이 많은 양의 버퍼와의 접촉을 통하여 초반에 빠르게 약물이 빠져나와서 초반 약물 방출이 많은 것으로 보인다.

실시예 6-2 Dorzolamide 탑재 및 방출 결과

실시예 6-1에 기재된 방법대로 Dorzolamide(Xi'an natural field bio-technique Co., Ltd, Xi’an, Shaanxi, China), 556.5μg이 포함된 PLGA/PEG NM을 PEG 6%를 사용하여 BRT와 동일하게 전기방사방법을 이용하여 제조하였다.

음성대조군으로는 NM을 포함하지 않는 단순히 Dorzolamide만을 정제 (PVA tablet) 방식으로 제조된 것이 사용되었다.

상기와 같이 제조된 NM을 이용하여 실시예 6-1에 기재된 바와 같이 생체외 약물 방출 실험을 수행하였다.

결과는 도 10b에 기재되어 있다. 이에 나타난 바와 같이 PVA 정제는 BRT와 동일하게 10 분 이내에 99%이상 방출되었고, PLGA/PEG NM 정제는 10분까지 88%까지 약물이 방출되고, 10~180분 동안 7%의 약물이 더 전달되어 180분까지 96%의 약물이 방출되었다.

상기 결과는 PLGA/PEG NM 정제를 사용하는 경우, 기존의 약물과 비교하여 눈에서의 마이크로입자의 거주시간이 월등히 증가하여, 눈 내로 전달되는 약물의 양이 증가되어 하루에 2회 이상 투여가 아닌 1일 1회 또는 수일에 1회로도 동일한 또는 증가된 약물효용성을 나타낼 수 있음을 증명하는 것이다.

실시예 7 마이크로 입자를 사용한 약물 전달에 의한 치료 효과

실시예 6-1 및 6-2에서 제조한 마이크로 입자 제형을 실시예 4에서와 같이 토끼의 안구에 투여한 후 실시예 5와 같이 안압을 측정하였다.

BRT 효과 실험의 경우 총 7개의 시료를 사용하였다. Alphagan P는 실제 임상에서 사용하는 brimonidine 제형이며, purite 라는 방부제가 들어 있고, 이에 의해 brimonidine이 흡수가 향상되는 것으로 알려져 있다. Alphagan P 35 μl를 사용하였으며, 이에는 52.5 μg brimonidine이 탑재되어 있다. 즉, alphagan P 35 μl, Brimonidine 35 μl, PVA 정제 (마이크로입자 없이, 단지 brimonidine 52.5 μg 포함) 및 상기 제조된 4 종류의 마이크로 입자 (52.5 μg brimonidine 탑재)를 사용하였다. dorzolamide 효과 실험의 경우, Trusopt 2% (MSD, USA) 25 μl, PVA 정제 (마이크로입자 없이, 단지 dorzolamide 556.5 μg 포함) 및 상기 제조된 마이크로입자 (dorzolamide 556.5 μg 포함) 를 사용하였다.

이어 실시예 5에 기재된 바와 같이 Tonopen이라고 하는 안압측정 장비를 사용하여 시료 투여전 안압을 측정하고 투여 후 0.5시간~ 최대 13시간까지 안압을 측정하여 약효를 확인하였다.

결과는 도 11 a 및 b에 기재되어 있다.

도 11a에서 alphagan P와 brimonidine 등은 최대 6시간, PVA 단독은 최대 7시간 효과가 있었으며, PLGA MS, PLGA/PEG MS, PLGA NM이 탑재된 PVA 정제는 상당량의 입자가 전안부에서 약물을 서방 전달하여 9~10시간 동안 효과가 있었고, 입자 점액부착능이 가장 좋아 약물의 서방성이 가장 오래 지속된 PLGA/PEG NM은 13시간까지도 효과가 있는 것으로 나타났다. 통계적으로 보았을 때, 6, 7, 8, 9, 10, 11 및 12 시간째에, PLGA/PEG NM 정제로 처리한 경우, 대조군 및 다른 제형과 비교하여 안압이 현저하게 감소하였다 (p < 0.05).

도 11b에서 Trusopt과 Dorzolamide 용액은 5시간동안 IOP 하강효과가 있었고, PVA는 1시간이 늘어난 6시까지 효과가 있었다. 반면에, 제조된 PLGA/PEG NM 정제를 이용하여 동일양의 dorzolamide를 전달한 경우 10시간까지의 IOP 하강효과가 있었다. 이는 통계적으로 보았을 때, 3, 4, 5, 6, 7, 8 및 9시간째에, PLGA/PEG NM 정제로 처리한 경우, 대조군 및 다른 제형과 비교하여 안압이 현저하게 감소하였다 (p < 0.05).

상기 결과는 본원에 따른 제형을 사용할 경우, 다양한 약물이 지속적이고 유효하게 전달되어 치료효과가 극대화되었음을 나타내는 것이다.

실시예 8 약물동태학 분석 결과

실시예 6-1과 같이 제조된 brimonidine이 탑재된 7가지 제형을 토끼의 눈에 넣은 후, 일정 시간 경과후 소량의 방수를 채취하여 다음과 같이 약물동태학 분석을 수행하였다. 약물 삽입후 일정시간이 지났을 때, 실시예4와 동일한 방법으로 토끼를 전신마취 후 30 게이지 바늘이 장착된 1 ml의 주사기를 이용하여 토끼의 눈에서 50 μl의 방수(AH, Aqueous humor)를 추출하여 SPE (Solid Phase Extraction) 및 HPLC 분석을 수행하였다. 먼저 Brimonidine Stock solution을 2000 μl/ml의 농도로 증류수에 녹인 후, 이 Stock solution을 이용하여 2000, 1000, 800, 600, 400, 200, 100, 50 μg/ml Brimonidine 용액을 제조하였다. 칼리브레이션을 하기 위하여 약물이 탑재되지 않은 25 μl 방수, 25 μl Stock Solution (2000, 1000, 800, 600, 400, 200, 100, 50 μg/ml), 50 μl IS (Internal standard, clonidine)(50μg/ml) 및 200 μl 의 인산완충액 (pH=8)혼합한 후, 11000Xg 10분 동안 원심분리를 수행한 후, 상층액을 취하여, 100μl의 시료를 이용하여 SPE를 수행하였다.

토끼에서 획득한 샘플 분석의 경우 50 μl의 시료, 50 μl의 IS (50μg/ml) 및 pH 8의 인산완충용액 (200 μl)을 혼합한 후 11000Xg 10분 동안 원심분리를 수행한 후, 상층액을 취하여, 100μl의 시료를 이용하여 SPE 를 수행하였다. SPE (Bond-Eluct-C18, 100mg, 1ml, Agilent Technologies)과정은 다음과 같다. 샘플 주입전 MeOH (1 ml)와 증류수 1ml로 세척한다. 시료를 주입 (칼리브레이션 및 분석용 각각) 한 후, 1ml의 PBS 완충액으로 세척하고, 1ml의 70% 아세토니트릴 을 이용하여 용출하였다. 이어 3시간 동안 40℃에서 스피드백(Speedvac, Thermo Savant SPD 2010 SpeedVac System, Thermo Electron Corporation, USA) 을 이용하여 수분을 모두 증발시킨 후, 증류수 100 μl를 넣어주고 여과한 후 (0.2μm, 4mm, Whatman, UK) HPLC로 분석하였다.

농도 측정을 위해 HPLC(Agilent 1260 Series, Agilent Technologies, CA, USA)를 분석을 수행하였으며, 상기와 같이 준비한 50μl의 시료를 주입하여 하기 조건에서 분석하였다: Mobile phase = 20 mM phosphate buffer (pH=2.5) : MeOH = 9:1, 유속 1ml/min, 248 nm.

결과는 표 3 및 도 12에 기재되어 있다. 표 3 및 도 12에 나타난 바와 같이 각 제형을 투여한 후 방수에서의 brimonidine의 농도 값이다. Cmax (최고 농도)는 PLGA/PEG NM 정제가 1.201 μg/ml로 가장 높게 측정되었으며, Tmax (최고 농도 시점)은 모두 동일하게 40분 (0.667시간)인 것으로 측정되었다. 약물의 흡수도를 나타내는 Area under curve (AUC)는 Alphagan P가 1.013이며, purite가 들어있지 않은 BRT 용액과 BRT 정제는 각각 0.795와 1.136으로 나타났으며, PLGA MS, PLGA/PEG MS, PLGA/NM으로 구성된 정제의AUC는 모두 1.3~1.4 인 것으로 측정되었다. 가장 우수한 AUC (약물 흡수)는 2.078의 PLGA/PEG NM인 것으로 나타났다.

[표 3]

실시예 9 마이크로 입자를 사용한 소장 점막 부착성 실험 결과

실시예 1에 기재된 방법으로 만들어진 Nile Red가 탑재된 MS, NM 그리고 Nile Red 자체를 pH 7.4 PBS에 넣어서 현탁액으로 만들고 (농도 = 1.8 μg/ml Nile Red) 토끼 소장의 점막 층이 위로 향하게 준비하였다. 토끼소장의 점막 층에 각각의 현탁액 25 μl씩 2방울씩 도포한 후, 5분 동안 기다렸다.

이어 현탁액이 도포된 각각의 토끼소장을 100 ml pH 7.4 PBS에 20회 입출을 반복한 후 (20회 세척), 실시예 4에서와 같이 TRITC 필터와 카메라를 이용하여 형광 이미지를 획득하여, Nile Red, MS 그리고 NM의 잔류량을 확인하였다.

도 13은 현탁액이 도포된 후, PBS에 20회 세척후 남은 Nile Red, Nile Red가 탑재된 MS와 NM에서의 형광 이미지이다. 도 13에서 볼 수 있듯이, Nile Red와 MS가 도포된 소장에서는 20회 세척 후, 남아있는 Nile Red와 MS가 거의 없는 것으로 확인되지만, NM에서는 많은 양의 입자가 남아있는 것으로 확인 되었다. 이러한 결과는, 넓은 비표면적을 가진 NM이 토끼 소장에 있는 점막과의 접착력을 증가시켜 다른 입자들보다 더 오랫동안 거주할 수 있음을 나타내는 것이고, 이는 본원에 따른 제형을 사용할 경우, 다양한 점막에서 지속적이고 유효한 약물 전달로 치료효과가 극대화될 수 있음을 나타내는 것이다.

Claims

표면에 나노크기의 무정형의 응집체가 형성되고, 생분해성 점착제를 포함하는, 점막 부착성 마이크로 입자.
제 1 항에 있어서, 상기 마이크로 입자는 폴리락타이드, 폴리글라이콜라이드, 폴리(락틱-코-글리콜산), 폴리오르토에스테르, 폴리안하이드라이드, 폴리아미노산, 폴리하이드록시부티르산, 폴리카프로락톤, 폴리알킬카보네이트, 에틸 셀룰로즈, 키토산, 전분, 구아검, 젤라틴 또는 콜라겐 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 확산 조절제를 추가로 포함하는 것인, 점막부착성 마이크로 입자.
제 1 항에 있어서, 상기 점막은 안구, 구강, 비강, 항문 또는 질내 점막인, 점막부착성 마이크로 입자.
제 1 항에 있어서, 상기 마이크로 입자는 정제 형태인, 점막부착성 마이크로 입자.
제 1 항에 있어서, 상기 생분해성 점착제는 수용성 중합체인, 점막부착성 마이크로 입자.
제 5 항에 있어서, 상기 생분해성 점착제는 PEG (Polyethylene Glycol)인, 점막 부착성 마이크로 입자.
삭제
제 2 항에 있어서, 상기 점착제는 PEG 이고, 상기 확산조절제는 PLGA (poly(lactic-co-glycolic acid))인, 점막 부착성 마이크로 입자.
제 1 항에 있어서, 상기 무정형의 응집체는 상기 생분해성 점착제를 전기방사 및 동결밀링 (freeze-milling) 하여 제조된 것인, 점막부착성 마이크로 입자.
제 1 항에 있어서, 상기 마이크로 입자는 점막부착능으로 인해 저분자화합물, 단백질약물, 방사선핵종(radionuclide), 핵산기재 약물 또는 그 조합을 서방전달 할 수 있는, 점막부착성 마이크로 입자.
제 1 항에 있어서,
상기 점막은 안구 점막으로, 상기 마이크로 입자는 안질환 치료 약물로 항바이러스제, 항균제, 항진균제, 항알러지제, 비스테로이드 소염제, 소염제, 소염 진통제, 소염 효소제, 항생물질, 술파제, 합성 페니실린, 녹내장 치료제, 백내장 치료제, 축동제, 산동제, 국소수렴제, 혈관수축제, 안압상승 방지제, 고안압증 치료제, 표면 마취제, α1-차단제, β-차단제, β1-차단제, 탄산 탈수소 효소 저해제, 국소용 선택 H1-블로커, 부신 피질 호르몬, 비타민 B12, 보효소형 비타민 B2, 항콜린에스테라아제 또는 유기 요오드 제제를 포함하는 것인, 점막부착성 마이크로 입자.
제 11 항에 따른 점막부착성 마이크로 입자를 포함하는 서방형 약물 전달용 점막부착 시스템.