KR101505422B1 - 이산화탄소 변환이 가능한 탄산무수화 효소－탄산칼슘 결정 복합체 - Google Patents

이산화탄소 변환이 가능한 탄산무수화 효소－탄산칼슘 결정 복합체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 이산화탄소 변환이 가능한 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 이산화탄소를 탄산칼슘으로 변환시키는 능력을 가진 탄산무수화 효소와 폴리에틸렌글리콜 및 자성나노입자를 이용하여 제작된 탄산무소화 효소-탄산칼슘 결정 복합체 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다.
발명의 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체는 폴리에틸렌글라이콜을 이용하여 탄산칼슘 결정의 형태를 화학반응에 유리한 형태로 유도하였으며, 탄산무수화 효소의 반응을 이용하여 이산화탄소 저감기술에 응용할 수 있다.

Description

이산화탄소 변환이 가능한 탄산무수화 효소－탄산칼슘 결정 복합체{Carbonic Anhydrase－Calcium Carbonate Crystalline Complex for Carbon Dioxide Bioconversion}
본 발명은 이산화탄소 변환이 가능한 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 이산화탄소를 탄산칼슘으로 변환시키는 능력을 가진 탄산무수화 효소와 폴리에틸렌글리콜 및 자성나노입자를 이용하여 제작된 탄산무소화 효소-탄산칼슘 결정 복합체 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다.
이산화탄소는 지구 온난화를 일으키는 주요 물질 중 하나로, 산업화에 따른 화석연료의 사용증가로 인해 이산화탄소 발생이 증가하여 지구 온난화를 촉진하고 있다. 이를 방지하기 위해 세계 각국에서는 탄소 배출을 줄이는 것과 동시에 이산화탄소 저감을 위한 노력을 하고 있다. 탄소배출권을 판매하여 탄소의 발생 및 화석연료의 사용을 가능한 한 억제하고 있으며, 이미 발생한 이산화탄소를 감소하기 위한 연구가 진행 중이다.
또한, 이산화탄소를 단지 제거해야 할 오염물질로만 보는 것 이외에, 이를 활용하여 경제적인 부가가치를 창출하고자 하는 노력이 진행되고 있다. 일반적으로 제시되는 재연소법 등의 방식으로 이산화탄소를 대기에서 분리할 경우 사후 처리 비용이 높아 경제적 가치가 떨어졌지만, 분리한 이산화탄소를 기반으로 가치 있는 물질을 확보할 경우 그 응용 가능성과 경제적 가치는 매우 높다고 할 수 있다. 이러한 방법 중 대표적인 예로 생체-결정화(biomineralization)가 있으며, 분리된 이산화탄소를 다른 화학물질과 결합시켜 결정화시키면, 적은 비용으로 이산화탄소를 감소시킬수 있으며 동시에 처리와 이용이 쉬운 생성물질들을 얻을 수 있다. 특히 자연계에서 일어나는 생체-결정화를 모방하였기 때문에 반응 환경이 까다롭지 않으며, 응용을 통해 원하는 형태로 얻을 수 있다는 장점을 지니고 있다 (Yu, K.M.K., et al., Chemsuschem , 1(11):893, 2008; Haszeldine, R.S., Science, 325(5948):1647, 2009; Al-Traboulsi, M., et al ., Environmental and Experimental Botany, 80:43, 2012; Chalmers, H., J. Gibbins, and M. Leach, Mitigation and Adaptation Strategies for Global Change, 17(6):621, 2012)
탄산무수화 효소(Carbonic anhydrase)는 이산화탄소에 물을 첨가하여 탄산을 얻는 가역 반응 CO2+H2O ⇔ H2CO3을 촉매하는 효소로 탄산 탈수 효소라고도 한다. 동/식물부터 미생물에 이르기 까기 다양한 생물에 존재하며, 동물에서는 호흡 과정 중 혈액 내의 이산화탄소를 배출하거나 혈액의 pH를 조절하는 데 쓰이고, 식물에서는 광합성 과정 중 C4식물의 이산화탄소 고정에 쓰인다.
탄산무수화 효소는 빠른 반응속도를 가지며, 탄소 고정 능력이 우수하여, 최근 탄산무수화 효소의 장점을 이용하여 기체 이산화탄소로부터 얻은 탄산 이온을 칼슘 이온과 반응시켜 의료용 탄산칼슘을 제작하거나, 이산화탄소를 저감하려는 연구가 꾸준히 진행되고 있다. 동물 혹은 식물 등의 세포로부터 추출하여 사용하는 탄산무수화 효소의 가격 경쟁력을 확보하기 위해 유전자 조작을 통해 대량 생산이 가능한 새로운 유형의 탄산무수화 효소를 확보하려는 연구 또한 활발히 진행되고 있다 (Prabhu, C et al ., Journal of molecular catalysis . B, Enzymatic , 71(1):71, 2011, 미국등록특허 제7132090호 및 한국등록특허 제1162663호).
탄산칼슘은 자연계에 가장 흔한 광물 중의 하나로, 매우 안정하며 생체적합성(biocompatibility)이 매우 뛰어나 산업, 의료 등 인간 생활 전반에 폭넓게 사용됨은 물론, 자연계에서도 어패류, 갑각류 등의 외골격, 인간 및 동물의 뼈 형성에도 큰 역할을 하는 물질이다. 또한 탄산칼슘의 형태가 자연에서 다양하게 형성된다는 것이 많은 연구를 통해 밝혀져 있다. 조개류, 갑각류와 같이 탄산칼슘 외골격을 통해 자신을 보호하는 생물들은, 탄산칼슘의 결정화 과정에 고유의 단백질 혹은 화학물질을 첨가하여 그 형태를 각자의 생존에 걸맞게 조절한다. 이를 모방하여 폴리아세트산(Polyacetic acid) 등의 화학 물질들을 첨가하여 탄산칼슘 결정의 형태 변화를 유도하는 연구가 진행되어 왔으나, 폴리에틸렌글라이콜(Polyethtlene glycol,PEG)을 이용하여 탄산칼슘의 형태 변화를 유도하여, 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체를 제조한 예는 아직까지 보고되지 않았다.
이에, 본 발명자들은 이산화탄소를 효과적으로 감소시키며, 바이오 촉매로 사용되는 탄산무수화 효소를 재활용하기 위해 예의 노력한 결과, 자성나노입자(magnetic nanoparticle), 폴리에틸렌글라이콜 및 탄산칼슘이 복합적으로 작용하여 자성 분리기능과 탄산무수화 효소의 활성을 지니는 탄산무소화 효소-탄산칼슘 복합체를 제조하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 자성 분리기능과 탄산무수화 효소의 활성을 지니는 탄산무소화 효소-탄산칼슘 복합체 및 이의 제조방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 해결하기 위하여, 본 발명은 (a) 염화칼슘(CaCl2) 수용액에 폴리에틸렌글라이콜(polyethtlene glycol, PEG) 및 탄산무수화 효소를 첨가한 다음, 여기에 이산화탄소를 수화시켜 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체를 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체를 회수하는 단계를 포함하는 이산화탄소 변환이 가능한 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 탄산칼슘 결정에 탄산무수화 효소가 이온결합으로 고정되어 있고, 폴리에틸렌글라이콜이 탄산칼슘 결정 내부에 포함되어 타원형 구조를 이루고 있는 것을 특징으로 하는 이산화탄소 변환이 가능한 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체를 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 제6항의 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체가 포함된 수용액에 이산화탄소를 수화시켜, 탄산이온(carbonate ion; CO3 2 -)을 생성시키는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 반응이 끝난 후에 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체를 제거한 다음, 탄산이온이 포함되어 있는 수용액에 양이온을 첨가하여 탄산염을 생성시키는 단계; 및 (c) 상기 생성된 탄산염을 제거하는 단계를 포함하는 탄산무수화 효소-탄산칼슘 복합체를 이용하여 이산화탄소를 탄산염으로 제거하는 방법을 제공한다.
본 발명의 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체는 폴리에틸렌글라이콜을 이용하여 탄산칼슘 결정의 형태를 화학반응에 유리한 형태로 유도하였으며, 탄산무수화 효소의 반응을 이용하여 이산화탄소 저감기술에 응용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체의 형태와 구성을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체를 자석을 이용하여 분리한 모습을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체의 형태와 크기를 TEM(Transmission Electron Microscopy)으로 확인한 것이다.
도 4는 본 발명의 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체가 가지고 있는 탄산무수화 효소 기능 및 안정성을 그래프로 나타낸 결과이다.
도 5는 본 발명의 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체를 이용하여 이산화탄소를 탄산염으로 제거하는 방법을 나타낸 모식도이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 일 관점에서, (a) 염화칼슘(CaCl2) 수용액에 폴리에틸렌글라이콜(polyethtlene glycol, PEG) 및 탄산무수화 효소를 첨가한 다음, 여기에 이산화탄소를 수화시켜 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체를 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체를 회수하는 단계를 포함하는 이산화탄소 변환이 가능한 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, (a) 단계는 15mM 내지 25mM의 염화칼슘 수용액에 0.3 중량% 내지 0.5 중량%의 폴리에틸렌글라이콜 및 0.02㎎/㎖ 내지 0.03㎎/㎖의 탄산무수화 효소를 pH를 8 내지 9로 조절하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 염화칼슘 수용액은 바람직하게는 20mM의 염화칼슘을 사용하며, 수용액 내의 칼슘 이온은 기체 이산화탄소를 탄산칼슘으로 변환하는데 필요하다. 본 발명에서는 일정 부피에 용해될 수 있는 이산화탄소의 최대량에 맞추어 최적화한 농도의 칼슘 이온을 처리한 것으로, 일정 농도 이하에서는 칼슘 이온의 농도가 높을수록 결정화 과정이 촉진되지만, 포화점을 넘어가게 되면 더 이상 칼슘 이온을 추가해도 결정화 과정이 촉진되지 않는다.
상기 탄산무수화 효소의 반응 정도에 따라 수용액에 이산화탄소가 녹는 속도가 결정되며, 탄산칼슘의 결정화에 영향을 주기 때문에, 바람직한 농도의 탄산무수화 효소가 첨가되었을 때, 빠른 속도로 탄산칼슘의 결정화가 이루어진다. 이산화탄소 기체와 접촉하는 면적이 한정되어 있기 때문에, 일정 이상의 탄산무수화 효소는 더 이상 결정화 속도를 빠르게 하지 못한다. 본 발명에서는 바람직하게는 0.5㎎(8750unit)의 탄산무수화 효소를 첨가하며, 0.5㎎ 이하의 탄산무수화 효소가 첨가된 경우 추가로 첨가할수록 결정화 속도가 빨라졌으나, 그 이상의 탄산무수화 효소를 첨가하여도 더 이상 결정화 속도를 상승시킬 수 없었다.
상기 폴리에틸렌글라이콜은 중합체로서 탄산칼슘 결정의 형태에 영향을 미치지만, 고농도에서는 이산화탄소의 고정 및 탄산칼슘의 결정화를 억제하며, 저농도에서는 탄산칼슘 결정의 형태 형성에 영향을 주지 못한다. 폴리에틸렌글라이콜과 염화칼슘만을 첨가한 버퍼에서는 결정화 반응이 일어나지 않았으나, 탄산무수화 효소에 의해 폴리에틸렌글라이콜의 억제 반응을 상쇄하면서 결정화 반응이 이루어졌다. 일정량 이상의 폴리에틸렌글라이콜이 추가될 경우 탄산칼슘 결정화가 이루어지지 않았다. 0.5 중량% 이하의 폴리에틸렌글라이콜이 추가된 경우 탄산칼슘 결정의 형태변화에 큰 영향을 주지 못했지만, 0.5 중량% 보다 많은 양의 폴리에틸렌글라이콜이 추가된 경우 결정화가 억제되었다. 즉 탄산칼슘 복합체의 결정화를 억제하지 못하면서 형태형성에만 영향을 주는 최적의 양인 0.5 중량% 폴리에틸렌글라이콜을 첨가하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, (a) 단계는 3부피% 내지 7부피%의 이산화탄소를 수화시켜, 25℃ 내지 35℃ 조건에서 600rpm 내지 1000rpm의 속도로 24시간 내지 48시간 동안 교반시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 탄산칼슘 결정 복합체를 형성하는데 필요한 이산화탄소는 기체상의 이산화탄소로부터 탄산무수화 효소 반응을 통해 변환되며, 기체상의 이산화탄소 농도가 높을수록 생성되는 탄산칼슘 결정의 양이 많아지고 속도가 빨라지는 것은 자명하므로, 3부피% 내지 7부피%의 이산화탄소 농도가 바람직하다.
본 발명의 (a)단계에서의 교반속도는 600rpm 내지 1000rpm의 속도로 하는 것이 바람직하나, 가장 바람직하게는 800rpm 이다. 500rpm의 속도로 교반하는 경우에는 결정화가 이루어 지지 않았으며, 600rpm 내지 700rpm 및 900rpm 내지 1000rpm에서는 크기와 형태가 일정하지 않았다.
본 발명에 있어서, (a)단계의 염화칼슘 수용액에 자성나노입자를 추가로 첨가하여 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체에 자성 분리 기능을 부여하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 자성나노입자는 염화 제1철(FeCl2) 및 염화 제2철 혼합물(FeCl2)에 수산화나트륨을 첨가하여 제조된 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 0.25 M의 염화 제1철과 0.5 M의 염화 제2철 혼합물에 5 M의 수산화나트륨을 첨가하여 제조되는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 자성나노입자는 (a) 단계의 염화칼슘 수용액 1㎖에 2.5㎕ 내지 7.5㎕를 첨가하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 5㎕를 첨가한다.
고농도의 자성나노입자가 첨가되는 경우, 효소-탄산칼슘 결정 복합체에 포함되지 못하고 남아있는 잉여 분량이 발생하며, 저농도의 자성나노입자가 첨가되는 경우에는 효소-탄산칼슘 결정 복합체에 전부 포함되지 못하여 효소-탄산칼슘 결정 복합체의 자성분리기능이 감소하므로, 염화칼슘 수용액 1㎖에 5㎕의 자성나노입자를 첨가하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에서, 20mM의 염화칼슘 수용액 20㎖에 자성나노입자 100㎕, 폴리에틸렌글라이콜(Polyethtlene glycol,PEG) 100㎎ 및 탄산무수화 효소 0.5㎎을 첨가하고 트리스버퍼(Tris-HCl buffer)를 이용하여 pH 8.3으로 조정하여 염화칼슘 수용액을 제조하였다. 그 후 수용액을 5%의 이산화탄소 반응기 내부에서 30℃의 조건으로 800rpm으로 24시간 동안 교반하여 탄산칼슘의 결정화를 유도하여, 자성나노입자 및 폴리에틸렌글라이콜을 함유하는 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체를 제조하였다.
본 발명은 다른 관점에서, 탄산칼슘 결정에 탄산무수화 효소가 이온결합으로 고정되어 있고, 폴리에틸렌글라이콜이 탄산칼슘 결정 내부에 포함되어 타원형 구조를 이루고 있는 것을 특징으로 하는 이산화탄소 변환이 가능한 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체는 비표면적(SBET)은 3.697 m2/ｇ 이며, 총 다공 부피(V)는 0.015㎤/ｇ 이고, 다공크기(pore size)는 dad=16.422㎚ 및 dde=12.498㎚ 값을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 폴리에틸렌글라이콜, 자성나노입자 및 탄산무수화 효소가 복합체를 이룬 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체는 타원형에 가까운 형태로서, 타원형 탄산칼슘 결정에 폴리에틸렌글라이콜이 뼈대를 이루고 탄산무수화 효소와 자성나노입자가 고정화되어 있는 형태이다 (도 1).
상기 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체는 탄산무수화 효소의 글루타민산(Glu) 또는 아스파르트산(Asp) 등의 카복실기가 탄산칼슘 결정의 칼슘이온(Ca 2+)과 이온결합을 형성하고 있으며, 효소의 아미노기(NH3 +)와 탄산칼슘 결정의 탄산이온(CO3 2-)이 이온결합을 형성하여 탄산칼슘 결정에 고정화되어 있으며, 폴리에틸렌글라이콜은 도 1에서와 같이 탄산칼슘 결정 내부에 포함되어 뼈대 역할을 하고 있는 형태이다.
본 발명에서는 H(OCH2CH2)nOH(linear formula)의 조성을 가진 폴리에틸렌글라이콜을 사용하였으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 다른 조성 및 분자량을 가진 폴리에틸렌글라이콜을 사용할 수 있으며, 본 발명의 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체는 폴리에틸렌글라이콜의 조성과 분자량에 따라 탄산칼슘 결정의 구조가 다르게 나타나는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체의 구조를 확인하기 위하여 TEM(Transmission Electron Microscopy)을 이용하여 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체의 크기와 모양을 확인한 결과, 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체는 타원형에 가까운 형태인 것을 확인하였다 (도 3). 또한, DLS(Direct Light Scattering)를 이용하여 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체의 표면적과 표면 구멍의 크기를 확인한 결과, 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체의 비표면적(SBET)는 3.697 m2/ｇ, 총 다공 부피(V)는 0.015㎤/ｇ, 다공크기(pore size)는 dad=16.422㎚, dde=12.498㎚ 값을 보이는 것을 확인하였다 (표 1).
본 발명의 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체의 탄산무수화 효소 활성을 측정하기 위하여 4-니트로페닐 아세테이트(4-nitrophenyl acetate)의 가수분해 반응을 이용하여 탄산무수화 효소 활성을 측정한 결과, 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체의 탄산무수화 효소의 활성을 확인할 수 있었으며, 13회의 재사용에도 효소 활성이 유지되는 것을 확인하였다. 또한, 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체와 free-탄산무수화 효소의 활성을 비교한 결과, free-탄산무수화 효소는 10일 전에 효소의 활성이 대부분 감소했지만, 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체는 50일 이상 효소의 활성이 85% 이상 유지되는 것을 확인하였다 (도 4).
본 발명의 탄산무수화 효소-탄산칼슘 복합체의 탄산무수화 효소를 이용해 수화된 이산화탄소를 탄산칼슘으로 제거할 수 있으므로, 이산화탄소 저감 기술에 응용할 수 있으며, 안정성이 우수해 여러 번의 재사용이 가능한 장점이 있다.
본 발명은 다른 관점에서, (a) 제6항의 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체가 포함된 수용액에 이산화탄소를 수화시켜, 탄산이온(carbonate ion; CO3 2-)을 생성시키는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 반응이 끝난 후에 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체를 제거한 다음, 탄산이온이 포함되어 있는 수용액에 양이온을 첨가하여 탄산염을 생성시키는 단계; 및 (c) 상기 생성된 탄산염을 제거하는 단계를 포함하는 탄산무수화 효소-탄산칼슘 복합체를 이용하여 이산화탄소를 탄산염으로 제거하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는 pH 7 내지 9 및 25℃ 내지 35℃ 조건에서 800rpm 내지 1000rpm의 속도로 교반시켜, 이산화탄소를 수화시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 양이온은, 칼슘이온, 칼륨이온, 나트륨이온, 마그네슘이온 및 암모늄이온 중에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 실시예에서, 본 발명의 탄산무수화 효소-탄산칼슘 복합체를 이용하여 이산화탄소를 탄산이온으로 전환시켰으며, 생성된 탄산이온에 염화칼슘을 첨가하여 탄산칼슘 결정을 생성하여, 탄산무소화 효소-탄산칼슘 복합체를 이용하여 이산화탄소의 제거가 가능한 것을 확인하였다 (도 5).
상기 과정을 통해 본 발명의 탄산무수화 효소-탄산칼슘 복합체를 이용하여 이산화탄소를 탄산염으로 전환시켜 제거 가능한 것을 확인하였으며, 또한 생성된 탄산염은 다양한 산업 분야에 응용될 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정복합체의 제조
1-1 : 자성나노입자의 제조
탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체를 제조하기 위하여, 자성나노입자를 공침(coprecipitation)방법으로 제작하였다. 공침방법은 특정 물질을 침전시킬 때 용해도에 도달하지 않은 다른 종의 물질이나 이온이 함께 침전되는 현상으로, 본 발명의 실시예에서는 0.25 M의 염화 제1철(FeCI2; MW 198.81, Sigma-Aldrich)
및 0.5 M의 염화 제2철(FeCI3; MW 270.30, Sigma-Aldrich)을 혼합한 혼합물에 5 M의 수산화나트륨(NaOH)을 첨가하여 자성나노입자를 제작한 후, 증류수로 여러 번 세척하여 불순물을 제거한 뒤에 실온에 보관하였다. 완성된 자성나노입자의 자성을 확인하기 위해 도 2에서와 같이 자석을 이용해 확인해 본 결과, 자석을 통해 용이하게 분리되는 것을 확인하였다.
1-2 : 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합제의 제조
본 발명의 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체를 제조하기 위해서, 염화칼슘(CaCl2 ;Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 수용액을 이산화탄소 반응기 내에서 노출시켜 탄산칼슘 결정화 반응을 유도하였다.
20mM의 염화칼슘 수용액 20㎖에 상기 실시예 1-1에서 제작한 자성나노입자 100㎕, 폴리에틸렌글라이콜(Polyethtlene glycol,PEG; MW ∼8000, Sigma-Aldrich) 100㎎ 및 탄산무수화 효소(EC 4.2.1.1; from bovine erythrocytes (BCA),Sigma-Aldrich) 0.5㎎을 첨가하고 트리스버퍼(Tris-HCl buffer)를 이용하여 pH 8.3으로 조정하여 염화칼슘 수용액을 제조하였다. 그 후 수용액을 5%의 이산화탄소 반응기(Thermo Forma Series II water jacketed CO2 incubator) 내부에서 30℃의 조건으로 800rpm으로 24시간 동안 교반하여 탄산칼슘의 결정화를 유도하여, 자성나노입자 및 폴리에틸렌글라이콜을 함유하는 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체를 제조하였다.
반응이 끝난 뒤 자석을 이용하여 자성을 가진 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체를 분리하여 증류수로 여러 번 세척하여 불순물 및 남아있는 이온을 제거한 뒤에 100 mM Tris-HCl(pH 8.3)에 담아 4℃에서 보관하였다.
탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합제의 구조
상기 실시예 1에서 제작된 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체의 구조를 확인하기 위하여 TEM(Transmission Electron Microscopy; (Tecnai 12, Philips, Eithoven, The Netherlands) 및 DLS(Direct Light Scattering)을 이용하여 측정을 하였다.
TEM(Transmission Electron Microscopy)을 이용하여 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체의 크기와 모양을 확인한 결과, 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체는 타원형에 가까운 형태인 것을 확인하였다 (도 3). 또한, DLS(Direct Light Scattering)를 이용하여 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체의 표면적과 표면 구멍의 크기를 확인한 결과, 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체의 비표면적(SBET)는 3.697 m2/ｇ, 총 다공 부피(V)는 0.015㎤/ｇ, 다공크기(pore size)는 dad=16.422㎚, dde=12.498㎚ 값을 보이는 것을 확인하였다 (표 1).
탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체(CCCCs)의 평균 표면적 및 표면 구멍의 크기
SBET V dad(average) dde(average)
CCCCs 3.697 m2/ｇ 0.015㎤/ｇ 6.422㎚ 12.498㎚
탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합제의 활성
상기 실시예 1에서 제작된 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체의 탄산무수화 효소 활성을 측정하기 위하여 4-니트로페닐 아세테이트(4-nitrophenyl acetate;Sigma-Aldrich)의 가수분해 반응을 이용하여 탄산무수화 효소 활성을 측정하였다.
4-니트로페닐 아세테이트는 수용액 상에서 자연반응으로 가수분해 되면서 노란색을 띄는데, 탄산무수화 효소는 이 반응을 촉진한다. 적정 농도의 4-니트로페닐 아세테이트를 반응시킨 뒤 노란색으로 수용액의 색이 변하는 정도를 흡광기를 이용하여 측정하면 탄산무수화 효소의 활성을 측정할 수 있다.
그 결과, 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체의 탄산무수화 효소의 활성을 확인할 수 있었으며, 13회의 재사용에도 효소 활성이 유지되는 것을 확인하였다. 또한, 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체와 free-탄산무수화 효소의 활성을 비교한 결과, free-탄산무수화 효소는 10일 전에 효소의 활성이 대대분 감소한 반면, 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체는 50일 이상 효소의 활성이 85% 이상 유지되는 것을 확인하였다 (도 4).
탄산무수화 효소-탄산칼슘 복합제를 이용한 이산화탄소의 제거
상기 실시예 1에서 제작된 탄산무수화 효소-탄산칼슘 복합체를 이용하여 이산화탄소를 탄산염으로 제거하기 위하여, 다음과 같은 실험을 수행하였다.
실시예 1에서 제작된 탄산무수화 효소-탄산칼슘 복합체가 포함된 수용액을 트리스버퍼(Tris-HCl buffer)를 이용하여 pH 8.3으로 조정한 다음, 5%의 이산화탄소 반응기 내부에서 30℃의 조건으로 800rpm으로 1시간 동안 교반하여 이산화탄소를 수화시켰다.
반응기 내부에서 기체상의 이산화탄소는 탄산무수화 효소-탄산칼슘 복합체의 탄산무수화 효소에 의해 가수분해되어 탄산(H2CO3)으로 전환되며, 탄산은 수용액 상에서 수소이온(H+)과 탄산이온(CO3 -)으로 존재하게 된다 (도 5).
CO2 + H2O → H2CO3 → H+ + HCO3 -
HCO3 - ⇔ H+ + CO3 2 -
상기와 같은 반응이 끝난 뒤 자석을 이용하여 자성을 가진 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체를 분리하였으며, 수용액상에 남아있는 탄산이온을 탄산염으로 제거하기 위하여, 염화칼슘(CaCl2)을 첨가하여 탄산칼슘 결정을 형성시켰다.
본 발명에서는 탄산무수화 효소-탄산칼슘 복합체를 이용하여 이산화탄소를 탄산이온으로 전환시킨 다음, 탄산칼슘으로 제거가 가능한 것을 확인하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (11)

  1. 다음의 단계를 포함하는 이산화탄소 변환이 가능한 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체의 제조방법.
    (a) 염화칼슘(CaCl2) 수용액에 폴리에틸렌글라이콜(polyethtlene glycol, PEG) 및 탄산무수화 효소를 첨가한 다음, 여기에 이산화탄소를 수화시켜 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체를 생성시키는 단계; 및
    (b) 상기 생성된 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체를 회수하는 단계.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, (a) 단계는 3부피% 내지 7부피%의 이산화탄소를 수화시켜, 25℃ 내지 35℃ 조건에서 800rpm 내지 1000rpm의 속도로 24시간 내지 48시간 동안 교반시키는 것을 특징으로 하는 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, (a)단계의 염화칼슘 수용액에 자성나노입자를 추가로 첨가하여 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체에 자성분리 기능을 부여하는 것을 특징으로 하는 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체의 제조방법.
  5. 제4항에 있어서, 자성나노입자는 염화 제1철(FeCl2) 및 염화 제2철 혼합물(FeCl2)에 수산화나트륨을 첨가하여 제조된 것을 특징으로 하는 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체의 제조방법.
  6. 탄산칼슘 결정에 탄산무수화 효소가 이온결합으로 고정되어 있고, 폴리에틸렌글라이콜이 탄산칼슘 결정 내부에 포함되어 타원형 구조를 이루고 있는 것을 특징으로 하는 이산화탄소 변환이 가능한 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체.
  7. 제6항에 있어서, 자성나노입자가 추가로 첨가되어 있는 것을 특징으로 하는 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체.
  8. 제6항에 있어서, 비표면적(SBET)은 3.697 m2/ｇ 이며, 총 다공 부피(V)는 0.015㎤/ｇ 이고, 다공크기(pore size)는 dad=16.422㎚ 및 dde=12.498㎚ 값을 가지는 것을 특징으로 하는 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체.
  9. 다음의 단계를 포함하는 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체를 이용하여 이산화탄소를 탄산염으로 제거하는 방법:
    (a) 제6항의 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체가 포함된 수용액에 이산화탄소를 수화시켜, 탄산이온(carbonate ion; CO3 2-)을 생성시키는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계의 반응이 끝난 후에 탄산무수화 효소-탄산칼슘 결정 복합체를 제거한 다음, 탄산이온이 포함되어 있는 수용액에 양이온을 첨가하여 탄산염을 생성시키는 단계; 및
    (c) 상기 생성된 탄산염을 제거하는 단계.
  10. 제9항에 있어서, 상기 (a) 단계는 pH 7 내지 9 및 25℃ 내지 35℃ 조건에서 800rpm 내지 1000rpm의 속도로 교반시켜, 이산화탄소를 수화시키는 것을 특징으로 하는 이산화탄소를 탄산염으로 제거하는 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 (b) 단계의 양이온은, 칼슘이온, 칼륨이온, 나트륨이온, 마그네슘이온 및 암모늄이온 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 이산화탄소를 탄산염으로 제거하는 방법.

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