KR101503461B1

KR101503461B1 - 화학요법제 유발 탈모증의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101503461B1
Application number: KR1020080088475A
Authority: KR
Inventors: 홍준표; 권오병; 김원철; 임선묵; 박민선
Original assignee: 주식회사 대웅
Priority date: 2008-09-08
Filing date: 2008-09-08
Publication date: 2015-03-18
Also published as: KR20100029634A; WO2010027217A3; WO2010027217A9; TW201014614A; WO2010027217A2

Abstract

본 발명은 레시틴(lecithin)을 포함하는 리포좀 막으로 이루어진 나노리포좀으로서, 상기 나노리포좀에 상피세포성장인자가 포접된 나노리포좀을 포함하는 화학요법제 유발 탈모증을 예방 또는 치료하기 위한 국소투여용 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 조성물 및 화학요법제를 각각 개별적으로 투여할 수 있도록 포함하는 복합제제를 제공한다.

Description

화학요법제 유발 탈모증의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating chemotherapeutic agent induced alopecia}

본 발명은 화학요법제 유발 탈모증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 활성성분으로서 상피세포성장인자가 포접된 나노리포좀을 포함하는 화학요법제 유발 탈모증 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

탈모증은 모발 주기 중에서 성장기에 있는 모발 비율이 줄어들고 퇴행기 또는 휴지기의 모발이 많아져 비정상적으로 모발이 빠지는 숫자가 많아지는 것을 일컫는다. 탈모 기전은 아직 정확하게 해명되어 있지 않지만, 탈모의 원인은 대체적으로 호르몬 불균형 등의 내분비계 이상, 자율신경계 이상 및 혈액순환 장애 등 순환계 이상에 의한 과도한 피지 생성, 모근의 영양 결핍, 비듬균 및 기타 세균 등에 의한 두피 기능 저하, 알레르기, 유전적 요인, 노화 등 다양한 원인이 있다.

또한, 다양한 화학요법제의 투여에 의해서도 탈모가 유발되며, 이는 항암 치료의 가장 심각한 부작용 중 하나이다. 화학요법제는 일반적으로 활발히 분열하는 세포에 작용하는 약물이기 때문에, 활발히 신진대사를 하는 기관(골수, 모발, 손톱, 발톱, 피부, 위장관 등)에 부작용을 유발하여 탈모가 유발되는 것이 다(Cassagnol 및 Cohen, US Pharm, 33, 10~18, 2008). 화학요법을 받는 환자의 80%이상은 탈모를 최고의 고민거리로 간주하고 있으며(Macquart-Moulin 등, Br J Cancer ,76, 1640~1645, 1997), 지금까지 화학요법에 의해 유발되는 탈모를 예방 또는 치료할 만한 효과적인 방법은 전혀 알려져 있지 않은 실정이다.

화학요법 후 탈모는 약 2~4주경에 시작되며, 모발은 보통 치료 종료 후 3~6개월 시점에서 자라기 시작한다. 탈모 정도는 사용된 약물, 용량, 및 투여 일정에 따라 달라지며, 탈모를 유발하는 고위험 약물은 사이클로포스파마이드, 독소루비신, 시스플라틴, 시토신 아라비노사이드, 및 에토포사이드 등이다(Botchkarev, JID Symposium Proceedings, 8, 72~75, 2003). 이들 약물은 국소 투여에서도 탈모를 일으킨다. 화학요법을 받은 환자로부터 두피 생검 채취의 윤리적 문제 때문에, 화학요법제에 의한 모낭 세포사의 기전에 대하여 알려진 것이 거의 없으나, 현재까지 알려진 기전은 세포분열이 활발한 성장기 모낭에 작용하여 모낭의 세포사를 유발하거나, 성장기에서 퇴행기로 이행을 촉진하는 것이다(Cassagnol 및 Cohen, US Pharm, 33, 10~18, 2008). 일반적으로, 화학요법 개시 후 2~4 주경에 모간은 성장기 모낭에서 나오자마자 대부분 탈락한다(성장기 탈모증). 화학요법제는 활발히 성장하는 모낭의 체세포 분열 및 대사 과정을 파괴하여, 그 결과 모간이 가늘어지게 되어 탈락하게 된다. 이후, 화학요법에 따른 피부의 모낭은 세포사에 의한 퇴화가 진행되고 이후 휴지기에 이르게 된다(Botchkarev, JID Symposium Proceedings, 8, 72~75, 2003).

상피세포성장인자(Epidermal Growth Factor; EGF)는 탈모증의 예방 또는 치 료에 효과가 있는 것으로 알려져 있다. EGF는 위산 분비 억제작용을 나타내는 유로가스트론(urogastrone)과 동일한 물질인 것으로 알려진 53개의 아미노산과 3개의 이황화물 결합(disulfide bond)을 가진 분자량 6,045 달톤의 폴리펩티드로서, 상피세포와 간엽세포를 포함한 각종 세포들의 유사분열 촉진, 세포성장 촉진 및 위산 분비 억제 등의 활성을 가지고 있어 피부나 각막의 상처 치료제 또는 위궤양 치료 효과가 있는 것으로 보고되어 있는 물질이다(Carpenter, Exp. Cell Res., 164, 1~10, 1986). 이러한 EGF의 탈모증 치료 효과는 여러 특허문헌에 개시되어 있다. 미국특허 5,616,471호 및 미국특허 제 6,113,889호는 모낭 세포의 배양을 위해 배지에 EGF를 포함시킴으로써 모낭 세포의 증식을 증가시키는 방법을 개시하고 있다. 또한, 유럽특허 제1655015호는 소의 양수에서 추출한 EGF와 덱스판테놀(dexpanthenol)과 히알루론산 나트륨 등의 혼합물로 구성된 모발 재생용 조성물을 개시하고 있고, 일본특허공개 제 2003-081866호는 세포성장인자를 포함한 서방성 젤라틴 하이드로겔 제제를 육모제 조성물로서 개시하고 있다. 또한, 일본 특허공개 제2004-284968호는 퀴논 유도체 또는 그 약리적으로 허용할 수 있는 염과 EGF를 함유하는 탈모를 예방용 외용제 조성물을 개시하고 있다. 즉, EGF는 화학요법으로 유도된 탈모증을 포함한 각종 탈모증의 치료에 단독으로 또는 다른 활성물질과 함께 사용될 수 있는 것으로 알려져 있다. 그러나, EGF는 화학요법제의 투여에 의해 유발된 탈모의 예방 또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있을 정도로 충분한 효과를 나타내지 못하고 있는 것으로 알려져 있다.

한편, EGF는 상온에서 특히, 수분 존재 하에서 매우 불안정한 특성을 가지므 로 물리화학적으로 안정화시키는 방법이 필요하다. 또한, EGF는 그 약효 특성상 통상적으로 피부에 국소적용에 의해 투여되므로 피부를 통한 약물의 전달을 보다 효과적으로 하기 위한 방법이 필요하다. 이를 목적으로, 본 출원인은 에스터화된 레시틴을 사용하여 제조된 나노리포좀으로서, 코엔자임 Q10 및/또는 EGF가 포접된 나노리포좀을 개발하여 특허출원을 완료한 바 있다(한국특허공개 2007-0101426). 종래에는, 보습성이 뛰어나고 인체에 무해하여 화장품이나 식품 분야에서 가장 보편적으로 사용하고 있는 레시틴이 높은 소수성으로 인해 나노리포좀을 제조하기 위한 리포이드로서 사용하기 위해서는 70℃ 이상의 고온으로 가열 및 분산시키는 공정이 필요하여, EGF와 같이 고온에서 불안정한 물질을 포집하기 위한 나노리포좀을 제조하기 위해 사용할 수 없었다. 한국특허공개 2007-0101426에서는 레시틴을 에스터화하여 리포좀을 제조함으로써 이러한 문제를 해결할 수 있었다. 그러나, 한국특허공개 2007-0101426에는 EGF를 포함한 나노리포좀이 특히 화학 요법제 유발 탈모증의 치료에 사용될 수 있다는 것은 전혀 개시되어 있지 않다.

이에 본 발명자들은 효과적인 화학 요법제 유발 탈모증의 예방 및 치료제를 개발하기 위해 노력한 결과, 상피세포성자(EGF)를 레시틴(lecithin)을 포함하는 리포좀 막으로 이루어진 나노리포좀에 포접시키면, 탈모증 중에서도 특히 화학 요법제 유발 탈모증의 예방 및 치료에 있어서 현저한 효과를 나타낸다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 화학 요법제 유발 탈모증의 예방 및 치료에 특히 효과가 좋은 의약 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 화학요법제 및 화학요법제 유발 탈모증의 예방 또는 치료에 효과적인 의약 조성물을 각각 개별적으로 투여할 수 있는 복합제제를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 레시틴(lecithin)을 포함하는 리포좀 막으로 이루어진 나노리포좀으로서, 상기 나노리포좀에 상피세포성장인자가 포접된 나노리포좀을 포함하는 화학요법제 유발 탈모증 예방 또는 치료하기 위한 국소투여용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 국소투여용 조성물 및 화학요법제를 각각 개별적으로 투여할 수 있도록 포함하는 복합제제를 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 명세서에서, "포접"이라 함은 리포좀 중앙의 친수성 공간에 수용성 물질을 내포시키거나, 리포좀 지질 이중막에 지용성 물질을 포집시키는 것을 말한다.

"나노리포좀"이라 함은 직경 약 100 ~ 200 nm 크기의 리포좀을 말하며, 통상 수 마이크로미터 크기의 리포좀을 약 1000 psi 이상의 압력 조건에서 분산시켜 제조된 것을 말한다.

본 발명의 조성물은 레시틴을 포함하는 리포좀 막으로 이루어진 나노리포좀에 상피세포성장인자(EGF)를 포접함으로써 얻어지는 나노리포좀을 포함한다. EGF를 레시틴을 포함하는 리포좀 막으로 이루어진 나노리포좀에 포접함으로써, EGF의 탈모증 예방 또는 치료 효과 중에서도 특히, 화학요법제 유발 탈모증의 예방 또는 치료 효과를 현저히 증진시킬 수 있었다. 뿐만 아니라, 본 발명의 조성물은 EGF를 상기 나노리포좀에 포접시킴으로써 상온에서 그리고 수분의 존재 하에서 매우 불안정한 EGF의 안정성도 확보할 수 있었다. 나노리포좀 제조에 사용되는 레시틴은 수소화된 레시틴(hydrogenated lecithin)이나 에스터화 레시틴(esterified lecithin) 등을 사용할 수 있다. 특히 에스터화 레시틴을 사용하여 리포좀을 제조할 경우, 에스터화 레시틴은 수소화 레시틴에 비해 국소 적용시 더 우수한 보습효과를 부여할 수 있으므로 탈모의 예방 또는 치료를 위해 피부에 적용 시 부수적으로 피부에 유익한 역할을 한다.

본 발명의 조성물에 있어서, 상기 상피세포성장인자는 화학요법제 유발 탈모증의 예방 또는 치료에 충분한 함량으로 사용될 수 있으며, 상기 치료학적으로 유효한 양은 화학요법제에 의해 유발된 탈모증의 정도, 환자의 나이, 성별, 감수성 등에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 조성물에 사용되는 EGF의 함량은 나노리포좀 총 중량(단위부피 당 gram 수; 통상 g/mL)에 대해 0.0001 ~ 0.1 중량%(1~1000ug/mL), 바람직하게는 0.001 ~ 0.01 중량%(10~100 ㎍/mL)일 수 있으며, 환부에 1일 1 회 내지 수회 국소 투여할 수 있다.

상기 레시틴을 포함하는 리포좀 막으로 이루어진 나노리포좀으로서, 상기 나노리포좀에 상피세포성장인자가 포접된 나노리포좀은 본 출원인이 출원한 한국특허공개 2007-0101426에 개시된 바에 따라 제조할 수 있으며, 상기 문헌은 전체가 참고로 본 명세서에 원용된다.

상기 리포좀 막은 레시틴을 포함하며, 예를 들어 레시틴은 수소화된 레시틴, 에스터화 레시틴, 또는 이들의 조합 등을 포함한다. 또한, 상기 리포좀 막은 필요에 따라 리포좀 제조에 통상적으로 사용되는 리포좀 막 성분(즉, 리포이드)을 더 포함할 수 있다. 상기 리포이드로는 포스포글리세라이드 포스포글리세라이드(phosphoglyceride) 또는 스핑고지질(sphingolipids) 등을 포함하며, 예를 들어 포스파티딜콜린[phospohatidylcholine, 즉 레시틴], 수소화된 레시틴(hydrogenated lecithin), 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine), 포스파티딜이노시톨(phosphatidylinisitol), 세라마이드(ceramide), 세레브로사이드(cereborsides, 즉 갈락토실 세라마이드), 스핑고마이엘린(sphingomyelin), 강글리오사이드(ganglosides), 또는 이들의 조합 등을 포함한다. 상기 리포이드는 에스터화 레시틴과 마찬가지로 보습효과를 부여할 수 있다. 상기 리포좀 막은 상기 리포이드 중 수소화된 레시틴 및/또는 세라마이드를 포함하는 것이 바람직하다. 상기 수소 화된 레시틴은 레시틴에 포함된 불포화된 탄화수소가 모두 환원되어 포화탄화수소로 이루어진 레시틴을 말한다.

상기 나노리포좀의 리포좀 막에 함유되는 에스터화 레시틴은 물이나 알콜에 분산성이 좋고 소수성과 친수성의 양쪽성을 갖는다. 따라서, 상기 에스터화 레시틴은 수용성 용매에 분산될 정도의 극성을 가지지만 수용성 용매에 완전히 용해될 정도의 큰 극성은 나타내지 않기 때문에 이를 이용하여 리포좀막을 형성할 경우 20℃ 내지 60℃의 낮은 온도에서 안정한 리포좀 용액을 제조할 수 있다.

상기 에스터화 레시틴은 레시틴 또는 수소화된 레시틴을 유기산과 반응시켜 제조할 수 있다. 에스터화 과정은 레시틴의 알코올기와 유기산이 반응하여 물 분자가 제거되는 축합반응으로, 이렇게 형성된 에스터화 레시틴은 수용액에서 물과 반응하여 레시틴(알코올기)과 유기산의 형태로 다시 해리된다. 따라서, 이 반응은 산도에 따라 다음과 같은 해리반응의 적절한 평형을 유지하면서 에스터화된 레시틴, 레시틴(또는 수소화된 레시틴), 및 유기산 형태로 공존하게 된다.

RCOOR'(에스터화 레티신) ⇔ RCOOH(유기산) + R'OH (레시틴 또는 수소화된 레시틴)

상기 에스터화 레시틴의 제조에 사용되는 유기산으로는 초산, 말산, 락트산, 글리콜산, 시트르산, 또는 옥살산 등 화장품이나 식품에 통상적으로 사용되는 유기산을 포함하며, 바람직하게는 무수 유기산을 포함한다. 더욱 바람직하게는 무수 말산 또는 무수 초산을 사용할 수 있다. 무수 초산을 사용할 경우, 무수 말산을 사용할 경우보다 에스터화 레시틴이 더 큰 친수성을 갖게 된다. 상기 리포좀에 포 접되는 EGF의 상대적인 양에 따라 유기산을 적절하게 선택할 수 있다. 이들 유기산은 피부에 적용 시 각질제거 효과나 피부 연화 효과 등을 나타낼 수도 있다.

에스터화 레시틴의 사용량은 리포좀을 형성할 수 있는 정도의 양이라면 특별히 제한되는 것은 아니나, EGF 1 중량부에 대해 약 1 내지 5 중량부일 수 있다.

상기 나노리포좀은 분산제로서 트리글리세라이드계 유기 화합물(예: 카프리릭/카프릭 트리글리세라이드); 음이온성 계면활성제(예: 디에틸아민 세틸포스페이트, 포스파티딜콜린 소듐염 또는 트리에틸아민 코코닐 글루타민 나트륨); 연화제(예: 부틸레이티드 히드록시 톨루엔), 베테인계 양쪽성 계면활성제(예: 롤리아민프로필베테인, 롤릴베테인 또는 코카미도 프로필베테인); 또는 킬레이팅제(예: 에틸렌디아민테트라아세테이트 나트륨염) 등을 하나 이상 추가로 포함할 수 있다.

상기 나노리포좀의 구체적인 제조방법은 한국특허공개 2007-0101426에 개시된 바에 따라 제조할 수 있다. 즉, 상기 나노리포좀의 제조방법은 레시틴을 유기산과 반응시켜 에스터화 레시틴을 제조하는 제1단계; 상기 에스터화 레시틴 및 EGF을 용매에 용해시키는 제2단계; 및 상기 제조된 용액을 나노크기의 리포좀으로 분산시키는 제3단계를 포함할 수 있다.

제1단계에서, 에스터화 레시틴은 레시틴을 유기산 중에서 축합반응시켜 제조한다. 여기서, 유기산은 바람직하게는 초산, 말산, 락트산, 글리콜산, 시트르산, 및 옥살산으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.

상기 에스터화 레시틴 및 EGF을 용매에 용해시키는 제2단계는, 에스터화레시틴을 유기용매에 용해시켜 유상용액을 제조하는 단계; EGF를 수용매에 용해시켜 수 상용액을 제조하는 단계; 및 상기 제조된 유상용액 및 수상용액을 혼합하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 유상용액의 제조단계에서, 유기용매는 특별히 제한되는 것은 아니지만, 에탄올을 사용할 수 있다. 상기 유상용액의 제조 시에는, 필요할 경우 유기용매에 수소화된 레시틴; 카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드와 같은 친수성의 트리글리세라이드계 유기화합물; 디에틸아민 세틸포스페이트, 아스코르빌 포스페이트 나트륨, 포스파티딜 콜린, 또는 트리에틸아민 코코닐 글루타민 나트륨과 같은 음이온 계면활성제; 또는 부틸레이티드 히드록시 톨루엔과 같은 연화제를 추가로 가할 수 있다.

상기 수상용액의 제조단계에서는, 순수한 물에 EGF 등의 친수성 활성성분을 용해시켜 수상용액을 제조할 수 있다. 필요할 경우, 디에틸아민 세틸포스페이트, 아스코빌 포스페이트 나트륨, 포스파티딜콜린 또는 트리에틸아민 코코닐 글루타민 나트륨과 같은 음이온 계면활성제, 또는 에틸렌디아민테트라아세테이트 나트륨과 같은 킬레이팅제를 추가로 가하여 수상용액을 제조할 수 있다.

상기 에스터화 레시틴 및 EGF를 용매에 용해시키는 과정은 20℃ 내지 60℃의 온도에서 수행할 수 있다. 온도가 20℃ 보다 낮을 경우 용해는 되지만 용해되는 시간이 길고 용해된 후에도 안정성에 문제가 있으며, 60℃ 보다 높을 경우에는 EGF가 불안정해질 수 있다.

상기 제조된 유상용액과 수상용액은 혼합 후, 호모믹서 교반기를 사용하고 균일하게 교반한다. 이 때, 균일 혼합된 리포좀 용액 중의 리포좀은 마이크로미터 크기의 입도를 나타낸다.

제3단계에서, 제2단계에서 균일 교반된 혼합 용액을 약 1000 psi 이상의 압력조건에서 마이크로플루다이저(M/F)를 1 회 이상 통과시켜서 나노크기의 리포좀으로 분산시켜 나노리포좀 용액을 제조한다. 압력이 약 1000 psi 보다 작을 경우, 나노 크기의 리포좀을 형성하기 곤란할 수가 있다. 마이크로플루다이저를 통과시키는 횟수는 2 회 이상 처리하는 것이 더욱 바람직하다.

상기와 같이 제조된 나노리포좀 용액의 리포좀은 수용액 중에서 수상/유상의 리포좀을 형성함으로써 가장 내부에 있는 수상에 존재하는 EGF를 안정화시킬 수 있다.

본 발명의 조성물은 국소투여에 적절한 제형으로 제제화될 수 있으며, 예를 들어 국소용 액제, 연고제, 로션제, 크림제 등으로 제제화될 수 있다. 제제화 시 필요에 따라, 아미노산, 중아황산나트륨, 메타중아황산나트륨, 아황산나트륨, 에틸렌디아민테트라초산디나트륨, 소듐바이설파이드, 소듐포름알데히드 설폭실레이트, 티오유레아, 아세톤소듐바이설파이트 등의 안정화제, 세라마이드, 글리세린, 프로필렌글리콜, 암모늄 알지네이트, 사이클로메치콘, 디메치콘, 폴리덱스트로오스, 소듐히알루로니데이트, 소듐락테이트, 솔비톨, 트리아세틴, 트리에탄올아민, 자일리톨 등의 보습제, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트류 등의 유화제, 안식향산나트륨, 파라옥시안식향산메칠, 파라옥시안식향산(이소)프로필, 파라옥시안식향산(이소)부틸, 솔비산, 솔빈산칼륨, 솔빈산나트륨, 디하이드로초산, 디하이드로초산나트륨, 염화벤잘코늄, 염화벤젠토늄, 페놀, 크레졸, 클로로크레졸, 벤질알콜 등 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제를 포함할 수 있으며, 이러한 담체 및 첨가제에 대해서는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세하게 기재되어 있다.

본 발명의 화학요법제 유발 탈모증 치료용 조성물은 제제화되어 단독으로 시중에 유통될 수도 있으나, 탈모증 유발 화학요법제의 탈모 예방 또또는 치료에 편리하게 사용할 수 있도록 화학요법제와 함께 포장되어 유통될 수도 있다.

따라서, 본 발명의 다른 일 측면에 따르면, 본 발명은 상기 화학요법제 유발 탈모증 치료용 조성물 및 화학요법제를 각각 개별적으로 투여할 수 있도록 포함하는 복합제제를 제공한다. 이러한 복합제제는 탈모증 유발 화학요법제의 투여 전에 탈모증의 예방을 위해 또는 화학요법제 투여 후 발생되는 탈모증의 치료를 위해, 화학요법제와 함께 포장된 탈모증 치료용 국소투여용 조성물을 환자에게 바로 편리하게 적용할 수 있어 바람직하다.

상기 복합제제에 포함될 수 있는 화학요법제는 탈모 유발이 가능한 임의의 화학요법제이며, 예를 들어 대사길항제(antimetabolites), 알킬화제(alkylating agents), 토포아이소머라제 길항제(topoisomerase inhibitors), 미세소관 길항제(anti-microtubule agents), 항암 항생제(antitumor antibiotics), 또는 식물유래 알칼로이드(plant alkaloids)등이 있다. 구체적으로, 예를 들면 독소루비신, 사이클로포스포마이드, 시스플라틴, 시토신 아라비노사이드, 에토포사이드, 닥티노마이신, 도노루비신, 도시탁셀, 이다루비신, 이포스파마이드, 이리노테칸, 파클리탁셀, 토포테칸, 블레오마이신, 메클로레타민, 메토트렉세이트, 에피루비 신(epirubicin), 이포스파마이드(ifosphamide), 빈데신(vindesine),비노렐빈(vinorelbine), 암사크린(amsacrine), 멜팔란(melphalan), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 젬시타빈(gemcitabine), 5-플루오로우라실, 부술판(busulphan), 로무스틴(lomustine), 또는 티오테파(thiotepa) 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

앞서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 레시틴을 포함하는 리포좀으로 이루어진 나노리포좀에 EGF를 포접시킴으로써, EGF의 탈모증에 대한 효과 중에서도 특히 화학요법제 유발 탈모증에 대한 예방 및 치료 효과가 당업자가 예측할 수 없을 정도로 현저히 향상되어 종래 화학요법제의 대표적 부작용인 탈모증에 효과적인 조성물을 제공할 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 수소화 레시틴을 사용한 EGF를 함유 나노리포좀의 제조

(1) 유상용액의 제조

에탄올 200 g에 수소화된 레시틴 40.0g, 카프릴릭/키프릭 트리글리세리드 200g, 디에틸아민 세틸 포스페이트 6.0g, 부틸레이티드 히드록시 톨루엔 10.0g을 첨가하고 약 60℃로 가열하여 교반하면서 녹인 후 상온으로 냉각시켜 유상용액을 제조하였다.

(2) 수상용액의 제조

정제수 1541.5g에 Na₂-EDTA 1.0g, 히스티딘(Histidine) 1.0g 및 EGF 0.5g을 첨가하고 상온에서 교반하면서 완전히 녹여 수상용액을 제조하였다.

(3) 나노리포좀 EGF의 제조

상기 제조된 수상용액을 유상용액에 첨가하고 호모믹서로 5분 이상 충분히 교반하여 균일하게 혼합되도록 하였다. 제조한 혼합용액을 최소 1200 psi 이상의 압력으로 마이크로플루다이저(microfluidizer)를 사용하여 1회 이상 통과시켜 나노 크기의 리포좀으로 분산시킴으로써 나노리포좀 EGF 용액을 제조하였다. 통과 시에는 냉각수로 상온 이하의 온도가 되도록 하였다.

실시예 2: 에스터화 레시틴을 사용한 EGF 함유 나노리포좀 제조

(1) 에스터화 레시틴 제조

수소화 포화탄화수소 레시틴 31g을 테트라하이드로퓨란 용액 200g에 70℃의 온도로 가열하여 녹였다. 레시틴이 맑게 완전히 용해된 다음 무수 말릭산 3g이나 무수 초산 2.5g을 첨가하여 용해시켰다. 충분히 맑게 용해된 후에 촉매로서 알킬 아민이나 알코올 아민을 0.5g 첨가하여 순환 환류 냉각시키면서 3시간이상 반응을 지속하였다. 반응이 완료된 다음 45℃에서 진공 건조시켜서 흰색 분말 상태의 에스 터화 레시틴을 수득하였다.

(2) 유상 용액의 제조

에탄올 110g에 에스터화 레시틴 30g, 카프릴릭/키프릭 트리글리세리드 200g, 디에틸아민 세틸 포스페이트 10g, 부틸레이티드 히드록시 톨루엔 0.5g을 첨가하고 약 40℃로 가열하여 교반하면서 녹인 후 상온으로 냉각시켜 유상용액을 제조하였다.

(3) 수상용액의 제조

Na-EDTA 0.5g, 아스코빌 포스페이트 나트륨(NAP) 1.0g 및 EGF 1.0g을 상온에서 교반하면서 정제수 650g에 완전히 녹여 수상용액을 제조하였다.

(4) 나노리포좀 EGF의 제조

상기 제조된 수상용액을 유상용액에 첨가하고 호모믹서로 5분 이상 충분히 교반하여 균일하게 혼합되도록 하였다. 제조한 혼합용액을 최소 1000 psi 이상의 압력으로 마이크로플루다이저를 사용하여 2회 이상 통과시켜 나노 크기의 리포좀으로 분산시킴으로써 나노리포좀 EGF 용액을 제조하였다. 통과 시에는 냉각수로 상온 이하의 온도가 되도록 하였다.

시험예 1: 제제 안정성 평가

상기 실시예 1(수소화 레시틴을 이용 경우) 및 실시예 2(에스터화 레시틴을 이용한 경우)에서 각각 제조한 나노리포좀 용액의 평균 입자 크기 및 상온에서 장시간 방치하였을 경우에 나타나는 겔화 현상을 비교하여 하기 표 1에 나타내었다. 또한, 용액 중 입자간의 입도 차이로 인해 보다 큰 입자상에 물질이 침착되어 입자가 성장하는 기전의 하나인 입자성장현상(Ostwald ripening)을 평가하였다(Ostwald W, Z. Phys. Chem., 34,495~503, 1900). 리포좀 용액을 장시간 방치하면 일반적으로 응집현상에 의해 겔화 현상이 나타나는데, 용액을 다시 교반하여도 재차 분산, 용해되지 않는 시점을 겔화 시점으로 하였다.

[표 1]

상기 표 1에서 보는 바와 같이, 시험예 1과 시험예 2 모두 유사한 안정성을 가지고 있음을 확인하였으며, 8주 동안 방치하였을 때에도 입자성장 현상은 관찰되지 않았다. 그러므로 상기 실시예 1에서 제조된 나노리포좀은 안정성이 우수하다고 판단된다.

시험예 2: 랫트 vibrissa 모낭 성장에 대한 EGF의 효과

생후 3주령인 Wistar 랫트 수컷으로부터 모낭을 분리, 배양하여 실험에 사용하였다. 24 웰 플레이트의 각 웰에 2 mM L-글루타민(Gibco Inc., NY, USA), 10 ug/mL 인슐린(Sigma, MO, USA), 50 nM 하이드로코르티손(Sigma, MO, USA), 100 유닛/mL 페니실린, 및 100 ㎍/mL 스트렙토마이신(Gibco Inc., NY, USA)을 포함하는 500 ㎕의 William E 배지(Gibco Inc., NY, USA)를 넣고, 웰 당 모낭 하나씩을 넣어 서 37℃, 5% CO₂ 항온기에서 배양하였다. 이때, EGF를 0.1, 0.3, 1 또는 10 ng/mL 농도로 처리하였고, 양성 대조물질인 황산미녹시딜(minoxidil sulfate; Sigma, USA)을 1 μM 농도로 처리하였고, 배양 중에 배지는 3일마다 교환하였다. 이미지 분석장치(Olympus, Japan)를 사용하여 배양 후 1일째 및 17일 째 모낭의 길이를 측정하여 모낭의 성장 정도를 확인하였다. 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

[표 2]

상기 표 2의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 1 ng/mL EGF를 처리하였을 때가 대조군에 비해 유의적으로 38% 향상된 모낭 성장 효과를 나타내었다.

시험예 3: 랫트 vibrissa 모유두세포 증식에 대한 EGF의 효과

랫트 vibrissa 모유두 세포를 100 유닛/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 10% FBS(Gibco Inc., NY, USA)가 함유된 DMEM(Hyclone Inc, USA) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 항온기에서 배양하였으며, 3 일에 한번씩 계대 배양하였다. 모유두 세포를 96-웰 플레이트에 넣고 24 시간 배양 후 무혈청 DMEM 배지로 교환하고 24시간 배양한 다음 약물을 처리하였다. 4 일 동안 배양한 다음 MTT 어세이(Sigma, MO, USA)를 이용하여 모유두세포의 증식을 측정하였다. 이때, EGF는 0.1, 0.3, 1 및 10 ng/mL 농도로, 양성대조물질인 황산미녹시딜(minoxidil sulfate; Sigma, USA)은 1 μM 농도로 사용하였다. 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

[표 3]

상기 표 3의 결과에 따르면, 0.3 및 1 ng/mL EGF를 처리하였을 때가 대조군에 비해 유의적으로 26% 향상된 모유두 세포 증식 효과를 나타내었다_.

시험예 4: 화학요법제에 의해 유발된 랫트 탈모 모델에서 탈모 예방 효과

화학요법제 투여에 따른 탈모 예방 효과를 평가하기 위하여 SD 랫트 1일령을 사용하여 시험하였다. 각 랫트의 체중을 측정하고 평균을 산출하여 각 군당 11 마리를 할당하여 군을 배정하였다. 생후 1~5일 및 8~38일까지 약물을 1일 2회 혹은 6회 국소 도포하여 생후 38일까지 관찰하면서 탈모 면적을 측정하였다. 이때 화학요법제인 에이디마이신(doxorubicin, 보령제약, 한국)을 생후 8일째 랫드에 4 mg/kg 용량으로 복강 투여하여 탈모를 유발하였다. 또한, 면역조직화학 염색 분석을 통하여 투약 기간 중 EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)의 변화 및 세포증식에 대한 영향을 평가하였다. 시험이 진행되는 동안 적절한 시점에서 투약 부위 조직을 적출하여 분석시료로 사용하였다. 세포증식표식인자인 Ki-67에 대한 마우 스 유래 항-Ki-67 랫트 항체(Dako, Denmark)를 사용하여 모낭 기저 내 증식하는 세포 비율을 측정하였다. 또한, 항-EGFR 랫트 항체(Cell Signaling Technology, USA)를 사용하여 EGFR을 분석하였다. 이때 탈모 면적을 포함한 모든 데이터의 정량화는 이미지 분석기(Image measurement standard v4.01, Bersoft, Dominica)를 이용하여 측정하여 평가하였다. 상기 약물로서는 EGF 또는 상기 실시예 2에서 제조된 나노리포좀(nanoEGF)를 사용하였다. 탈모면적의 평가 결과를 하기 표 4 및 도 1에 나타내었다. 또한, 각 시험군에서의 탈모 부위를 육안으로 관찰하여 촬영한 사진을 도 2에 나타내었다. 그리고, EGFR의 변화를 도 3에 나타내고, 세포증식에 대한 분석 결과를 도 4에 나타내었다.

[표 4]

상기 표 4, 도 1, 및 도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, nanoEGF는 매우 뛰어난 탈모 예방 효과를 보여 주었다. EGF의 농도가 높은 경우(50 ㎍/mL > 10 ㎍/mL), 그리고 EGF의 도포 회수가 많은 경우(6회 > 2회)에 더 우수한 탈모 예방 효과를 보였다(표 4 및 도 1). 또한 nanoEGF가 나노리포좀화 되지 않은 EGF 단순 제형보다 효과가 현저히 탁월하였다.

또한, 도 3 및 4의 세포증식 및 EGFR의 분석 결과에서 알 수 있는 바와 같이, EGF를 처치한 시험군에서만 세포증식 및 EGFR 발현이 증가되었으며, 탈모 예방은 모낭 기저 내 세포증식이 촉진되고 EGFR 발현이 증가된 것과 상관성이 있는 것으로 확인되었다. 따라서, EGF는 EGFR 발현을 증가시키고 모낭 기저 세포 증식을 촉진시킴으로써 화학요법제에 의해 유발되는 탈모를 예방하는 것이다.

시험예 5: EGF 안정성 평가

나노리포좀화 시 EGF의 안정성을 평가하기 위하여, EGF 용액(10mM 인산완충액, pH7.4), 실시예 2에 따른 nanoEGF 용액을 40℃, 75% RH 가혹조건에 보관하면서 3 개월간 상대적인 안정성을 비교하였다. ELISA 방법(human EGF Quantikine ELISA kit[Cat. No. DEG00], R&D Systems)을 이용하여 잔류 함량을 분석하였으며, 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

[표 5]

상기 표 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 나노리포좀에 봉입된 EGF의 안정성이 EGF 용액에 비해 유의성 있게 현저히 증가하였음을 알 수 있다.

또한, 냉장조건(4℃)에서 48 주 동안 nanoEGF의 안정성을 상기 방법과 동일한 방법으로 평가하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타난 바와 같이, nanoEGF는 48 주까지 95%의 함량을 유지하였다.

도 1는 화학요법제 독소루비신에 의한 SD 랫드 탈모 유발 모델에서 나노리포좀화 EGF(nanoEGF)의 탈모 예방 효과를 무처치군, 음성대조군, EGF 용액과 비교하여, 탈모 면적으로서 평가한 결과를 나타낸 그래프이다:

무처치군(-x-); 음성대조군(-■-), 매체 투여; 시험군 1(-△-), EGF(10 ㎍/mL) 2회/일 처치; 시험군 2(-▲-), EGF(50 ㎍/mL) 2회/일 처치; 시험군 3(-○-), nanoEGF(10 ㎍/mL) 2회/일 처치; 시험군 4(-●-), nanoEGF (50 ㎍/mL) 2회/일 처치; 시험군 5(-◇-), nanoEGF(10 ㎍/mL) 6회/일 처치; 시험군 6(-◆-), nanoEGF(50 ㎍/mL) 6회/일 처치.

도 2는 화학요법제 독소루비신에 의한 SD 랫드 탈모 유발모델에서 nanoEGF의 탈모 예방 효과를 무처치군, 음성대조군, EGF 용액과 비교하여 육안으로 관찰하여 촬영한 사진이다.

도 3은 화학요법제 독소루비신에 의한 SD 랫드 탈모 유발모델에서 약물 처치에 따른 EGFR의 프로파일을 무처치군, 음성대조군, EGF 용액과 비교하여 분석한 결과를 나타내 그래프이다:

무처치군(-○-); 음성대조군(-▲-), 매체 투여; 시험군 1(-■-), EGF(10 ㎍/mL) 6회/일 처치; 시험군 2(-●-), nanoEGF (50 ㎍/mL) 6회/일 처치; 정상 동물군(-△-).

도 4는 화학요법제 독소루비신에 의한 SD 랫드 탈모 유발모델에서 약물 처치에 따른 세포증식(Ki-67 표식인자)에 미치는 영향을 무처치군, 음성대조군, EGF 용 액과 비교하여 분석한 결과를 나타내 그래프이다:

무처치군(-○-); 음성대조군(-▲-), 매체 투여; 시험군 1(-■-), EGF(10 ㎍/mL) 6회/일 처치; 시험군 2(-●-), nanoEGF (50 ㎍/mL) 6회/일 처치; 정상 동물군.

도 5는 냉장조건에서 nanoEGF의 안정성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

Claims

레시틴(lecithin)을 포함하는 리포좀 막으로 이루어진 나노리포좀으로서, 상기 나노리포좀에 상피세포성장인자(Epidermal Growth Factor)가 포접된 나노리포좀을 포함하는, 화학요법제 유발 탈모증을 예방 또는 치료하기 위한 국소투여용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 리포좀 막에 포함된 레시틴이 수소화된 레시틴(hydrogenated lecithin), 에스터화 레시틴(esterified lecithin), 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 조성물.
제2항에 있어서, 상기 에스터화 레시틴을 포함하는 리포좀 막이 수소화된 레시틴(hydrogenated lecithin), 세라마이드, 또는 이들의 혼합물을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제2항에 있어서, 상기 에스터화 레시틴은 레시틴 또는 수소화된 레시틴과 유기산의 반응 생성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제4항에 있어서, 상기 유기산은 초산, 말산, 락트산, 글리콜산, 시트르산, 또는 옥살산인 것을 특징으로 하는 조성물.
제2항에 있어서, 상기 에스터화 레시틴을 포함하는 나노리포좀이 음이온성 계면활성제, 트리글리세라이드계 유기 화합물, 연화제, 킬레이팅제, 및 양쪽성 계면활성제로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화학요법제는 대사길항제, 알킬화제, 토포아이소머라제 길항제, 미세소관 길항제, 항암 항생제, 또는 식물유래 알칼로이드인 것을 특징으로 하는 조성물.
제7항에 있어서, 상기 화학요법제는 독소루비신, 사이클로포스포마이드, 시스플라틴, 시토신 아라비노사이드, 에토포사이드, 닥티노마이신, 도노루비신, 도시탁셀, 이다루비신, 이포스파마이드, 이리노테칸, 파클리탁셀, 토포테칸, 블레오마이신, 메클로레타민, 메토트렉세이트, 에피루비신(epirubicin), 이포스파마이드(ifosphamide), 빈데신(vindesine),비노렐빈(vinorelbine), 암사크린(amsacrine), 멜팔란(melphalan), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 젬시타빈(gemcitabine), 5-플루오로우라실, 부술판(busulphan), 로무스틴(lomustine), 또는 티오테파(thiotepa)인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 조성물 및 화학요법제를 각각 개별 적으로 투여할 수 있도록 포함하는 복합제제.
제9항에 있어서, 상기 화학요법제는 독소루비신, 사이클로포스포마이드, 시스플라틴, 시토신 아라비노사이드, 에토포사이드, 닥티노마이신, 도노루비신, 도시탁셀, 이다루비신, 이포스파마이드, 이리노테칸, 파클리탁셀, 토포테칸, 블레오마이신, 메클로레타민, 메토트렉세이트, 에피루비신(epirubicin), 이포스파마이드(ifosphamide), 빈데신(vindesine),비노렐빈(vinorelbine), 암사크린(amsacrine), 멜팔란(melphalan), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 젬시타빈(gemcitabine), 5-플루오로우라실, 부술판(busulphan), 로무스틴(lomustine), 또는 티오테파(thiotepa) 인 것을 특징으로 하는 복합제제.