KR101495275B1 - 폐암 진단 및 치료를 위한 표적 단백질 - Google Patents

폐암 진단 및 치료를 위한 표적 단백질 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 폐암 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 유효성분을 포함하는 폐암 진단 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, APOO(Apolipoprotein O), ATP1A1(ATPase, Na+/K+ transporting, alpha 1 polypeptide), CANX(calnexin) 및 DDOST(dolichyl-diphosphooligosaccharide-protein glycosyltransferase)로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 표적 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 물질을 유효성분으로 포함하는 폐암 진단 또는 치료용 조성물을 제공한다. 상기 표적 폴리펩티드는 폐암 조직 또는 세포에서 특이적으로 과발현되므로 폐암의 진단 또는 치료용 표적 물질로서 적합할 뿐만 아니라, 세포의 표면에서 발현되는 막 단백질이므로 비침습적인 방법으로도 쉽게 검출될 수 있는 바, 폐암의 진단 및 치료를 위한 표적 물질로서 유용하게 이용될 수 있다.

Description

폐암 진단 및 치료를 위한 표적 단백질{Target protein for both diagnosis and treatment of lung cancer}
본 발명은 폐암의 진단 및 치료를 위한 표적 단백질에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 신규한 폐암 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 물질을 유효성분으로 포함하는 폐암 진단 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
폐암이란 폐에 생긴 악성 종양을 말하는 것으로서, 크게 암세포가 기관지나 폐포에서 처음 발생한 원발성 폐암과 암세포가 다른 기관에서 생겨나 혈관이나 림프관을 타고 폐로 이동해 자라는 전이성 폐암으로 나눌 수 있다. 조직학적으로 크게 비소세포폐암(NSCLC, non small cell lung cancer)과 소세포폐암(SCLC, small cell lung cancer)으로 분류되고, 비소세포폐암이 전체 폐암분포의 75%를 차지하고 있다. 상기 비소세포폐암(NSCLC)은 다시 선암(adenocarcinoma), 편평상피세포암(squamous cell carcinoma), 대세포암(large cell carcinoma)으로 분류되고, 이 중 선암이 점차적으로 높은 빈도를 보이고 있다. 특히, 폐암은 20세기에 들어 흡연이 보편화되면서 급격하게 늘기 시작하였고, 우리나라의 경우, 2008년에 발표된 한국중앙암등록본부 자료에 의하면 2003-2005년 우리나라 연 평균 암 발생 중 폐암은 남녀를 합쳐서 전체 암 발생의 12.1%로 2위를 차지하고, 인구 10만 명당 조발생률은 33.2건이나 될 정도로 급격하게 늘고 있다. 남녀의 성비는 3.83:1로 남자에게서 더 자주 발생하였고, 발생건수로는 남성의 암 중에서 2위를 차지하였고, 여성의 암 중에서 5위를 차지하였다. 남녀를 합쳐서 본 연령대별로는 60대가 34.3%로 가장 많고, 70대가 31.0%, 50대가 14.6%의 순이다(보건복지가족부 중앙암등록본부 2008년 10월 15일 발표 자료). 더욱이 흡연인구의 증가와 대기 오염 등의 원인으로 우리나라에서도 급속히 증가하고 있는 종양이며 암의 종류별 사망률은 21.4%로 1위이고, 남자에게서는 24.9%, 여자 15.1%로 각각 1위, 2위이다(2006년 사망원인통계연보, 통계청).
폐암은 암세포의 성장으로 인한 주변 조직 침범 또는 기도폐쇄, 림프절 전이 등의 증상을 초래하는 것이 보통이지만, 환자의 10-15% 정도는 아무런 증상 없이 정기 검진에서 진단된다. 또한, 대부분의 폐암이 진단 당시에 상당히 진행된 상태로 진단되므로 완치가 어려운 경우들이 대부분이라는 문제가 있다. 따라서 폐암을 조기에 진단하여 폐암으로 인한 사망률을 줄이는 것이 시급한 문제이다.
폐암을 진단하기 위해서 여러 가지 방법이 사용되고 있는데, 현재까지는 종양의 크기를 측정하고, 림프절로의 전이 유무를 조사하거나, 폐 종양 조직이나 림프절 등을 생검하여 면역조직화학방법으로 분석하거나 흉부 전산화 단층 촬영, 기관지 내시경 등을 이용하고 있다. 그러나, 흉부단층 촬영의 경우 폐암의 크기가 약 0.1 cm 이상 되어야 측정가능한데, 이 시기는 이미 암이 다른 조직으로 전이되었을 가능성이 높으며, 내시경이 기관지로 삽입되어 폐 내부를 직접 관찰할 수 있는 기관지 내시경 방법은 폐 말단에 있는 종양을 관찰하기 곤란한 한계를 가지고 있다.
이러한 문제점에 대하여, 폐암의 마커들을 이용하여 암을 진단하기 위한 시도들이 진행되고 있다. 현재까지 유전체 혹은 단백체 분석기술을 이용하여 암 특이적 바이오마커를 개발하고자 하는 시도는 DNA 바이오마커나 혈액 내 마커 단백질에 대부분 집중되어, 폐암조직(혹은 폐암세포)과 정상조직(혹은 정상세포), 혹은 폐암환자 체액(혈액 포함)과 정상인 체액에서 달리 발현되는 유전체 혹은 단백체를 대상으로 진행되는 형태가 대부분이었다. DNA 바이오마커의 경우, cDNA 마이크로어레이를 이용한 데이터는 미국 국립 암연구소(National Cancer Institute)에서 암 특이적 발현 유전자에 대한 데이터베이스를 웹을 통하여 공개하고 있을 만큼 많은 연구가 진행되어있으며(http://www.cancer.gov), 또한 일부 암 특이적인 단백질에 대하여 목표지향적인 치료제의 개발 혹은 진단용 마커로 개발되고 있기도 하지만(http://www.clinicaltrial.gov), 지금까지 개발된 폐암의 바이오마커로는 프로모터 인자 과메틸화나 K-ras, p53의 돌연변이와 같이 DNA 바이오마커로서 가능성이 있는 것들이 대부분이다. 다른 한편, '피 한 방울로 암을 조기에 진단 한다'는 목표 아래 주로 혈액 내에서 암특이적 발현을 보이는 마커 단백질을 찾는데 연구가 활발히 진행되어, 조직 등에서 발굴한 암배 항원(CEA, carcinoembryonic antigen), CYFRA21-1, 플라스마 칼리크레인 B1(KLKB1), 뉴런 특이성 엔올라제와 같은 단백질 바이오마커가 폐암에 활용할 수 있는 바이오마커로 발견되었지만, 아직까지 임상적으로 유용하게 사용되고 있지는 못하고 있다.
상기와 같이, 종래 밝혀진 DNA 바이오마커나 혈액 내 단백질마커가 임상적으로 적용되지 못하고 있는 이유는 (1)특정 조직의 정상 부위 대 질환부위에 대한 DNA 마이크로어레이 등을 통한 유전자 발현 분석의 경우 유전자의 증감이 직접적으로 단백질의 발현의 문제로 연결되지 않는 경우가 많으며, (2)혈액 단백질의 경우 시료 채취가 쉬운 장점은 있지만 특정한 조직의 상태를 반영한다고 보기에 너무 전신적인(systemic) 문제가 많고, 혈액 내의 풍부 단백질(abundant protein)의 배제가 까다로운 문제(전체 단백질의 99%가 22종의 단백질임)가 있어 특정 질환의 마커로 일반화시킬 수 없는 문제가 있다. 또한, (3)세포 내부에 존재하는 단백질 및 유전자를 바이오마커로 개발하는 경우 비침습적인 진단 방법으로 개발하기 어렵고, 치료용 표적물질로의 개발 역시 별도의 약물전달체가 필요하게 되는 등의 문제가 있다. 상기와 같은 문제점에 대하여, 기본적으로 폐암 조직(또는 세포)에서만 특이적으로 발현되면서도, 비침습적으로 검출할 수 있어 폐암만의 특이적인 바이오마커의 개발이 절실함에도 불구하고, 아직까지 임상적으로 유용하게 이용될 만한 폐암 바이오마커는 발견되지 않고 있는 실정이다.
본 발명의 목적은 폐암 조직 또는 세포에서만 특이적으로 발현되면서도 비침습적으로 검출할 수 있는 폐암의 진단 또는 치료를 위한 신규한 표적 단백질 및 이에 특이적으로 결합하는 유효성분을 포함하는 폐암 진단 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 APOO(Apolipoprotein O), ATP1A1(ATPase, Na+/K+ transporting, alpha 1 polypeptide), CANX(calnexin) 및 DDOST(dolichyl-diphosphooligosaccharide-protein glycosyltransferase)로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 포함하는 폐암 진단용 조성물을 제공한다.
또한 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 다른 측면은 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 폐암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST 폴리펩티드는 폐암 조직 또는 세포에서 특이적으로 과발현되므로 폐암의 진단 또는 치료용 표적 물질로서 적합하다. 또한, 상기 4종의 바이오마커는 세포의 표면[보다 상세하게는, 세포막의 외측 표면(outer cell membrane surface)]에 위치하는 막 단백질이므로 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 물질을 처리하면, 비교적 용이하게 상기 단백질에 결합하여 검출 또는 조절할 수 있다. 즉, 상기 4종의 바이오마커에 결합하는 물질은 CPP(cell penetrating peptide)의 도움 없이도 상기 바이오마커에 결합하여 기능을 나타낼 수 있는 이점이 있다. 또한, 세포 내에 존재하는 생체물질을 타겟으로 하는 의약의 경우, 대체적으로 과량을 투여하여 의약이 세포내로 확산되어 유입되도록 한다. 그러나, 본 발명의 치료물질은 세포 표면에 있는 단백질에 특이적으로 결합하는 물질이기 때문에, 비교적 낮은 투여량으로 유효한 치료 효과를 달성할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르면, 폐암의 진단 및 치료를 매우 효율적으로 할 수 있다.
다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 대조군 세포주와 A549, SK-MES-1, H460 및 H146 세포주에서 분리한 세포막 단백질을 SDS-PAGE로 분리한 젤 사진이다.
도 2는 대조군 세포주와 A549, SK-MES-1, H460 및 H146 세포주에서 분리한 세포막 단백질을 절단한 후, HPLC를 수행한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 대조군 세포주와 A549, SK-MES-1, H460 및 H146 세포주에서 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST의 특이적 발현 여부를 웨스턴 블럿을 통해 확인한 결과를 나타낸 사진이다.
도 4 내지 도 7은 각각 A549 세포주, H460 세포주, SK-MES-1 세포주 및 H146 세포주에서 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST의 세포 표면 발현 여부를 유세포 분석을 통해 확인한 그래프이다.
도 8 내지 도 10은 각각 A549 세포주, H460 세포주 및 SK-MES-1 세포주에서 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST의 세포 표면 발현 여부를 면역세포화학 분석을 통해 확인한 현미경 사진이다.
도 11은 Cy5.5-표지 Anti-DDOST 항체 및 대조구를 주사한 경우, 주사 후 30분, 1시간, 1.5시간, 3시간, 4.5시간, 24시간 경과 후 스펙트럼 형광 이미지화를 수행한 결과를 나타낸 사진이다.
도 12는 정맥 주사를 통해 구축한 이종이식(xenograft)모델의 암조직 표면에 대한 이미지화 결과를 나타낸 사진이다.
도 13 내지 도 15는 각각 A549 세포주, H460 세포주 및 SK-MES-1 세포주에서 APOO, CANX 및 DDOST에 대한 항체를 이용하여 ADCC 반응을 유도함으로써 폐암 세포의 사멸 또는 성장 억제를 확인한 그래프이다.
도 16는 A549 세포주에 의하여 종양이 생성된 누드마우스에서 DDOST에 대한 항체를 이용하여 종양의 성장이 억제됨을 확인한 그래프이다.
도 17은 SK-MES-1 세포주에 의하여 종양이 생성된 누드마우스에서 DDOST에 대한 항체를 복강 주사한 경우 암세포의 생장을 억제하는 결과를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
1. 폐암 진단용 조성물
본 발명의 일 측면은 APOO(Apolipoprotein O), ATP1A1(ATPase, Na+/K+ transporting, alpha 1 polypeptide), CANX(calnexin) 및 DDOST(dolichyl-diphosphooligosaccharide-protein glycosyltransferase)로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 포함하는 폐암 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 폐암 진단용 조성물은 1) APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 2) APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 앱타머를 포함한다.
상기 APOO 폴리펩티드는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하다. 또한, 상기 APOO 폴리펩티드는 서열번호 1로 기재되는 뉴클레오티드 서열에 의하여 코딩되는 것이 바람직하다.
상기 APT1A1 폴리펩티드는 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하다. 또한, 상기 APOO 폴리펩티드는 서열번호 3으로 기재되는 뉴클레오티드 서열에 의하여 코딩되는 것이 바람직하다.
상기 CANX 폴리펩티드는 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하다. 또한, 상기 APOO 폴리펩티드는 서열번호 5으로 기재되는 뉴클레오티드 서열에 의하여 코딩되는 것이 바람직하다.
상기 DDOST 폴리펩티드는 서열번호 8로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하다. 또한 상기 DDOST 폴리펩티드는 서열번호 7로 기재되는 뉴클레오티드 서열에 의하여 코딩되는 것이 바람직하다.
상기 항체는 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드의 일부 또는 전부를 항원성 부위로 인지하여, 상기 항원성 부위에 특이적이고 직접적으로 결합하는 것을 의미하며, 폴리클로날(polyclonal) 항체 또는 모노클로날(monoclonal) 항체를 모두 포함한다. 상기 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체는 당업자에게 알려진 공지의 방법으로 제작될 수 있다. 즉, 상기 단일클론 항체는 당업계에 널리 공지된 융합 방법(fusion method)(Kohler 및 Milstein (1976) European Jounral of Immunology, 6:511-519 참조), 재조합 DNA 방법 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al., Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al., J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 또한, 상기 폴리클로날 항체는 항원인 APOO, ATP1A1, CANX 또는 DDOST 폴리펩티드를 마우스, 래트, 양, 토끼와 같은 포유동물을 포함하는 외부 숙주에 주사함으로써 제조될 수 있다. 상기 항원은 근내, 복강내 또는 피하 주사방법으로 주사되며, 일반적으로 항원성을 증가시키기 위한 보조제(adjuvant)와 함께 투여될 수 있고, 외부 숙주로부터 정기적으로 혈액을 채취하여 형상된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수거하여 항체를 분리함으로써 수득 및 이용될 수 있다. 또한, 상기 항체는 상업적으로 알려진 APOO, ATP1A1, CANX 또는 DDOST 항체를 구입하여 이용할 수 있다.
상기 앱타머(aptamer)는 단일 사슬 DNA 또는 RNA 분자로서, SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)라 불리는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 라이브러리를 이용한 진화적인 방법에 의해 특정 화학 분자나 생물학적 분자에 높은 친화력과 선별력을 갖고 결합하는 올리고머를 분리하여 수득할 수 있다(C. Tuerand L. Gold, Science 249, 505 - 510, 2005; A. D. Ellington and J. W. Szostak, Nature 346, 818 - 822, 1990; M. Famulok, et. al., Acc. Chem. Res. 33, 591 - 599, 2000; D. S. Wilson and Szostak, Annu. Rev. Biochem. 68, 611 - 647, 1999). 앱타머는 표적에 특이적으로 결합하고 표적의 활성을 조정할 수 있는데, 예컨대, 결합을 통하여 표적이 기능하는 능력을 차단할 수 있다. 본 발명의 경우, SELEX를 이용하여 진화적인 방법으로 상기 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드에 높은 친화력 및 선별력을 갖는 앱타머를 수득하여 이용할 수 있다.
상기 항체 또는 앱타머는 상기 검출체가 태깅(tagging)된 것일 수 있다. 상기 검출체는 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드 표적에 상기 항체 또는 앱타머가 특이적으로 결합하였는지 여부를 용이하게 확인, 검출 및 정량하기 위한 것으로서, 발색효소(퍼옥시다제(peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase) 등), 형광물질(FITC, RITC, 로다민(rhodamine), 텍사스레드(Texas Red), 플로레신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 퀀텀닷(quantum dots)), 크로모포어(chromophore) 및 방사성 동위원소(124I, 125I, 111In, 99mTc, 32P, 35S 등)로 구성된 군에서 선택되는 적어도 어느 하나일 수 있다. 상기 검출체가 상기 항체 또는 앱타머에 태깅되는 경우, 상기 검출체는 상기 항체 또는 앱타머에서 표적에 대한 특이성 또는 선택성에 영향이 없도록 부착되는 것이 바람직하고, 이를 위하여 상기 항체 또는 앱타머에 링크(공유결합 또는 가교)되어 제공될 수 있다. 상기와 같은 검출체의 태깅 위치는 당업자가 반복 실험을 통하여 용이하게 결정할 수 있다.
상기 폐암은 비소세포폐암(NSCLC) 또는 소세포폐암(SCLC)일 수 있고, 특히 상기 비소세포폐암은 선암(adenocarcinoma), 편평상피세포암(squamous cell carcinoma) 또는 대세포암(large cell carcinoma)일 수 있다.
상기 조성물은 비강 투여용인 것이 바람직하다. 이는 상기 항체 또는 앱타머의 결합 특이성 및 선택성을 향상시키기 위한 것으로서, 상기 조성물이 비강 투여되는 경우 다른 조직이 아닌 폐암 조직 또는 세포에서 발현되는 표적(APOO, ATP1A1, CANX 또는 DDOST 폴리펩티드)에 더욱 선택적으로 결합될 수 있는 것이다.
상기 조성물이 피검체에 비강투여 되는 경우, 상기 조성물 내의 항체 또는 앱타머는 폐 조직 또는 세포에서 발현되는 APOO, ATP1A1, CANX 또는 DDOST 폴리펩티드에 특이적, 선택적으로 결합하게 되고, 상기 항체 또는 앱타머에 태깅된 검출체에서 일어나는 반응을 통해 상기와 같이 표적에 결합된 항체 또는 앱타머의 위치 또는 발현량을 측정할 수 있다. 즉, 피검체의 폐 조직 또는 세포 내에서 상기 검출체의 반응이 많이 일어나면, 상기 피검체의 폐 조직에는 APOO, ATP1A1, CANX 또는 DDOST 폴리펩티드가 과량으로 존재하는 것이고, 상기 피검체는 폐암에 걸린 것으로 진단될 수 있는 것이다. 또한, 상기 조성물은 비강 투여됨으로써 상기 피검체에서 폐암 세포 존부를 비침습적으로 확인할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 폐암 세포주인 A549, SK-MES-1, H460 및 H146 세포주에서 상기 4 가지 폴리펩티드인 APOO, ATP1A1, CANX 또는 DDOST가 특이적으로 과발현됨을 확인한 바(도 3 내지 도 5 참조), 본 발명의 APOO, ATP1A1, CANX 또는 DDOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 포함하는 조성물은 폐암의 진단에 유용하게 이용될 수 있다.
2. 폐암 진단용 키트
본 발명의 다른 측면은 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머, 또는 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 상보적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 폐암 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 폐암 진단용 키트는 1) APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 2) APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 앱타머, 또는 3) APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 상보적으로 결합하는 프라이머 또는 4) APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 상보적으로 결합하는 프로브를 포함한다.
상기 키트는 상기 "1. 폐암 진단용 조성물 " 항목의 조성물과는 달리 피검체 내로 투여되기 위한 것이 아니라, 피검체로부터 유래된 폐세척액, 생검, 혈액, 타액, 소변 등의 생물학적 시료를 이용하여 피검체의 폐암 유무를 진단하기 위한 것이다. 따라서, 상기 생물학적 시료 내에 포함된 단백질 또는 핵산을 검출하기 위한 것이고, 특히 본 발명의 상기 키트는 상기 생물학적 시료 내에 포함된 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드, 또는 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 검출하는데 이용된다.
본 발명의 폐암 진단용 키트는 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 포함할 수 있다. 상기 항체 또는 앱타머는 상기 APOO, ATP1A1, CANX 또는 DDOST를 검출하기 위한 것으로서, 상기 "1. 폐암 진단용 조성물 " 항목에서 설명한 바와 동일하다. 따라서, 상기 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머에 관해서는 상기 "1. 폐암 진단용 조성물 " 항목의 설명을 원용하여 상세한 설명은 생략하도록 하고, 이하에서는 상기 폐암 진단용 키트에 특이적인 구성(프라이머 또는 프로브)에 대해서만 설명하도록 한다.
상기 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 각각 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5 및 서열번호 7로 기재되는 핵산 서열을 가지는 것이 바람직하다.
상기 프라이머(primer)는 적절한 조건 및 환경에서 주형 DNA에 상보적인 DNA의 합성이 개시될 수 있도록 하는 것으로서, 상기 APOO, ATP1A1, CANX 또는 DDOST의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 혼성화될 수 있는 단일가닥의 올리고뉴클레오티드이다. 상기 프라이머의 길이는 온도, 반응 조건 및 프라이머의 용도 등 다양한 요소에 따라 변형되지만, 일반적으로 10 내지 30 nt 길이의 폴리뉴클레오티드인 것이 바람직하다. 상기 프라이머 서열은 주형(표적)이 되는 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열과 완전하게 상보적인 서열일 필요는 없고, 상기 주형(표적) 서열과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성만 가지면 된다. 이러한 프라이머의 디자인은 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5 또는 서열번호 7로 구성된 군으로부터 선택되는 표적 폴리뉴클레오타이드 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예컨대, 프라이머 디자인용 프로그램인 Primer 3 프로그램(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/), Blast 프로그램(NCBI)을 이용하여 설계할 수 있다.
상기 프로브(probe)는 표적 폴리뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 의미하는 것으로서, 상기 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 혼성화될 수 있는 단일가닥의 선형 폴리뉴클레오티드이다. 상기 프로브는 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것일 수 있다. 상기 프로브가 자연적으로 존재하는 것인 경우 상기 프로브는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드로 구설될 수 있고, 상기 프로브가 인위적으로 합성된 것인 경우 상기 프로브는 펩타이드 핵산(PNA) (M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 또는 디아미노퓨린 등으로 구성될 수 있다.
상기 프라이머 또는 프로브는 상기 검출체가 태깅(tagging)된 것일 수 있다. 상기 검출체는 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 표적에 상기 프라이머 또는 프로브가 특이적으로 결합하였는지 여부를 용이하게 확인, 검출 및 정량하기 위한 것으로서, 발색효소(퍼옥시다제(peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase) 등), 형광물질(FITC, RITC, 로다민(rhodamine), 텍사스레드(Texas Red), 플로레신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 퀀텀닷(quantum dots)), 크로모포어(chromophore) 및 방사성 동위원소(124I, 125I, 111In, 99mTc, 32P, 35S 등)로 구성된 군에서 선택되는 적어도 어느 하나일 수 있다. 상기 검출체가 상기 프라이머 또는 프로브에 태깅되는 경우, 상기 검출체는 상기 프라이머 또는 프로브에서 표적에 대한 특이성 또는 선택성에 영향이 없도록 부착되는 것이 바람직하고, 이를 위하여 상기 프라이머 또는 프로브에 링크(공유결합 또는 가교)되어 제공될 수 있다. 상기와 같은 검출체의 태깅 위치는 당업자가 반복 실험을 통하여 용이하게 결정할 수 있다.
상기 키트는 마이크로어레이칩인 것이 바람직하다. 상기 마이크로어레이 칩이 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머로 구성되는 경우, 상기 마이크로어레이 칩은 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드의 발현량을 번역(translation)된 단백질 수준에서 검출하기 위한 것이 된다. 또한, 상기 마이크로어레이 칩이 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 상보적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브로 구성되는 경우, 상기 마이크로어레이 칩은 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드의 발현량을 전사(transcription)된 mRNA의 수준에서 검출하기 위한 것이 된다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 폐암 세포주인 A549, SK-MES-1, H460 및 H146 세포주에서 상기 4 가지 폴리펩티드인 APOO, ATP1A1, CANX 또는 DDOST가 특이적으로 과발현됨을 확인한 바(도 3 내지 도 5 참조), 상기 APOO, ATP1A1, CANX 또는 DDOST 폴리펩티드에 대한 항체 또는 앱타머, 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 대한 프라이머 또는 프로브를 포함하는 키트는 폐암 진단용 키트로서 유용하게 이용할 수 있다.
3. 폐암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 폴리펩티드 검출 방법
본 발명의 또 다른 측면은 폐암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 폴리펩티드 검출 방법을 제공한다. 상기 폴리펩티드 검출 방법은 in vivo 또는 in vitro 상에서 수행될 수 있다.
본 발명의 폐암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 폴리펩티드 검출 방법은 1) 피검체에 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 표적 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 투여하여 상기 표적 폴리펩티드에 결합시키는 단계; 2) 상기 단계 1)의 표적 폴리펩티드에 결합된 항체의 양 및 위치를 측정함으로써 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 3) 상기 단계 2)에서 측정한 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드의 발현 수준이 대조군보다 증가된 피검체를 폐암에 걸릴 위험이 있는 개체로 판정하는 단계를 포함한다.
상기 단계 1)의 항체 또는 앱타머는 상기 APOO, ATP1A1, CANX 또는 DDOST를 검출하기 위한 것으로서, 상기 "1. 폐암 진단용 조성물 " 항목에서 설명한 바와 동일하다. 따라서, 상기 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머에 관해서는 상기 "1. 폐암 진단용 조성물 " 항목의 설명을 원용하여 상세한 설명은 생략하도록 하고, 이하에서는 상기 폐암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 폴리펩티드 검출 방법에 특이적인 구성(폴리펩티드의 발현 수준 측정 단계 및 폐암으로 판정하는 단계)에 대해서만 설명하도록 한다.
상기 단계 1)의 피검체는 폐암에 걸린 것으로 의심되는 개체 또는 폐암에 걸릴 위험이 있는지 진단을 필요로 하는 개체로서 인간, 원숭이, 개, 염소, 돼지 또는 쥐 등 척추동물이고 바람직하게는 포유동물이다.
상기 단계 2)의 폴리펩티드 발현 수준 측정은 상기 단계 1)의 표적 폴리펩티드에 결합된 항체 또는 앱타머에 태깅된 검출체의 존부를 측정함으로써 간접적으로 상기 단계 1)의 피검체 내에서 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드가 어느 조직에 어느 정도로 존재하는지를 확인, 검출 및 정량할 수 있다. 당업자는 상기 검출체의 종류에 따라 그 검출 방법을 용이하게 선택할 수 있다. 예컨대, 상기 검출체가 FITC, RITC, 로다민(rhodamine), 텍사스레드(Texas Red), 플로레신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 퀀텀닷(quantum dots) 등과 같은 형광물질인 경우, 상기 표적 폴리펩티드에 결합된 항체 또는 앱타머의 양 및 위치는 형광단층촬영(Fluorescence mediated tomography:FMT)으로 측정할 수 있다.
상기 단계 3)의 대조군은 폐암에 걸리지 않은 것으로 인정되는 개체이고, 상기 단계 3)의 대조군 내에서 표적 폴리펩티드의 발현 수준은 상기 단계 1)의 항체 또는 앱타머를 상기 대조군에 투여하고 상기 단계 2)와 같이 측정함으로써 결정된다. 상기 단계 3)에서 측정된 대조군 내에서의 상기 표적 폴리펩티드 발현 수준은 폐암이 걸리지 않은 경우에도 기본적으로 발현되어 개체 내에 존재하는 양이다.
상기 단계 3)의 피검체를 폐암에 걸릴 위험이 있는 개체로 판정하는 단계는 상기 대조군 내에서의 상기 표적 폴리펩티드의 발현 수준과 상기 피검체 내에서의 상기 표적 폴리펩티드의 발현 수준을 비교함으로써 수행된다. 상기 피검체 내에서 발현된 상기 표적 폴리펩티드의 양이 상기 대조군 내에서의 상기 표적 폴리펩티드의 발현 수준 보다 좋은 경우, 상기 피검체는 폐암에 걸린 것으로 인정된다.
본 발명의 다른 폐암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 폴리펩티드 검출 방법은 1') 피검체 유래 시료에 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 표적 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 처리하여 상기 표적 폴리펩티드에 결합시키는 단계; 2') 상기 단계 1')의 표적 폴리펩티드에 결합된 항체의 양 및 위치를 측정함으로써 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 3') 상기 단계 2')의 표적 폴리펩티드의 발현 수준이 대조군보다 증가된 피검체를 폐암에 걸릴 위험이 있는 개체로 판정하는 단계를 포함한다.
상기 단계 1')의 항체 또는 앱타머는 상기 APOO, ATP1A1, CANX 또는 DDOST를 검출하기 위한 것으로서, 상기 "1. 폐암 진단용 조성물 " 항목에서 설명한 바와 동일하다. 따라서, 상기 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머에 관해서는 상기 "1. 폐암 진단용 조성물 " 항목의 설명을 원용하여 상세한 설명은 생략하도록 하고, 이하에서는 상기 폐암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 폴리펩티드 검출 방법에 특이적인 구성(폴리펩티드의 발현 수준 측정 단계 및 폐암으로 판정하는 단계)에 대해서만 설명하도록 한다.
상기 단계 1')의 피검체는 폐암에 걸린 것으로 의심되는 개체 또는 폐암에 걸릴 위험이 있는지 진단을 필요로 하는 개체로서 인간, 원숭이, 개, 염소, 돼지 또는 쥐 등 척추동물이고 바람직하게는 포유동물이다.
상기 단계 1')의 피검체 유래 시료는 피검체로부터 유래된 폐세척액, 생검, 혈액, 타액, 소변 등의 모든 생물학적 시료일 수 있다.
상기 단계 2')의 상기 폴리펩티드의 발현 수준은 상기 단계 1')의 표적 폴리펩티드에 특이적으로 결합된 항체 또는 앱타머의 존부를 측정함으로써 간접적으로 상기 단계 1')의 피검체 내에서 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드가 어느 조직에 어느 정도로 존재하는지를 확인, 검출 및 정량할 수 있다. 상기 표적 폴리펩티드의 발현 수준의 측정은 면역침강법(immunoprecipitation), 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, RT-PCR, 웨스턴 블롯(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 방법으로 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 아니하고, 당업자가 적절하게 선택하여 수행할 수 있다.
상기 단계 3')의 대조군은 폐암에 걸리지 않은 것으로 인정되는 개체에서 유래한 폐세척액, 생검, 혈액, 타액, 소변 등의 모든 생물학적 시료이고, 상기 단계 3')의 대조군 내에서 표적 폴리펩티드의 발현 수준은 상기 단계 1')의 항체 또는 앱타머를 상기 대조군에 처리하고 상기 단계 2')와 같이 측정함으로써 결정된다. 상기 단계 3')에서 측정된 대조군 내에서의 상기 표적 폴리펩티드 발현 수준은 폐암이 걸리지 않은 경우에도 기본적으로 발현되어 개체 내에 존재하는 양이다.
상기 단계 3')의 피검체를 폐암에 걸릴 위험이 있는 개체로 판정하는 단계는 상기 대조군 내에서의 상기 표적 폴리펩티드의 발현 수준과 상기 피검체 내에서의 상기 표적 폴리펩티드의 발현 수준을 비교함으로써 수행된다. 상기 피검체 내에서 발현된 상기 표적 폴리펩티드의 양이 상기 대조군 내에서의 상기 표적 폴리펩티드의 발현 수준 보다 좋은 경우, 상기 피검체는 폐암에 걸린 것으로 인정된다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 폐암 세포주인 A549, SK-MES-1, H460 및 H146 세포주에서 상기 4 가지 폴리펩티드인 APOO, ATP1A1, CANX 또는 DDOST가 특이적으로 과발현됨을 확인한 바(도 3 내지 도 5 참조), 본 발명의 폴리펩티드 검출 방법은 APOO, ATP1A1, CANX 또는 DDOST 폴리펩티드의 발현량을 측정함으로써, 폐암의 진단에 필요한 정보를 제공하는데 유용하게 이용할 수 있다.
4. 폐암 치료용 약학적 조성물
본 발명의 또 다른 측면은 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 폐암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 폐암 치료용 약학적 조성물은 1) APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드의 발현 억제제 또는 2) APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드의 활성 억제제를 포함한다.
상기 APOO 폴리펩티드는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하다. 또한, 상기 APOO 폴리펩티드는 서열번호 1로 기재되는 뉴클레오티드 서열에 의하여 코딩되는 것이 바람직하다.
상기 APT1A1 폴리펩티드는 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하다. 또한, 상기 APOO 폴리펩티드는 서열번호 3으로 기재되는 뉴클레오티드 서열에 의하여 코딩되는 것이 바람직하다.
상기 CANX 폴리펩티드는 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하다. 또한, 상기 APOO 폴리펩티드는 서열번호 5으로 기재되는 뉴클레오티드 서열에 의하여 코딩되는 것이 바람직하다.
상기 DDOST 폴리펩티드는 서열번호 8로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하다. 또한 상기 DDOST 폴리펩티드는 서열번호 7로 기재되는 뉴클레오티드 서열에 의하여 코딩되는 것이 바람직하다.
상기 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드의 발현 억제제는 상기 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 및 작은 간섭 RNA(siRNA)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.
상기 안티센스 뉴클레오티드는 왓슨-클릭 염기쌍에 정의된 바에 따라, DNA, 미성숙-mRNA 또는 성숙된 mRNA의 상보적 염기서열에 결합(혼성화)하여 DNA에서 단백질로의 유전정보 흐름을 방해하는 것이다. 상기 안티센스 뉴클레오티드는 모노머 단위의 긴 사슬이기 때문에 이들은 표적 RNA 서열에 대해 쉽게 합성될 수 있다. 최근 많은 연구들은 표적 단백질을 연구하기 위한 생화학적 수단으로 안티센스 뉴클레오티드의 유용성을 증명하였다(Rothenberg et al., J. Natl. Cancer Inst., 81:1539-1544, 1999). 올리고뉴클레오티드 화학 및 향상된 세포흡착, 표적결합 친화도 및 뉴클레아제 내성을 나타내는 뉴클레오티드 합성 분야에서 최근 많은 진보가 있었으므로 안티센스 뉴클레오티드의 사용은 새로운 형태의 억제제로 고려될 수 있다.
상기 작은 간섭 RNA(siRNA)는 세포 내에서 표적 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA와 상보적으로 결합(혼성화)하여, 상기 표적 폴리펩티드의 DNA에서 단백질로의 유전정보 흐름을 방해하는 것으로서, 상기 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 유전자의 mRNA 염기서열 내에서 선택되는 15 내지 30 nt 길이의 센스 서열 및 상기 센스 서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 서열로 구성된다. 상기 센스 서열은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 25 nt길이의 폴리뉴클레오티드로 구성되는 것이 바람직하다.
상기 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)는 50 내기 100 nt 길이를 가지는 단일 가닥의 RNA가 세포 내에서 스템-루프(stem-loop) 구조를 이루고, 5 내지 30 nt 길이의 뉴클레오티드의 루프(loop) 부위 양쪽으로 상보적으로 15 내지 50 nt 길이의 신 RNA가 염기쌍을 이루어 이중가닥의 스템(stem)을 형성하며, 상기 스템 형성 가닥 각각의 이전과 이후에 1 내지 500 nt 길이의 뉴클레오티드를 추가로 더 포함하는 전체 길이의 RNA를 의미하는 것이다. 상기와 같은 shRNA는 세포 내에서 루프가 절단되고, 상기 siRNA와 같이 표적 폴리펩티드의 DNA에서 단백질로의 유전정보 흐름을 방해하는 작용을 한다. 상기 shRNA는 세포 내에서 절단된 후, 상기 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 유전자의 mRNA 염기서열 내에서 선택되는 15 내지 30 nt 길이의 센스 서열 및 상기 센스 서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 서열을 가지게 되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 아니한다.
상기 안티센스 뉴클레오티드, 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 및 작은 간섭 RNA(siRNA)는 상기 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합함으로써, APOO, ATP1A1, CANX 또는 DDOST 폴리펩티드의 발현을 억제하고, 따라서 폐암을 치료할 수 있는 유효 성분으로서 작용한다.
상기 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드의 활성 억제제는 상기 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드에 상보적으로 결합하는 앱타머, 항체 및 펩티드 미메틱스로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.
상기 항체 또는 앱타머는 상기 APOO, ATP1A1, CANX 또는 DDOST를 검출하기 위한 것으로서, 상기 "1. 폐암 진단용 조성물 " 항목에서 설명한 바와 동일하다. 따라서, 상기 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머에 관해서는 상기 "1. 폐암 진단용 조성물 " 항목의 설명을 원용하여 상세한 설명은 생략하도록 하고, 이하에서는 펩티드 미메틱스에 관해서만 설명하도록 한다.
상기 펩티드 미메틱스는 표적 폴리펩티드의 결합 도메인을 억제하여 표적 폴리펩티드의 활성을 억제하는 것으로서, APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드의 결합 도메인을 억제하는 것이다. 상기 펩티드 미메틱스는 펩티드 또는 비펩티드일 수 있고, psi 결합(Benkirane, N., et al. J. Biol. Chem., 271:33218-33224, 1996)과 같은, 비펩티드 결합에 의해 결합된 아미노산으로 구성될 수 있다. 또한, "구조적으로 강제된(conformationally constrained)" 펩티드, 사이클릭 미메틱스(cyclic mimetics), 적어도 하나의 엑소사이클릭 도메인(exocyclic domain), 결합 부분(결합 아미노산) 및 활성 부위를 포함하는 사이클릭 미메틱스일 수 있다. 펩티드 미메틱스는 MAP7D2 단백질의 이차구조 특성과 유사하게 구조화되고 항체(Park, B. W. et al. Nat Biotechnol 18, 194-198, 2000) 또는 수용성 수용체(Takasaki, W. et al. Nat Biotechnol 15, 1266-1270, 1997)와 같은 거대한 분자의 억제 특성을 모방할 수 있으며, 천연의 길항제와 동등한 효과로 작용할 수 있는 신규한 소분자일 수 있다(Wrighton, N. C. et al. Nat Biotechnol 15, 1261-1265, 1997).
상기 앱타머, 항체 및 펩티드 미메틱스는 상기 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드의 활성 도메인(active domain)에 결합함으로써, APOO, ATP1A1, CANX 또는 DDOST 폴리펩티드의 활성을 억제하고, 따라서 폐암을 치료할 수 있는 유효 성분으로서 작용한다.
상기 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 유효성분을 0.0001 내지 50 중량%로 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
상기 조성물은 비강 투여용인 것이 바람직하다. 이는 상기 발현 또는 활성 억제제의 결합 특이성 및 선택성을 향상시키기 위한 것으로서, 상기 조성물이 비강 투여되는 경우 다른 조직이 아닌 폐암 조직 또는 세포에서 발현되는 표적(APOO, ATP1A1, CANX 또는 DDOST 폴리펩티드)에 더욱 선택적으로 결합될 수 있는 것이다.
상기 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하나, 상기 조성물의 일일 투여량은 0.0001 ㎎/㎖ 내지 10 ㎎/㎖이며, 바람직하게는 0.0001 ㎎/㎖ 내지 5 ㎎/㎖이며, 하루 일 회 내지 수회에 나누어 투여되는 것이 바람직하다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 폐암 세포주인 A549, SK-MES-1, H460 및 H146 세포주에서 상기 4 가지 폴리펩티드인 APOO, ATP1A1, CANX 또는 DDOST의 발현 또는 활성을 억제한 경우, 상기 폐암 세포주의 성장이 억제되는 결과를 확인였고, 본 발명의 폐암 치료용 약학적 조성물을 이용하여 APOO, ATP1A1, CANX 또는 DDOST 폴리펩티드의 발현 또는 활성을 억제함으로써, 폐암 치료의 가능성을 확인한 바(도 11 내지 도 14 참조), 상기 APOO, ATP1A1, CANX 또는 DDOST 폴리펩티드의 발현 또는 활성 억제제는 폐암 치료용 조성물의 유효성분으로서 유용하게 이용할 수 있다.
5. 폐암 치료용 후보 물질 스크리닝 방법
아울러, 본 발명의 또 다른 측면은 폐암 치료용 후보 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 폐암 치료용 후보 물질의 스크리닝 방법은 1) APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 표적 폴리펩티드를 발현하는 세포주에 피검물질을 처리하는 단계; 2) 상기 단계 1)의 세포주에서 표적 폴리펩티드의 발현 정도를 측정하는 단계; 및 3) 상기 단계 2)에서 측정한 표적 폴리펩티드의 발현 수준이 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계를 포함한다.
상기 단계 2)의 표적 폴리펩티드의 발현 정도 측정은 역침강법(immunoprecipitation), 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, RT-PCR, 웨스턴 블롯(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것이 바람직하나 당업자에게 알려진 전사체 또는 그로부터 코딩된 단백질의 양을 측정하는 모든 방법을 사용할 수 있다.
상기 단계 3)에서 선별된 피검물질은 상기 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 표적 폴리펩티드의 발현을 억제하는 물질로서, 상기 "4. 폐암 치료용 약학적 조성물 " 항목에서 설명된 발현 억제제로 이용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 폐암 치료용 후보 물질의 스크리닝 방법은 1) APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 표적 폴리펩티드에 피검물질을 처리하는 단계; 2) 상기 표적 폴리펩티드의 활성 정도를 측정하는 단계; 및 3) 상기 표적 폴리펩티드의 활성 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계를 포함한다.
상기 단계 2)의 표적 폴리펩티드의 활성 정도는 SDS-PAGE, 면역형광법, 효소면역분석법(ELISA), 질량분석 및 단백질 칩으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나로 측정하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니하고, 당업자에게 알려진 단백질의 활성 정도를 측정하는 모든 방법을 사용할 수 있다.
상기 단계 3)에서 선별된 피검물질은 상기 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 표적 폴리펩티드의 활성을 억제하는 물질로서, 상기 "4. 폐암 치료용 약학적 조성물 " 항목에서 설명된 활성 억제제로 이용될 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 폐암 세포주인 A549, SK-MES-1, H460 및 H146 세포주에서 상기 4 가지 폴리펩티드인 APOO, ATP1A1, CANX 또는 DDOST의 발현 또는 활성을 억제한 경우, 상기 폐암 세포주의 성장이 억제되는 결과를 확인한 바, 본 발명의 스크리닝 방법은 APOO, ATP1A1, CANX 또는 DDOST 폴리펩티드의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 피검물질을 스크리닝함으로써, 폐암 치료의 후보 물질을 스크리닝하는데 유용하게 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실험예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실험예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기의 실험예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
신규 폐암 마커 폴리펩티드의 선별
<1-1> 세포막 단백질의 분리
정상 허파조직과 A549 (편평세포암, squamous cell carcinoma), SK-MES-1(선암, adenocarcinoma), H460(대세포암, large cell carcinoma) 및 H146(소세포암, small cell carcinoma) 세포주로부터 단백질가수분해효소 억제제(protease inhibitor)인 PMSF(sigma, St Louis, USA) 100 mM을 이용해 소니케이션(sonication) 방법으로 세포 및 조직을 파쇄한 후, 15,000 rpm에서 30분 동안 분별원심분리(differential centrifugation)하여 세포막 분획을 농화(enrichment)하고, 펠렛(pellet) 부분인 막 단백질(membrane protein)만으로 10% SDS-PAGE를 수행하여 세포막 단백질을 분리하였다(도 1).
<1-2> 세포막 단백질의 동정
상기 실시예 <1-1>과 같이 분리한 5 가지 세포주의 막 단백질에 트립신(trypsin)을 처리하여 HPLC를 수행하였고, 정상조직의 HPLC 단백질 프로파일과 비교하여 상기 4가지 종류의 폐암 세포주에서 나타나는 상이한 피크(peak)의 단백질을 선별하여 MS/MS로 이를 동정하였다. 보다 상세하게는, 막 단백질을 전기영동한 젤을 증류수로 5분동안 세척한 뒤 바이오-세이프 쿠마시 염색(coomassie stain) 용액(Coomassie G250 Stain)(BioRad, USA)으로 상온에서 한 시간 반응시켜 염색하였다. 그런 다음, 상기 젤을 증류수에 30분 동안 담가 탈염색(destaining)하였다. 상기 젤로부터 염색된 단백질 밴드만 잘라내어, 75 mM 암모늄 바이카보네이트(ammonium bicarbonate)(Sigma, USA) / 40% 에탄올(Duksan, Korea) (1:1)로 다시 탈염색(destainin)한 후, 젤 조각이 충분히 덮힐 정도로 5 mM DTT / 25 mM 암모늄 바이카보네이트(ammonium bicarbonate)(Sigma, USA) 용액을 첨가하여 60 ℃에서 30분 동안 반응시켰다. 용액은 버리고, 젤 조각은 상온에 두어 온도를 낮추어 냉각시켰고, 젤의 알킨화(alkylation)를 위해 55 mM의 요오드아세트아미드(iodoacetamide)(Sigma, USA) 용액을 처리하여 상온에 30분 동안 반응시킨 다음, 상기 젤 조각을 100% ACN에 세척하여 건조시켰다. 상기 건조된 젤 조각을 20 ㎎/㎖의 수정된 시퀀싱 그레이드 트립신(modified sequencing grade trypsin)(Roche Applied Science)를 포함하는 25 mM 암모늄 바이카보네이트 버퍼(ammonium bicarbonate buffer) 10 ㎖에 적신 다음, 37 ℃에 밤새 반응시켰다. 트립신 분해된 펩타이드 혼합물(tryptic peptide mixure)을 젤과 함께 0.1% 포름산(formic acid)(Junsei, Japan)에 흘려주었다. LC-MS/MS 분석은 NSI sources(San Jose, CA)가 장착된 Thermo Finnigan's ProteomeX workstation LTQ linear IT MS (Thermo Electron, USA)을 이용해 수행하였다. 12 ㎖의 펩타이드 혼합물을 주입하고 펩타이드 트랩 카트리지(peptide trap cartridge)(Agilent, USA)에 로딩한 다음, 그래디언트 일루션(gradient elution)에 의해 컬럼으로 분리시켰다.
그 결과, 상기 4가지 종류의 폐암 세포주에서 정상 세포와는 달리 발현되는, 총 1,340 종의 단백질을 검출할 수 있었다.
상기와 같이 검출된 총 1,340 종의 단백질 중, 정상 허파 조직에서는 전혀 발현되지 않으면서 4가지 종류의 폐암에서 모두 발현되는 136개의 단백질을 선별하였다. 이후, Protein Atlas의 immunohistochemistry 등의 자료를 확인하여 136개의 단백질 중 막 단백질 16개를 확인하였다. 상기 16개 단백질의 구체적인 발현 위치를 PSORTⅡ 분석을 통해 확인하여, 세포 내막(inner cell membrane) 등 치료 타겟 및 진단 마커로 이용되기 어려운 단백질을 제외하고, 암세포에서 발현량이 가장 많은 4 종의 단백질 APOO(Apolipoprotein O), ATP1A1(ATPase, Na+/K+ transporting, alpha 1 polypeptide), CANX(calnexin) 및 DDOST(dolichyl-diphosphooligosaccharide-protein glycosyltransferase)을 최종적으로 선별하였다.
<1-3> APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST의 발현 특성 분석
상기 실시예 <1-2>에서 선별한 4개의 폐암 특이적 막 단백질, APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST의 발현 특성 분석을 위하여, 웨스턴 블럿(Western Blot), 유세포 분석(FACS) 및 면역세포화학 분석(immunocytochemistry)을 각각 수행하였다.
<1-3-1> 웨스턴 블럿(Western Blot)
상기 실시예 <1-1>에서 수득한 막 단백질 시료를 전기영동하고, 상기 4 가지 단백질들에 대하여 웨스턴 블럿을 실시하였다. 세포주별로 소니케이션(sonication) 방법으로 세포를 파쇄한 후, 원심분리기를 통해 막 단백질만을 10% SDS-PAGE로 분리하여, PVDF 막(membrane)(Milllipore, Italy)으로 TE70X SEMI-DRY TRANSFER UNIT 14X16 CM(Hoefer, San Francisco, USA)을 이용해 30V로 1시간동안 전사(transfer)시켰다. 전사된 막(membrane)에 1시간동안 5% 스킴 밀크(Skim Milk)로 차단(blocking)한 후, 1차 항체(primary antibody)를 상온에 2시간 동안 반응시켰다. 상기 1차 항체는 Anti-APOO(Sigma, USA), Anti-ATP1A1(AbClon, Korea) Anti-CANX(sigma, USA), Anti-DDOST(Sigma, USA)를 사용하였다. 그 다음, 2차 항체(secondary antibody)를 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 상기 2차 항체는 Goat anti-mouse IgG 및 Goat anti-rabbit IgG(Ab frontier, Korea)를 사용하였다.
그 결과, 상기 4 가지 단백질이 상기 4 가지 종류의 폐암 세포주에서 특이적으로 발현됨을 확인하였다(도 3).
<1-3-2> 유세포 분석(FACS)
상기 실시예 <1-1>에서 수득한 막 단백질 시료를 전기영동하고, 상기 4 가지 단백질들에 대하여 유세포 분석을 실시하였다. 보다 구체적으로, 세포주 별로 1차 항체를 상온에서 30분 동안 반응시켰다. 상기 1차 항체는 Anti-APOO(Sigma, USA), Anti-ATP1A1(AbClon, Korea), Anti-CANX(Sigma, USA) 및 Anti-DDOST(Sigma, USA)를 사용하였다. 상기 1차 항체를 처리한 후, 2차 항체를 상온에서 30분 동안 반응시켰고, 상기 2차 항체는 형광물질인 FITC(Fluorescein isothiocyanate)가 결합되어 있는 Goat Anti-Mouse IgG(FITC) 및 Goat Anti-rabbit IgG(FITC)(Ab frontier, Seoul, Korea)를 사용하였다. 그런 다음, 유세포 분석기 BD FACSCalibur(BD Biosciences, USA)를 이용해 유세포 분석을 실시하였다.
그 결과, 상기 4 가지 단백질이 상기 4 가지 종류의 폐암 세포주에서 세포 표면에 발현되고, 세포막 밖에서 항체와 결합함을 알 수 있었다(도 4 내지 도 7).
<1-3-3> 면역세포화학 분석(immunocytochemistry)
상기 세포주 A549 (선암, adenocarcinoma), SK-MES-1(편평세포암, squamous cell carcinoma) 및 H460(대세포암, large cell carcinoma)를 대상으로 상기 4 가지 단백질들에 대하여 면역세포화학 분석을 실시하였다. 상기 4가지 세포주들에 대하여, Lab-Tek chamber Slide(Nunc, USA)을 이용하여 상온에서 3시간 동안 1차 항체를 처리하였고, 상기 1차 항체는 Anti-APOO(Sigma, USA), Anti-ATP1A1(AbClon,Korea), Anti-CANX(Sigma, USA) 및 Anti-DDOST(Sigma, USA)를 이용하였다. 상기와 같이 1차 항체를 처리하고 난 뒤, 상온에서 30분 동안 2차 항체를 반응시켰다. 상기 2차 항체로는 horseradish peroxidase가 결합되어 있는 Goat anti-mouse IgG 및 Goat anti-rabbit IgG(Ab frontier, Korea)를 사용하였다. 그런 다음, VECTASTAIN Elite ABC kit (Vecter Laboratories, USA)을 이용해 DAB(3,3'-Diaminobenzidine) 발색 반응을 관찰하였다.
그 결과, 상기 4 가지 단백질이 상기 3 가지 종류의 폐암 세포주에서 세포 표면에 발현되고, 세포막 밖에서 항체와 결합함을 확인할 수 있었다(도 8 내지 도 10).
항체를 이용한 이미지화
<1-4> 형광 표지
50 mM Na2HPO4(PH 7.4) 내의 5 μl의 Anti-DDOST 항체(Sigma, 단백질 농도 1 μg/μl)를 상온에서 4시간 동안 5 nmol/L의 DMSO에 용해한 40 nmol의 Cy5.5 NHS 에스터에 함께 배양하였다. 혼합물은 프리 Cy5.5를 제거하기 위해, 세파덱스 G50 컬럼(시그마, USA)으로 필터링 하였다. Cy5.5-표지 Anti-DDOST 항체 또는 토끼 IgG 대조구 샘플은 스톡 용액으로 4℃로 유지하였다. Cy5.5 표지된 Anti-DDOST 항체 또는 IgG 샘플의 단백질 농도는 BCA 단백질 분석에 의해 결정하였다.
<1-5> In vivo 이미지화
수컷 누드 마우스는 네 종류의 폐암 세포, A549(선암(adenocarcinoma)), NCI-H460(비소세포성 폐 암종(Non-small cell lung carcinoma)), NCI-H146 (소세포 폐암종(Small cell lung carcinoma)) 및 SK-MES-1 (편평상피성 폐암종(squamous cell lung carcinoma))를 누드 마우스의 등에 6군데 피하 주사하여 이식하였다.
그리고나서, 종양의 직경이 약 5 mm에 이르렀을 때 이미지화를 수행하였다. Cy5.5로 표지된 anti-DDOST 항체와 anti-Rabbit IgG 항체를 각각 1 ug/μl의 농도로 섞은 50μl의 용액을 광학 이미지화 전에 마우스 꼬리 정맥을 통해 정맥 내로 주입하였다. 주사 후 30분, 1시간, 1.5시간, 3시간, 4.5시간, 24시간 경과 후 스펙트럼 형광 이미지화를 수행하였다. 항체가 종양을 특이적으로 표적할 수 있는지 확인하기 위하여 항체에 표지한 cy5.5를 이용하여 항체를 검출하고자 하였다. 이미지스테이션(Kodak Image Station 400MM; Eastman Kodak Company, New Haven, CT)으로 마우스의 종양 부위를 이미지화 하였다. 각각의 종양은 1500, 800, 800, 400, 400, 및 300의 최소 레벨로 이미지화 하였다.
각각의 항체를 주사한 후 형광 이미지화한 결과를 도 11에 나타내었다. 상단의 6장의 사진은 Cy5.5-표지 Anti-DDOST 항체를 주사한 경우이며, 하단의 6장의 사진은 아이소타입 대조구를 주사한 경우를 나타낸다. 도 11에서 보는 바와 같이 대조구의 경우 주사 후 30분 이내에 체외로 배출되어 미량의 형광만이 방광부위에 남아있음을 알 수 있다. 반면에 항-DDOST 항체를 주사한 경우 등위에 자라는 폐암덩어리에 정확히 표지되었다. A549 이외 H460을 대상으로 한 실험에서도 유사한 결과를 얻을 수 있었다. 이로서 DDOST를 타겟으로 하는 in vivo 이미지화가 가능하다는 결과를 도출하였다.
한편, 정맥 주사를 통해 구축한 이종이식(xenograft)모델의 경우에 대하여도 동일한 실험을 수행하였다. 살아있는 상태에서의 이미징은 시그널이 약하여 관찰이 어려웠으나, 도 12에서 보는 바와 같이 조직을 적출하여 조직의 절편을 관찰해 보면 암조직 표면에 정확히 붙어 표지가 가능함을 알 수 있었다. 따라서 시그널이 강한 물질을 결합시킨다면 폐조직내에서의 in vivo 이미지화도 충분히 가능하다는 결론을 도출하였다.
상기 실시예 <1-2>에서 선별한 4개의 폐암 특이적 막 단백질, APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST 폴리펩티드의 활성을 억제함으로써, 상기 폴리펩티드들에 대한 항체의 항암 약제로서의 적용 가능성을 확인하기 위하여, in vitro 및 in vivo 실험을 각각 수행하였다.
<2-1> in vitro 에서의 항암 효과 확인
A549, SK-MES-1 및 H460 세포주에서 항체를 이용하여 APOO, CANX 및 DDOST의 활성을 억제한 후, 상기 폐암 세포주의 성장이 억제되는지 여부를 확인하였다. 보다 상세하게는, 상기 3 세포주에 Anti-APOO(Sigma, USA), Anti-CANX(Sigma, USA) 및 Anti-DDOST(Sigma, USA) 항체를 각각 연속적인 희석(Serial dilution) 방법으로 처리하고, 상기 처리한 항체의 생성 동물종과 동일한 동물종에서 유래한 혈청(rabbit serum)(Sigma, USA)을 첨가하여 항체의존성 세포매개성 세포독성(Antibody-Dependent Cell-medicated Cytotoxicity, ADCC)을 유도하였다. 그런 다음, 상기 폐암 세포주에서 세포의 사멸 혹은 성장 억제 정도를 측정하였다.
그 결과, 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 상기 3 폐암 세포주에서 상기 APOO, CANX 및 DDOST에 대한 항체의 농도에 비례하여, 폐암 세포의 성장이 억제되는 것을 확인하였다.
상기와 같은 폐암 세포의 사멸 및 성장 억제 데이터로부터 세포의 반수치사농도(LC50, lethal concentration 50%)를 측정하였다.
그 결과, A549 세포주의 경우, DDOST, CANX 및 APOO에 대하여 각각 0.77 ㎍/㎖, 0.03 ㎍/㎖ 및 0.05 ㎍/㎖의 농도로 항체를 처리하면 전체 세포의 성장을 반으로 억제 할 수 있는 것으로 나타났다(도 13). 또한 H460 세포주의 경우, DDOST, CANX 및 APOO에 대하여 반수치사농도가 각각 6.4 ㎍/㎖, 0.07 ㎍/㎖ 및 0.05 ㎍/㎖로 나타났다(도 14). 아울러, SK-MES-1 세포주의 경우, DDOST, CANX 및 APOO에 대하여 반수치사농도가 각각 7.9 ㎍/㎖, 0.06 ㎍/㎖ 및 0.06 ㎍/㎖로 나타났다(도 15).
상기와 같은 결과로부터, 상기 4 종의 폴리펩티드 APOO(Apolipoprotein O), ATP1A1(ATPase, Na+/K+ transporting, alpha 1 polypeptide), CANX(calnexin) 및 DDOST(dolichyl-diphosphooligosaccharide-protein glycosyltransferase)가 폐암 치료의 표적이 될 수 있고, 상기 4 폴리펩티드에 대한 항체가 폐암을 치료할 수 있는 유효 성분으로서 작용 할 수 있음을 확인하였다.
<2-2> in vivo 에서의 항암 효과 확인 1
누드마우스(NARA, seoul, Korea)에 폐암 세포주인 A549 세포주를 피하주입하여 종양을 생성시켰다. 그런 다음, 항체(Anti-DDOST(Sigma, USA))를 dose 별(100 ㎍ 및 200 ㎍)로 두 차례 처리한 후, 종양의 부피를 측정하였다.
그 결과, 항체를 처리하지 않은 대조군에 비하여, 시간이 지날수록 처리 dose에 비례하여 종양의 성장이 억제됨을 확인하였다(도 16).
상기와 같은 결과로부터, 상기 4 종의 폴리펩티드 APOO(Apolipoprotein O), ATP1A1(ATPase, Na+/K+ transporting, alpha 1 polypeptide), CANX(calnexin) 및 DDOST(dolichyl-diphosphooligosaccharide-protein glycosyltransferase)가 폐암 치료의 표적이 될 수 있고, 상기 4 폴리펩티드에 대한 항체가 폐암을 치료할 수 있는 유효 성분으로서 작용 할 수 있음을 확인하였다.
<2-3> in vivo 에서의 항암 효과 확인 2
<2-3-1> 폐암 피하 이종이식 모델 준비
피하 이종이식 모델을 위하여, A549 세포(1ㅧ107/200 μl)를 BALB/c 누드 마우스의 등에 4-6군데 피하 주사하였다. 종양을 버니어 캘리퍼를 사용하여 일주일간 모니터링 하고 측정하였고, 그 부피는 식 "V= 1/2 ㅧ ( W2 ㅧ L )" 에 의해서 계산되었다(상기 식에서 V는 종양 부피, W는 최소 직경(diameter), L은 최대 직경을 나타낸다).
마우스는 5개의 처치(treatment) 그룹으로 나누었다. A549 세포의 모델에서의 Anti-DDOST 항체 처치의 효능을 테스트하기 위하여, 종양 직경이 평균 약 5 mm 되었을때 처치를 시작하였다. Anti-DDOST 항체, 토끼 IgG 대조구 및 PBS-대조구를 일주일에 한번씩 총 2회 복강 내 주사하여 처치를 수행하였다.
<2-3-2> 면역조직화학 분석(Immunohistochemistry)
DDOST 단백질 발현은 파라핀-내장형의 IHC에 의해 입증되었다. 각각의 폐 조직 샘플은 4μm 두께로 구획화 하였고, 알코올의 시리얼 내에서 수화된 크실렌(xylene) 내에서 디파라핀화되었다. 비특이적 결합은 차단되었고, 슬라이드는 4 ℃에서 하루동안 Anti-DDOST 항체(시그마, USA)와 함께 배양하였다. IHC 반응은 3'3-디아미노벤지딘(DAB)을 사용한 벡타스테인 ABC 킷(Vector Laboratories Inc., USA)으로써 수행하였다.
그 결과, 도 17에서 볼 수 있듯이 DDOST에 대한 항체를 복강 주사한 경우 그렇지 않은 경우에 비하여 효과적으로 암세포의 생장을 억제하는 것을 볼 수 있었으며, 이러한 경향은 항체의 양에 비례하여 커짐을 확인하였다.
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 예시적으로 설명하였으나, 본 발명의 범위는 상기와 같은 특정 실시예에만 한정되지 아니하며, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 특허청구범위에 기재된 범주 내에서 적절하게 변경이 가능할 것이다.
<110> Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University <120> Target protein for both diagnosis and treatment of lung cancer <130> PN130260P <150> KR 10-2012-0060732 <151> 2012-06-07 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1134 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gggtttgcgt tcacccgctg cccgggcgcg acgcgctgcg gctcagcgac gcggcttcta 60 gaaccgggtg attgaactaa accttcgccg caccgagttt gcagtacggc cgtcacccgc 120 accgctgcct gcttgcggtt ggagaaatca aggccctacc gggcctccgt agtcacctct 180 ctatagtggg cgtggccgag gccggggtga ccctgccgga gcctccgctg ccagcgacat 240 gttcaaggta attcagaggt ccgtggggcc agccagcctg agcttgctca ccttcaaagt 300 ctatgcagca ccaaaaaagg actcacctcc caaaaattcc gtgaaggttg atgagctttc 360 actctactca gttcctgagg gtcaatcgaa gtatgtggag gaggcaagga gccagcttga 420 agaaagcatc tcacagctcc gacactattg cgagccatac acaacctggt gtcaggaaac 480 gtactcccaa actaagccca agatgcaaag tttggttcaa tgggggttag acagctatga 540 ctatctccaa aatgcacctc ctggattttt tccgagactt ggtgttattg gttttgctgg 600 ccttattgga ctccttttgg ctagaggttc aaaaataaag aagctagtgt atccgcctgg 660 tttcatggga ttagctgcct ccctctatta tccacaacaa gccatcgtgt ttgcccaggt 720 cagtggggag agattatatg actggggttt acgaggatat atagtcatag aagatttgtg 780 gaaggagaac tttcaaaagc caggaaatgt gaagaattca cctggaacta agtagaaaac 840 tccatgctct gccatcttaa tcagttatag gtaaacattg gaaactccat agaataaatc 900 agtatttcta cagaaaaatg gcatagaagt cagtattgaa tgtattaaat tggctttctt 960 cttcaggaaa aactagacca gacctctgtt atcttctgtg aaatcatcct acaagcaaac 1020 taacctggaa tcccttcacc tagagataat gtacaagcct tagaactcct cattctcatg 1080 ttgctattta tgtacctaat taaaacccaa gttaaaaaaa aaaatccgaa aaaa 1134 <210> 2 <211> 180 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Phe Lys Val Ile Gln Arg Ser Val Gly Pro Ala Ser Leu Ser Leu 1 5 10 15 Leu Thr Phe Lys Val Tyr Ala Ala Pro Lys Lys Asp Ser Pro Pro Lys 20 25 30 Asn Ser Val Lys Val Asp Glu Leu Ser Leu Tyr Ser Val Pro Glu Gly 35 40 45 Gln Ser Lys Tyr Val Glu Glu Ala Arg Ser Gln Leu Glu Glu Ser Ile 50 55 60 Ser Gln Leu Arg His Tyr Cys Glu Pro 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ttgacactga cgatgtgaat ttccctatcg ataatctgtg ctttgttggg 2100 ctcatctcca tgattgaccc tccacgggcg gccgttcctg atgccgtggg caaatgtcga 2160 agtgctggaa ttaaggtcat catggtcaca ggagaccatc caatcacagc taaagctatt 2220 gccaaaggtg tgggcatcat ctcagaaggc aatgagaccg tggaagacat tgctgcccgc 2280 ctcaacatcc cagtcagcca ggtgaacccc agggatgcca aggcctgcgt agtacacggc 2340 agtgatctaa aggacatgac ctccgagcag ctggatgaca ttttgaagta ccacactgag 2400 atagtgtttg ccaggacctc ccctcagcag aagctcatca ttgtggaagg ctgccaaaga 2460 cagggtgcta tcgtggctgt gactggtgac ggtgtgaatg actctccagc tttgaagaaa 2520 gcagacattg gggttgctat ggggattgct ggctcagatg tgtccaagca agctgctgac 2580 atgattcttc tggatgacaa ctttgcctca attgtgactg gagtagagga aggtcgtctg 2640 atctttgata acttgaagaa atccattgct tataccttaa ccagtaacat tcccgagatc 2700 accccgttcc tgatatttat tattgcaaac attccactac cactggggac tgtcaccatc 2760 ctctgcattg acttgggcac tgacatggtt cctgccatct ccctggctta tgagcaggct 2820 gagagtgaca tcatgaagag acagcccaga aatcccaaaa cagacaaact tgtgaatgag 2880 cggctgatca 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agagaaggaa gaggaaaagg acaagggaga 1740 tgaggaggag gaaggagaag agaaacttga agagaaacag aaaagtgatg ctgaagaaga 1800 tggtggcact gtcagtcaag aggaggaaga cagaaaacct aaagcagagg aggatgaaat 1860 tttgaacaga tcaccaagaa acagaaagcc acgaagagag tgaaacaatc ttaagagctt 1920 gatctgtgat ttcttctccc tcctcccctg caagagtggt cctaggagag gacctggcac 1980 accttaggtt gacattcaga aaacttcaag acatcaccat cagcaggctc cagttgaaca 2040 ctagtctgtg taactttaaa catctagcag taaatacttg cagttgtgat ataaaggacc 2100 ctgtttctgt agaaaagaaa acatttaaca taatggttgt gaaatgtaac atgaagcaaa 2160 ctaacttttt tttttttaac atctttgttt ttaaaataga atgatagaac tttgccagtc 2220 tttaagatct tggcttaatt taatgtatta atctgtttgt gcaaacataa taccaccatt 2280 taaaaatgtt agggagatga gttgcagttt ttataataga ttttttttaa agtttggtat 2340 tgtaaaacat tcacacctct gtccctcaaa attgataatt acgtttaaag tgcagtcatt 2400 tgtggttaga atcttgtttt gtttgcttcc attattgagt tcctcctaag gaaattgagg 2460 agagggactg aatagaagcc caaattcata taaaagttgc gtttaagttg tattaaaaat 2520 agatatataa gaaaaaattc tttcacttga 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gactatgttc aattagtggg ttgatcttcg 4260 tataattggc cactatgtga gagttcacta ctaggcagaa actattatgg acagtgaaat 4320 aatgactttt atctcaccac gtgagtttga tgcagtcttt tctgtctagc ccttgcctct 4380 tcctgcccat gtgattgcgg tgcagtagtt tctgttgtat aatagtgtgg acagcagctc 4440 agaaaaggag ggaatgctac tgataatttg tagataatat tctttaagac ttaggggaac 4500 cattgaactt tgaaattttt attagaaaat tatttgttca gaatcagact ccattatttt 4560 acatatactt aaatacttta ggggtatttt tgaaagttag cccagttttt tatgtgctat 4620 taaattttta gattacatac taaagaaaag tatgtacaca gaatgtagtg ctcctagtta 4680 ctattttttc tattaagaaa tagtttagtt ctggtgtaaa atttgtttga atgctaaaaa 4740 aaaaaaagca ggactgcatt atggcacttt tgccttggtg gcccactttc tccatttaaa 4800 acattaggat ttgtattttt ctgctgcgtt tgtatgaaga catatttgat tgttgttttc 4860 tcttgatttt aaaataaaac ctcatgagcc ctagtaaaaa 4900 <210> 6 <211> 592 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Glu Gly Lys Trp Leu Leu Cys Met Leu Leu Val Leu Gly Thr Ala 1 5 10 15 Ile Val Glu Ala His Asp Gly His Asp Asp Asp Val Ile Asp Ile Glu 20 25 30 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Pro Asp Asn Ser Phe Glu Ile Leu Val Asp Gln Ser Val 245 250 255 Val Asn Ser Gly Asn Leu Leu Asn Asp Met Thr Pro Pro Val Asn Pro 260 265 270 Ser Arg Glu Ile Glu Asp Pro Glu Asp Arg Lys Pro Glu Asp Trp Asp 275 280 285 Glu Arg Pro Lys Ile Pro Asp Pro Glu Ala Val Lys Pro Asp Asp Trp 290 295 300 Asp Glu Asp Ala Pro Ala Lys Ile Pro Asp Glu Glu Ala Thr Lys Pro 305 310 315 320 Glu Gly Trp Leu Asp Asp Glu Pro Glu Tyr Val Pro Asp Pro Asp Ala 325 330 335 Glu Lys Pro Glu Asp Trp Asp Glu Asp Met Asp Gly Glu Trp Glu Ala 340 345 350 Pro Gln Ile Ala Asn Pro Arg Cys Glu Ser Ala Pro Gly Cys Gly Val 355 360 365 Trp Gln Arg Pro Val Ile Asp Asn Pro Asn Tyr Lys Gly Lys Trp Lys 370 375 380 Pro Pro Met Ile Asp Asn Pro Ser Tyr Gln Gly Ile Trp Lys Pro Arg 385 390 395 400 Lys Ile Pro Asn Pro Asp Phe Phe Glu Asp Leu Glu Pro Phe Arg Met 405 410 415 Thr Pro Phe Ser Ala Ile Gly Leu Glu Leu Trp Ser Met Thr Ser Asp 420 425 430 Ile Phe Phe Asp Asn Phe Ile Ile Cys Ala Asp Arg Arg Ile Val Asp 435 440 445 Asp Trp Ala Asn Asp Gly Trp Gly Leu Lys Lys Ala Ala Asp Gly Ala 450 455 460 Ala Glu Pro Gly Val Val Gly Gln Met Ile Glu Ala Ala Glu Glu Arg 465 470 475 480 Pro Trp Leu Trp Val Val Tyr Ile Leu Thr Val Ala Leu Pro Val Phe 485 490 495 Leu Val Ile Leu Phe Cys Cys Ser Gly Lys Lys Gln Thr Ser Gly Met 500 505 510 Glu Tyr Lys Lys Thr Asp Ala Pro Gln Pro Asp Val Lys Glu Glu Glu 515 520 525 Glu Glu Lys Glu Glu Glu Lys Asp Lys Gly Asp Glu Glu Glu Glu Gly 530 535 540 Glu Glu Lys Leu Glu Glu Lys Gln Lys Ser Asp Ala Glu Glu Asp Gly 545 550 555 560 Gly Thr Val Ser Gln Glu Glu Glu Asp Arg Lys Pro Lys Ala Glu Glu 565 570 575 Asp Glu Ile Leu Asn Arg Ser Pro Arg Asn Arg Lys Pro Arg Arg Glu 580 585 590 <210> 7 <211> 2144 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 aatccacctc ccaccagggc acttccggcg gcgctctccg cgccttatcg ccaaagctgc 60 ggctctggac gcccagccgc ggcgtatccc gatcacttcc gggtagtgct ccacgggcac 120 gagccgcgat tgggctaccg tagatggggt acttccggtg tgcaggtgct gggtccttcg 180 gcaggaggag gaagatggag cccagcaccg cggcccgggc ttgggccctc ttttggttgc 240 tgctgccctt gcttggcgcg gtttgcgcca gcggaccccg caccttagtg ctgctggaca 300 acctcaacgt gcgggagact cattcgcttt tcttccggag cctgaaggac cggggctttg 360 agctcacatt caagaccgct gatgacccca gcctgtctct cataaagtat ggggaattcc 420 tctatgacaa tctcatcatt ttctcccctt cggtagaaga ttttggaggc aacatcaacg 480 tggagaccat cagtgccttt attgacggcg gaggcagtgt gctggtagct gccagctccg 540 acattggtga ccctcttcga gagctgggca gtgagtgcgg gattgagttt gacgaggaga 600 aaacggctgt cattgaccat cacaactatg acatctcaga ccttggccag catacgctca 660 tcgtggctga cactgagaac ctgctgaagg ccccaaccat cgttgggaaa tcatctctaa 720 atcccatcct ctttcgaggt gttgggatgg tggccgatcc tgataaccct ttggtgctgg 780 acatcctgac gggctcttcc acctcttact ccttcttccc ggacaagcct atcacccagt 840 atccacatgc ggtggggaag aacaccctcc tcattgctgg gctccaggcc aggaacaatg 900 cccgcgtcat cttcagcggc tccctcgact tcttcagcga ctccttcttc aactcagcag 960 tgcagaaggc ggcgcccggc tcccagaggt attcccagac aggcaactat gaactagctg 1020 tggccctctc ccgctgggtg ttcaaggagg agggtgtcct ccgtgtgggg cctgtgtccc 1080 atcatcgggt gggcgagaca gccccaccca atgcctacac tgtcactgac ctagtggagt 1140 atagcatcgt gatccagcag ctctcaaatg gcaaatgggt cccctttgat ggcgatgaca 1200 ttcagctgga gtttgtccgc attgatcctt ttgtgaggac cttcctgaag aagaaaggtg 1260 gcaaatacag tgttcagttc aagttgcccg acgtgtatgg tgtattccag tttaaagtgg 1320 attacaaccg gctaggctac acacacctgt actcttccac tcaggtatcc gtgcggccac 1380 tccagcacac gcagtatgag cgcttcatcc cctcggccta cccctactac gccagcgcct 1440 tctccatgat gctggggctc ttcatcttca gcatcgtctt cttgcacatg aaggagaagg 1500 agaagtccga ctgaggggct agagccctct ccgcacagcg tggagacggg gcaaggaggg 1560 gggttattag gattggtggt tttgttttgc tttgtttaaa gccgtgggaa aatggcacaa 1620 ctttacctct gtgggagatg caacactgag agccaagggg tgggagttgg gataattttt 1680 atataaaaga agtttttcca ctttgaattg ctaaaagtgg catttttcct atgtgcagtc 1740 actcctctca tttctaaaat agggacgtgg ccaggcacgg tggctcatgc ctgtaatccc 1800 agcactttgg gaggccgagg caggcggctc acgaggtcag gagatcgaga ctatcctggc 1860 taacacggta aaaccctgtc tctactaaaa gtacaaaaaa ttagctgggc gtggtggtgg 1920 gcacctgtag tcccagctac tcgggaggct gaggcaggag aaaggcatga atccaagagg 1980 cagagcttgc agtgagctga gatcacgcca ttgcactcca gcctgggcaa cagtgttaag 2040 actctgtctc aaatataaat aaataaataa ataaataaat aaataaataa aaataaagcg 2100 agatgttgcc ctcaaacttc acctggaaaa aaaaaaaaaa aaaa 2144 <210> 8 <211> 456 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Gly Tyr Phe Arg Cys Ala Arg Ala Gly Ser Phe Gly Arg Arg Arg 1 5 10 15 Lys Met Glu Pro Ser Thr Ala Ala Arg Ala Trp Ala Leu Phe Trp Leu 20 25 30 Leu Leu Pro Leu Leu Gly Ala Val Cys Ala Ser Gly Pro Arg Thr Leu 35 40 45 Val Leu Leu Asp Asn Leu Asn Val Arg Glu Thr His Ser Leu Phe Phe 50 55 60 Arg Ser Leu Lys Asp Arg Gly Phe Glu Leu Thr Phe Lys Thr Ala Asp 65 70 75 80 Asp Pro Ser Leu Ser Leu Ile Lys Tyr Gly Glu Phe Leu Tyr Asp Asn 85 90 95 Leu Ile Ile Phe Ser Pro Ser Val Glu Asp Phe Gly Gly Asn Ile Asn 100 105 110 Val Glu Thr Ile Ser Ala Phe Ile Asp Gly Gly Gly Ser Val Leu Val 115 120 125 Ala Ala Ser Ser Asp Ile Gly Asp Pro Leu Arg Glu Leu Gly Ser Glu 130 135 140 Cys Gly Ile Glu Phe Asp Glu Glu Lys Thr Ala Val Ile Asp His His 145 150 155 160 Asn Tyr Asp Ile Ser Asp Leu Gly Gln His Thr Leu Ile Val Ala Asp 165 170 175 Thr Glu Asn Leu Leu Lys Ala Pro Thr Ile Val Gly Lys Ser Ser Leu 180 185 190 Asn Pro Ile Leu Phe Arg Gly Val Gly Met Val Ala Asp Pro Asp Asn 195 200 205 Pro Leu Val Leu Asp Ile Leu Thr Gly Ser Ser Thr Ser Tyr Ser Phe 210 215 220 Phe Pro Asp Lys Pro Ile Thr Gln Tyr Pro His Ala Val Gly Lys Asn 225 230 235 240 Thr Leu Leu Ile Ala Gly Leu Gln Ala Arg Asn Asn Ala Arg Val Ile 245 250 255 Phe Ser Gly Ser Leu Asp Phe Phe Ser Asp Ser Phe Phe Asn Ser Ala 260 265 270 Val Gln Lys Ala Ala Pro Gly Ser Gln Arg Tyr Ser Gln Thr Gly Asn 275 280 285 Tyr Glu Leu Ala Val Ala Leu Ser Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Gly 290 295 300 Val Leu Arg Val Gly Pro Val Ser His His Arg Val Gly Glu Thr Ala 305 310 315 320 Pro Pro Asn Ala Tyr Thr Val Thr Asp Leu Val Glu Tyr Ser Ile Val 325 330 335 Ile Gln Gln Leu Ser Asn Gly Lys Trp Val Pro Phe Asp Gly Asp Asp 340 345 350 Ile Gln Leu Glu Phe Val Arg Ile Asp Pro Phe Val Arg Thr Phe Leu 355 360 365 Lys Lys Lys Gly Gly Lys Tyr Ser Val Gln Phe Lys Leu Pro Asp Val 370 375 380 Tyr Gly Val Phe Gln Phe Lys Val Asp Tyr Asn Arg Leu Gly Tyr Thr 385 390 395 400 His Leu Tyr Ser Ser Thr Gln Val Ser Val Arg Pro Leu Gln His Thr 405 410 415 Gln Tyr Glu Arg Phe Ile Pro Ser Ala Tyr Pro Tyr Tyr Ala Ser Ala 420 425 430 Phe Ser Met Met Leu Gly Leu Phe Ile Phe Ser Ile Val Phe Leu His 435 440 445 Met Lys Glu Lys Glu Lys Ser Asp 450 455

Claims (18)

  1. 각각 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6 및 서열번호 8로 기재되는 APOO(Apolipoprotein O), ATP1A1(ATPase, Na+/K+ transporting, alpha 1 polypeptide), CANX(calnexin) 및 DDOST(dolichyl-diphosphooligosaccharide -protein glycosyltransferase)로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머, 또는 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 상보적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 폐암 진단용 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 앱타머는 발색효소, 형광물질 및 방사성 동위원소로 구성된 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 검출체로 태깅(tagging)된 것을 특징으로 하는 폐암 진단용 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 비강 투여용인 것을 특징으로 하는 폐암 진단용 조성물.
  5. 각각 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6 및 서열번호 8로 기재되는 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머, 또는 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드를 코딩하는 각각 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5 및 서열번호 7로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 상보적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 폐암 진단용 키트.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제5항에 있어서, 상기 키트는 마이크로어레이 칩인 것을 특징으로 하는 폐암 진단용 키트.
  9. 피검체 유래 시료에서 각각 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6 및 서열번호 8로 기재되는 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    각각 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6 및 서열번호 8로 기재되는 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드의 발현 수준이 대조군보다 증가된 피검체를 폐암에 걸릴 위험이 있는 개체로 판정하는 단계를 포함하는, 폐암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 폴리펩티드 검출 방법.
  10. 삭제
  11. 제9항에 있어서, 상기 폴리펩티드의 발현 수준은 면역침강법(immunoprecipitation), 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, RT-PCR, 웨스턴 블롯(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 방법으로 측정되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 검출 방법.
  12. 각각 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6 및 서열번호 8로 기재되는 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 폐암 치료용 약학적 조성물.
  13. 삭제
  14. 제12항에 있어서, 상기 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드의 발현 억제제는 상기 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 및 작은 간섭 RNA(siRNA)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 폐암 치료용 약학적 조성물.
  15. 제12항에 있어서, 상기 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드의 활성 억제제는 상기 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드에 상보적으로 결합하는 앱타머, 항체 및 펩티드 미메틱스로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 폐암 치료용 약학적 조성물.
  16. 제12항에 있어서, 상기 조성물은 비강 투여용인 것을 특징으로 하는 폐암 치료용 약학적 조성물.
  17. 각각 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6 및 서열번호 8로 기재되는 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드를 발현하는 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;
    상기 세포주에서 각각 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6 및 서열번호 8로 기재되는 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드의 발현 정도를 측정하는 단계; 및
    상기 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드의 발현 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 폐암 치료용 후보 물질의 스크리닝 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 폴리펩티드의 발현 정도는 면역침강법(immunoprecipitation), 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, RT-PCR, 웨스턴 블롯(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
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