KR101489638B1

KR101489638B1 - 인간유래 항균 펩타이드의 분비를 촉진하는 신규화합물, 그제조방법, 및 이를 유효성분으로 함유하는피부외용제조성물

Info

Publication number: KR101489638B1
Application number: KR20080030142A
Authority: KR
Inventors: 박병덕; 곽형섭; 정세규; 배종환
Original assignee: (주)네오팜
Priority date: 2008-04-01
Filing date: 2008-04-01
Publication date: 2015-02-11
Also published as: KR20090104955A

Abstract

본 발명은 인간유래의 항균펩타이드인 β-디펜신, 카델리시딘의 분비 촉진효과를 가지는 신규한 화합물, 그 제조방법, 및 이를 유효성분으로 함유하는 항균펩타이드 분비 촉진용 피부외용제 조성물에 관한 것으로서, 본 발명 화합물은 항균펩타이드 분비를 촉진하며, 손상된 피부장벽의 회복효과를 가지며, 상처치유에도 효과적이다. 본 발명 화합물을 유효성분으로 하는 피부외용제는 피부 및 신체 내 조직기관에서 항균펩타이드의 분비를 발현시키므로 안전하고, 외용 또는 내용 형태로 투여하는 기존의 항균제로는 힘들었던 부위에 효과적인 항균작용을 발휘할 수 있다.

항균펩타이드, β-디펜신, 카델리시딘, 항균

Description

인간유래 항균 펩타이드의 분비를 촉진하는 신규화합물, 그 제조방법, 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부외용제조성물{HUMAN ANTIMICROBIAL PEPTIDES PROMOTER, METHOD FOR PREPARING THEREOF, AND COMPOSITION COMPRISING THE SAME AS ACTIVE INGREDIENT}

본 발명은 인간유래 항균 펩타이드의 분비를 촉진하는 화합물에 관한 것으로, 구체적으로는 인간유래 항균 펩타이드인 β-디펜신 타입 2 및 카델리시딘의 직접 혹은 간접 발현을 유도할 수 있는 신규한 화합물, 그 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부외용제조성물에 관한 것이다.

항생물질인 항균펩타이드는 생체방어 메카니즘에 관련된 자연면역물질인데, 세균(bacteria), 진균(fungi), 바이러스(viruses)와 같은 미생물의 생체막에 침투하여 이를 파괴하며 국소적인 감염방어까지 담당하는 저분자 물질이다. 항균펩타이드는 양친매성 구조를 가지는 데, 항균펩타이드의 양이온 부위가 미생물 세포막이 가지고 있는 음이온성 인지질에 결합하는 원리에 의해 항균활성을 나타낸다.

디펜신(defensin)은 항균펩타이드 중 가장 연구가 많이 된 것들 중 하나이다. 디펜신에는 α-디펜신과 β-디펜신이 있다. β-디펜신은 피부, 폐, 기관, 신 장, 생식기 등의 점막 상피에서 발현되는 디펜신으로서, 현재까지 인간유래 β-디펜신으로는 6종류, 즉 인간 β-디펜신-1(hBD-1), 인간 β-디펜신-2(hBD-2), 인간 β-디펜신-3(hBD-3), 인간 β-디펜신-4(hBD-4), 인간 β-디펜신-5(hBD-5)및 인간β-디펜신-6(hBD-6)이 단리되어(isolated) 그 구조가 결정되어 있다. hBD-1은 표피세포에서 일정하게 발현이 되지만 hBD-2는 피부에 손상이 있을 경우 매우 많이 발현되며, 면역반응과 염증의 치료에 중요 역할을 담당하고 있다. hBD-3는 건선피부 환자에게서 매우 높게 발현되는 것으로 알려져 있다. 또한 최근에 β-디펜신은 국소 감염 방어뿐만 아니라, 수상 세포(dendritic cells), T 림프구(lymphocytes), 단핵 세포(monocytes) 등의 세포를 주화성 이동(chemotactic migration) 시킴으로써 후천성 면역에도 관여하고 있는 것으로 알려져 있다.

카델리시딘(Cathelicidin)은 광범위한 항균작용을 나타내며 다양한 면역조절작용 기능을 한다. 인간 유래 카델리시딘(cathelicidin)인 LL-37은 α-헬릭스 구조를 가지고 있으며 다양한 염증조절 기능을 갖는다. 또한 LL-37은 거대세포에서도 분비된다. LL-37은 직접적인 항균역할을 하고 있으며 호중구, 단일세포, T 세포에 대한 주화성을 나타내며 내피세포의 증식을 유도한다. 피부에 존재하여 외래항원의 침투시 즉각적인 방어역할을 함으로써 항원 억제 기능을 담당한다.(Braff MH, Bardan A, Nizet V.et.al. Cutaneous defense mechanisms by antimicrobial peptides. J Invest Dermatol, 2005, vol.125,p.9).

염증완화를 위한 자연치유 물질인 디펜신, 카델리시딘은 피부의 손상이 있을 경우에 분비되어 항원을 억제하며, 또한 케라티노사이트(keratinocyte)의 분화, 증 식을 유도하여 상처치유의 역할도 담당하고 있다. (Niyonsaba F, Ushio H, Nakano N, et.al Antimicrobial peptides human b-defensins stimulate epidermal keratinocyte migration, proliferation and production of proinflammatory cytokines and chemokines. J Invest Dermatol, 2007,vol.127,p.594). 아토피 피부염 환자의 피부에는 디펜신, 카델리시딘 등 자연항생물질이 부족해서 포도상구균(葡萄狀球菌)이 비정상적으로 기승을 부린다는 연구 결과가 발표되기도 했다.(The England Journal of Medicine, "Endogenous Antimicrobial Peptides and Skin Infections in Atopic Dermatitis", Peck Y. Ong, and others Vol.347 No.15 Page 1151-1160)

따라서, 피부에서의 항균펩타이드의 발현 유도는 외래 항원에 대한 일차 방어 및 치료에 있어서 중요하다. 사람의 피부에서 β-디펜신, 카델리시딘의 발현을 유도함으로써 피부의 손상을 일차 방어하며 상처 난 부위를 보호하여 외래항원의 침입을 차단하는 것은 피부보호 및 피부건강 유지에 있어 중요한 역할을 한다.

종래 항균펩타이드 분비 촉진 효과를 가지는 물질들이 알려져 있었는바, 한국특허공개 제10-2006-0076775호에는 각종 유기산이 인간 β-디펜신의 분비를 촉진하는 작용을 발휘한다는 것이 개시되어 있으며, 국제특허공개 WO 0168085호에는 아미노산인 이소류신(Isoleucine)이 디펜신 분비촉진 작용을 한다는 것이 개시되어 있다. 그러나 일부 물질의 경우에는 그 효과가 만족스럽지 못하고, 염증유발 싸이토카인의 분비를 유도하는 경우가 있었다. 따라서, 항균펩타이드 분비 촉진활성이 더욱 우수하면서도 염증유발 싸이토카인의 분비를 유도하지 않는 화합물에 대한 요 구가 있어왔다.

본 발명자들은 새로운 항균펩타이드 분비촉진 물질을 합성하고자 오랫동안 다양한 물질을 합성하고 그 활성을 실험하는 과정을 거쳤다. 그 결과 인간 유래 β-디펜신과, 카델리시딘의 분비 촉진효과가 뛰어난 신규한 화합물을 합성하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 인간 유래의 항균펩타이드의 분비를 촉진하는 신규한 화합물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기의 인간 유래 항균펩타이드 분비 촉진 신규화합물의 제조방법을 제공한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기의 인간 유래 항균펩타이드 분비 촉진 신규화합물을 유효성분으로 함유하는 피부외용조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면 하기의 화학식(I)로 표시되는 신규 화합물이 제공된다.

(상기 식 중 R₁, R₂는 독립적으로 수소 또는 탄소수 1∼20의 직쇄형 또는 분지형 알킬기이고, R₃는 수소 또는 메틸기이다.)

상기 화학식 (I)은 인간 유래의 항균펩타이드, 구체적으로는 β-디펜신 및/또는 카델리시딘의 분비를 촉진하는 효과를 가진다.

본 발명에 있어 더욱 바람직한 화합물은 상기의 화합물 식 중에서 R₁, R₂ 가 각각 탄소수 6의 직쇄 알킬기이고, R₃가 메틸기인 화합물이며, 하기의 화학식 (Ia)와 같이 표시된다.

또한, 본 발명에 따르면 하기의 단계를 포함하는 항균펩타이드 분비 촉진용 신규화합물의 제조방법이 제공된다.

A) 유기용매에서 옥타노일 클로라이드와 트리에틸아민(TEA)을 반응시켜 하기 화학식 (II)화합물을 얻는 단계

B) 하기 화학식 (II) 화합물과 L-티로신 메틸 에스테르(L-Tyrosine methyl ester)에 에탄올을 가하여 교반하는 단계

C) 상기 B)단계 반응생성물을 추출하고 크로마토그래프로 분리하여 상기 화학식 (Ia)화합물을 얻는 단계

상기 제조합성공정에 있어서 유기용매로는 톨루엔을 사용할 수 있으며, 상기 A)공정에서 옥타노일클로라이드와 트리에틸아민은 0.8∼1.2:1의 몰비로 사용되는 것이 바람직하며, 상기 B)공정에서 상기 화학식 (II)화합물과 L-티로신 메틸 에스테르는 1:1의 몰비로 사용되는 것이 바람직하다.

본 발명에 따르면 상기 화학식 (I)의 신규화합물을 활성성분으로 가지는 항균펩타이드 분비 촉진용 피부외용제 조성물이 제공된다.

본 발명에 있어 상기 피부외용제 조성물은 활성성분으로서의 상기 화학식 (I) 또는 (Ia) 화합물을 0.001∼90 중량%, 더욱 바람직하게는 0.001∼50 중량% 포함할 수 있다. 또한 상기 피부외용제 조성물은 피부나 점막에 적용 가능한 한 그 제형에 대해서는 특별히 제한되는 것은 아니나, 액상, 유액상, 현탁액상, 크림상, 연고상, 겔상, 젤리상, 스프레이상으로 제조될 수 있다.

이하 본 발명에 따른 항균펩타이드 분비 촉진용 신규 화합물에 대하여 상세하게 설명한다. 본 발명의 항균펩타이드 분비 촉진용 신규화합물은 하기의 화학 식(I)의 구조를 가진다.

본 발명에 있어서 더욱 바람직한 화합물은 상기 식 중에서 R₁, R₂가 각각 탄소수 6의 직쇄형 알킬기이고, R₃가 메틸기인 경우이다. 이를 구조식으로 나타내면 하기 식(Ia)와 같다.

상기 화합물(Ia)은 하기와 같은 방법에 의하여 제조된다.

C ₆ 알킬케텐다이머(AKD)의 제조

옥타노일 클로라이드에 유기용매(톨루엔)를 가하고 반응기 온도를 -5℃이하로 내린다. 여기에 트리에틸아민(TEA)을 반응기 내 온도변화 없이 천천히 첨가한다. TEA가 모두 첨가되고 1시간 동안 교반하고, 실온에서 3∼4시간 교반한다. 반응물에 물을 가하고 CH₂Cl₂로 추출한다. MC층을 Na₂SO₄로 건조하고 필터링(filter) 한 후 용매는 감압 건조한다. Column chromatograph (EA:Hex=1:30)로 분리하고 용매를 감압 건조하면 연한 노란색의 액체를 얻는다.

Rf (EA:Hex=1:20) : 0.55

1H NMR (300MHz, CDCl₃) : δ 0.9(t, 6H, CH₃), 1.29∼1.44(br, 16H, CH₂), 1.76(q, 2H, CH₂ CH ₂ CHCO), 2.12(q, 2H, CH₂ CH ₂ CH=C), 3.93(t, 1H, CH₂ CHCO), 4.69(t, 1H, CH₂ CH=C)

상기 합성에 있어서 옥타노일 클로라이드와 트리에틸아민(TEA)은 0.8∼1.2:1의 몰비로 사용되는 것이 좋으며, 반응온도는 0℃이하, 바람직하게는 -5℃에서부터 실온까지 승온 시키면서 합성을 진행한다.

상기 식( Ia )화합물(‘ NP - AMP019 ’으로 명명함)의 제조

L-티로신 메틸 에스테르(L-Tyrosine methyl ester)와 상기 단계에서 합성된 C6 AKD(화학식 II)를 넣고 에탄올을 가하여 2∼3시간 교반한다. 반응물에 물을 가하고 HCl로 산성화시키고 EA를 넣어 2회 추출한다. EA층을 브라인(brine)으로 2회 씻어 준 후 Na₂SO₄로 건조하고 필터링(filter) 한 후 용매는 감압 건조한다. Column chromatograph (MC:EtOH=10:1)로 분리하고 용매를 감압 건조하면 흰색 고체를 얻는다.

Rf (MC:EtOH=1:1) : 0.33

1H NMR (300MHz, CDCl₃) : δ 0.87(t, 6H, CH₃), 1.22∼1.38(br, 16H, CH₂), 1.55∼1.56 (m, 4H, NHCH(CH₂ CH ₂ )CO, CH₂ CH ₂ CH₂CO), 1.83(q, 2H, CH₂ CH ₂ CH(CO)CO), 1.91(q, 2H, NHCH(CH ₂ CH₂)CO), 2.54(t, 2H, CH₂ CH ₂ CO) 2.65(t, 2H, NHCH(CH₂ CH₂ CH ₂ NH)CO) 3.39(t, 1H, CH₂ CH (CO)CO), 3.74(s 3H, OCH ₃ ), 4.54(m 1H, NHCH(CH₂)CO), 6.79(d, 1H, NH)

상기 합성에 있어서, L-티로신 메틸 에스테르(L-Tyrosine methyl ester)와 C6 AKD(화학식 II)화합물은 동일 몰비로 사용되는 것이 바람직하다.

이와 같이 합성된 상기 화학식 (Ia)화합물을 가지고, β-디펜신 및 카델리시딘 분비 촉진을 확인하는 시험을 한 결과, 본 발명 화합물은 세포내에서 인간 β-디펜신-2 및 LL-37의 분비를 촉진하는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 상기 화학식 (Ia)화합물을 가지고, 피부장벽회복 실험을 한 결과, 본 발명 항균펩타이드 유도 화합물이 피부장벽회복에 효과가 있음을 확인할 수 있었으며, 상처치유에도 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

인간 유래 항균펩타이드인 디펜신은 짧은 시간에 항균작용을 나타내고, 피부 및 신체 내 조직기관에서 분비되기 때문에, 디펜신 및 카델리시딘의 분비를 촉진하는 본 발명 화합물 및 이를 포함하는 외용제 조성물은 외용 또는 내용 형태로 투여하는 기존의 항균제로는 힘들었던 부위에 효과적인 항균작용을 발휘할 수 있다.

본 발명의 인간 디펜신 분비 촉진제는, 적용된 부위에서 β-디펜신-2 분비 촉진을 유도하여 생체내의 항균작용이나 면역작용을 증가시켜 생체의 방어기능을 더욱 효과적으로 할 수 있게 된다. 따라서, 본 발명의 항균펩타이드 분비 촉진 물질은 외래 항원인 세균, 진균, 바이러스와 같은 감염이 원인이 되어 일어나는 증상의 예방 및 치료에 효과적이다. 무엇보다 항균펩타이드의 감소를 보이는 아토피성 피부에 도포하면 항균펩타이드의 증가를 유도하므로 외래항원의 침입을 억제하는 효과적인 이점을 얻을 수 있다.

이하, 하기의 실시예와 시험예들을 통하여 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명이 이 예들에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 화합물의 제조

C ₆ AKD 제조

옥타노일 클로라이드(Octanoyl chloride) 100g(0.61㏖)에 톨루엔 800ml를 가하고 아이스 배쓰(ice bath)를 이용하여 반응기 온도를 -5℃이하로 내린다. 여기에 트리에틸아민(TEA) 69g(0.68㏖ 1.1eq)을 드롭와이즈(dropwise)를 이용하여 반응기 내 온도 변화 없이 천천히 첨가한다. TEA가 모두 첨가 되고 1시간 동안 교반하고, 아이스 배쓰를 제거하고 실온에서 3∼4시간 교반한다. 반응물에 물을 가하고 CH2Cl2로 추출한다. MC층을 Na₂SO₄로 건조하고 필터한 후 용매는 감압 건조한다. 컬럼 크로마토그래프(Column chromatograph) (EA:Hex=1:30)로 분리하고 용매를 감압 건조하면 연한 노란색의 액체를 69g(90% yield)를 얻는다.

R_f (EA:Hex=1:20) : 0.55

¹H NMR (300MHz, CDCl₃) : δ 0.9(t, 6H, CH₃), 1.29∼1.44(br, 16H, CH₂), 1.76(q, 2H, CH₂ CH ₂ CHCO), 2.12(q, 2H, CH₂ CH ₂ CH=C), 3.93(t, 1H, CH₂ CHCO), 4.69(t, 1H, CH₂ CH=C)

NP - AMP019 의 제조

L-티로신 메틸 에스테르(L-Tyrosine methyl ester) 5g (0.026㏖)과 C6 AKD 6.46g (0.026㏖) 넣고 에탄올을 50ml 가하여 2∼3시간 교반한다. 반응물에 물을 200ml 가하고 1N HCl로 산성화 시키고 EA 200ml를 넣어 2회 추출한다. EA층을 브라인(brine)으로 2회 씻어 준다. EA층을 Na₂SO₄로 건조하고 필터 한 후 용매는 감압 건조한다. 컬럼 크로마토그래프(Column chromatograph) (MC:EtOH=10:1)로 분리하고 용매를 감압 건조하면 흰색 고체 6.87g(60% yield)를 얻는다.

R_f (MC:EtOH=1:1) : 0.33

¹H NMR (300MHz, CDCl₃) : δ 0.87(t, 6H, CH₃), 1.22∼1.38(br, 16H, CH₂), 1.55∼1.56(m, 4H, NHCH(CH₂ CH ₂ )CO, CH₂ CH ₂ CH₂CO), 1.83(q, 2H, CH₂ CH ₂ CH(CO)CO), 1.91(q, 2H, NHCH(CH ₂ CH₂)CO), 2.54(t, 2H, CH₂ CH ₂ CO) 2.65(t, 2H, NHCH(CH₂ CH₂ CH ₂ NH)CO) 3.39(t, 1H, CH₂ CH (CO)CO), 3.74(s 3H, OCH ₃ ), 4.54(m 1H, NHCH(CH₂)CO), 6.79(d, 1H, NH)

상기 실시예 1의 합성물질(NP-AMP019)을 이용 β-디펜신 분비 촉진 효과를 평가하기 위해서 in vitro 실험을 수행하였다.

시험예 1: β- 디펜신 및 카델리시딘 분비촉진확인 시험

인간 케라티노사이트(Human keratinocyte, HaCaT)를 키우기 위해 세럼이 없고 1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함한 배지를 이용하였다. 37℃, 5％ CO₂ 인큐베이터에서 키운다. 6 웰 플레이트에 1*10^5 cells/well로 각 웰에 넣은 후 24시간 동안 키운다. 다음날 1.7mM calcium chloride 와 합성물질(NP-AMP019)을 첨가하여 24시간 동안 반응시킨다.

적어도 하나의 무처리 대조군과 적어도 하나의 양성 대조군을 함께 사용한다. 양성 대조군은 hBD-2에 대해서는 TNF-a, LL-37에 대해서는 LPS 100ng/mL로 반응시킨다. 상기와 같이 접촉시킨 후, 상등액을 수집하고 세포를 PBS(Phosphate Buffer Saline)로 세척한다. 반응이 끝난 후 세포를 튜브에 모은다. RNA를 뽑기 위해 트라이졸 시약을 1ml첨가한다. 상온에서 15초 반응한 후 클로로포름(chloroform)을 200ul 첨가한다. 13,000 rpm에서 10분간 원심분리한다. 상층액을 다른 튜브에 옮겨 담은 후 이소프로판올(isopropanol) 500ul를 첨가한 후 13,000 rpm에서 10분간 원심 분리한다. 침전된 RNA를 70% 에탄올 이용하여 세척을 수행한다. 2번 연속 수행 후 3차 증류수를 이용 RNA를 녹인다. 희석한 RNA를 260 과 280nm 사이에서 분석하며 정량한다.

이렇게 얻은 RNA를 RT-PCR 과정을 통해 PCR 결과를 얻는다. RT-PCR을 하기 위해 MgCl2 2ul, RT buffer 1ul, dNTP mix1 ul, Rnase inhibitor 0.25ul, RTase 0.5ul, oligo dT 0.5ul, 증류수 3.75ul, RNA 2ug을 튜브에 넣은 후 반응시킨다. RT-PCR 반응 조건은 45℃에서 1시간, 95℃에서 5분 수행한다. GAPDH, hBD2 및 LL-37에 대한 정성 분석인 PCR을 수행한다. 사용한 프라이머는 다음의 문헌에서 얻었다.(Kim JE, Kim BJ, Jeong MS, et.al Expression and Modulation of LL-37 in Normal Human Keratinocytes,HaCaT cells, and Inflammatory Skin Diseases. J Korean Med Sci 2005, vol.20, p649, Pernet I, Reymermier C, Guezennec A,et.al Calcium triggers beta-defensin (hBD-2 and hBD-3) and chemokine macrophage inflammatory protein-3 alpha (MIP-3alpha/CCL20) expression in monolayers of activated human keratinocytes. Exp Dermatol. 2003 vol.12, p755). 사용한 프라이머는 다음과 같다.

GAPDH 센스 : 5'- GGG CAT GAA CCA TGA GAA GT -3'

GAPDH 안티센스 : 5'-GTC TTC TGG GTG GCA GTG AT -3'

hBD-2 센스: 5'- CCA GCC ATC AGC CAT GAG GGT-3'

hBD-2 안티센스: 5'-GGA GCC CTT TCT GAA TCC GCA-3'

LL-37 센스: 5'-TCG GAT GCT AAC CTC TAC CG-3'

LL-37 안티센스: 5'-GGG TAC AAG ATT CCG CAA AA-3'

PCR을 PCR premix 12.5ul, Primer sense(10uM) 2ul, Primer anti-sense(10uM) 2ul, cDNA 1.5ul 증류수 7ul를 넣은 후 반응시킨다. hBD-2의 PCR 조건은 94℃ 30초, 59℃ 30초, 72℃ 30초에서 30 싸이클을 순환시킨 후 72℃에서 10분 수행한다. LL-37의 PCR 조건은 94℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 30초에서 30싸이클을 순환시킨 후 72℃에서 10분 수행한다. 증폭 후 최종 산물을 서로 혼합하고 최종용액을 자외선 하에서 판독할 수 있는 핵산 삽입부(에티이움 브로마이드와 같은)를 1.5%로 굳힌 아가로오스젤에 로딩한다. 위의 시료를 이동시킨 후 암실에서 자외선 하에서 판독하여 컴퓨터상에서 사진을 찍는다. 밴드강도를 정량화할 수 있는 이미지 프로세싱 소프트웨어에서 상기 젤 사진을 분석한다. 디펜신 및 카델리시딘의 기초 발현이 검출되지 않기 때문에(무처리 대조군), hBD-2/GAPDH 및 LL-37/GAPDH 밴드 강도의 비를 이용하여 항균펩타이드 발현유도를 검출할 수 있다. 이 결과를 좀더 명확히 하기 위해 real time PCR을 수행한다. Sybergreen 5 ul, Primer sense(10uM) 2ul, Primer anti-sense(10uM) 2ul, cDNA 1ul, 증류수 1ul를 넣은 후 반응시킨다.

이 결과로 얻은 결과물을 프로그램을 이용 분석한다. 얻어진 결과를 도 1에 나타낸다. 이러한 결과로부터, 본 합성물질은 세포내에서 인간 β-디펜신-2 및 LL-37의 분비를 촉진하는 것을 확인할 수 있었다.

시험예 2: β- 디펜신 및 카델리시딘 분비촉진확인 시험

HaCaT을 80% 콘플런스가 되도록 유리 커버슬립(coverslip)에서 키운 후 합성물질(NP-AMP019)을 농도별 처리한 후 메탄올을 이용 30분 동안 4℃에서 고정시킨다. Donky 세럼을 30분간 처리한다. 1시간 동안 polyclonal chicken anti-hCAP18/LL-37 antibody 와 goat anti -human hBD-2를 반응시킨 후 PBS를 이용 5분 간격으로 3번 세척해준다. 이어서 donkey anti-chicken TRITC, donkey anti-goat FITC antibody 30분 반응한 후 광초점 현미경을 통한 세포로부터 발현되는 디펜신 및 카델리시딘을 측정한다.

얻어진 결과를 도 2에 나타내었다. 이러한 결과로부터, 본 발명 화합물은 세포내에서 인간 β-디펜신-2 와 LL-37의 분비를 촉진하는 것을 확인할 수 있었다.

시험예 3: β- 디펜신 및 카델리시딘 분비촉진확인 시험

무모생쥐를 1% 옥사졸론(Oxazolone)을 감작 시킨 후 일주일 후 0.1% 옥사졸론을 격일로 10번 도포한다. 항균펩타이드 감소 유도한 마우스에 6일 동안 vehicle(PEG:EtOH)(7:3)과 1% 합성물질(NP-AMP019)을 일정량 오전, 오후에 도포한다. 마지막 날 마우스를 희생시킨 후 얻은 마우스의 피부를 취한 후 파라핀 블록을 만든다. 파라핀 절단기를 이용 슬라이드 위에 조직을 붙인다. Peroxides blocking 시약을 500ul 로딩 후 30분 동안 반응한다. PBS 용매를 이용 5분 간격으로 3번 씻어낸다. Protein blocking 시약을 500ul 로딩 후 15분간 반응한다. 일차 anti- mouse β-defensin 3와 anti- mouse CRAMP를 각각 30분 동안 25℃에서 반응한다. 이차 안티바디로 donky anti-goat IgG-FITC를 30분 동안 25℃에서 반응한다. 반응 종료 후 광 초점 현미경을 통해 피부의 각질층에서 mBD-3와 CRAMP의 발현을 측정한다.

본 발명 합성물질을 도포한 마우스의 피부각질층에서 mBD-3와 CRAMP의 발현이 증가하는 것으로 측정되었다. 얻어진 결과를 도 3에 나타내었다. 이러한 결과 로부터, 본 발명 합성물질은 피부에서 항균펩타이드 분비를 촉진하는 것을 확인할 수 있었다.

시험예 4: 피부장벽 손상 회복시험

무모생쥐를 이용하여 장벽을 손상시킨 후 본 발명 합성화합물(NP-AMP019)이 장벽회복에 영향을 주는 결과를 얻기 위하여 본 실험을 수행하였다. 무모생쥐의 좌, 우 표피의 손상을 주기 위해 D-Squame을 이용 표피의 손상을 준다. 이때 경피수분손실(TEWL: trans epidermal water loss)을 측정하여 값의 차이가 거의 없도록 유지한 후 vehicle(PEG:EtOH)(7:3), 본 발명 합성물질(NP-AMP019)을 도포한다. 3시간, 6시간, 24시간 경과 후 TEWL을 측정하여 장벽회복능을 측정하였다.

측정결과 vehicle만 도포한 마우스보다 본 발명 합성물질(NP-AMP019)을 도포한 마우스에서 장벽회복능이 빠르게 측정되었다.

얻어진 결과를 도 4에 나타내었다. 이러한 결과로부터 본 발명 항균펩타이드 유도 물질이 장벽회복에 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

시험예 5: 피부장벽 손상 회복시험

무모생쥐 피부의 좌, 우 경피수분손실(TEWL)을 오전에 측정한 후 아무것도 처리하지 않은 마우스를 이용하여 테이프 스트리핑(tape stripping) 하여 측정치 결과가 45∼50(g/㎠/hr)이 되도록 맞춘다. 각 그룹을 동일하게 테이프 스트리핑(tape stripping)하여 45∼50(g/㎠/hr)으로 맞춘다. 오후에도 위와 같은 동일한 실험을 수행한다. 실험수행 한 2일째부터 5일째까지 오전에 TEWL를 측정한 후 아무것도 처리하지 않은 마우스에 테이프 스트리핑(tape stripping) 하여 30∼40(g/㎠/hr)에 맞춘 후 각 그룹을 동일하게 30∼40(g/㎠/hr)으로 맞춘다. 이때부터 주의할 사항은 동일한 힘의 세기와 테이프 스트리핑 횟수로 실험을 수행한다. 6일째 되는 날 실험에 사용된 모든 마우스를 희생시킨 후 측정한 부위의 피부를 도려내어 파라핀 블록을 만든 후 H&E 염색을 통해 피부의 두께를 측정한다.

측정결과 아무것도 처리하지 않은 마우스 및 vehicle만 도포한 마우스 결과와 비교하여 본 발명 합성물질(NP-AMP019)을 도포한 마우스에서 피부의 두께가 두꺼워 지지 않는 결과를 확인하였다. 이 결과를 통해 만성 장벽 손상된 피부의 회복을 항균 펩타이드 유도 물질인 본 발명 화합물(1% NP-AMP019)이 효과적으로 장벽손상을 회복시키는 결과를 얻었다.

얻어진 결과를 도 5a 및 도 5b에 나타내었다. 이러한 결과로부터 본 발명 항균펩타이드 유도 물질이 장벽회복에 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

시험예 6: 상처치유 효과시험

인간 케라티노사이트 (HaCaT)을 24 웰 플레이트에 2*10^4 cells/well로 각 웰에 넣은 후 24시간 동안 키운다. 200 ul 팁을 이용하여 정 중앙을 나눈 후 세럼 메디아에 본 발명 합성물질(NP-AMP019)을 농도 의존적으로 처리한다. 양성 대조군은 hBD-2 5ug/mL로 반응시킨다. 상기와 같이 반응시킨 후 24시간, 48시간에 따른 세포의 움직임을 측정한다.

측정결과 아무것도 처리하지 않은 콘트롤 그룹과 비교하였을 때 농도에 따른 세포의 빠른 움직임을 확인할 수 있었다. 얻어진 결과를 도 6에 나타내었다. 이러한 결과로부터 본 발명 합성물질(NP-AMP019)이 상처치유에 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 2: 크림제제의 제조

통상의 크림제조의 방법으로 하기의 조성을 가지는 크림을 제조하였다.

	Function	Ingredient	중량%
수상	방부제	Methyl paraben	0.2
	폴리머	xanthan gum	0.1
	보습제	Glycerine	8.0
	정제수	Water	74.0
유상	지방산	Stearic acid	2.0
	고급알코올	Cetanol	2.0
	왁스류	Bees wax	2.0
	계면활성제	POE(15) GMS	2.5
	계면활성제	POE(10) GMS	1.0
	계면활성제	GMS	1.5
	오일류	Macademia nut oil	3.0
	오일류	Squalane	3.0
	방부제	Propyl paraben	0.1
	유효성분	NP-AMP-01	0.5
첨가물	향료	Fragrance	0.1

상기 실시예 2에 의해 제조된 크림은 그 저장 안정성이 우수하고, 사용감도 우수한 것으로 확인되었다.

본 발명에 따른 항균펩타이드 분비촉진 피부외용제 조성물은 피부 및 신체 내 조직기관에서의 항균펩타이드의 발현을 유도하므로 외용 또는 내용 형태로 투여 하는 기존의 항균제로는 힘들었던 부위에 효과적인 항균작용을 발휘할 수 있다. 또한 T 림포사이트를 주화성으로 행동하게 하여 면역담당 세포의 유도를 통해 면역기능에 중요한 기능을 담당하며 2차 감염을 방지하는 효능을 가지므로, 아토피피부염이나 화상 등에 의해 감염되기 쉬운 피부에 적용 가능한 화장료 조성물이나 의약용 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명 합성물질이 세포내에서 인간유래 항균펩타이드인 hBD-2와 LL-37을 발현시키는 정도를 나타내는 그래프이고,

도 2는 본 발명 합성물질이 피부의 각질층에서 인간유래 항균펩타이드인 hBD-2와 LL-37을 발현시키는 정도를 나타내는 사진이고,

도 3은 본 발명 합성물질을 도포한 마우스의 피부각질층에서 mBD-3와 CRAMP의 발현정도를 나타내는 사진이고,

도 4는 본 발명 합성물질을 도포한 마우스에서의 피부장벽회복능을 나타내는 그래프이고,

도 5a 및 도 5b는 본 발명 합성물질을 만성손상 마우스 피부에 도포하였을 때의 피부두께 측정에 따른 장벽회복 능을 나타내는 사진 및 그래프이고,

도 6은 본 발명 합성물질의 상처치유 효과를 나타내는 그래프이다.

Claims

하기의 화학식(I)로 표시되는 항균펩타이드 분비촉진용 신규 화합물.

(상기 식 중 R₁, R₂는 독립적으로 수소 또는 탄소수 1∼20의 직쇄형 또는 분지형 알킬기이고, R₃는 수소 또는 메틸기이다.)
제1항에 있어서 상기 항균펩타이드는 인간유래의 β-디펜신, 또는 카델리시딘, 또는 β-디펜신과 카델리시딘인 것을 특징으로 하는 항균펩타이드 분비촉진용 신규 화합물.
제1항에 있어서 상기의 화합물 식(I) 중에서 R₁, R₂가 각각 탄소수 6의 직쇄 알킬기이고, R₃가 메틸기인 화합물이며, 하기의 화학식 (Ia)와 같이 표시되는 항균펩타이드 분비촉진용 신규 화합물.
하기의 단계를 포함하는 항균펩타이드 분비촉진용 신규화합물의 제조방법.

A) 유기용매에서 옥타노일 클로라이드와 트리에틸아민(TEA)을 반응시켜 하기 화학식 (II)화합물을 얻는 단계

B) 하기 화학식 (II) 화합물과 L-티로신 메틸 에스테르(L-Tyrosine methyl ester)에 에탄올을 가하여 교반하는 단계

C) 상기 B)단계 반응생성물을 추출하고 크로마토그래프로 분리하여 상기 청구항 제3항의 화학식 (Ia)화합물을 얻는 단계
제4항에 있어서, 상기 A)공정에서 옥타노일클로라이드와 트리에틸아민은 0.8∼1.2:1의 몰비로 사용되며, 상기 B)공정에서 상기 화학식 (II)화합물과 L-티로신 메틸 에스테르는 1:1의 몰비로 사용되는 것을 특징으로 하는 항균펩타이드 분비촉진용 신규화합물의 제조방법.
하기 화학식 (I)의 화합물을 활성성분으로 가지는 항균펩타이드 분비촉진용 피부외용제 조성물.

(상기 식 중 R₁, R₂는 독립적으로 수소 또는 탄소수 1∼20의 직쇄형 또는 분지형 알킬기이고, R₃는 수소 또는 메틸기이다.)
하기 화학식 (Ia)의 화합물을 활성성분으로 가지는 항균펩타이드 분비촉진용 피부외용제 조성물.
제6항 또는 제7항에 있어서, 활성성분으로서의 상기 화합물을 0.001∼90중량% 함유하는 것을 특징으로 하는 항균펩타이드 분비 촉진용 피부외용제 조성물.
제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 피부외용제 조성물은 액상, 유액상, 현탁액상, 크림상, 연고상, 겔상, 젤리상, 또는 스프레이상인 것을 특징으로 하는 항균펩타이드 분비 촉진용 피부외용제 조성물.