KR101483589B1 - 새싹보리 추출물 및 이로부터 분리된 폴리코사놀계 화합물을 포함하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학 조성물 - Google Patents

새싹보리 추출물 및 이로부터 분리된 폴리코사놀계 화합물을 포함하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 새싹보리 유래 폴리코사놀 성분인 헥사코사놀, 옥타코사놀 등의 폴리코사놀의 함량이 높은 추출물 및 그의 제조 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 본 추출방법은 보리를 품종별로 파종하여 발아시켜 길이가 15∼25cm 전후로 될 때 뿌리를 제외한 지상부를 수확하여 건조, 분쇄하여 헥산 또는 주정으로 추출, 농축 및 유기용매를 진공에서 제거하는 것을 특징으로 하여, 고농도의 헥사코사놀, 옥타코사놀 등의 폴리코사놀을 함유하는 추출물을 제조하는 방법과 최적 수확시기, 최적추출방법 및 보리품종 선발에 관한 것이다. 헥사코사놀, 옥타코사놀 등의 폴리코사놀은 콜레스테롤 개선, 항동맥경화, 항당뇨, 항혈전, 항균활성, 지구력 강화 및 기능성 화장료로 효과가 있음이 알려져 있다.
또한, 새싹보리 유래 헥산 추출물에 대한 헥사코사놀, 옥타코사놀 등의 폴리코사놀의 구성성분에 대한 정량분석 과 AMP(Adenosine monophosphate)Kinase 인산화 활성 단백질의 발현 검정 등을 수행하였으며 새싹보리의 헥사코사놀, 옥타코사놀 및 폴리코사놀을 함유하는 추출물을 이용한 조성물들은 콜레스테롤 개선, 항동맥경화, 당뇨, 항균, 혈전용해, 피부활력 증가 및 지구력증진 등의 건강 기능성 식품, 기능성 화장품 등의 원료 및 제품 등에 이용될 수 있다.

Description

새싹보리 추출물 및 이로부터 분리된 폴리코사놀계 화합물을 포함하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학 조성물 {Extract from barley sprout and metabolic disease prevention comprising policosanol compounds separated from the same and treatment pharmaceutical composition}
본 발명은 새싹보리 유래 헥사코사놀 및 옥타코사놀 등의 폴리코사놀 함량이 높은 지질을 제조하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 새싹보리 유래 폴리코사놀 성분 중 에이코사놀(Eicosanol), 헤네이코사놀(Heneicosanol), 도코사놀(Docosanol), 트리코사놀(Tricosanol), 테트라코사놀(Tetracosanol), 헥사코사놀(Hexacosanol), 헵타코사놀(Heptacosanol), 옥타코사놀(Octacosanol), 트리아콘타놀(Triacontanol) 성분을 함유하는 추출물을 제조하는 방법과 최적 수확시기, 보리품종 선발에 관한 것이다. 또한 새싹보리 유래 헥산 추출물에 대한 헥사코사놀, 옥타코사놀 및 폴리코사놀의 구성성분에 대한 정량과 AMP(Adenosine monophosphate)Kinase 인산화 활성 단백질의 발현 검정 등을 수행하였으며 이를 이용한 비만, 콜레스테롤 개선, 당뇨, 혈전예방, 항균, 피부활력 증가 및 지구력증진 등의 식품, 화장료, 천연물의약품 등의 활용에 관한 분야이다.
현대사회의 의학기술 발달로 인해 사회는 고령화 되어가고 경제발달로 인해 건강에 대한 인식이 확산되고 있으며 높은 삶의 질을 추구하는 현상은 우리나라 뿐 만 아니라 전 세계적인 추세가 되었으며 이러한 현상은 향후 더욱 가속화 될 것으로 예측된다. 따라서 매우 빠른 속도로 변화되고 있는 사회현상과 점차 다양화 되어가는 소비자의 기대를 충족시킬 수 있는 새로운 바이오메디컬 소재개발, 기능성 식품소재 개발 및 웰빙소재 개발이 필요한 실정이다.
새싹보리(어린보리잎)는 예전부터 칼슘, 마그네슘 및 칼륨 등의 무기성분 함량이 높을 뿐 아니라 비타민 B1 및 비타민 C의 함량이 뛰어나 영양학적으로도 우수한 식품원으로 알려져 있고(한국특허출원: 10-2004-0045798, 보리잎차 제조방법, 김동원외) 또한 항산화, 항염증, 항암기능을 가지는 사포나린(Saponarin), 루토나린(Lutonarin) 및 아이소비텍신(Isovitexin) 등의 기능성 이차대사물질 함유되어 건강기능성 식품 및 의약품 소재로 그 산업적 이용 가능성이 커지고 있다.(Benedet JA et al, J. Agric. Food. Chem, 2007, 55, 5499-5504) 일본, 미국 등에서는 새싹보리잎을 건조하여 가루로 만든 상품을 건강식품으로 개발하여 판매하고 있다.
한편, AMPK(AMP-activated protein kinase)는 세포 내 에너지 밸런스 및 영양분 대사조절의 중추적 역할을 하는 전사인자로 여러 효소들의 인산화를 조절함으로써 글루코스 이동, 지방산 합성, 콜레스테롤 생합성 등의 다양한 생리작용에 영향을 미치는 효소로 잘 알려져 있다.(Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., , 2007, 47, 185-210) AMPK는 세린/트레오닌 카이네이즈(Serine/threonine kinase)로 ATP에 비하여 AMP를 증가하는 외부적, 내부적 환경에서 화성화 되어 세포 내 에너지(ATP)를 생성하는 효소이다. AMPK는 a, b, g 등의 3개의 서브유닛을 가지 헤테로트리머(Heterotrimer)로 알려져 있고 신체내 근육, 간 등의 조직에 다양하게 분포되어 있음이 알려져 있다.(Hardie DG et al, Eur J Biochem , 1997, 246, 259-273)
최근의 연구들은 AMPK가 세포 내 에너지 변화에 반응하여 대사전환 과정의 주요한 조절인자로서 탄수화물과 지방 등의 대사에 결정적인 역할을 하고 있음을 보여준다. 특히 인체내의 지방산과 스텔롤 합성과정에 주요한 조절 단계를 촉매하여 아세틸 CoA 카르복시나아제(Acetyl-CoA carboxylase: ACC)와 3-하이드록시-3-메틸글루트릴-CoA 리턱테이즈(3-hydroxy-3-methylglutryl-CoA reductase: HMGR)의 인산화 유도 및 지방산이 미토콘드리아로 들어가는 역할하는 효소를 저해하여 말로닐 CoA 등의 효소 생성을 억제함으로서 지질합성의 억제에 의한 항동맥경화 및 콜레스테롤 개선을 기능이 있음이 밝혀졌다(Sullivan JE et al. FEBS Lett, 1994, 353, 33-36; Grahame HD et al, Journal of Cell Science, 2004, 117 (23), 5479-5487). 또한 AMPK는 에너지 부족상태로부터 회복을 도와줌으로서 운동능력의 향상, 피로의 경감도 가능하게 하여 AMPK의 활성화 물질은 지구력 향상, 피로예방 및 개선제로 식품 또는 의약품 소재가 될 수 있음이 보고되었고(한국공개특허 10-2006-0119449) 운동을 시킨 쥐의 근육세포에서 ATP가 소모되고 그 결과 AMP의 양이 상대적으로 증가하여 AMPK의 활성도가 증가되고 포도당의 흡수가 증가된다는 사실이 관찰되면서 인슐린 신호전달 체계에 이상이 발견되는 대부분의 제 2형 당뇨병 환자에서 새로운 치료 목표점이 될수 있다는 사실을 의미한다. 실제로 제2형 당뇨환자들의 대부분이 운동을 함으로써 혈당량을 감소할 수 있으며 당뇨모델 동물에서 운동에 의해 AMPK가 활성화 되며 동시에 혈당량이 감소되는 사실도 보고되고 있다.(한국공개특허 10-2004-0018577; Benerjee S. et al, Lipids, 46, 311-321, 2011)
폴리코사놀(Policosanol)은 사탕수수(Sugar cane, 학명Saccharum Officinarium) 이나 밀납(Beeswax) 등에서 추출되는 물질로 알려져 있고 긴탄소사슬의 1차 포화 지방족 알코올의 혼합물 성분이다. 그 구성은 에이코사놀(Eicosanol, C20H42O), 헤네이코사놀(Heneicosanol, C21H44O), 도코사놀(Docosanol, C22H46O), 트리코사놀(Tricosanol, C23H48O), 테트라코사놀(Tetracosanol, C24H50O), 헥사코사놀(Hexacosanol, C26H54O), 헵타코사놀(Heptacosanol, C27H56O), 옥타코사놀(Octacosanol, C28H58O), 트리아콘타놀(Triacontanol, C30H62O) 성분을 통칭하여 부르며 따라서 독자적인 화학식은 존재하지 않는다. 그중 최근까지 발표된 헥사코사놀 및 옥타코사놀 관련 특허 및 보고자료는 콜레스테롤 합성시 초기 속도제한 단계를 촉매하는 효소인 HMG-CoA 환원효소의 활동을 저해시켜 총 콜레스테롤과 저밀도 저단백콜레스테롤(LCL-C) 수치를 저하시킨다는 보고(오한진, 식품산업과 영양, 15(1), 24-26, 2010)가 있다. 또한, 12개월 동안 20 mg/일 투여량으로 사탕수수로부터 단리된 폴리코사놀로 치료한 고혈압 및 2형 과콜레스테롤혈증이 있는 고령 환자는 현저히 감소된 총콜레스테롤(TC), 저밀도콜레스테롤(LDL-C) 수준을 나타내었으며, 고밀도콜레스테롤(HDL-C)의 수치는 증가시킨다는 임상의 연구결과 보고가 있다(Castano et al, Int. J. Clin Pharmacol, 2001, 21, 43-57; Gouni-Berthold et al, American Heart Journal, 2002, 143(2), 356-365)
또한, 폴리코사놀 중 헥사코사놀은 스트렙도조토신으로 유발한 혈당을 조절하는 효과가 신장기관에서 TGF-beta1 과 말론디알데하이드(Malonaldehyde)의 증가를 방지하고 nitric oxide synthase의 발현을 조절하는 등 제2형 당뇨 및 비만억제에 효과적이다 라는 연구보고도 있다(Saito et al, European Journal of Phamacology, 2006, 544, 132-137; Okada et al, Mol Cell Biochem, 2008, 315, 169-177)
옥타코사놀 및 헥사코사놀 등의 폴리코사놀의 조성물은 또한, 혈소판 응집의 현저한 억제와 함께 항-혈전 작용을 나타내는 것으로 입증되었고(Carbajal et al, pharmacol. Res.,1998, 38, 89-91) 에너지 방출하는 활성인자로 근육 및 인체에서 에너지를 생성(소인철, 운동영양학회지, 2006, 10(3), 275-280) 시키는 한편 세포의 ATP 생성증가를 통하여 세포활성이 증가되어 피부주름 및 탄력이 크게 개선된다는 보고 등 다양한 기능을 가지는 것으로 확인되었다(한국공개특허 10-2008-0119520).
최근까지 발표된 새싹보리(보리잎) 관련 특허 및 보고자료 로는 새싹보리 유래 폴리페놀계 화합물을 함유하는 추출물 및 이의 제조방법(한국공개특허 10-2010-0005714), 새싹보리 추출물을 포함하는 뉴라미니데이즈 활성 억제용 조성물 및 인플루엔자 바이러스 감염질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물(한국공개특허 10-2011-0020660), 밀순 또는 보리순 차의 제조방법(한국공개특허 10-2006-0072848), 당뇨환자용 음료수(한국공개특허 10-2006-0089639), 보리잎의 수용성 페놀화합물의 분석(Duh PD et al, J. Agric. Food Chem, 2001, 49, 1455-1463), 보리잎 분말을 함유한 두부(한국공개특허 10-2007-0122846) 등이 있다. 또한 보리순을 이용한 콜레스테롤 개선효과에 대한 연구는 보리순이 고지방을 급여한 마우스의 지질 함량과 간조직 지질대사 관련 효소활성에 미치는 영향(양은주외, 한국영양학회지, 2009, 42(1), 14-22)과 토끼의 동맥경화 유발 모델을 이용한 보리순 추출물의 항산화 작용과 고지혈증 억제효과에 관한 연구(Yu YM et al, Jpn. J. Pharmacol. 2002, 89, 142-148) 등이 있다.
어린 보리잎을 이용한 다른 연구보고에는 보리어린잎 항산화물질인 사포나린과 이소베텍신의 메탄올 추출 및 활성검정(류, 2002; 한국공개특허 10-2005-0091334), 보리잎의 열수 추출물의 항산화 활성을 가지는 폴리페놀류의 LC에 분석(Ferreres F et al, J. Agric. Food Chem., 2009, 57, 2405-2409) 등이 보고되어 있다.
지금까지의 새싹보리(보리순)의 연구는 주로 조추출물을 이용하여 제품의 제조 등에 사용되었고, 항산화 활성 등의 생리활성 검정 또한 새싹보리 조추출물에 대한 활성검정이 대부분이고, 조추출물에서 사포나린, 루토나린 및 배당체를 분리하여 보리 품종별 폴리페놀류의 함량을 측정하였다.
그러나, 새싹보리(보리순)의 주요 콜레스테롤 개선, 항동맥경화, 항당뇨, 기능성화장료, 지구력증진 등의 활성을 가지는 헥사코사놀 및 옥타코사놀 등의 폴리코사놀에 대한 물질의 분리, 구조 동정된 성분별 함량분석, 생리활성 검정 및 유효성분 최대 생산을 위한 추출 조건 등에 대한 연구는 부족한 실정이다.
따라서 본 발명은 그동안 선행연구가 이루어지지 않았던 새싹보리의 유래 헥사코사놀 및 옥타코사놀 등의 폴리코사놀이 세포 내 글루코스 이동, 지방산 합성, 콜레스테롤 생합성, 에너지 밸런스 및 영양분 대사조절의 중추적 역할을 하는 전사인자인 AMPK(AMP-activated protein kinase)효소들의 인산화를 증가시킴으로써 콜레스테롤 개선, 항동맥경화, 항당뇨, 기능성화장료 및 지구력 증진 등에 효과가 있는 건강기능성식품, 기능성화장품 및 음료 등의 활용에 관한 분야와 새싹보리의 헥사코사놀 및 옥타코사놀 등의 폴리코사놀 유효성분을 구명 및 함량을 정량 분석하고, 새싹보리의 폴리코사놀 유효성분을 분리 하기위한 추출방법, 폴리코사놀 유효성분을 다량 함유하는 추출물 제조 및 이를 이용한 활용에 관한 분야이다.
본 발명자들은 새싹보리 유래 기능성 물질을 탐색하던 중 새싹보리 추출물이 강한 AMPK 활성 증가효과를 보임을 확인하였고, 이 활성인자에 관여하는 물질을 분리, 정제 및 화학구조를 동정하였으며, 각각의 생리활성을 검정한 결과 폴리코사놀 중 헥사코사놀, 옥타코사놀이 새싹보리의 유효활성 물질임을 확인하였다. 그리고 기존 새싹보리 추출물에서는 보고된 물질 중 헥사코사놀 및 옥타코사놀 등의 폴리코사놀을 최초로 콜레스테롤 개선 및 항당뇨 등의 주요 활성 유효성분을 포함하는 물질에 대한 최대생산 조건을 확립하였다. 또한 새싹보리 유래 헥산 추출물에 대한 헥사코사놀, 옥타코사놀 및 폴리코사놀의 구성성분에 대한 정량과 AMP(Adenosine monophosphate)Kinase 인산화 활성 단백질의 발현 검정 등을 수행하였으며 이를 이용한 비만, 고지혈증, 당뇨, 혈전예방, 항균, 피부활력 증가 및 지구력증진 등의 식품, 화장료, 천연물의약품 등의 활용에 관해 본 발명을 완성하였다.
본 발명은
1) 상온에서 육묘용 상자를 이용하여 상토 또는 무상토에 보리종자를 골고루 뿌리고 상토 또는 비닐을 덮는 단계; 파종 종자가 마르지 않게 물을 샤워식으로 뿌리면서 15∼25℃에서 보리를 키우는 단계; 7~15일 지난 후 새싹보리의 길이가 15-25 cm 전후 정도 자라면 새싹보리를 수확하는 단계;
2) 수확한 새싹보리를 세척 후 상온에서 음건하는 단계; 음건된 새싹보리를 분쇄하는 단계; 분쇄한 새싹보리를 n-헥산으로 추출하는 단계;
3) 상기 헥산 추출물을 실리카겔 크로마토그래피를 이용하여 용매 헥산, 에틸아세테이트로 분리하는 단계; 헥산 층의 추출물을 클로로포럼과 헥산으로 재결정 분리하는 단계; 헥산 층 유래 분획에서 2차 크로마토그래피를 이용하여 헥산 및 아세톤 용매로 분리하여 헥사코사놀, 헵타코사놀, 옥타코사놀 등을 순수 분리 동정하는 단계;
4) 표 1에서 표시되는 상기 순수 분리된 새싹보리 유래 추출물 및 헥사코사놀, 옥타코사놀 등의 폴리코사놀을 유효성분으로 하는 것을 특징으로 하는 세포내 콜레스테롤 개선, 항동맥경화 및 항당뇨의 활성에 관여하는 AMPK 활성 검정하는 단계;
5) 새싹보리의 콜레스테롤 개선, 항동맥경화 및 항당뇨의 활성의 주요 성분인 헥사코사놀 및 옥타코사놀 등의 폴리코사놀을 최대로 얻기 위해 n-헥산의 농도별(0~100%) 폴리코사놀 성분을 추출하는 단계;
6) 상기의 새싹보리 유래 헥사코사놀, 옥타코사놀 등의 폴리코사놀을 주요 성분으로 하는 추출물 및 유효성분을 이용한 콜레스테롤 개선, 항동맥경화, 항당뇨, 지구력 증진, 항혈전 및 기능성 화장표 등의 건강 기능성 식품, 사료용 첨가물 및 화장품 첨가물을 개발하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 새싹보리 추출물 또는 이로부터 분리된 하기 표 1로 표시되는 헥사코사놀 및 옥타코사놀 등의 폴리코사놀 화합물을 유효성분으로 하는 항비만, 콜레스테롤 개선, 항동맥경화, 항당뇨, 활성을 포함하는 화장품 조성물을 제공한다.
하기에 표 1의 폴리코사놀의 화합물 1은 에이코사놀, 화합물 2는 헤네이코사놀, 화합물 3은 도코사놀, 화합물 4는 트리코사놀, 화합물 5는 테트라코사놀, 화합물 6은 헥사코사놀, 화합물 7은 헵타코사놀, 화합물 8은 옥타코사놀, 화합물 9는 트리아콘타놀 화합물이다.
화합물 구조 화학식 화합물명
1
Figure 112011088452665-pat00001
 C20H42O 1-에이코사놀
2
Figure 112011088452665-pat00002
 C21H44O 헤네이코사놀
3
Figure 112011088452665-pat00003
 C22H46O 도코사놀
4
Figure 112011088452665-pat00004
 C23H48O 트리코사놀
5
Figure 112011088452665-pat00005
 C24H50O 테트라코사놀
6
Figure 112011088452665-pat00006
 C26H54O 헥사코사놀
7
Figure 112011088452665-pat00007
 C27H56O 헵타코사놀
8
Figure 112011088452665-pat00008
 C28H58O 옥타코사놀
9
Figure 112011088452665-pat00009
 C30H62O 트리아콘타놀
상기와 같은 구성에 의하여 본 발명에 따른 새싹보리 유래 헥사코사놀 및 옥타코사놀 등의 폴리코사놀 성분을 분리 동정하고 각각의 추출물에 대한 세포내에서 콜레스테롤 개선, 항동맥경화 및 항당뇨 등의 활성을 나타내는 핵심전사인자인 AMPK 활성증가를 확인하였다. 그리고 폴리코사놀 중 주요 다량성분인 헥사코사놀 및 옥타코사놀 등을 최대로 함유한 추출물 제조를 위해 품종별, 생육시기별로 새싹보리를 수확하여 n-헥산의 추출물의 함량을 측정하여 최대생산 조건을 확립하였다. 또한 헥사코사놀 및 옥타코사놀 등의 폴리코사놀을 분리, 정제 및 화학구조를 동정하였고, 콜레스테롤 개선, 항동맥경화 및 항당뇨 등의 활성을 나타내는 주요 성분인 헥사코사놀 및 옥타코사놀 등의 폴리코사놀을 대량 생산 조건을 확립함으로써 새싹보리 원료, n-헥산 추출물, 기능성 물질 공급원으로 이용이 가능하며 분리된 고순도의 물질을 이용하여 분석용 표준물질 뿐 만 아니라 항비만, 콜레스테롤 개선, 항동맥경화, 지구력 증진, 혈전용해제 및 항당뇨 등의 고가의 기능성 화장료 또는 식의약품 원료로 활용성이 높은 발명이다.
도 1은 새싹보리 유래 폴리코사놀 9종 화합물에 대한 TLC 전개 사진이다.
도 2는 새싹보리 유래 헥사코사놀 및 옥타코사놀 등의 폴리코사놀의 GC-Ms/Ms 스펙트럼이다.
도 3은 새싹보리 품종별, 길이별 헥사코사놀 및 옥타코사놀 등의 폴리코사놀 함량이다.
도 4는 새싹보리 추출용매별 헥사코사놀 및 옥타코사놀 등의 폴리코사놀 함량이다.
도 5는 새싹보리 유래 헥사코사놀 및 옥타코사놀 등의 폴리코사놀 AMPK 인산화 활성화 그래프이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들에게만 한정하는 것은 아니다.
실시예 1 : 새싹보리로부터 폴리페놀성분 추출, 분리 및 정제
상온에서 보리 품종별 종자를 균일한 발아를 위해 4~6시간 물에 침종시킨 후 꺼내어 공기 중에서 8시간가량 물이 빠지도록 한 후 육묘용 상자를 이용하여 상토에 보리종자를 골고루 뿌리고 상토를 덮었으며; 상토가 마르지 않게 주기적으로 물을 주면서 보리를 상온에서 키웠다. 종자가 발아 후 7~15일 지나 새싹보리의 길이가 15-25cm 전후 정도 자라면 새싹보리의 지상부를 수확하였다. 수확한 새싹보리를 물로 세척 후 물기를 제거하였으며, 음건하였다. 음건한 새싹보리는 분쇄기를 이용하여 분쇄하였으며, 새싹보리 품종별 분말 100g을 추출용기에 넣고 n-헥산 1,000 mL을 사용하여 50-60 ℃에서 48시간동안 교반하여 성분을 추출하였다. 추출한 시료는 여과지로 여과한 다음, 감압 농축하여 50g 추출물을 얻었다. 얻은 n-헥산 분획물(50g)은 실리카겔 컬럼크로마토그래피 (400g, 70~230 메쉬, Merk)를 사용하였으며, 이동상 용매로는 n-헥산, n-헥산에틸아세테이트 (100:1 ~ 10:1 혼합비) 혼합용매을 순차적으로 사용하여 5개의 분획(Fr.B1 ~Fr.B5)을 얻었다. Fr.B1 (5g)을 실리카켈 (50g, 70~230 메쉬)에 흡착시킨 후, 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 하였으며, 이때 이동상 용매는 n-헥산:에틸아세테이트 혼합용매를 사용하여 흰색의 침전물을 얻고 이를 정제하여 화합물 1, 화합물 2를 각각 32mg, 25mg을 얻었다. Fr.B2 (20g)을 실리카켈 (100g, 70~230 메쉬)에 흡착시킨 후, 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 하였으며, 이때 이동상 용매는 n-헥산:에틸아세테이트 혼합용매를 사용하여 흰색의 침전물을 얻고 이를 정제하여 화합물 3, 화합물 4 각각 32mg, 56mg을 얻었다. Fr.B3 (20g)을 실리카켈 (300g, 70~230 메쉬)에 흡착시킨 후, 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 하였으며, 이때 이동상 용매는 n-헥산:에틸아세테이트 혼합용매(100:1~15:1)를 사용하여 또다른 흰색 침전물을 얻고 이를 정제하여 화합물 5 (100 mg)을 얻었다. 또한 Fr.B4를 클로로포럼에 녹인후 n-헥산 재결정 용매로는 헥산: 클로로포름(100:1 혼합비) 혼합용매 사용하여 재결정을 통해 흰색 침전물을 얻고 이를 헥산으로 세척하여 화합물 6, 화합물 7, 화합물 8 을 각각 980 mg, 650 mg, 480 mg 얻었다. Fr.B5 (5g)를 실리카켈 (6g, 70~230 메쉬)에 흡착시킨 후, 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 하였으며, 이때 이동상 용매는 n-헥산:아세톤(80:1-1:1 혼합용매)를 사용하여 또다른 흰색 침전물을 얻고 이를 정제하여 화합물 9 (30mg)을 얻었다. 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3은 새싹보리 n-헥산추출물의 추출물 상태에서 GC-Ms/Ms 분석을 통해 그 함유량을 정량하였다. 분리한 새싹보리유래 헥사코사놀 및 옥타코사놀 등의 폴리코사놀 화합물의 순상 실리카켈 TLC 페턴은 도1에 나타내었다.
실시예 2 : 새싹보리 추출물의 헥사코사놀 및 옥타코사놀 등의 폴리코사놀 화합물 구조 분석
상기 실시예 1에서 얻은 물질을 GC-MS/Ms 분석기(Gas chromatography mass-mass chromatography)를 사용하여 표준물질과 비교하여 검출시간, 분자량 및 분자의 딸이온 등을 통해 분자구조를 결정하였으며, 측정결과는 하기와 같으며, 화합물 1은 에이코사놀, 화합물 2는 헤네이코사놀, 화합물 3은 도코사놀, 화합물 4는 트리코사놀, 화합물 5는 테트라코사놀, 화합물 6은 헥사코사놀, 화합물 7은 헵타코사놀, 화합물 8은 옥타코사놀, 화합물 9는 트리아콘타놀 화합물로 동정하였다. 분리한 폴리코사놀의 화합물의 구조는 표1에 나타내었다.
[화합물 1]: 에이코사놀
1) 물성 : 흰색파우더
2) 분자량 : 298
3) 분자식 : C20H42O
[화합물 2]: 헤네이코사놀
1) 물성 : 흰색파우더
2) 분자량 : 312
3) 분자식 : C21H44O
[화합물 3]: 도코사놀
1) 물성 : 흰색파우더
2) 분자량 : 326
3) 분자식 : C22H46O
[화합물 4]: 트리코사놀
1) 물성 : 흰색파우더
2) 분자량 : 340
3) 분자식 : C23H48O
[화합물 5]: 테트라코사놀
1) 물성 : 흰색파우더
2) 분자량 : 354
3) 분자식 : C24H50O
[화합물 6]: 헥사코사놀
1) 물성 : 흰색파우더
2) 분자량 : 382
3) 분자식 : C26H54O
[화합물 7]: 헵타코사놀
1) 물성 : 흰색파우더
2) 분자량 : 396
3) 분자식 : C27H56O
[화합물 8]: 옥타코사놀
1) 물성 : 흰색파우더
2) 분자량 : 410
3) 분자식 : C28H58O
[화합물 9]: 트리아콘타놀
1) 물성 : 흰색파우더
2) 분자량 : 438
3) 분자식 : C30H62O
새싹보리 추출물에서 함유량이 많고, 생리활성이 뛰어난 헥사코사놀 및 옥타코사놀 등의 폴리코사놀 화합물 9종의 GC-Ms/Ms 스펙트럼은 도2에 나타내었다.
실시예 3 : 새싹보리 품종별, 길이(생육시기)별 추출물의 헥사코사놀 및 옥타코사놀 등의 폴리코사놀 함량 분석
본 발명의 새싹보리 유래 추출물 또는 이로부터 분리된 헥사코사놀 및 옥타코사놀 등의 폴리코사놀 화합물의 품종별, 길이(생육시기)별 폴리코사놀의 최대함유 시기를 알아보기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. 보리 품종별 종자를 균일한 발아를 위해 12∼18시간 물에 침종시킨 후 꺼내어 공기 중에서 8시간가량 물이 빠지도록 한 후 육묘용 상자를 이용하여 무상토 혹은 상토에 보리종자를 골고루 뿌리고 상토 또는 비닐을 덮었으며; 상토가 마르지 않게 주기적으로 샤워식으로 물을 주면서 보리를 15∼25℃ 에서 키웠다. 종자가 발아 후 새싹보리의 길이가 5, 10, 15, 20, 25 cm 전후 정도 자라면 새싹보리의 지상부를 수확하였다. 음건 세절 후 n-헥산으로 3회 실온에서 교반하여 추출한 후 용매를 감압농축 하였다. 각각의 샘플시료에 클로로포름 0.5 ml을 첨가 후 1mL 볼륨메트릭 플라스크에 옮긴후 GC-Ms/Ms(Agilent 7890)의 유도체 시약 MSTFA(N-methyl-N-(trimethylsiyl) trifluoroacetamide, Sigma) 250 ul 첨가한 후 60℃에서 20분간 반응시킨 후 다시 클로로포럼 용매를 1ml가 될 때까지 첨가하였다. 이 시료를 GC-Ms/Ms 시스템(Waters)에 2uL 주입하였으며, 컬럼은 DB-5 (길이: 30m, 내경: 250 μm, 두께: 0.25 μm, Agilent)을 이용하였다. 이동상 기체는 헬륨가스를 유속 1.0 ml/min으로 하고, 온도는 칼럼 오븐은 최초온도 150℃(1분)에서 출발하여 20℃/min 및 15℃/min으로 320℃ 까지 증가시켰다. 검출은 Waters TQD GC-Mass 에서 실시하였다. 헥사코사놀 및 옥타코사놀 등의 폴리코사놀을 정량하기 위하여 농도를 달리하여 위와 동일한 방법으로 GC-Ms/Ms 시스템에 주입하여 [표2]와 같은 표준검량곡선을 구하였다.
폴리코사놀 화합물 표준검량곡선 비고
에이코사놀 y=455.653x-318.461 R 2 =0.991
헤네이코사놀 y=352.44x-256.143 R 2 ==0.991
도코사놀 y=436.863x-324.12 R 2 =0.991
트리코사놀 y=948.974x-630.752 R 2 =0.994
테트라코사놀 y=420.914x-341.492 R 2 =0.992
헥사코사놀 y=293.65x-215.871 R 2 =0.993
헵타코사놀 y=205.484x-168.47 R 2 =0.992
옥타코사놀 y=117.162x-107.551 R 2 =0.990
트리아콘타놀 y=118.875x-103.454 R 2 =0.990
상기 도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명의 새싹보리 추출물 또는 이로부터 분리된 헥사코사놀 및 옥타코사놀 등의 폴리코사놀 화합물은 보리품종 10 품종(대진보리, 낙영보리, 다향보리, 샛강보리, 알찬보리, 큰알보리, 찰보리, 오월보리, 건강보리, 대연보리)과 5∼10, 10∼15, 15∼20, 20∼25 Cm로 새싹이 자랐을 때의 헥사코사놀 및 옥타코사놀 등의 폴리코사놀을 함량을 측정한 결과 보리품종 중 큰알보리가 15-20 Cm 자랐을 때 수확한 것이 에이코사놀: 6.6, 헤네이코사놀: 0.4, 도코사놀: 22.8, 트리코사놀: 0.2, 테트라코사놀: 35.9, 헥사코사놀: 231.4, 헵타코사놀: 4.6, 옥타코사놀: 34.5, 트리아콘타놀: 6.2 mg/100g으로 전체 폴리코사놀의 함량은 342.4 mg/100g으로 함량이 제일 높았다. 새싹보리 품종별, 길이별 헥사코사놀 및 옥타코사놀을 함유하는 폴리코사놀의 함량 결과는 아래 도 3에서 나타내었다.
실시예 4 : 새싹보리의 헥사코사놀 및 옥타코사놀 등의 폴리코사놀 최적추출법 확인
상기 실시예 1과 실시예 3에서 새싹보리 중 폴리코사놀 함량이 가장 높았던 큰알보리의 15-20 Cm의 조건에서 수확한 새싹보리 분말 1g에 헥산:에틸에테르의 농도(0∼100 % 중량)를 달리하여 20 ml을 첨가하고, 50℃에서 24시간 교반 추출한 다음 원심분리기(10,000rpm, 4℃)로 상층액을 분리한후, 0.45um 필터(Advantec MFS, Inc, CA, USA)로 여과하였다. 감압농축 후 실시예 3의 방법으로 GC-Ms/Ms로 헥사코사놀 및 옥타코사놀 등의 폴리코사놀의 표준검량곡선을 구한 후 추출용매별 유효성분 최대추출조건을 분석하였다. 헥산 추출물의 에틸에테르 농도별 헥사코사놀 및 옥타코사놀 등의 폴리코사놀을 정량한 결과는 [도 4]에 나타내었다. 상기 도 4에 보는 바와 같이, 헥사코사놀 및 옥타코사놀 등의 폴리코사놀의 최대추출조건은 90% 헥산: 10% 에틸에테르 조건에서 최대 추출됨을 보였고 이때 에이코사놀, 헤네이코사놀, 도코사놀, 트리코사놀, 테트라코사놀, 헥사코사놀, 헵타코사놀, 옥타코사놀, 트리아콘타놀 중량비는 0.5 : 0.2 : 4.8 : 0.1 : 13.5 : 68.3 : 1.8 : 9. 1: 1.8로 나타났다. 따라서 이를 모두 고려할 때 약 80 ∼ 100(중량%) n-헥산 : 에틸에테르 추출용매에서 헥사코사놀 및 옥타코사놀 등의 폴리코사놀의 함량이 가장 높은 것을 확인하였다.
실시예 5 : 새싹보리 유래 추출물, 헥사코사놀 및 옥타코사놀 등의 폴리코사놀 성분의 AMPK 활성증가 생리활성 검정
[1단계: 세포배양]
사람 간암 세포주(human hepatoma cell line)인 HepG2 세포는 한국세포주은행(Korea Cell Line Bank, KCLB)으로부터 분양받아 사용하였다. 세포는 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM 배지에 10% 비활성화 우태아 혈청(inactivated fetal bovine serum, FBS), 1% penicillin/streptomycin를 첨가하여 37oC 및 5% 이산화탄소 조건 하에 배양하였다.
[2단계: 단백질 발현 분석(Immunoblotting)]
새싹보리 유래 폴리코사놀 헥산 추출물과 그 함량비율이 제일 높은 헥사코사놀, 옥타코사놀을 처리한 HepG2 세포에 lysis buffer(10 mM Tris-HCl [pH 7.4], 0.1 M EDTA, 10 mM NaCl and 0.5% Triton X-100, proteinase inhibitor)를 넣고 용해한 후, 13,000 rpm, 4℃, 20분간 원심분리하여 상층액을 얻어내었다. Bradford법을 사용해 상층액으로부터 단백질 농도를 정량하여 40 μg의 단백질을 취하였다. 추출된 단백질 40 μg에 1× SDS sample buffer(50 mM Tris, pH 6.8, 2% SDS, 10% glycerol, 0.01% bromophenol blue, 5% β-mercaptoethanol)를 넣어 100oC에서 5분간 가열하였다. 준비된 시료를 10% SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)에 전기영동하고, PVDF membrane에 전이시킨 후 TBST buffer(10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20)에 5% nonfat dry milk를 녹여 blocking을 하였다. Membrane에 1차 및 2차 항체를 각각 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. TBST buffer로 세척한 후, ECL 시약을 이용하여 chemiluminescence로 단백질 밴드를 검출 및 시각화하였다. 단백질 밴드는 소프트웨어(Gel-Pro Analyzer 4.0)를 통해 정량 및 수치화하고, 이를 위해 reference gene으로 α-tubulin을 사용하여 표준화하였다. 새싹보리 유래 헥산추출물 및 헥사코사놀, 옥타코사놀을 함유하는 폴리코사놀을 처리하여 활성화된 AMPK, 인산화된 AMPK 및 인산화 AMPK: AMPK의 비율(%대조군) 함량 결과는 아래 도 5에서 나타내었다.
상기 도 5에 나타난 바와 같이, 본 발명의 간세포에서 새싹보리 추출물 또는 이로부터 분리된 헥사코사놀 및 옥타코사놀 등의 폴리코사놀을 처리하여 배양하였을 때 AMPK 및 인산화된-AMPK 단백질의 발현량의 변화를 측정한 결과이다. 새싹보리 헥산추출물을 100 ug/ml, 500 ug/ml 처리 하였을 때 활성형인 phospho-AMPK/AMPK 발현이 약1.3배, 2.5배 증가하는 것을 알 수 있고, 새싹보리 유래 헥사코사놀을 100 uM, 200 uM 처리하였을 때 활성형인 phospho-AMPK/AMPK 발현이 약 2.5배, 7.7배 증가하였다. 또한, 새싹보리 유래 옥타코사놀을 100 uM, 200 uM 처리하였을 때 활성형인 phospho-AMPK/AMPK 발현이 약2배, 7배 증가하였다. 상기 실험으로 항비만, 항당뇨, 콜레스테롤 개선, 항동맥경화, 지구력 증진, 기능성화장료 및 항균 등의 핵심 전사단백질인 AMPK 발현 증가를 촉진한다는 사실을 알 수 있었다.

Claims (8)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 새싹보리를 동결 건조하여 분말을 얻은 뒤 이를 n-헥산 또는 n-헥산 및 에틸에테르를 사용하여 추출물을 얻는 단계;
    상기 추출물에 물을 넣어 현탁시키고, 유기용매를 가하여 각각 분획물을 얻는 단계; 및
    상기 분획물을 실리카겔 칼럼에서 용출시켜 분획물을 얻는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 하기 화학식 1~9로 표시되는 화합물의 추출방법.
    [화학식 1]
    Figure 112013073474115-pat00042

    [화학식 2]
    Figure 112013073474115-pat00043

    [화학식 3]
    Figure 112013073474115-pat00044

    [화학식 4]
    Figure 112013073474115-pat00045

    [화학식 5]
    Figure 112013073474115-pat00046

    [화학식 6]
    Figure 112013073474115-pat00047

    [화학식 7]
    Figure 112013073474115-pat00048

    [화학식 8]
    Figure 112013073474115-pat00049

    [화학식 9]
    Figure 112013073474115-pat00050
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 유기용매는 60~100 중량% 농도의 n-헥산인 것을 특징으로 하는 추출방법.
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