KR101483249B1 - 세포단위 방사선 손상모델 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 의약학 분야에서 질병치료기술 및 약제를 개발하기 위해 시행하는 생체 외 세포단위 실험을 위한 질병모델 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 효율적인 방사선 조사를 통해 상기 질병모델을 보다 용이하게 제조할 수 있는 방법에 관한 것이다.

Description

세포단위 방사선 손상모델 제조방법 {preparation method of in vitro irradiation-induced cell or tissue injury model}

본 발명은 의약학 분야에서 질병 치료 및 약제 개발을 위해 수행하는 생체 외 세포단위 실험을 위한 질병 모델 제조 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 효율적인 방사선 조사를 통해 방사선에 의한 다양한 세포 및 조직의 손상모델을 보다 용이하게 제조할 수 있는 방법에 관한 것이다.

의약학 분야에서 질병 치료 기술 및 약제의 개발을 위해, 세포, 조직 또는 동물 단위의 다양한 실험 모델을 사용하고 있다. 질병 치료 효과 및 약제의 효능을 가장 손쉽고 빠르게 확인할 수 있는 방법으로서 동물 실험 모델이 주로 사용되어 왔다. 그러나 인간과 동물이 공유할 수 있는 질병의 종류에는 한계가 있을 뿐만 아니라, 최근 동물의 희생에 대한 윤리적 고찰에 따른 동물 실험에 대한 반대의견이 거세지고 있는 추세이므로, 동물 실험을 대체할 수 있는 대안으로서 세포단위 실험 모델이 각광받고 있다.

한편, 모든 암 환자의 약 50% 이상은 암 치료 과정 중 방사선 치료를 받고 있으며, 방사선 치료는 다양한 양성 및 악성 종양, 원발성 및 전이성 종양, 및 혈관성 질환을 치료하는데 널리 이용되고 있다. 특히, 방사선 치료는 원발성 뇌종양, 전이성 뇌종양, 중추신경계를 침범한 백혈병이나 림프종, 두부 및 경부암을 치료하는데 중요한 치료법 중 하나이다. 그러나, 방사선에 대한 정상 세포나 조직의 저항력 (tolerance)은 제한적이어서, 방사선 조사로 인한 정상 세포나 조직의 손상을 최소화하기 위해서는 방사선 조사량을 조절해야 할 필요가 있다. 이에, 뇌질환에 대한 방사선 치료는, 종래의 전뇌 방사선 조사에서 벗어나, 병소 부위에만 다량의 방사선을 조사하고 정상 뇌조직에의 방사선량은 최소화할 수 있는 수술 중 방사선 치료 (intraoperative radiotherapy), 조직 내 근접 방사선 치료 (interstitial brachytherapy), 감마 나이프(Gamma knife) 또는 선형가속기를 이용한 방사선 수술(Linear accelerator radiosurgery) 로 치료 영역이 확대되고 있다. 그러나 이러한 노력에도 불구하고 병변 주위 정상 조직의 방사선 조사는 불가피하며 이로 인한 합병증은 줄어들지 않고 있다 (Br J Cancer 85:1233-1239, 2001). 특히, 소아나 성인에서 두부의 방사선 조사는, 방사선 조사 후 수개월에서 수년 후 비가역적이고 심각한 인지장애를 일으킬 수 있는 문제가 있다.

이와 같이, 방사선 조사로 인한 정상 조직의 손상을 예방 또는 치료하기 위해 다양한 약물을 연구 중이나, 아직까지 탁월한 효과를 보이는 약제나 치료방법은 개발되지 않고 있는 실정이다.

따라서, 방사선 치료 분야에서, 방사선 조사로 인한 다양한 세포 및 조직 손상 기전을 연구하거나 그 손상을 치료하는 기술 및 약제를 개발하기 위한 목적으로, 방사선 조사로 인한 세포 또는 조직 손상 실험 모델이 매우 유용하게 사용될 수 있다.

방사선 치료 분야에서 종래 이용되던 방사선 손상 세포 또는 조직 실험 모델은, 주로 x-ray 기기에 기반을 둔 방사선 손상 모델이었다. 그러나, 상기 x-ray 기반 세포 실험 모델을 제조하기 위해서는, 세포들이 방사선에 균일하게 노출되게 하기 위해서 일반적으로 큰 플라스크(25-cm flasks)에서 세포를 배양해야 하는 한계가 있었다(Yamakawa et.al., 2008, Lin et.al., 2010, Mackonis et.al., 2011) (도 14 참조).

이처럼 큰 플라스크에서 세포를 배양할 경우, 한번에 많은 세포 및 배지가 필요하기 때문에 시간적, 경제적 낭비가 클 뿐만 아니라, 세포가 일부는 뭉쳐있거나 일부는 떨어져 있어 세포의 균등한 분포가 어렵고, 이에 따라 모든 세포에 균일하게 방사선 조사가 이루어지지 못하여 실험 결과에 오류가 발생할 우려가 높다는 문제가 있다.

또한, 일반적으로 세포 배양에 사용되는 100 pi cell culture dish (세포배양접시) 또는 6웰, 96웰 플레이트와 같은 작은 배양 접시(culture dish)를 사용할 경우에는, 세포의 일정량을 비교적 균일하게 분주할 수 있지만, 한 플레이트에 한가지 조사량만 적용하거나, 또는 한 배양접시에 한 종류의 세포에만 적용 가능하다는 문제가 있다. 예컨대, 특정 방사선 조사량이 다양한 종류의 세포에 미치는 영향, 또는 한 종류의 세포에 다양한 방사선 조사량이 미치는 영향을 조사하기 위해서는, 각 조건 별로 (세포 종류별로 또는 방사선 조사량별로) 별도의 실험을 여러 번 수행하여야 하는 문제가 있어, 시간적, 비용적 부담이 큰 문제가 있다.

따라서, 배양용기 내 세포의 균일한 분포 및 방사선의 균일한 조사로 정확도가 높은 결과를 얻을 수 있을 뿐만 아니라, 한 번의 실험으로 다양한 조건에 따른 영향을 분석할 수 있는 고효율의 방사선 조사 시스템 및 이를 통한 세포단위 방사선 손상 모델 제조 방법의 개발이 요구된다.

이에, 본 발명은 종래 x-ray 기반의 방사선 조사 기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 실제 존재하는 모든 세포에 균일하게 방사선 조사가 가능하여 정확성이 높을 뿐만 아니라, 다양한 종류의 세포에 대해 동시에 방사선 조사가 가능하고, 나아가 각 세포별로 조사량을 달리하여 동시에 다양한 조건의 방사선 조사 실험을 수행할 수 있는 효율적인 방사선 조사 시스템 및 이를 통한 세포단위 방사선 손상 모델 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

종래 방사선 조사를 통한 세포손상 실험은 x-ray 기기에 기반을 두어 수행되었으나, 상기 살펴본 바와 같이 비경제적일 뿐만 아니라 실험 결과의 오류 발생 우려가 높은 문제가 있었다. 이러한 문제를 해결하기 위하여 본 발명자들이 연구한 결과, 실제 임상에서 이용되고 있는 근접 고선량 방사선 요법(Brachytherapy) 기술을 세포단위 손상 실험에 최적화되도록 변형시켜 접목함으로써 고효율로 정확도 높은 방사선 손상 모델의 제조가 가능하다는 것을 확인하였다. 또한, 실제 암 등에 대한 방사선 치료에 사용되는 방사선원, 예컨대 이리듐(Ir) 을 이용함으로써 실제 임상과 유사한 연구환경을 조성할 수 있어, 신규한 질병 치료 기술 및 약제의 개발에 효과적으로 응용이 가능한 실험 모델을 용이하고 간편하게 제조할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다.

방사선 요법은 크게, 인체의 외부에서 방사선을 조사하는 방식인 외부 방사선 치료(external beam radiation therapy), 및 방사성 동위원소를 종양부위에 직접 위치시켜 치료하는 내부 방사선 또는 근접 방사선 치료 요법(Brachytherapy)으로 분류할 수 있다.

근접 방사선 치료 요법(Brachytherapy)의 관건은 방사선 동위원소를 표적 병변과 그 근방에만 전달하고 표적 병변으로부터 떨어진 곳으로의 전달은 줄이는 것으로서, 이는 선형가속기 등의 기기를 사용하여 고에너지의 방사선 또는 전자선을 환자의 외부에 조사하여 환자의 피부를 통과하여 방사선이 종양 부위에 도달하도록 하는 외부 방사선 조사 요법과는 달리, 방사성 동위원소를 종양 내에 직접 삽입하거나, 장기 내로 카테터(catheter, 도관) 또는 매모사이트(mammosite, 풍선을 가진 도관)를 삽입하여 종양 부위에 강한 방사선량을 조사하는 방법이다. 근접 방사선 치료 요법은 외부 방사선 조사 요법에 비해 방사선 동위원소에 대해 원치 않는 노출을 최소화할 수 있는 장점이 있어 실제 임상에서 암 치료에 널리 이용되고 있다. 특히, 도관을 이용한 근접 방사선 치료 요법은 인체의 병변 부위에 도관 말단을 직접 삽입하여 국소부위의 방사선 치료 효율을 높이며 주변의 정상조직에 방사선이 조사되는 위험을 최소화하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 상기 근접 방사선 치료 기술을 최초로 세포단위 또는 조직단위 실험모델에 최적화되도록 변형하여 적용한 것이다.

구체적으로, 본 발명은 근접 방사선 치료 요법에 사용되는 방사선원 및 도관을 사용하여 세포 또는 조직에 방사선을 조사함으로써, 기존의 세포 모델 제조에 사용되었던 x-ray 기반 실험이 방사선 빔을 방출 및 분사함으로써 방사선 조사의 정확도가 떨어졌던 단점을 극복하고 세포단위 실험의 정확성을 향상시키는 기술을 제공한다. 이 때, 기존의 근접 방사선 치료 기술이 도관을 인체 내에 직접 삽입하는 방식으로 사용되었던 것과는 달리, 본 발명에서는 도관을 세포 또는 조직을 포함하는 단일 또는 복수 개의 배양 용기의 상단에 배치시킨 후 방사선을 특정 조건 하에 조사함을 특징으로 한다. 본 발명에 의할 경우, 세포에 균일한 방사선 노출 영역을 조성할 수 있어 보다 용이하고 간편한 방법으로 세포단위 방사선 손상모델을 고효율로 제조할 수 있다.

일 구현예로서, 본 발명은 1) 복수의 웰을 포함하는 플레이트를 준비하고, 상기 각 웰에서 세포 또는 조직을 배양하는 단계; 2) 근접 방사선 치료 장치의 도관이 상기 각 웰의 상단부를 가로지르도록 배치시키는 단계; 및 3) 방사선 조사량을 결정하고 상기 도관으로부터 방사선을 조사하는 단계를 포함하는, 방사선 손상된 세포 또는 조직 모델을 제조하는 방법을 제공한다.

상기에서, 방사선 조사 대상인 세포 또는 조직은 인간을 포함한 모든 생물에서 유래한 것일 수 있으며, 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 동물의 신체를 구성하는 외배엽, 중배엽 또는 내배엽에서 기원한 모든 세포 또는 조직; 병적 상태의 세포 (예컨대, 종양세포); 뇌신경세포를 포함한 모든 정상세포; 배아세포; 성체줄기세포 및 역분화 줄기세포를 포함한 모든 계열의 줄기세포; 인위적으로 조작, 제작 및 배양한 세포; 세균 또는 바이러스에서부터 식물을 구성하는 세포까지, 모든 종류의 세포에 본 발명의 기술을 적용할 수 있다.

상기에서, 복수의 웰을 포함하는 플레이트로는, 세포 또는 조직 배양 분야에서 사용되는 배양 접시 등 다양한 공지의 배양 용기를 사용할 수 있다. 예를 들어, 6, 12, 24, 48, 96 또는 384 웰로 구성된 세포 배양 접시 등을 사용할 수 있으나, 이는 대표적인 예시일 뿐, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 6 웰의 배양 접시를 사용할 수 있다. 복수의 웰을 포함하는 배양 접시는 단일 또는 복수 개로 사용 가능하다.

상기에서, 근접 방사선 치료 장치로는, 방사선원과 도관을 포함하는 장치로서 현재 임상에서 근접 방사선 치료 요법에 사용되고 있는 장치를 사용할 수 있다. 바람직하게, 상기 방사선원은 도관 내부 공간에 위치할 수 있다. 바람직한 일예로, 이리듐(¹⁹²Ir)을 방사선원으로 사용하는 감마메드(Gammamed) 12i 등 높은 선량률로 단시간에 계획한 선량을 조사하는 원격조정 고선량률(High Dose Rate; HDR) 근접 치료 장치를 사용할 수 있다. 이외에도 방사선을 낼 수 있는 다양한 물질, 예컨대 ¹³⁷Cs, ¹⁹²Ir, ¹²⁵I, ¹⁹⁸Au, ²⁴¹Am, ¹⁰³Pd, ¹⁴⁵Sm 또는 ¹⁹Yb 등을 방사선원으로 사용하는 다양한 방사선 조사 장비 (Ballester et al.)면 특별히 제한되지 않고 사용할 수 있다. 예컨대, Microselectron (HDR) Nucletron Engineering BV (네덜란드), Gamma med plus MDS/Nordion (캐나다), VariSource Varian associates (미국) 등이 들 수 있다.

상기 방사선 조사를 위한 방사선원으로는 감마선을 내는 ¹⁹²Ir, 베타선을 내는 ³²P, ⁹⁰Sr/⁹⁰Y, ⁹⁰Y, ¹⁸⁸Re, ¹⁶⁶Ho 등을 사용할 수 있으며, 상기 방사성 동위원소들은 ¹⁹²Ir 시드(seeds), ³²P 코팅 스텐트(coated stents), ⁹⁰Y 와이어(wires)나 코일(coils), ¹⁸⁸Re 용액(solution), ⁹⁰Sr/⁹⁰Y 시드(seeds) 또는 ¹⁶⁶Ho-코팅 풍선(coated balloon)이나 스텐트(stent) 형태로 사용될 수 있다. 바람직하게는 ¹⁹²Ir 를 시드 (seed) 형태로 사용할 수 있다.

도관을 이용한 방사선원 철사 시스템은 ¹⁹²Ir, ³²P, ⁹⁰Sr/⁹⁰Y 과 같은 방사선 선원을 철사 끝에 들어갈 수 있는 0.014에서 0.040 인치 직경의 금속성 통(canister) 또는 종자(seed)로 만들 수 있으며, 도관의 내강을 통해 방사선 선원을 포함하는 철선을 진입시켜 방사선 선원을 하방쪽으로 진행시킬 수 있다. 이 과정은 후장진(afterloading)이라고 하고 수동이나 모터로 움직일 수 있다 (Teirstein PS, Massullo V, Jani S, Popma JJ, Mintz GS, Russo RJ, Schatz RA, Guarneri EM, Steuterman S, Morris NB, Leon MB, Tripuraneni P. Catheter-based radiotherapy to inhibit restenosis after coronary stenting. N Engl J Med 1997; 336:1697-703. 참조).

상기 도관은 플라스틱 또는 비닐 재질의 방사선이 투과되지 않는 재질로 이루어진 것이 바람직하며, 도관의 규격 및 사용 가능한 갯수는 방사선 조사장치의 규격에 따라 적절히 선택하여 사용 가능하다. 바람직하게는 1개 이상, 보다 바람직하게는 1개에서 최대 24개까지 사용될 수 있다.

상기 도관은 각 세포 또는 조직이 배양된 용기의 중심점을 가로지르도록 배치함으로써 균일한 방사선 노출 영역을 조성할 수 있으며, 예컨대 상기 용기의 커버(cover)에 다양한 방법으로 (테이프, 글루 등) 부착함으로써 도관을 용기 상단에 고정시킬 수 있다.

또한 바람직하게는 상기 도관의 내부에 방사선이 멈추는 포인트인 캐소드(cathode)를 복수 개로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 1~5개의 캐소드가 하나의 용기(웰) 상부에 위치하도록 도관을 배치할 수 있다.

상기 방사선 조사 단계는 바람직하게는 방사선을 0 내지 수십 Gy로 조사하는 단계를 포함하여 이루어질 수 있다. 방사선의 transit time, dose, distance, location 등과 관련된 제반 수식 및 계산과 관련한 모든 사항은 Supe 등이 발표한 논문을 참고하여 적용 가능하다 (Pol J Med Phys Eng 2007;13(2):55-64).

또한, 사용되는 근접 방사선 조사 장치의 종류 및 방사선원의 종류가 다르더라도, 본 발명의 일 구현예에 따른 방법을 이용한다면 방사선 positioning time 및 거리 조절을 통하여 복수의 웰이 존재하는 플레이트, 바람직하게는 6웰 플레이트에 균일하게 방사선 조사 실험이 가능하게 된다.

구체적인 일예로, 방사선원으로서 ¹⁹²Ir 를 사용하고, 각 웰당 크기가 직경 약 2cm 정도이고 높이가 약 1cm정도인 6웰 플레이트를 사용하여 실험할 경우, 방사선이 도 1a의 우측 도관에 나타낸 바와 같이 도관을 따라 이동하면서 각 이동점(캐소드)에서 정확한 방사선량이 각 웰 내부의 전 영역에 균등하게 미치게 되며 또한 주변의 다른 웰에는 영향을 미치지 않아 정확도 높은 결과를 얻을 수 있게 된다 (도 3 및 도 4 참조).

본 발명의 제조방법은 이처럼 각 웰당 독립적으로 방사선량이 균등하게 미치도록 조절이 가능한 효과가 있어, 실험의 목적에 따라 동시에 다양한 방사선량을 적용하거나 동시에 다양한 종류의 세포를 적용하는 등, 한 번의 실험을 통해 다수의 다양하고도 정확도 높은 실험모델의 제조가 가능하다는 장점이 있다. 이를 위하여, 바람직한 일예로, 본 발명에서 하나의 플레이트를 구성하는 복수의 웰 각각에는 서로 다른 종류의 세포 또는 조직을 배양할 수 있다. 또 다른 일예로, 각 웰의 상단을 가로지르는 도관으로부터 서로 다른 줄의 웰들에 서로 다른 방사선량으로 방사선을 조사하는 것이 가능하다.

이처럼 본 발명의 바람직한 일 구현예에 따른 제조방법은 상술한 바와 같이 용기 및 도관을 복수개로 사용함으로써 용기 내 모든 세포 또는 조직에 균일하게 방사선 조사가 가능하여 정확성이 높고 균일한 결과를 갖는 손상 모델의 제조가 가능할 뿐만 아니라, 또한 다양한 세포 또는 조직의 종류에 대해 동시에 방사선을 조사할 수 있어 특정 방사선량의 다양한 세포 또는 조직에 대한 영향을 비교 분석이 가능한 손상 모델의 제조가 가능하다. 또한, 특정 종류의 세포 또는 조직에 대해 각각 조사량을 달리하여 다양한 방사선량에 따른 영향의 비교가 가능한 손상 모델을 모두 한번의 실험을 통해 간편하고 용이하게 제조가 가능하여 실험횟수 및 제반비용을 획기적으로 감소시킬 수 있다. 나아가, 본 발명의 방법은 실제 암 치료 등 임상분야에서 방사선 치료에 사용하는 방사선원을 이용함으로써 실험실에서 시행한 연구결과를 신규한 질병치료 기술 및 약제의 개발에 효과적으로 응용이 가능하다.

본 발명의 세포단위 방사선 손상모델 제조방법에 따르면 모든 세포에 균일하게 방사선 조사가 가능하여 실험의 정확성이 현저히 향상될 뿐만 아니라, 다양한 세포 종류에 대해 동시에 방사선 조사가 가능하며, 또한 각 세포별로 조사량을 달리하여 동시에 다양한 조건의 방사선 조사 실험을 수행할 수 있어 신규한 질병치료 기술 및 약제의 개발에 효과적으로 응용이 가능한 고품질의 실험 모델을 용이하고 간편하게 제조할 수 있다.

도 1a 는 6 웰에서 방사선 도관이 놓여지는 곳(흰색 화살표)과 방사선이 멈추는 포인트(검은색 화살표: X-ray를 사용하여 표시)를 나타낸다.
도 1b는 6 웰에 방사선 도관을 고정하였을 때의 모습을 나타낸다.
도 1c는 사용된 방사선 기계를 나타낸다. 흰색 화살표는 도 1a에서와 같은 도관을 나타낸다.
도 1d는 도관이 세포 배양 접시에 어떻게 배치되는지, 및 방사선 조사 거리를 각각 나타낸다.
도 2는 목적하는 3개의 방사선량 (dose 량)을 만들기 위해 도관의 위치에 따라 x,y 축을 어떻게 잡았고, 도관에서 용기 바닥까지 포인트를 얼마나 잡았는지를 나타낸 것이다. 즉, 이 발명장치를 이용하여 x,y,z축 및 방사선 positioning time만 조절하면 방사선 조사량이 계산되어 6 웰 내의 어디에도 원하는 균일하면서 다양한 조사량의 방사선 조사가 가능함을 나타낸다.
도 3a는 방사선 조사량 1Gy 에서 포인트별 머무르는 시간을 계산하여 나타낸 것이다 (67초).
도 3b는 설정된 방사선량이 일률적으로 나오고 있음을 확인한 표(평균 방사선량 0.99Gy)이다.
도 3c는 방사선 조사량 3Gy 에서 포인트별 머무르는 시간을 계산하여 나타낸 것이다 (203초).
도 3d는 설정된 방사선량이 일률적으로 나오고 있음을 확인한 표(평균 방사선량 3.00Gy)이다.
도 3e는 방사선 조사량 5Gy 에서 포인트별 머무르는 시간을 계산하여 나타낸 것이다 (337초).
도 3f는 설정된 방사선량이 일률적으로 나오고 있음을 확인한 표(평균 방사선량 4.98Gy)이다.
도 4a 는 상기 도 3에서 얻어진 평균 방사선량을 토대로 1Gy로 도관 라인에서부터의 거리에 따라 측정된 방사선량을 등고선으로 나타낸 그래프이다.
도 4b 는 상기 도 3에서 얻어진 평균 방사선량을 토대로 3Gy로 도관 라인에서부터의 거리에 따라 측정된 방사선량을 등고선으로 나타낸 그래프이다.
도 4c 는 상기 도 3에서 얻어진 평균 방사선량을 토대로 5Gy로 도관 라인에서부터의 거리에 따라 측정된 방사선량을 등고선으로 나타낸 그래프이다.
도 5는 1 ~ 5 Gy 방사선 조사 후 인간 지방유래 중간엽 줄기세포 (MSCs) 의 생존률을 나타낸 그래프이다.
도 6은 1 ~ 5 Gy 방사선 조사 후 MSCs 의 변화를 200배 확대한 현미경 사진을 나타낸 것이다.
도 7은 1 ~ 5 Gy 방사선 조사 후 MSCs 로부터 유래된 자멸사 지표인 cleaved caspase-3 및 Bax 의 웨스턴 블롯 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 1 ~ 5 Gy 방사선 조사 후 인간 교모세포종 세포 (U87 세포)의 생존률을 나타낸 그래프이다.
도 9는 3 ~ 10 Gy 방사선 조사 후 U87 세포의 변화를 200배 확대한 현미경 사진을 나타낸 것이다.
도 10은 3 ~ 10 Gy 방사선 조사 후 U87 세포로부터 유래된 자멸사 지표인 cleaved caspase-3 및 Bax 의 웨스턴 블롯 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 5 ~ 40 Gy 방사선 조사 후 백서의 피질신경세포 (CN 세포)의 생존률을 MTT assay로 나타낸 그래프이다.
도 12는 10 ~ 40 Gy 방사선 조사 후 CN 세포의 변화를 200배 확대한 현미경 사진을 나태낸 것이다.
도 13은 대조군 (방사선 조사하지 않은 군) 과 40 Gy 방사선 조사 후 CN 세포의 변화를 40배 확대한 현미경 사진 및 Hoechst stain 염색결과를 나타낸 것이다.
도 14는 10 ~ 40 Gy 방사선 조사 후 CN 세포로부터 유래된 자멸사 지표인 cleaved caspase-3 및 Bax 의 웨스턴 블롯 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 CN 세포에 40Gy 방사선을 조사한 후 12 ~ 48시간까지 세포의 생존율을 LDH assay로 나타낸 그래프이다.
도 16은 CN 세포에 40Gy 방사선을 조사한 후 12 ~ 48시간까지 세포로부터 유래된 자멸사 지표인 cleaved caspase-3, cleaved PARP 및 Bax의 시간별 웨스턴 블롯 결과를 나타낸 것이다.
도 17는 종래 x-ray 기반 실험에서 포톤과 같이 beam이 넓은 방사선원을 사용하려면 25cm²의 큰 플라스크를 이용하여야 할 뿐 아니라, beam이 골고루 조사되지 못하는 문제가 있음을 보여주는 것이다.

이하 본 발명의 이해를 돕기 위해 바람직한 실시예를 통해 더욱 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

1-1. 세포준비

각각의 세포들을 6 웰(well) 을 포함하는 배양접시 (plate)에 동량으로 계대배양(subculture)한 후, 100% 가득 채울 때까지 키웠다. 배양된 세포들은 방사선을 조사하지 않은 대조군(control) 그룹과 방사선을 조사한 실험군(1~40Gy 방사선 조사량에 따른 그룹)으로 나누어 실험을 하였다. 각각의 그룹당 3번의 실험을 수행하였으며, 각 그룹당 결과를 방사선 조사시점으로부터 24시간 후의 생존 세포 개수 및 상기 생존 세포들에서 단백질을 추출하여 cleaved caspase-3, PARP, bax 항체를 사용하여 웨스턴 블롯(western blot)을 시행하여 얻어진 값으로 나타냈다(실시예 2 참조). 상기 3개의 물질은 세포의 자멸사를 시사하는 단백질이다.

1-2. 방사선 조사

방사선 조사는 이전에 근접 방사선 치료 (brachytherapy)에 쓰이던 고선량률 근접치료장치인 GammaMed 12i(MDS/Nordion, formerly Isotopen-technik Dr. Sauerwein GMBH) 를 사용하여 수행하였으며, 선원으로는 Ir-192(seed 형태)를 사용하였다. 선원의 활성도는 370 GBq(10 Ci)이고, 참고 공기커마 속도(reference air kerma rate, RAKR)는 40,84mGy·m²/h로 하였다.

상기 장치의 도관이 세포 배양 접시의 중심점을 가로지르도록 배양 접시 상부에 고정하여 도관 주변으로 균일 방사선 노출 영역 (a uniform irradiation field) 을 조성하였다.

구체적으로 본 실험에서는 3개의 배양 접시가 2열로 배치된 6 웰 세포 배양 플레이트의 각 열에 도관이 한 줄씩 각 웰의 중심점을 가로지르도록 배치하여 방사선을 조사하였으며, 도관의 내부에는 방사선이 멈추는 포인트인 캐소드(cathodes)를 각 웰당 3 혹은 4개로 배치되도록 구성하였으며 도관은 상기 장비에 포함되어 실제 환자에게 사용하는 것을 제조회사의 프로토콜에 따른 규격으로 사용하였다. 캐소드 개수는 6 웰 플레이트의 각 웰에 균등한 방사선이 조사되도록 계산하여 도출하였다 (Pol J Med Phys Eng 2007;13(2):55-64)(도 1 및 도 2 참조).

이처럼 도관을 배치하고, 각 방사선량에 따른 방사선원의 도관 포인트별 positioning time을 계산하여 1Gy의 경우 67초, 3Gy의 경우 203초, 및 5Gy의 경우 337초로 각각 설정함에 따라, 반지름 1cm 크기의 배양 접시 내 각각 평균 방사선량이 0.99Gy(도 3b), 3.00Gy(도 3d), 및 4.98Gy(도 3f)로 원하는 방사선량이 균일하게 조사됨을 확인할 수 있었다 (Pol J Med Phys Eng 2007;13(2):55-64).

또한 상기 얻어진 평균 방사선량을 토대로 도관 라인으로부터 떨어진 거리에 따라 측정된 방사선량을 등고선으로 나타낸 결과, 임의로 설정한 1, 3, 5Gy의 방사선량 모두에서 방사선 노출 영역은 각 웰당 중첩 없이 반경 1cm로 균등하게 나타남을 확인할 수 있었다. 이처럼 본 실시예에 따라 방사선을 조사한 결과 각 웰마다 방사선량이 동일하게 조사될 수 있을 뿐만 아니라, 해당하는 웰 외에 주변의 다른 웰에는 방사선이 노출되지 않도록 하여 상호간 영향을 미치지 않으면서 정확도 높은 방사선 조사가 가능함을 확인할 수 있었다.(도 4a 내지 4c).

< 실시예 2> 방사선 조사량에 따른 세포 변화 측정

2-1. 세포의 준비

백서(Sprague-Dawley rat)의 뇌피질 신경세포(CN, 본 연구자가 직접 추출 및 배양함), 인간 지방유래 중간엽 줄기세포 (MSCs, 알엔엘바이오 제공) 와 인간 교모세포종 세포 (U87 cell, 고려대학교 신경외과 강신혁 교수로부터 제공받음) 를 세가지 방사선 조사량에 노출시켜 세포변화(세포자멸사 발생여부 및 생존 패턴)를 측정하였다.

우선 1 X 10⁶개가 들어 있는 1 바이얼(vial) 3~4개의 MSCs 와 U87 세포를 100 pi dish에 분주 하고 10% FBS(fetal bovine serum)(GenDEPOT 제품의 F0600-050) 과 1% 페니실린(GenDEPOT 제품의 CA005-010)을 포함하는 DMEM(GenDEPOT 제품의 CM002-050)에서 3~4 일 동안 37℃, 5% 산소 조건으로 배양하여 90%를 채우도록 하였다. 이후 6 웰 배양 플레이트의 한 웰당 1 X 10⁵개의 세포가 들어가도록 계대배양(sub-culture)하였다. 세포 분주(Cells seeding)의 안정화를 위해 3일을 더 소요 한 뒤 방사선량 1, 3, 5, 10, 20, 40 Gy에 각각 노출 시켰다. 대조군(Control)은 방사선에 노출 시키지 않은 세포를 사용하였다.

방사선 조사 이후 세포자멸사(cell apoptosis)와 회복을 관찰하기 위해 12, 24, 36, 48시간 이후에 세포를 계수하고, 살아있는 세포의 생존 패턴은 생존세포를 용해액(lysis solution)에 녹여 단백질을 추출하여 Western Blot 실험을 하여 caspase-3 (cell signaling 제품의 ca9662), PARP (Cell signaling제품의 9542)와 Bax, Bcl-2 (abcam 제품의 ab7977, ab 7973) 를 관찰함으로써 분석하였다(하기 2-4 참고).

백서의 피질신경세포(cortical neuron)는 임신한 백서에서 E18일째가 되는 날 약간의 마취를 하고 척추탈골을 시킨 뒤에 배에서 추출한 각각의 E18 백서를 clean bench 로 가지고 와서 피부와 두개골(skull)을 제거하고 뇌에서 필요로 하는 피질(cortical) 층만 분리하여 neurobasal(NB) media (invitrogen 제품의 21103-049)에서 혈액을 제거하고 트립신(tripsin) (gibco 제품의 25200) 을 처리하여 조직을 부수었다. 부순 조직을 micro 필터로 걸러서 내려온 세포들을 6웰에 깔아 사용하였다.

2-2. 세포 계수( cell counting )

MSCs, U87 세포는 방사선 조사 후 24시간 후에 각각의 웰을 모아서 tryphan blue를 사용하여 계수하였고, CN 세포는 방사선 조사 후 24시간 후에 현미경 접안 렌즈에 그리드를 붙여 계수하여 확인하였다. 이 때 정상 세포와 사멸된 세포의 비율을 세포 생존율로 정하였다.

2-3. 세포 생존도 측정

세포 생존도는 LDH (Lactate dehydrogenase) assay 및 MTT (3-(4,5-dimethylthizol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide)) assay를 이용하여 측정하였다. LDH assay를 위해 각 실험군의 배양액 50ml를 96웰 플레이트에 옮긴 후, 100μl의 LDH 반응액 (Sigma제품의 TOX7)을 첨가하여 상온에서 30분간 반응시켰다. 이 후, microplate reader (Molecular Device)의 490nm파장에서 흡광도(optical density, OD)값을 측정하였다. 방사선 조사를 하지 않은 대조군의 OD값에 대한 방사선 조사군의 OD값을 상대적 백분율로 환산하여 평균±표준오차 (mean±SEM)로 나타내었다. MTT assay를 위해 방사선 조사를 받은 세포 웰에 20μL의 MTT solution (Dojindo 제품의 CK04-11)처리한 후 5시간 배양하고 배지를 제거한후 200 μL의 DMSO(Honeywell제품의 081-4SK)로 용해시켰다. 이 후, microplate reader (Molecular Device)의 560nm 파장에서 흡광도(optical density, OD)값을 측정하였다.

2-4. Hoechst 염색

커버슬립에서 배양된 대뇌 피질 신경세포는 방사선 조사 후, 4 % formaldehyde 용액에서 20분간 고정시킨 후, PBS로 두 차례 세척한 다음 5 ug/mL의 Hoechst 33342 (Promega제품의 H3570) 용액에서 염색하였다. 염색된 대뇌 피질 신경세포의 DNA 분절 및 응축 정도에 기초하여, 살아있는 세포와 apoptotic 세포를 구분하였다. 각 실험군은 형광현미경 (OLYMPUS BX61)의 400배율 하에서 무작위로 선택된 6개 구역에서 염색된 세포의 수를 세어, 전체 신경세포의 수 중 apoptosis가 일어난 세포의 수의 비율을 구하였다.

2-5. 웨스턴 블롯 ( western blot )

1) 실험방법

각 세포들(1 X 10⁴)을 50ml 의 lysis buffer (50mM Tris-HCl, pH 7.5, 150mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% deoxicholic acid sodium, 1% Triton X-100)에 30분 동안 상온에서 배양한 후에, cell과 lysis buffer 가 들어가 있는 상태의 튜브를 초음파 기계에 끼워 내부의 엉켜있는 cell 들이 눈에 보이지 않을 정도까지 10번 정도 초음파를 쏘아 세포들을 파쇄 한 후, 3분간 원심분리(1,2000 g) 후에, 상등액을 분리하였다. 상등액을 IntRON protein assay kit (intron 회사의 21411143)을 사용하여 제조사의 방법에 따라 BCA 정량을 하였다. 부분 표본(Aliquots) 된 단백질(50μg)의 Bcl-2에 대한 Western blot 분석을 12% SDS-PAGE 로 하였다. 이 때 β-tubulin(abcam 제품의 ab6046) 을 항존 유전자(house keeping gene)로 비교 분석하였다. PDVF membrane에 전기영동을 한 후에, 5% 스킴 밀크(skim milk)로 1시간 상온에서 블로킹(blocking) 하였다.

Blocking을 마친 후, 각각 actin에 대한 산양 모노클로널(goat monoclonal to actin)(1:1000 희석), bax 에 대한 토끼 폴리클로널 (rabbit polyclonal to bax)(1:1000 희석), caspase-3 에 대한 토끼 폴리클로널 (rabbit polyclonal to caspase-3)(1:1000 희석), Bcl-2 (rabbit polyclonal to bcl-2) (1:1,000 희석), PARP (rabbit polyclonal to PARP) (1:1,000 희석), β-tubulin 에 대한 토끼 폴리클로널 (rabbit polyclonal to β-tubulin) (1:3000 희석)에 대한 1차 항체(Primary antibodies)를 붙이기 위해서 4?에서 밤새 배양 (overnight) 을 하였다. 1차 항체를 붙인 후에 TBST 1X로, 1 시간 세척(washing)을 하였다. 액틴에 대한 모노클로널 2차 항체 (1:10,000), 토끼 IgG에 대한 산양 폴리클로널 2차 항체를 각각 caspase-3 (1:10,000), PARP (1:10,000), Bax (1:20,000), Bcl-2 (1:10,000), β-tubulin (1:20,000) 희석하여 붙였다. 이 후에 1시간 TBST 1X로 세척한 후, ECL+ detection kit(GenDEPOT 회사의 W3651-012) 을 사용하여 검출(detection) 반응 후 필름 (Agfa)에 노출하여 현상하였다.

<실험결과>

1) 방사선량에 따른 인간 지방유래 중간엽 줄기세포 ( MSCs ) 의 변화

도 5는 대조군(방사선 비노출군) 및 실험군(방사선량 1, 3, 5Gy) 총 4개의 군으로 나누어 실험된 MSCs 세포의 생존 비율 그래프로서, 방사선량(Dose)이 3Gy일 때 세포 생존비율이 50% 전후임을 알 수 있었다.

또한 도 6에 나타낸 각 그룹별 방사선 조사 후 지방줄기세포의 변화를 200배 확대한 현미경 사진을 보면 방사선 조사량이 증가할수록 세포수가 감소함을 확인할 수 있어 방사선 조사량이 증가할수록 세포의 사멸이 증가함을 보여주었다.

한편, 방사선 조사 후 세포로부터 상기 실시예 2-3의 방법으로 단백질을 추출하여 웨스턴 블롯을 수행한 결과를 도 7에 나타냈다. 도 7은 각각의 방사선량에서 세포자멸사가 발생할 때 발현이 증가되는 Bax, cleaved caspase3의 발현정도를 western blot을 통해 실험하여 측정한 결과를 나타낸 것으로서, 방사선 조사를 통해 1Gy부터 세포가 사멸되기 시작하고 3Gy 부터 본격적으로 자멸사가 발생하여 방사선 조사량이 높을수록 Bax, cleaved caspase3의 발현이 증가하여 세포자멸사가 더욱 많이 발생한다는 사실을 확인하였다.

이는 본 발명자가 개발한 방사선 조사모델을 이용하여 방사선 조사량이 증가함에 따라 인간 지방유래 중간엽 줄기세포의 사멸이 증가함을 증명한 것으로 새로운 방사선 조사모델이 유효한 방법임을 입증한 것이다.

2) 방사선량에 따른 인간 교모세포종 세포 ( U87 ) 의 변화

도 8은 대조군(방사선 비노출군) 및 실험군(방사선량 1, 3, 5Gy) 총 4개의 군으로 나누어 실험된 U87 세포(brain tumor cell)의 생존 비율 그래프로서, 상기 MSCs에서 나타난 결과와 마찬가지로 방사선량(Dose)이 3Gy일 때 세포 생존비율이 50% 전후임을 알 수 있었다.

또한 도 9에 나타낸 각 그룹별 방사선 (3, 5, 10Gy) 조사 후 인간 신경교종세포의 변화를 200배 확대한 현미경 사진을 보면 방사선 조사량이 증가할수록 세포수가 감소함을 확인할 수 있어 방사선 조사량이 증가할수록 세포의 사멸이 증가함을 보여주었다.

한편, 방사선 조사 후 세포로부터 상기 실시예 2-3의 방법으로 단백질을 추출하여 웨스턴 블롯을 수행한 결과를 도 10에 나타냈다. 도 10은 각각의 방사선량에서 세포자멸사가 발생할 때 발현이 증가되는 Bax 및 cleaved caspase3의 발현정도를 western blot을 통해 실험하여 측정한 결과를 나타낸 것으로서, 세포계수 방법을 이용하면 방사선 조사를 통해 1Gy부터 세포가 사멸되기 시작하고 3Gy 부터 본격적으로 자멸사가 발생하는 것으로 보이지만 웨스턴 블롯 수행결과 5Gy부터 본격적인 Bax 및 cleaved caspase3의 발현량이 증가하며 방사선 조사량이 높아질수록 Bax 및 cleaved caspase3의 발현량이 증가하여 세포자멸사가 더욱 많이 발생한다는 사실을 확인하였다.

이는 본 발명자가 개발한 방사선 조사모델을 이용하여 방사선 조사량이 증가함에 따라 인간교모세포종 세포 (뇌의 악성종양세포)의 사멸이 증가함을 증명한 것으로 새로운 방사선 조사모델이 유효한 방법임을 입증한 것이다.

3) 방사선량에 따른 백서의 피질신경세포 ( CN ) 의 변화

도 11은 대조군(방사선 비노출군) 및 실험군(방사선량 5, 10, 20, 40 Gy) 총 5개의 군으로 나누어 실험된 CN 세포(cortical neuron)의 생존 비율 그래프로서 MTT assay를 이용하여 측정하였으며, 줄기세포 및 악성종양 세포와 다르게 방사선 조사량(dose)이 40Gy일 때 세포 생존비율이 50% 전후임을 알 수 있었다.

또한 도 12에 나타낸 각 그룹별 방사선 조사 후 백서의 대뇌 피질 신경세포의 변화를 200배 확대한 현미경 사진을 보면 대조군 (dose 0) 세포의 수상돌기(dendrite)는 곧고 길게 뻗어있는 것을 관찰할 수 있으나, 조사량이 증가하면서 생존 세포수도 감소하고 수상돌기도 점점 소멸하며 부서지는 형태를 관찰할 수 있었다.

도 13은 대조군과 40 Gy 방사선을 조사한 후 24시간이 지난 신경세포의 현미경 사진 및 Hoechst 염색 사진으로서 대조군에 비해 40 Gy방사선을 조사한 신경세포는 사멸이 증가하였고 Hoechst 염색상 밝은 청색의 조각난 핵들이 다수 관찰되었다.

한편, 대조군 및 10, 20, 40 Gy 방사선 조사 후 피질 신경세포로부터 상기 실시예 2-3의 방법으로 단백질을 추출하여 웨스턴 블롯을 수행한 결과를 도 14에 나타냈다. 도 14는 각각의 방사선량에서 세포자멸사가 발생할 때 발현이 증가되는 Bax 및 cleaved caspase3의 발현정도를 western blot을 통해 실험하여 측정한 결과를 나타낸 것으로서, 앞서 살펴본 바와 마찬가지로 방사선 조사량이 높을수록 Bax, cleaved caspase3의 발현이 증가하여 세포자멸사가 많이 발생한다는 사실을 확인하였다.

이는 본 발명자가 개발한 방사선 조사모델을 이용하여 방사선 조사량이 증가함에 따라 백서의 피질신경세포의 사멸도 증가함을 증명한 것으로 새로운 방사선 조사모델이 유효한 방법임을 입증한 것이다.

4) 방사선 조사 후 시간에 따른 백서의 피질신경세포 ( CN ) 의 변화

도 15는 백서의 피질신경세포에 40 Gy 방사선 조사 후 시간경과에 따른 세포의 자멸사 정도를 LDH assay로 분석한 결과이다. 대조군에 비해 방사선 조사군에서 세포의 자멸사가 증가함이 관찰되었고 48시간까지 시간이 경과함에 따라 세포의 자멸사가 진행됨을 확인하였다.

도 16은 백서의 피질 신경세포에 40 Gy 방사선 조사 후 시간경과에 따른 세포에서 유래되는 자멸사 연관 단백질의 발현을 상기 실시예 2-3의 방법으로 웨스턴 블롯으로 검증한 결과를 보여준다. 세포자멸사가 발생할 때 발현이 증가되는 Bax, cleaved caspase3 및 cleaved PARP의 발현 정도는 방사선 조사 후 12시간 및 24시간째 가장 증가되어 이때 자멸사가 가장 활발히 발생함을 증명하였으며 48시간째까지 자멸사가 진행되나 24시간 이후로는 자멸사 정도가 점차 감소함을 관찰하였다.

이상의 결과를 종합하여 볼 때 본 발명자가 개발한 새로운 방사선 조사모델을 이용하여 다양한 종류의 세포들에게 방사선을 조사한 결과 세포 종류에 따라 사멸을 유발하는 방사선 조사량에 차이가 있었으며, 방사선 조사량이 증가함에 다양한 종류의 세포들의 자멸사가 비례적으로 증가함을 증명하였으며 이는 새로운 방사선 조사모델이 유효한 방법임을 입증한 것이다.

Claims (10)

1) 복수의 웰을 포함하는 플레이트를 준비하고, 상기 각 웰에서 세포 또는 조직을 배양하는 단계;
2) 방사선원을 포함하는 근접 방사선 치료 장치의 도관이 상기 각 웰의 상단부를 가로지르도록 배치시키는 단계; 및
3) 방사선 조사량을 결정하고 상기 도관으로부터 방사선을 조사하는 단계를 포함하는,
방사선 손상된 세포 또는 조직을 제조하는 방법.

제1항에 있어서, 상기 복수의 웰을 포함하는 플레이트는 6, 12, 24, 48, 96 또는 384 웰 플레이트인 방법.

제1항에 있어서, 상기 웰은 원형의 웰인 방법.

제1항에 있어서, 상기 방사선원은 ¹³⁷Cs, ¹⁹²Ir, ¹²⁵I, ¹⁹⁸Au, ²⁴¹Am, ¹⁰³Pd, ¹⁴⁵Sm, ¹⁹Yb, ³²P, ⁹⁰Sr, ⁹⁰Y, ¹⁸⁸Re 및 ¹⁶⁶Ho 로 이루어진 군에서 선택되는 방사성 동위원소인 방법.

제1항에 있어서, 상기 근접 방사선 치료 장치는 고선량률(High Dose Rate) 근접 방사선 치료 장치인 방법.

제1항에 있어서, 상기 도관이 각 웰의 상단부의 중심점을 가로지르도록 배치시키는 것인 방법.

제1항에 있어서, 상기 각 웰의 상단부를 가로지르는 도관이 1개 내지 24개 인 방법.

제1항에 있어서, 상기 각 웰의 상단부를 가로지르는 도관은 내부에 방사선이 멈추는 포인트를 웰당 1개 내지 5개 포함하는 것인 방법.

제1항에 있어서, 상기 각 웰에 서로 다른 종류의 세포 또는 조직을 배양하는 것인 방법.

제1항에 있어서, 상기 도관으로부터 각 웰에 서로 다른 방사선량으로 방사선을 조사하는 것인 방법.

Images