RU2778859C1 - Устройство для фиксации и позиционирования клеточных культур при прецизионном облучении - Google Patents
Устройство для фиксации и позиционирования клеточных культур при прецизионном облучении Download PDFInfo
- Publication number
- RU2778859C1 RU2778859C1 RU2021135083A RU2021135083A RU2778859C1 RU 2778859 C1 RU2778859 C1 RU 2778859C1 RU 2021135083 A RU2021135083 A RU 2021135083A RU 2021135083 A RU2021135083 A RU 2021135083A RU 2778859 C1 RU2778859 C1 RU 2778859C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cell cultures
- cells
- irradiation
- tablet
- sphere
- Prior art date
Links
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 title claims abstract description 45
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims abstract description 4
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims abstract description 4
- 210000004881 tumor cells Anatomy 0.000 abstract description 9
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 238000009434 installation Methods 0.000 abstract description 3
- 230000003211 malignant Effects 0.000 abstract description 3
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 230000002476 tumorcidal Effects 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 238000009199 stereotactic radiation therapy Methods 0.000 abstract 1
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 60
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 19
- 239000001963 growth media Substances 0.000 description 10
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 9
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 9
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 8
- 208000005017 Glioblastoma Diseases 0.000 description 7
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 description 6
- 210000003169 Central Nervous System Anatomy 0.000 description 5
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- 206010003571 Astrocytoma Diseases 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 4
- 201000011614 malignant glioma Diseases 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 description 3
- 230000002062 proliferating Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 210000004556 Brain Anatomy 0.000 description 2
- 206010022114 Injury Diseases 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000002609 media Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000010133 oligodendroglioma Diseases 0.000 description 2
- 201000007286 pilocytic astrocytoma Diseases 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 239000006163 transport media Substances 0.000 description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 2
- 206010073128 Anaplastic oligodendroglioma Diseases 0.000 description 1
- 206010065869 Astrocytoma, low grade Diseases 0.000 description 1
- 102000020504 Collagenase family Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase family Proteins 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 210000001652 Frontal Lobe Anatomy 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 210000004408 Hybridomas Anatomy 0.000 description 1
- 206010027191 Meningioma Diseases 0.000 description 1
- 206010027193 Meningioma malignant Diseases 0.000 description 1
- 206010027476 Metastasis Diseases 0.000 description 1
- 208000007538 Neurilemmoma Diseases 0.000 description 1
- 210000000869 Occipital Lobe Anatomy 0.000 description 1
- 206010073131 Oligoastrocytoma Diseases 0.000 description 1
- 210000001152 Parietal Lobe Anatomy 0.000 description 1
- 208000007913 Pituitary Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- BPEGJWRSRHCHSN-UHFFFAOYSA-N Temodal Chemical compound O=C1N(C)N=NC2=C(C(N)=O)N=CN21 BPEGJWRSRHCHSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive Effects 0.000 description 1
- 201000005476 astroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 201000005216 brain cancer Diseases 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture media Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 1
- 239000007799 cork Substances 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 238000010192 crystallographic characterization Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N edta Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001738 genotoxic Effects 0.000 description 1
- 231100000024 genotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- 238000009114 investigational therapy Methods 0.000 description 1
- 230000001678 irradiating Effects 0.000 description 1
- 230000003902 lesions Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic Effects 0.000 description 1
- 210000004255 neuroglia Anatomy 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 201000007288 pleomorphic xanthoastrocytoma Diseases 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent Effects 0.000 description 1
- 230000006335 response to radiation Effects 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000002719 stereotactic radiosurgery Methods 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 201000004059 subependymal giant cell astrocytoma Diseases 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 229960004964 temozolomide Drugs 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 238000004078 waterproofing Methods 0.000 description 1
Images
Abstract
Устройство для фиксации и позиционирования клеточных культур при прецизионном облучении относится к нейроонкологии и может быть использовано для повышения эффективности и индивидуального подхода при проведении стереотаксической лучевой терапии. Устройство содержит планшет для культивирования клеточных культур и выполнено в виде двух сфер: наружной и внутренней. Сферы расположены одна в другой и разделены внутренним, герметизированным силиконовой гофрой замкнутого сечения пространством, заполненным шариками. Внутренняя сфера меньшего диаметра выполнена в виде неразборной замкнутой конструкции с прямоугольным углублением под установку планшета для культивирования клеточных культур. Нижняя треть внутренней сферы имеет сплошное сечение. Верхние две трети внутренней сферы полые, содержат отверстие в верхней точке для заполнения водой. Наружная сфера большего диаметра, выполнена в виде разборной полой конструкции с прямоугольным отверстием под установку планшета для культивирования клеточных культур. Планшет выполнен из полистирола в виде лунок. Устройство обеспечивает снижение травматизации культуры опухолевых клеток, надежную их фиксацию при проведении облучения и позволяет верифицировано подойти к выбору суммарных доз облучения для конкретного пациента, обеспечивающих наилучший туморорицидный эффект у больных злокачественными опухолями головного мозга. 1 ил.
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к нейроонкологии, и может быть использовано для повышения эффективности и индивидуального подхода при проведении стереотаксической лучевой терапии.
Первичные опухоли центральной нервной системы (ЦНС) составляют около 2 % всех опухолей человека, или, по данным CBTRUS (Central Brain Tumor Register of the United States), 21,4 случая на 100 тыс. населения. Другими словами, каждый год в России появляется примерно 32 100 новых случаев первичных опухолей ЦНС. Это разнородная группа опухолей, причем морфологический диагноз - основной фактор прогноза и дифференцированного подхода к лечению. Среди первичных опухолей ЦНС преобладают менингиомы (35,6 %, причем только 1 % составляют злокачественные менингиомы) и глиомы (35,5 %, причем 15,6 % от общего числа первичных опухолей мозга составляет глиобластома). Питуитарные опухоли составляют 15 %, невриномы VIII нерва - 8 %.
Глиомы - собирательный термин, который объединяет все диффузные астроцитарные и олигодендроглиальные опухоли, а также другие виды - пилоидную астроцитому, субэпиндимарную гигантоклеточную астроцитому, астробластому и другие опухоли, исходящие их клеток глии. Ведено понятие “Grade”, которое определяет степень злокачественности глиомы от I до IV. Выделяют глиомы низкой степени злокачестенности Grade I-II (высокодифференцированные глиомы, включающие астроцитому, олигодендроглиому, олигоастроцитому, а также редкие типы опухолей - плеоморфную ксантоастроцитому, субэпиндимарную гигантоклеточную астроцитому, пилоидную астроцитому) и злокачественные глиомы Grade III-IV (анапластическая астроцитома, анапластическая олигоастроцитома, анапластическая олигодендроглиома, глиобластома). Наиболее злокачественными являются глиомы Grade IV.
Несмотря на проводимое агрессивное лечение, включающее оперативное удаление опухоли и химиолучевую терапию, практически все глиомы рецидивируют. По данным Stupp R. и соавт. (2009), медиана времени до прогрессирования заболевания на фоне комбинированного лечения темозоломидом и лучевой терапией (ЛТ) составляет лишь 6,9 месяца.
В качестве возможных вариантов лечения при возникновении рецидива или продолжающемся росте опухоли могут рассматриваться: повторная операция, повторная ЛТ, химиотерапия (XT) и комбинация этих методов. Неудовлетворительный эффект от применяемого лечения обусловлен прежде всего гетерогенностью опухоли по клеточному составу и, следовательно, радиочувствительностью. Оценка in vitro чувствительности опухоли к ионизирующему излучению позволит обеспечить индивидуализацию в подходе к проведению радиотерапевтического и/или радиохирургического лечения.
Одним из вариантов лечения рецидива или локального метастазирования злокачественной глиомы по головному мозгу является методика стереотаксической радиохирургии, которая заключается в прицельном однократном подведении всей предписанной дозы облучения к опухолевому узлу.
Однако, как были показаны ранее проведенные нами (MULTINUCLEATED CELLS RESISTANT TO GENOTOXIC FACTORS WITHIN HUMAN GLIOBLASTOMA CELL LINES Kiseleva L.N., Kartashev A.V., Vartanyan N.L., Pinevich A.A., Samoilovich M.P. Cell and Tissue Biology. 2019. Т. 13. № 1. С. 1-7.) исследования, несмотря на высокую изоэффективную дозу (биологический эквивалент), в ряде глиобластом сохраняются жизнеспособные опухолевые клетки.
С целью расширения и персонификации лучевой терапии больных со злокачественными глиомами и особенно с их рецидивами были проведен ряд экспериментов по определению индивидуальной чувствительности опухоли, полученной от пациента и превращенной в клеточную культуру (Kiseleva L.N., Kartashev A.V., Vartanyan N.L., Pinevich A.A., Filatov M.V., Samoilovich M.P. Characterization of new human glioblastoma cell lines. Cell and Tissue Biology, 2018, 12(1): 1-6).
Клетки сохранялись в замороженном состоянии в криохранилище при температуре жидкого азота. Маркированную пробирку с клетками доставали из хранилища и сразу погружали в водяную баню с температурой 40±2°C. Сразу после оттаивания содержимое криопробирки переносили в центрифужную пробирку в ростовую среду комнатной температуры, состоящую из среды для культур клеток αMEM (95%) и сыворотки эмбрионов коров (5%). Клетки осаждали центрифугированием при 100g в течение 6 минут и убирали надосадочную жидкость. Добавляли 5 мл ростовой среды, осторожно пипетировали клетки и переносили в пластиковый вентилируемый культуральный флакон площадью 25 см2. Флакон помещали в инкубатор с воздушной фазой, содержащей 6% CO2, температурой +37°C и в условия 100% влажности. Клетки инкубировали в течение 2-3 суток, ежедневно контролируя с помощью инвертированного микроскопа формирование клеточного монослоя. По достижении клетками 70% конфлюента клетки пересевали в 24-луночный культуральный планшет. Для этого из флакона удаляли ростовую среду, наливали в него стерильный раствор Дальбекко без кальция и магния, выдерживали 2-3 минуты, удаляли из флакона. Затем во флакон наливали 0,5 мл раствора трипсина с версеном и оставляли в нем клетки на 7-10 минут, контролируя с помощью микроскопа открепление клеток от поверхности. Когда большинство клеток оказывалось в суспензии, во флакон наливали 5 мл ростовой среды и брали пробу для подсчета концентрации клеток с помощью кондуктометрического счетчика частиц.
Клетки во флаконах подвергались облучению на линейном ускорителе Electa Axesse c энергией 6 МэВ. Облучение клеток в дозах 10, 20, 30 Гр, мощность дозы составила 2 Гр/мин. После облучения флаконы с клетками снова были перенесены в инкубатор. Спустя 1 час во всех флаконах с клетками была проведена замена 2/3 культуральной среды. В дальнейшем, два раза в неделю проводили контроль состояния клеток и их фотографирование, а также замену половины ростовой среды на свежую. В течение 27 суток проводилось наблюдение - во всех флаконах, подвергшихся облучению, сохранялись немногочисленные живые клетки. При этом ни в одном из флаконов не было обнаружено признаков пролиферации клеток. По истечении 27 суток наблюдения были прекращены, клетки, оставшиеся прикрепленными на дне флакона, были окрашены красителем Май-Грюнвальд для последующего исследования морфологии наиболее резистентных клеток.
Таким образом, приведенный эксперимент позволил установить, что при облучении клеток глиомы T2 с помощью аппарата ионизирующего излучения в дозах 10, 20 или 30 Гр происходит гибель значительной части культуры, прекращается пролиферация клеток, но длительно сохраняются живые клетки, которые, при изменении условий, могут возобновить пролиферацию. Подобная вариабельность в чувствительности клеток к воздействию ионизирующего излучения позволяет сделать вывод о том, что только индивидуальный подход к подбору суммарной дозы облучения позволит достичь наилучшего терапевтического эффекта.
Одним из наиболее современных и прецизионных методов лечения больных с первичными и рецидивирующими опухолями головного мозга является методика радиохирургического облучения внутричерепной мишени, позволяющая за 1-2 сеанса подвести полную терапевтическую дозу к зоне опухолевого поражения ЦНС. Однако предписываемая суммарная доза, применяемая при радиохирургическом облучении, базируется не на чувствительности опухоли к облучению, а пропорционально зависит от объема облучаемой ткани (чем больше объем, тем меньше суммарная доза).
В связи с этим мы пришли к выводу, что основополагающим для достижения наилучшего терапевтического эффекта является персонифицированный подход к выбору дозы, основывающейся не только на облучаемом объеме, но и на индивидуальной чувствительности.
В настоящее время активно стали разрабатываться методы персонифицированного подбора дозы путем облучения культур опухолевых клеток, полученных из операционного материала, при помощи различных устройств для фиксации клеток на аппарате «Гамма-нож».
Наиболее близким к заявленному изобретению является способ фиксации клеток на гамма терапевтическом аппарате «Гамма-нож», опубликованный в статье «Scheck In vitro biological dosimeter modeling of the glioblastoma response to radiation delivered by the Gamma Knife» (Laboratory investigation J Neurosurg 2010), который и взят нами в качестве прототипа.
Данное устройство представляет собой кассету (планшет для культивирования клеточных культур) OptiCell производства Biocrystal Ltd. Которая содержит специальную мембрану площадью 50 см2 на которую высаживают клеточную культуру, имеющую адгезивные свойства к данной мембране и растущей на ней в виде клеточного монослоя.
Облучение клеточных культур осуществляется следующим образом. Кассета OptiCell размещается между двумя листками парафина толщиной 1 см. Парафин в данном случае используется как ткань-эквивалентное вещество и применяется для симуляции тела человека при изучении глубинного распределения ионизирующего излучения. Полученный блок (парафин-кассета-парафин) фиксируется в стереотаксической раме, применяемой в нейрохирургии и являющейся неотъемлемой частью аппарата «Гамма-нож». Проводится облучение. После процедуры облучения, кассета с клеточной культурой вынимается из стереотаксической рамы и без парафиновых листов помещается в СО2 инкубатор. Контроль за состоянием клеток осуществляется с помощью световой микроскопии.
Существенным недостатком способа-прототипа является невозможность точной оценки суммарной дозы на конкретную область мембраны с клеточной культурой в связи с тем, что она маркирована по зонам и представляет собой единое пространство 50 см2. Применение парафина в качестве ткань-эквивалентного объекта не оптимально, вследствие мягкости и его непрочности. Так же следует отметить, что кассета при облучении поворачивается на 90 градусов из горизонтального положения в вертикальный, что вызывает дополнительную травматизацию клеток и, в конечном итоге, снижает информативность метода.
Таким образом, приведенные решения не могут решить задачу обеспечения надежной фиксации и позиционирования клеточных культур при претензионном облучении для точного персонифицированного подбора доз облучения.
Технический результат настоящего изобретения состоит в устранении указанных недостатков и повышении точности подбора суммарных доз облучения для клеточных культур, за счет разработки и использования при прецизионном облучении устройства для фиксации и позиционирования клеточных культур.
Устройство для фиксации и позиционирования клеточных культур состоит из двух полусфер - наружной и внутренней, расположенных одна в другой и разделенных внутренним пространством, которое герметизировано силиконовой гофрой замкнутого сечения. Внутренняя сфера меньшего диаметра и выполнена в виде неразборной замкнутой конструкции с прямоугольным углублением под установку планшета для культивирования клеточных культур. Нижняя треть внутренней сферы сплошного сечения, а верхняя на две трети полая, содержащая отверстие в верхней точке для заполнения водой. Наружная сфера большего диаметра, выполнена в виде разборной полой конструкции с прямоугольным отверстием под установку планшета для культивирования клеточных культур. Планшет для клеточных культур выполнен из нетоксичного полистирола и представляет собой поднос, на котором жестко смонтированы лунки.
Точное описание устройства для фиксации и позиционирования клеточных культур при прецизионном облучении представлено на чертежах.
Краткое описание чертежей:
Фиг. 1 - Трехмерная изометрическая модель с удаленным сектором, где:
1 - планшет для культивирования клеточных культур в виде лунок;
2 - шарики;
3 - сфера внутренняя;
4 - пространство между внешней и внутренней сферой;
5 - сфера наружная;
6 - сплошное сечение нижней трети внутренней сферы
7 - силиконовая гофра.
Выполнение устройства в виде двух сфер наружной (Фиг.1,5) и внутренней (Фиг.1,3) и расположение их одна в одной обеспечивает жесткую фиксацию стереотаксической рамы за внешнюю сферу.
Пространство (Фиг.1,4) между внешней и внутренней сферой, а также полость внутренней сферы заполняется водой через отверстие, находящееся в верхней точке. После заполнения водой отверстие герметично закрывается пробкой. Водное наполнение обеспечивает тканевую симуляцию головного мозга, имеют большинство фантомов для дозиметрического планирования. Выполнение внутренней сферы (Фиг. 1,3) в виде неразборной замкнутой конструкции с прямоугольным углублением под установку планшета для культивирования клеточных культур (Фиг. 1,1) обеспечивает неподвижность планшета в пространстве при прекращении его перемещений.
Нижняя треть внутренней сферы имеет сплошное сечение (Фиг 1,6), обеспечивающее стабилизацию положения внутренней сферы в пространстве.
Сфера с большим диаметром (наружная) (Фиг. 1,5) является разборной полой конструкцией с прямоугольным отверстием под установку планшета (Фиг. 1,1) При сборке, для центровки сфер, в пространство между малой и большой сферой равномерно размещают шарики из пластика (Фиг. 1,2) одинакового диаметра, обеспечивающие свободное движение внутренней сферы относительно внешней, это помогает компенсировать вибрацию при переносе клеточной культуры от аппарата к аппарату. При этом углубление малой сферы и прямоугольное отверстие большой сферы совмещается таким образом, чтобы можно было установить планшет для культивирования клеточных культур. Для соединения углубления и прямоугольного отверстия используется гофра замкнутого сечения (Фиг. 1,7), которая плотно прилегает, а также герметизирует внутреннее пространство между малой и большой сферой. Она служит гидроизоляцией, а также обеспечивает возможность движения внутренней сферы относительно внешней.
Изготовление планшета для культивирования клеточных культур из полистирола в виде лунок позволяет обеспечить неподвижность клеточных культур, выполнить их культивацию, увеличить локальный контроль при наблюдении за состоянием клеток после облучения.
Для проведения облучения устройство помещают в стереотаксическую раму, которая является неотъемлемой частью гамма-ножа, фиксация производится за внешний контур.
Таким образом, такая конструкция устройства, при подготовке проведения облучения, позволяет жестко зафиксировать внешний контур, при этом обеспечить неподвижность луночного планшета для переноса. Неподвижность исследуемой клеточной культуры уменьшает ее травматизацию при проведении исследования, а также благодаря применению планшетной системы культивирования, в отличие от прототипа, позволяет более точно определить зону облучения. Это дает возможность верифицировано подойти к выбору суммарных доз облучения, обеспечивающих наилучший туморорицидный эффект у больных злокачественными опухолями головного мозга.
Сущность изобретения поясняется примерами.
Пример 1
Пациент Р., пол мужской, возраст 45 лет, диагноз - глиобластома в левой лобной доле, оперативное лечение 12.11.2011. Фрагмент удаленной ткани опухоли отправлен для гистологической верификации диагноза. Один фрагмент ткани опухоли был помещен в транспортную среду и доставлен в лабораторию для выделения клеток и получения культуры клеток опухоли.
В лаборатории фрагмент опухолевой ткани был подвергнут ферментативной обработке в 0,1% растворе коллагеназы I типа (Sigma). Затем клетки были отмыты от разрушенных клеточных элементов путем центрифугирования (100g, 6 минут), ресуспендированы в ростовой среде (95% α-MEM, 5% сыворотки эмбрионов коров, гентамицин) и посеяны в пластиковый вентилируемый флакон для монослойных культур. Флакон помещен в инкубатор с воздушной фазой, содержащей 6% CO2, температурой +37°C и в условия 100% влажности. После достижения пролиферирующими клетками 70% конфлюентного монослоя клетки были сняты с ростовой поверхности, как описано выше. Половина клеток была подвергнута криоконсервации, остальные клетки были перенесены в ростовую среду и распределены на 2 флакона. Пересеянные клетки растили до 70% конфлюента, снимали с культуральной поверхности и, подсчитав их концентрацию, пересевали по 50 000 клеток в 1 мл в ячейки планшета для культивирования культур клеток (Фиг. 1). Состояние монослоя клеток оценивали визуально с помощью инвертированного микроскопа. Клетки растили до 70-80% конфлюентного монослоя, обычно это занимало 48 часов. Планшет с клетками (Фиг.1,1) вынимали из инкубатора и края планшета герметизировали лабораторной термопленкой парафильм (Parafilm M, PM-996, США). Затем планшет помещали в полиэтиленовый пакет (толщина материала 0,2-0,3 мм). Пакет запаивали по периметру по размеру планшета, не оставляя по краям воздушных пузырей. Планшет переносили в помещения для проведения компьютерной томографии. Планшет помещали в устройство для фиксации и позиционирования клеточных культур при прецизионном облучении для составления плана и схемы облучения (Фиг.1).
Затем устройство для фиксации и позиционирования клеточных культур при прецизионном облучении со вставленным в него и зафиксированным планшетом помещали в аппарат «Гамма-нож» для проведения запланированного облучения. Выполняли облучение в суммарных дозах 1 , 2, 3, 4, 5, 7, 8 и 10 Гр при мощности 2 Гр/мин. По окончании облучения планшет с клетками возвращали в культуральный блок, вынимали его из упаковки и помещали в инкубатор. Через 1 час пребывания в инкубаторе планшет вынимали и в нем заменяли культуральную среду на свежую. Далее один раз в 3-4 дня проводили замену половины среды на свежую. В те же сроки проводили визуальную оценку и фотографирование состояния клеток с помощью инвертированного микроскопа, оснащенного цифровой камерой. Интенсивная гибель клеток, облученных в дозах от 3 Гр и выше, была зарегистрирована после 7 дня. На 14 сутки после облучения отсутствие живых клеток и полная гибель клеточных культур была зарегистрирована при дозах 4 Гр и выше.
Таким образом было установлено, что наименьшей терапевтической дозой для опухолевых клеток пациента являлась - 4Гр.
Проведенный впоследствии пациенту курс лучевой терапии с рекомендованной дозой, позволил достичь удовлетворительного ответа на лечение без ранних лучевых осложнений. Ремиссия составила 5 месяцев.
Пример 2
Пациент Т., пол мужской, возраст 61 год, диагноз - мультиформная глиома правой теменной и затылочной долей. Оперативное лечение 13.07.2010.
Фрагмент удаленной ткани опухоли отправлен для гистологической верификации диагноза. Один фрагмент ткани опухоли был помещен в транспортную среду и доставлен в лабораторию для выделения клеток и получения культуры клеток опухоли. Дальнейшие процедуры получения опухолевых клеток, их культивирования и подготовка к облучению были выполнены аналогично примеру 1.
Планшет для культивирования клеточных культур (Фиг. 1,1) переносили в помещение для проведения компьютерной томографии. Планшет помещали в устройство для фиксации и позиционирования клеточных культур при прецизионном облучении для составления плана и схемы облучения. Затем устройство для фиксации и позиционирования клеточных культур при прецизионном облучении со вставленным в него и зафиксированным планшетом (Фиг.1) помещали в аппарат «Гамма-нож» для проведения запланированного облучения. Выполняли облучение в суммарных дозах 5,7,10,12,20 Гр, мощность составила 1,94 Гр/мин. По окончании облучения планшет с клетками возвращали в культуральный блок, вынимали его из упаковки и помещали в инкубатор. Через 1 час пребывания в инкубаторе планшет вынимали и в нем заменяли культуральную среду на свежую. Далее один раз в 3-4 дня проводили замену половины среды на свежую. В те же сроки проводили визуальную оценку и фотографирование состояния клеток с помощью инвертированного микроскопа, оснащенного цифровой камерой. Интенсивная гибель клеток, облученных в дозах от 10 Гр и выше, была зарегистрирована после 11 суток. При этом в ячейках планшета сохранялись немногочисленные живые клетки. Поэтому наблюдение над клетками этой культуры продолжили. На 46 сутки после облучения среди клеток, облученных в дозе 10 Гр, был обнаружен фокус пролиферации. Это свидетельствовало о том, что для клеток этого пациента доза облучения 10 Гр не является абсолютно туморицидной, при ней сохраняются единичные долгоживущие клетки, которые могут восстановить пролиферативную способность и дать начало рецидиву. Минимальная доза, при которой мы не обнаружили восстановления пролиферативной способности была 12 Гр.
Проведенный впоследствии пациенту курс лучевой терапии с рекомендованной дозой, позволил достичь удовлетворительного ответа на лечение без ранних лучевых осложнений. Ремиссия составила 4,8 месяца.
Таким образом использование предлагаемого устройство для фиксации и позиционирования клеточных культур при прецизионном облучении доказало свою эффективность. За счет своей конструкции обеспечило снижение травматичности культуры опухолевых клеток при облучении, надежную их фиксацию, что позволило подобрать наиболее эффективную индивидуальную лечебную дозу для конкретного пациента.
К настоящему времени при помощи предлагаемого устройства для фиксации и позиционирования клеточных культур проведено облучение опухолевых клеточных культур, изъятых при оперативных вмешательствах у 5 больных с опухолями головного мозга с положительным результатом.
Устройство разработано в отделе лучевых и комбинированных методов лечения совместно с лабораторией гибридомных технологий в ФГБУ «РНЦРХТ им. ак. А.М. Гранова».
Claims (1)
- Устройство для фиксации и позиционирования клеточных культур при прецизионном облучении, содержащее планшет для культивирования клеточных культур, отличающееся тем, что устройство выполнено в виде двух сфер: наружной и внутренней, которые расположены одна в другой и разделены внутренним, герметизированным силиконовой гофрой замкнутого сечения пространством, заполненным шариками, при этом внутренняя сфера меньшего диаметра и выполнена в виде неразборной замкнутой конструкции с прямоугольным углублением под установку планшета для культивирования клеточных культур, нижняя треть внутренней сферы имеет сплошное сечение, а верхние две трети полые, содержат отверстие в верхней точке для заполнения водой, а наружная сфера большего диаметра, выполнена в виде разборной полой конструкции с прямоугольным отверстием под установку планшета для культивирования клеточных культур, при этом планшет выполнен в из полистирола в виде лунок.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2778859C1 true RU2778859C1 (ru) | 2022-08-26 |
Family
ID=
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6290907B1 (en) * | 1997-09-11 | 2001-09-18 | Hitachi, Ltd. | Sample handling system |
| RU136227U1 (ru) * | 2013-08-29 | 2013-12-27 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Ульяновский государственный университет" | Компактный источник альфа-частиц для облучения клеточных культур |
| RU2510654C2 (ru) * | 2007-09-18 | 2014-04-10 | Кордис Корпорейшн | ЛОКАЛЬНАЯ СОСУДИСТАЯ ДОСТАВКА ИНГИБИТОРОВ mTOR В СОЧЕТАНИИ СО СТИМУЛЯТОРАМИ РЕЦЕПТОРА, АКТИВИРУЕМОГО ПРОЛИФЕРАТОРАМИ ПЕРОКСИСОМ |
| RU2627927C2 (ru) * | 2011-09-25 | 2017-08-14 | Теранос, Инк. | Системы и способы многостороннего анализа |
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6290907B1 (en) * | 1997-09-11 | 2001-09-18 | Hitachi, Ltd. | Sample handling system |
| RU2510654C2 (ru) * | 2007-09-18 | 2014-04-10 | Кордис Корпорейшн | ЛОКАЛЬНАЯ СОСУДИСТАЯ ДОСТАВКА ИНГИБИТОРОВ mTOR В СОЧЕТАНИИ СО СТИМУЛЯТОРАМИ РЕЦЕПТОРА, АКТИВИРУЕМОГО ПРОЛИФЕРАТОРАМИ ПЕРОКСИСОМ |
| RU2627927C2 (ru) * | 2011-09-25 | 2017-08-14 | Теранос, Инк. | Системы и способы многостороннего анализа |
| RU136227U1 (ru) * | 2013-08-29 | 2013-12-27 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Ульяновский государственный университет" | Компактный источник альфа-частиц для облучения клеточных культур |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Scheck In vitro biological dosimeter modeling of the glioblastoma response to radiation delivered by the Gamma Knife // Laboratory investigation J Neurosurg. 2010. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Sutherland et al. | Growth of multicell spheroids in tissue culture as a model of nodular carcinomas | |
| Girinsky et al. | Predictive value of in vitro radiosensitivity parameters in head and neck cancers and cervical carcinomas: preliminary correlations with local control and overall survival | |
| Gross et al. | Calibration of misonidazole labeling by simultaneous measurement of oxygen tension and labeling density in multicellular spheroids | |
| Sureka et al. | Radiation biology for medical physicists | |
| Aas et al. | The RG2 rat glioma model | |
| Wang et al. | The in vivo study on the radiobiologic effect of prolonged delivery time to tumor control in C57BL mice implanted with Lewis lung cancer | |
| Fujisawa et al. | Comparison of human chordoma cell-kill for 290 MeV/n carbon ions versus 70 MeV protons in vitro | |
| Gragg et al. | The Response of Chinese Hamster Ovary Cells to Fast-Neutron Radiotherapy Beams: II. Sublethal and Potentially Lethal Damage Recovery Capabilities | |
| FitzGerald et al. | Effect of X-irradiation dose rate on the clonagenic survival of human and experimental animal hematopoietic tumor cell lines: evidence for heterogeneity | |
| RU2778859C1 (ru) | Устройство для фиксации и позиционирования клеточных культур при прецизионном облучении | |
| Grenman et al. | Radiosensitivity of head and neck cancer cells in vitro: A 96-well plate clonogenic cell assay for squamous cell carcinoma | |
| Kwock et al. | Endothelial cell damage after γ-irradiation in vitro: impaired uptake of α-aminoisobutyric acid | |
| Röttinger et al. | Modification of pH induced cellular inactivation by irradiation—Glial cells | |
| CN108977494A (zh) | 一种预测药物疗效的方法 | |
| Gerner et al. | Polyamines and polyamine biosynthesis in cells exposed to hyperthermia | |
| Bromley et al. | Predicting the clonogenic survival of A549 cells after modulated x-ray irradiation using the linear quadratic model | |
| Marcu | The first Rs of radiotherapy: or standing on the shoulders of giants | |
| Roda et al. | Blood–brain barrier (BBB) toxicity and permeability assessment after L-(4-10Boronophenyl) alanine, a conventional B-containing drug for boron neutron capture therapy, using an in vitro BBB model | |
| Horowitz et al. | Conditioned medium from plateau-phase cells: effect on growth of proliferative cells and on repair of potentially lethal radiation damage | |
| Weichselbaum et al. | Repair of fractionated radiation in plateau phase cultures of human tumor cells and human multicellular tumor spheroids | |
| Gutin et al. | Combination therapy with 1, 3-bis (2-chloroethyl)-1-nitrosourea and low dose rate radiation in the 9L rat brain tumor and spheroid models: implications for brain tumor brachytherapy | |
| BR102019013765A2 (pt) | Método de obtenção de vacina autóloga à base de células dendríticas para tumores cerebrais e vacina resultante | |
| Conger et al. | Ultrasonic effects on mammalian multicellular tumor spheroids | |
| Afzal et al. | PLD repair in rat rhabdomyosarcoma tumor cells irradiated in vivo and in vitro with high-LET and low-LET radiation | |
| Valerlote et al. | Growth characteristics of MOPC-315 plasmacytoma and response to anticancer agents |