KR101478881B1 - 이중 검출 형광 공초점 현미경 장치 및 그 영상을 획득하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명의 실시 예는 현미경에 관한 것으로, 자세하게는 이중 검출 형광 공초점 현미경 장치와 장치를 이용하여 영상을 획득하는 방법에 관한 것이다. 형광물질의 3차원 영상을 얻기 위한 현미경 장치에 있어서, 형광물질을 포함하는 시편과 시편을 관찰하기 위한 대물렌즈를 구비한 시편부; 및 크기가 다른 제1 핀홀과 제2 핀홀을 구비하고 있으며, 제1 핀홀과 제2 핀홀을 각각 통과한 형광 신호의 세기를 측정하는 제1 검출기(Photomultiplier tube, PMT)와 제2 검출기를 구비한 검출부를 포함하고, 검출부는 제1 검출기와 제2 검출기에서 측정한 각 형광 신호의 세기를 통해 시편의 높이를 구하고, 3차원 영상을 획득하는 것을 특징으로 하는 공초점 현미경 장치가 제공될 수 있다.

Description

이중 검출 형광 공초점 현미경 장치 및 그 영상을 획득하는 방법{DUAL DETECTION CONFOCAL FLUORESCENCE MICROSCOPY APPARATUS AND METHOD OF CAPTURING IMAGE}

본 발명의 실시 예는 현미경에 관한 것으로, 자세하게는 이중 검출 형광 공초점 현미경 장치와 장치를 이용하여 영상을 획득하는 방법에 관한 것이다.

기존의 공초점 현미경은 보통 하나의 핀홀을 사용하여 신호의 강도를 측정한다. 이때 Axial Response Curve(축방향 응답 곡선)가 intensity와 축방향 거리로 나타나는데, 초점 평면에서 가장 강한 강도의 신호가 측정되고 초점 평면에서 벗어날수록 측정되는 빛의 세기는 감소한다. 공초점 현미경은 NA(Numerical Aperture)가 높은 대물렌즈를 사용하여 Axial Response Curve의 반치폭을 축방향 분해능으로 사용한다. 따라서 3차원 영상을 측정하기 위해서 초점평면을 이동시키며 축적된 평면 영상을 쌓아서 복원한다. 여기서 초점 평면을 이동시키는 기계적인 구동기가 필요하다.

하나의 핀홀을 사용하여 구한 Axial Response Curve가 나타내는 신호의 세기와 축방향 거리의 관계를 이용하여 깊이 분별력을 갖기 위해서는 측정 대상이 항상 일정한 빛을 방출할 때만 가능하다. 하지만 형광 신호는 그 신호의 세기가 일정하지 않다. 따라서 측정 대상의 깊이와 상관없이 방출되는 형광 빛이 강할 경우 강한 강도의 신호가 측정되므로, 형광물질이 같은 깊이에 있더라도 강한 빛을 방출하면 신호 세기가 크게 측정되어 초점평면에 가까이 있는 것으로 인식되며 약한 형광 빛을 방출하면 초점평면에서 멀리 벗어난 것으로 인식되는 문제가 있다.

본 발명의 실시예를 설명하기에 앞서, 관련도가 높은 기존의 현미경에 대해서 설명하고자 한다.

공초점 주사 현미경: 공초점 현미경은 광 검출기 앞에 핀홀을 위치시켜 대물렌즈의 초점 평면에서 방출된 빛은 핀홀을 통과하고 초점에서 벗어난 평면에서 방출된 빛은 핀홀에 차단되어 초점 영역의 신호만을 받아들일 수 있다. 따라서, 시편의 손상 없이 광학적 절편 영상을 획득할 수 있고 대물렌즈를 광축 방향으로 이송시키거나 시편을 광축 방향으로 이송시키면서 광학적 절편 영상을 연속적으로 획득하면 시편의 3차원 영상을 획득할 수 있다. 하지만 3차원 영상을 얻기 위해서는 일반적으로 수 십장 이상의 광학적 절편 영상을 획득해야 하기 때문에 영상 획득 시간이 오래 걸리고 과도한 레이저 빛을 조사하여 광 탈색(photo bleaching) 현상이 발생할 위험이 높으며, 기계적 이송을 위해 시스템의 크기가 커지고 복잡해 지는 문제점이 존재한다.

미분 공초점 현미경: 미분 공초점 현미경은 시편에서 반사되어 광 검출기를 향하는 빛을 광 분리기로 나눈다. 한 광 검출기 앞의 핀홀은 대물렌즈의 공액초점 위치 보다 멀리 위치하며, 다른 핀홀은 대물렌즈의 공액초점 위치 보다 가까이 위치한다. 핀홀이 대물렌즈 공액초점에서 벗어난 거리만큼 축방향 응답곡선도 이동하므로 두 개의 축방향 응답곡선의 차로 새로운 곡선을 얻으며, 이 곡선이 빛의 세기와 빛이 반사되는 시편의 높이의 관계를 나타내므로 두 광 검출기로 검출한 빛의 세기의 차를 측정하여 빛이 반사되는 시편의 높이를 직접 측정할 수 있다. 하지만 반사형 현미경으로만 사용되는 반면 형광 신호의 양자 수율(Quantum Yield)의 특성이 있기 때문에 시편 내의 형광 입자의 깊이 측정이 어렵다.

스펙트럼 영역의 형광 간섭 단층촬영기: 형광신호의 자가간섭을 측정하여 형광물질의 깊이를 측정하는 방식이다. 투과형 시편을 조명하여 발생한 형광 신호를 다른 두 경로로 진행시키는데, 다른 경로로 진행한 두 형광 빛을 간섭시킨 빛의 스펙트럼을 관찰하고, 스펙트럼의 위상 변화로 형광 입자의 위치 측정 가능하나 시스템의 구성이 복잡하고, 시편의 샘플링이 요구되며 생체 내에서(In-vivo) 이미징이 힘들다.

본 발명의 일실시예는 형광물질로부터 방출된 형광 신호를 이용하여 3차원 형광 신호 영상을 고속 측정할 수 있는 광학 측정 시스템을 개발하고자 한다.

자세하게는, 공초점 현미경 장치를 개발하여 기계적인 이송 없이 깊이 분별력을 가지며, 고속으로 3차원 영상의 획득이 가능하도록 하며, 이에 현미경의 시편으로 입사된 빛의 광축 위에 위치한 형광물질의 깊이의 측정이 가능하도록 하는데 본 발명의 목적이 있다.

형광물질의 3차원 영상을 얻기 위한 현미경 장치에 있어서, 형광물질을 포함하는 시편과 시편을 관찰하기 위한 대물렌즈를 구비한 시편부; 및 크기가 다른 제1 핀홀과 제2 핀홀을 구비하고 있으며, 제1 핀홀과 제2 핀홀을 각각 통과한 형광 신호의 세기를 측정하는 제1 검출기(Photomultiplier tube, PMT)와 제2 검출기를 구비한 검출부를 포함하고, 검출부는 제1 검출기와 제2 검출기에서 측정한 각 형광 신호의 세기를 통해 시편의 높이를 구하고, 3차원 영상을 획득하는 것을 특징으로 하는 공초점 현미경 장치가 제공될 수 있다.

일측에 있어서, 검출부는 시편에서 방출하는 형광 신호를 나누어 제1 핀홀과 제2 핀홀로 전달하는 빔 스플리터(Beam Splitter)를 포함하고, 빔 스플리터는 형광 신호의 크기를 나누어 전달할 수 있다.

또 다른 측면에 있어서, 검출부는 제1 검출기로부터 측정한 신호의 세기와 제2 검출기로부터 측정한 신호 세기 비율을 측정하고, 반치폭이 다른 두 개의 축방향 응답 곡선을 획득하며, 축방향 응답 곡선에 신호 세기 비율을 대입하여 시편의 높이를 측정할 수 있다.

또 다른 측면에 있어서, 축방향 응답 곡선은 실험 또는 수식을 통해서 획득하며, 교정 과정을 거쳐 미리 획득할 수 있다.

또 다른 측면에 있어서, 축방향 응답 곡선은 반치폭을 축방향 분해능으로 고려하지 않고 축방향 측정 범위로 간주하면, 시편과 초점 평면 간의 거리에 따라 측정되는 신호의 세기가 달라질 수 있다.

또 다른 측면에 있어서, 검출부는 각 형광 신호의 세기를 측정할 때엔 형광 신호가 방출되는 위치와 제1 핀홀, 제2 핀홀의 크기, 그리고 양자 수율이 고려될 수 있다.

또 다른 측면에 있어서, 검출부는 시편을 초점 평면의 이동 없이 횡방향으로 스캔함으로써 3차원 시편의 영상을 복원할 수 있다.

또 다른 측면에 있어서, 형광 신호는 레이저의 평행광이 시편부의 시편에서 방출되어 생성되며, 공초점 현미경 장치는 공진형 스캐너 또는 갈바노 거울을 포함하여 레이저의 평행광을 시편에 입사시켜 2차원 평면 스캐닝을 할 수 있다.

또 다른 측면에 있어서, 공초점 현미경 장치는 특정 파장 기준으로 빛을 반사하고 통과시키는 반투과 거울로 구성되는 다이크로익 미러와 에미션 필터(Emission Filter)를 포함하고, 다이크로익 미러와 에미션 필터를 통해 형광 신호를 검출부로 전달 할 수 있다.

형광물질의 3차원 영상을 얻기 위한 현미경 장치에 있어서, 형광물질을 포함하는 시편과 시편을 관찰하기 위한 대물렌즈를 구비한 시편부; 및 크기가 다른 복수 개의 지점에 대한 형광 신호의 세기를 측정하는 측정 장치를 포함하고, 측정 장치는 측정한 형광 신호의 세기를 이용하여 시편의 높이를 구하고, 3차원 영상을 획득하는 것을 특징으로 하는 공초점 현미경 장치가 제공될 수 있다.

일측에 있어서, 크기가 다른 복수 개의 지점은 제1 지점과 제2 지점으로 구분되는데, 제1 지점은 크기가 작은 핀홀 역할을 하고, 제2 지점은 제1 지점을 포함하고 있으며, 크기가 큰 핀홀의 역할을 할 수 있다.

또 다른 측면에 있어서, 측정 장치는 CCD(Charge Coupled Device)에 해당하고 제1 지점과 제2 지점은 픽셀 단위로 구성되는데, 측정 장치는 제1 지점의 픽셀에서 형광 신호의 세기를 측정하고, 제1 지점의 주변 픽셀을 포함하는 제2 지점의 픽셀에서 측정한 형광 신호의 세기를 적분할 수 있다.

또 다른 측면에 있어서, 측정 장치는 Detector array(배열 검출기)에 해당하고, 상기 제1 지점과 제2 지점은 센서 단위로 구성되는데, 측정 장치는 제1 지점의 센서에서 형광 신호의 세기를 측정하고, 제1 지점의 주변 센서를 포함하는 상기 제2 지점의 센서에서 측정한 형광 신호의 세기를 적분할 수 있다.

현미경 장치에서 형광물질의 3차원 영상을 얻기 위한 방법에 있어서, 형광물질을 포함하는 시편에서 방출되는 형광 신호를 검출부로 전달하는 단계; 및 검출부 내의 제1 핀홀과 제2 핀홀에 전달된 형광 신호를 각각 통과시켜 각각의 형광 신호의 세기를 측정하는 단계; 및 검출부에서 측정한 각각의 형광 신호의 세기를 통해 시편의 높이를 구하고 3차원 영상을 획득하는 단계를 포함하는 3차원 영상 획득 방법이 제공될 수 있다.

본 발명의 일실시예를 통해, 형광물질로부터 방출된 형광 신호를 이용하여 3차원 형광 신호 영상을 고속 측정할 수 있는 광학 측정 시스템을 개발할 수 있다.

또한, 공초점 현미경 장치를 개발하여 기계적인 이송 없이 깊이 분별력을 가지며, 고속으로 3차원 영상의 획득이 가능한 현미경 장치를 제공할 수 있고, 이에 현미경의 시편으로 입사된 빛의 광축 위에 위치한 형광물질의 깊이의 측정이 가능하게 될 수 있다.

더불어, 본 발명의 실시예를 통해 영상 기기의 활용도를 더욱 높일 수 있으며, 장치의 구조가 단순하기 때문에 살아있는 생체 내에서 관찰이 가능하다.

그리고, 제안하는 현미경 장치에 큰 핀홀을 추가적으로 사용하여 형광 영상의 효율을 향상시키는 효과를 가져올 수 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 있어서, 3차원 형광 영상을 획득하는 공초점 현미경 장치의 구성을 설명하기 위한 도면이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 있어서, 두 개의 핀홀을 통해 획득할 수 있는 축방향 응답 곡선의 비율을 설명하기 위한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 있어서, 축방향 응답 곡선의 비율을 이용하여 형광 신호의 강도에 따른 시편의 높이를 구하는 방법을 설명하기 위한 도면이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 있어서, 공초점 현미경 장치의 다른 실시예를 설명하기 위한 도면이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 있어서, 공초점 현미경 장치의 또 다른 구성의 실시예를 설명하기 위한 도면이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 있어서, 공초점 현미경 장치에서 3차원 영상을 획득하기 위한 방법을 설명하기 위한 흐름도이다.

이하, 3차원 영상을 획득하기 위한 공초점 현미경 장치와 3차원 영상을 획득하는 방법에 대해서 첨부된 도면을 참조하여 자세히 설명한다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 있어서, 형광물질의 3차원 영상을 획득할 수 있는 공초점 현미경 장치의 구성을 나타낸 것이다. 실시예에 있어서, 공초점 현미경 장치(100)는 형광물질을 포함하는 시편(111)과 시편(111)을 관찰하기 위한 대물렌즈(112)를 포함하고 있는 시편부(110)와 시편(111)에서 방출된 형광 신호를 이용하여 시편(111)의 3차원 영상을 검출해내는 검출부(120)가 포함되어 구성될 수 있다.

그리고 검출부(120)는 전달된 형광 신호를 크기가 다른 두 개의 핀홀인 제1 핀홀(121)과 제2 핀홀(123)로 분할하여 전달하는 빔 스플리터(Beam Splitter)(125)가 포함되어 있으며, 제1 핀홀(121)과 제2 핀홀(123)을 통과한 형광 신호는 제1 검출기(122)와 제2 검출기(124)에서 측정되어 형광 신호의 세기를 추출할 수 있다. 이에 두 개의 검출기(122, 124)에서는 서로 다른 광축 방향 신호를 동시에 획득할 수 있는데, 이 신호를 이용하여 두 개의 축방향 응답 곡선을 도출해낼 수 있으며, 두 개의 축방향 응답 곡선을 나눈 새로운 응답 곡선(126)을 획득할 수 있다.

본 발명의 이중 검출 형광 공초점 현미경 장치(100)에서 빛이 어떻게 이동하는지, 실시예에 대해서 더 자세히 설명한다.

현미경 장치(100)의 광원(101)으로는 488nm 파장의 레이저를 선택적으로 사용할 수 있다. 광원(101)의 레이저는 먼저 시편(111)으로 입사되는데, 레이저에서 발생한 빛은 콜리메이터(Collimator)에서 평행광으로 만들어지는데, 만들어진 평행광은 여기 필터(Excitation Filter)를 거치는데, 여기 필터는 입사하는데 적합한 파장을 선택적으로 통과시키고, 노이즈를 억제하여 감소하도록 하는 필터이다. 여기 필터를 통과한 평행광은 다이크로익 미러(Dichroic Mirror)(103)에 반사되어 진행방향이 변경된다.

본 발명의 광학 시스템, 즉 현미경 장치(100)에서 2차원 스캐닝은 공진형 스캐너(CRS) 또는 갈바노 거울(Galvano Mirror)(102)로써 구현할 수 있다. 여기서, 공진형 스캐너는 정해진 구간에서 공진 주파수로 진동하면서 갈바노 거울(102)은 전기적 신호로 받게 되고 이 신호에 의해서 거울이 회전되는데, 다이크로익 미러(103)와 갈바노 거울(102)의 회전축이 직각이 되도록 위치시켜서 입사되는 평행광이 두 거울에 순서대로 반사되면, 시편을 X 방향과 Y 방향으로 커버하는 2차원적 스캐닝을 수행할 수 있다.

한편, 공진형 스캐너와 갈바노 거울(102)에 반사되어 진행 경로가 변경된 평행광은 중계 렌즈에 입사되어 평행광의 중심이 대물렌즈(112)에 맺히게 된다. 실시예에 있어서, 중계렌즈는 대물렌즈의 구경 중심을 향하도록 빛의 방향을 조절하는 렌즈이며, 이때 중계렌즈의 배율은 대물렌즈의 구경에 적합하도록 조절 될 수 있다. 또한, 평행광은 대물렌즈(112)를 통과하여 형광물질을 포함하는 시편(111)에 입사된다.

여기서, 시편(111)에 입사된 빛의 일부는 시편(111)에 포함되어 있는 형광물질에 의해 흡수되었다가 다시 방출되는데, 이때 방출되는 신호는 형광 신호가 될 수 있다. 형광 신호는 시편(111)에 포함되어 있는 형광물질에서 방출된 신호로, 주파수가 낮은 긴 파장의 신호가 된다.

시편(111)에서 방출된 형광 신호는 평행광이 입사한 방향을 거슬러 반대 방향으로 진행하여 갈바노 거울(102)과 다이크로익 미러(103)로 이동하는데, 다이크로익 미러(103)에서 반사되지 않고 통과한다. 다이크로익 미러(103)는 특정 파장을 기준으로 원하는 파장의 신호만 통과시키고 다른 파장의 신호는 반사시키는 특징을 가지고 있는 거울이며, 이에 따라 주파수가 변한 형광 신호를 통과시킬 수 있는 것이다.

다이크로익 미러(103)를 통과한 형광 신호는 에미션 필터(Emission Filter)(104)를 통과하여 시편(111)에 의한 형광 신호만 검출부(120)로 전달될 수 있다. 전달되는 형광 신호는 광축 위의 형광물질을 포함하는 시편(111)에 대한 위치를 측정하기 위한 실시예로서, 빔 스플리터(Beam Splitter)(125)에 의해서 나누어지고 각 신호는 집광렌즈를 통해 각각이 신호에 대해 핀홀(121, 123)에 초점을 맺을 수 있다. 이때 핀홀(121, 123)은 각각 크기가 다르다.

실시예에 있어서, 제1 핀홀(121)은 크기가 큰 핀홀, 제2 핀홀(123)은 크기가 작은 핀홀을 의미할 수 있으며, 그 반대에 대해서도 설명할 수 있다. 각 핀홀에 맺힌 초점에 대해서 제1 검출기(122)와 제2 검출기(124)를 통해서 각 신호를 측정할 수 있다. 여기서, 제1 핀홀과 제2 핀홀의 크기가 다르기 때문에, 각 신호에 대한 축방향 응답 곡선(Axial Response Curve)(126)은 반치폭(Full Width Half Maximum)이 다르게 나타난다.

축방향 응답 곡선(126)은 도 2에 도시된 축방향 응답 곡선에 상응하는 것이 될 수 있으며, 도 2의 그래프는 미리 계측되어 있는 것으로, 수식에 의한 것이거나 또는 실험적으로 도출될 수 있는 것이다. 도 2의 축방향 응답 곡선은 신호의 세기에 대해 정규화된 것으로 측정된 신호 세기에 대한 축방향 응답 곡선을 비교하기에 적합하다. 그래프가 나타내고자 하는 바는 시편 내 형광물질의 깊이(z)에 따라 형광 신호 세기의 강도가 어떻게 나타나는지에 대한 것이다.

이에, 도 2의 축방향 응답 곡선, 제1 검출기(122)와 제2 검출기(124)로 검출된 신호의 세기에 대해 도출된 축방향 응답 곡선에 대해서 자세히 설명한다.

수학식 1은 도 2의 그래프와 연결될 수 있는 것으로, 여기서 I(Φ)는 형광물질의 특성에 따라, 예컨대 농도, Ph, 온도 등의 환경 조건 특성에 따라 변할 수 있는 형광 신호의 세기를 의미하며, I(z, r_p)은 형광물질의 깊이, 즉 초점과 시편 사이의 거리와 핀홀의 지름에 따라 변할 수 있는 형광 신호의 세기를 의미한다. 또한, I_R은 제1 핀홀과 제2 핀홀에서 구한 형광 신호의 세기의 비율에 대한 것이다.

실시예에 있어서, 도 1에 도시된 제1 핀홀과 제2 핀홀을 비교하면, 제1 핀홀의 크기가 더 크며, 핀홀의 크기가 클수록 같은 형광 신호가 유입되더라도 더 많은 범위에서 신호를 수신하기 때문에, 이에 따라 측정되는 신호의 세기가 더 크게 나타날 수 있다.

도 2의 그래프는 실험적, 이론적으로 미리 도출되어 있는 그래프에 수학식 1에 의한 값을 통해 구할 수 있다. 실시예에 있어서, I_L은 큰 핀홀의 검출기에서 측정된 신호에 세기에 대한 것이며, I_S은 작은 핀홀의 검출기에서 측정된 형광 신호에 대한 것이다. 상기에 설명한 바와 같이, 핀홀이 클 때에 신호의 세기 또한 크게 나타나는 것을 확인할 수 있다. 두 개의 핀홀에서 측정되는 신호의 세기에 대한 그래프는 점선으로 표시되어 있으며, 실선으로 표시된 그래프 I_R은 두 개의 축방향 응답 곡선을 나누어 새로운 응답 곡선을 얻은 것이다.

또한, 당연한 것일 수 있으나 도 2의 그래프에 따르면, 시편 내의 형광물질의 깊이가 커짐에 따라, 다시 말하면, 초점과 시편 사이의 거리가 멀어짐에 따라 측정되는 신호의 세기는 약해질 수 있다.

이렇게 구한 새로운 축방향 응답 곡선을 이용하여, 각 핀홀로 측정된 형광 신호의 세기를 나눈 값으로 시편의 형광물질의 깊이를 측정할 수 있다. 여기서, 축방향 응답 곡선의 반치폭을 축방향의 분해능으로 고려하지 않고 축방향 측정 범위로 간주하게 되면, 형광물질의 시편과 초점 평면 간의 거리에 따라 측정되는 빛의 세기가 달라질 수 있으며, 축방향 응답 곡선의 특성을 통해 이를 확인할 수 있다.

뿐만 아니라, 형광 신호는 양자 수율(Quantum Yield)이 고려되어 형광이 방출되는 양에 비례하여 그 강도가 측정될 수 있다. 따라서, 제1 검출기와 제2 검출기를 통해 측정된 신호의 세기는 형광 신호가 방출되는 위치와 핀홀의 크기, 양자 수율이 고려되어 결정될 수 있다. 두 개의 핀홀의 크기가 결정되었을 때, 핀홀에서 각각 측정된 두 신호 세기의 비율은 수학식 1에 나타난 바와 같이, 형광 신호가 방출되는 위치에 대한 값을 나타날 수 있다.

도 3의 실시예를 이용하여, 도 2의 그래프에서 시편 내 형광물질의 깊이를 어떻게 유추해내는지 설명할 수 있다. 도 3의 오른쪽에 도시되어 있는 그래프는 도 2에 도시된 그래프 X축과 Y축을 이동시킨 것이다. 광축에 수직인 초점 평면(Focal Plane)에 대해서 도시된 바와 같이 X 방향으로 스캔할 수 있다. 도 3의 실시예는 상기에 설명한 바와 같이 측정되는 신호 세기의 비율은 형광 신호가 방출된 위치에 대한 값으로 정해진다는 특성을 이용하는 것이다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 그래프의 값에 측정된 값을 대입함으로써, 실시예로, 측정된 신호의 세기로 시편 내의 형광물질에 대한 높이를 직접 구할 수 있으므로, 시편을 초점 평면의 이동 없이 횡방향, 도시된 바와 같이 X-, Y-방향으로 스캔하여 3차원 형광 시편의 영상을 복원할 수 있다.

본 발명의 실시예는 두 개의 핀홀과 두 개의 검출기를 통해 검출부가 구성될 수 있는데, 또 다른 실시예로서 도 4와 같이 Area CCD(Charge Coupled Device)를 이용하여 검출부(420)가 구성될 수 있다. 실시예에 있어서, 도 4는 도 1의 현미경 장치와 유사한 것으로, 검출부(120, 420)의 구성이 상이하게 나타나며, 시편부(410)는 도 1에 나타낸 바와 같이, 형광물질을 포함하는 시편과 시편을 관찰하기 위한 대물렌즈를 포함하여 구성할 수 있다.

도 4의 실시예에 있어서, 광원으로부터 신호의 진행방향은 도 1의 실시예와 같다. 레이저 광원에서 방출된 빛은 콜리메이터를 통해 평행광으로 형성되고, 이 평행광은 여기 필터를 통과한 후 다이크로익 미러에 반사되어 공진형 스캐너와 갈바노 거울로 이동할 수 있다. 공진형 스캐너와 갈바노 거울에 반사되어 진행경로가 변경된 평행광은 중계렌즈에 입사되어 시편부(410)로 이동하는데, 평행광의 중심이 대물렌즈의 중심에 맺히게 되고, 평행광은 대물렌즈를 통과하여 시편에 입사되었다가 방출될 수 있다.

여기서, 시편으로부터 방출된 신호는 형광 신호로 입사된 평행광과 같은 경로를 반대 방향으로 진행하여 다이크로익 미러로 이동하는데, 여기서 반사되지 않고 통과되고, 에미션 필터를 함께 통과함으로서 시편에 대한 형광 신호만 남아있게 되며, 이 형광 신호를 검출부(420)로 이동할 수 있다.

검출부(420)의 CCD는 대물렌즈의 결합 초점면(Conjugate Focal Plane)에서 영상을 측정할 수 있다. 본 발명의 실시예를 통해 측정된 영상(422)은 픽셀 구조로 되어 있으며, 중심에서 에어리 디스크(Airy disc)와 비슷한 크기에 해당하는 하나 이상의 픽셀들이 도 1의 작은 핀홀의 역할을 하며, 주변의 픽셀은 큰 핀홀의 역할을 하는데, 형광 신호가 입사되는 픽셀에서 각각 측정되는 신호의 세기를 적분할 수 있다. CCD는 초점을 변경하여 형광 신호가 조사되는 픽셀의 범위도 함께 변하며, 포함되는 픽셀의 수는 실시예에 한정하지 않는다.

도 5는 본 발명의 실시예에 있어서, 공초점 현미경 장치의 또 다른 실시예로서, CCD의 측정 장치 대신 배열 검출기(Detector array)(521)를 사용하여 CCD의 사용과 비슷한 실시예를 획득할 수 있다. 실시예에 있어서, CCD의 속도보다 더 빠르게 측정할 수 있으며, 고감도의 결과를 획득할 수 있다. 마찬가지로, 검출부(520)를 제외한 나머지 구성은 도 1에 상응하므로, 빛이 입사되어 시편부(510)에서 반사되어 형광 신호를 방출하고 검출부(520)로 전달되는 과정에 대해서는 설명을 생략하도록 한다.

배열 검출기(521)는 광 센서를 포함하고 있는 것으로, 측정 영상(522)은 센서 단위로 구성되는데, 도시된 하나의 픽셀은 하나의 센서를 의미한다. 가운데 있는 중심 디텍터는 도 1에서의 작은 핀홀의 역할을 하며, 주변에 배열되어 있는 센서는 큰 핀홀의 역할을 한다. 각 센서는 도달하는 신호의 세기를 측정할 수 있으며, 주변 센서에서 측정한 신호의 세기는 전체 신호의 세기로 적분되어 결과 값으로 나타날 수 있다.

도 6은 본 발명의 일실시예에 있어서, 공초점 현미경 장치에서 3차원 영상을 획득할 수 있는 방법을 설명하기 위한 흐름도이다. 실시예에 있어서, 도 1을 통해 설명한 공초점 현미경 장치(100)에서 실시될 수 있다.

단계(610)에서 공초점 현미경 장치(100)는 형광물질을 포함하는 시편에서 방출되는 형광 신호를 검출부로 전달할 수 있다. 여기서, 형광 신호는 평행광이 시편에 입사되었다가 에너지를 잃고 방출되는 것으로 이 형광 신호를 이용하여 시편의 3차원 영상을 획득할 수 있다.

단계(620)에서 공초점 현미경 장치(100)는 검출부 내의 제1 핀홀과 제2 핀홀에 전달된 형광 신호를 각각 통과시켜 각각에 대한 형광 신호의 세기를 측정할 수 있다. 실질적으로 형광 신호의 세기를 측정할 때 형광 신호의 크기를 나누어 제1 핀홀과 제2 핀홀에 전달하여 측정할 수 있으며, 각 핀홀의 뒤에 배치되는 것으로 제1 검출기와 제2 검출기를 통해 신호의 세기를 측정할 수 있다.

단계(630)에서 형광 신호의 세기를 통해 시편의 높이를 구하고 3차원 영상을 획득할 수 있다. 측정된 신호의 세기를 3차원 영상을 획득하기 위해 각각의 형광 신호의 세기에 대한 축방향 응답 곡선을 구하고, 두 개의 축방향 응답 곡선을 나누어 새로운 축방향 응답 곡선을 획득할 수 있는데, 새롭게 획득한 축방향 응답 곡선을 이용하여 시편 내의 형광물질의 깊이 정보를 확인할 수 있다.

여기서, 축방향 응답 곡선의 반치폭을 축방향의 분해능으로 고려하지 않고 축방향 측정 범위로 간주하게 되면, 형광물질의 시편과 초점 평면 간의 거리에 따라 측정되는 빛의 세기가 달라질 수 있으며, 축방향 응답 곡선의 특성을 통해 이를 확인할 수 있다.

더불어, 형광 신호는 양자 수율(Quantum Yield)이 고려되어 형광이 방출되는 양에 비례하여 그 강도가 측정될 수 있다. 따라서, 제1 검출기와 제2 검출기를 통해 측정된 신호의 세기는 형광 신호가 방출되는 위치와 제1 핀홀, 제2 핀홀의 크기, 그리고 양자 수율이 고려되어 결정될 수 있다. 두 개의 핀홀의 크기가 결정되었을 때, 핀홀에서 각각 측정된 두 신호 세기의 비율은 형광 신호가 방출되는 위치에 대한 값을 나타낼 수 있다.

이와 같이, 공초점 현미경 장치를 통해서 형광물질로부터 방출된 형광 신호를 이용하여 3차원 형광 신호 영상을 고속 측정할 수 있는 광학 측정 시스템을 개발할 수 있으며, 이와 같은 공초점 현미경 장치를 개발하여 기계적인 이송 없이 깊이 분별력을 가지고, 고속으로 3차원 영상의 획득이 가능한 현미경 장치를 제공할 수 있고, 이에 현미경의 시편으로 입사된 빛의 광축 위에 위치한 형광물질의 깊이의 측정이 가능하게 될 수 있다.

더불어, 본 발명의 실시예를 통해 영상 기기의 활용도를 더욱 높일 수 있으며, 장치의 구조가 단순하기 때문에 살아있는 생체 내에서 관찰이 가능하고, 제안하는 현미경 장치에 큰 핀홀을 추가적으로 사용하여 형광 영상의 효율을 향상시키는 효과를 가져올 수 있다.

실시예에 따른 3차원 영상 획득 방법은 다양한 컴퓨터 수단을 통하여 수행될 수 있는 프로그램 명령 형태로 구현되어 컴퓨터 판독 가능 매체에 기록될 수 있다. 상기 컴퓨터 판독 가능 매체는 프로그램 명령, 데이터 파일, 데이터 구조 등을 단독으로 또는 조합하여 포함할 수 있다. 상기 매체에 기록되는 프로그램 명령은 실시예를 위하여 특별히 설계되고 구성된 것들이거나 컴퓨터 소프트웨어 당업자에게 공지되어 사용 가능한 것일 수도 있다. 컴퓨터 판독 가능 기록 매체의 예에는 하드 디스크, 플로피 디스크 및 자기 테이프와 같은 자기 매체(magnetic media), CD-ROM, DVD와 같은 광기록 매체(optical media), 플롭티컬 디스크(floptical disk)와 같은 자기-광 매체(magneto-optical media), 및 롬(ROM), 램(RAM), 플래시 메모리 등과 같은 프로그램 명령을 저장하고 수행하도록 특별히 구성된 하드웨어 장치가 포함된다. 프로그램 명령의 예에는 컴파일러에 의해 만들어지는 것과 같은 기계어 코드뿐만 아니라 인터프리터 등을 사용해서 컴퓨터에 의해서 실행될 수 있는 고급 언어 코드를 포함한다. 상기된 하드웨어 장치는 실시예의 동작을 수행하기 위해 하나 이상의 소프트웨어 모듈로서 작동하도록 구성될 수 있으며, 그 역도 마찬가지이다.

이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기의 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 시스템, 구조, 장치, 회로 등의 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.

그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 특허청구범위의 범위에 속한다.

100, 400, 500: 공초점 현미경 장치
110, 410, 510: 시편부
120, 420, 520: 검출부

Claims (18)

1. 형광물질의 3차원 영상을 얻기 위한 현미경 장치에 있어서,
   형광물질을 포함하는 시편과 상기 시편을 관찰하기 위한 대물렌즈를 구비한 시편부; 및
   크기가 다른 제1 핀홀과 제2 핀홀을 구비하고 있으며, 상기 제1 핀홀과 제2 핀홀을 각각 통과한 형광 신호의 세기를 측정하는 제1 검출기(Photomultiplier tube, PMT)와 제2 검출기를 구비한 검출부
   를 포함하고,
   상기 검출부는 상기 제1 검출기와 제2 검출기에서 각각 1회 측정한 각 형광 신호의 세기를 통해 시편의 높이를 구하고, 3차원 영상을 획득하고,
   상기 검출부는 상기 제1 검출기로부터 측정한 신호의 세기와 상기 제2 검출기로부터 측정한 신호 세기 비율을 측정하고, 반치폭이 다른 두 개의 축방향 응답 곡선을 획득하며,
   상기 축방향 응답 곡선에 상기 신호 세기 비율을 대입하여 상기 시편의 높이를 측정하는 것을 특징으로 하는 공초점 현미경 장치.
2. 제1항에 있어서,
   상기 검출부는 상기 시편에서 방출하는 형광 신호를 나누어 제1 핀홀과 제2 핀홀로 전달하는 빔 스플리터(Beam Splitter)를 포함하고,
   상기 빔 스플리터는 상기 형광 신호의 크기를 나누어 전달하는 것
   을 특징으로 하는 공초점 현미경 장치.
3. 삭제
4. 제1항에 있어서,
   상기 축방향 응답 곡선은 실험 또는 수식을 통해서 획득하며, 교정 과정을 거쳐 미리 획득하는 것
   을 특징으로 하는 공초점 현미경 장치.
5. 제1항에 있어서,
   상기 축방향 응답 곡선은 반치폭을 축방향 분해능으로 고려하지 않고 축방향 측정 범위로 간주하면, 상기 시편과 초점 평면 간의 거리에 따라 측정되는 신호의 세기가 달라지는 것
   을 특징으로 하는 공초점 현미경 장치.
6. 제1항에 있어서,
   상기 검출부는 상기 각 형광 신호의 세기를 측정할 때엔 상기 형광 신호가 방출되는 위치와 상기 제1 핀홀, 제2 핀홀의 크기, 그리고 양자 수율이 고려되는 것
   을 특징으로 하는 공초점 현미경 장치.
7. 제6항에 있어서,
   상기 검출부는 상기 시편을 초점 평면의 이동 없이 횡방향으로 스캔함으로써 3차원 시편의 영상을 복원하는 것
   을 특징으로 하는 공초점 현미경 장치.
8. 제1항에 있어서,
   상기 형광 신호는 레이저의 평행광이 상기 시편부의 상기 시편에서 방출되어 생성되며,
   상기 공초점 현미경 장치는 공진형 스캐너 혹은 갈바노 거울을 포함하여 상기 레이저의 평행광을 상기 시편에 입사시켜 2차원 평면 스캐닝이 가능한 것
   을 특징으로 하는 공초점 현미경 장치.
9. 제1항에 있어서,
   상기 공초점 현미경 장치는 특정 파장 기준으로 빛을 반사하고 통과시키는 반투과 거울로 구성되는 다이크로익 미러와 에미션 필터(Emission Filter)를 포함하고,
   상기 다이크로익 미러와 에미션 필터를 통해 상기 형광 신호를 상기 검출부로 전달하는 것
   을 특징으로 하는 공초점 현미경 장치.
10. 형광물질의 3차원 영상을 얻기 위한 현미경 장치에 있어서,
    형광물질을 포함하는 시편과 상기 시편을 관찰하기 위한 대물렌즈를 구비한 시편부; 및
    크기가 다른 복수 개의 지점에 대한 형광 신호의 세기를 각각 1회 측정하는 측정 장치
    를 포함하고,
    상기 측정 장치는 상기 측정한 형광 신호의 세기를 이용하여 상기 시편의 높이를 구하고, 3차원 영상을 획득하는 것
    을 특징으로 하는 공초점 현미경 장치.
11. 제10항에 있어서,
    상기 크기가 다른 복수 개의 지점은 제1 지점과 제2 지점으로 구분되는데,
    상기 제1 지점은 크기가 작은 핀홀 역할을 하고,
    상기 제2 지점은 상기 제1 지점을 포함하고 있으며, 크기가 큰 핀홀의 역할을 하는 것
    을 특징으로 하는 공초점 현미경 장치.
12. 제11항에 있어서,
    상기 측정 장치는 CCD(Charge Coupled Device)에 해당하고
    상기 제1 지점과 제2 지점은 픽셀 단위로 구성되는데,
    상기 측정 장치는 상기 제1 지점의 픽셀에서 형광 신호의 세기를 측정하고, 상기 제1 지점의 주변 픽셀을 포함하는 상기 제2 지점의 픽셀에서 측정한 형광 신호의 세기를 적분하는 것
    을 특징으로 하는 공초점 현미경 장치.
13. 제11항에 있어서,
    상기 측정 장치는 Detector array(배열 검출기)에 해당하고,
    상기 제1 지점과 제2 지점은 센서 단위로 구성되는데
    상기 측정 장치는 상기 제1 지점의 센서에서 형광 신호의 세기를 측정하고, 상기 제1 지점의 주변 센서를 포함하는 상기 제2 지점의 센서에서 측정한 형광 신호의 세기를 적분하는 것
    을 특징으로 하는 공초점 현미경 장치.
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