KR101469156B1

KR101469156B1 - Pet／mr/광학 이미지 삼중 조영제

Info

Publication number: KR101469156B1
Application number: KR20130062751A
Authority: KR
Inventors: 유정수; 김종희; 이웅희
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2013-05-31
Filing date: 2013-05-31
Publication date: 2014-12-04

Abstract

본 발명은 PET/MR/광학 이미지 삼중 조영제에 관한 것이다. 본 발명에 따른 PET/MR/광학 이미지 삼중 조영제는 PET/MR/광학 이미지를 동시에 촬영할 수 있으며, 높은 정확도의 이미징 정보를 제공하며 수용액 내 안정도가 높아 세포 이동, 각종 질병 진단 (예컨대, 암 진단) 및 약물 운반과 같은 다양한 생물학적 거동의 비침투 고민감성 실시간 이미징에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

PET／MR/광학 이미지 삼중 조영제{Multimodality PET/MR/optical Contrast Agent}

본 발명은 PET/MR/광학 이미지 삼중 조영제에 관한 것이다.

생물학적 타겟의 이미징 기술은, 생물학적 현상을 이해하거나 다양한 질환의 정확한 진단에 사용되는 중요한 도구가 되고 있기 때문에, 1) 민감도, 2) 정확도, 및 3) 신속도의 관점에서 뛰어나야 한다.

하지만, 현재의 단일 이미징 방식(single imaging modality)으로는 정확도가 떨어져 오진 가능성이 있다는 한계점을 보이고 있다. 따라서, 각각의 단일 이미징 방식을 조합함으로써 다중-방식 이미징이 중요한 수단으로 부각되어 많이 연구되고 있으며 임상에서도 표준 방법이 되고 있다. 삼중-방식을 조합함으로써, 단일 이미징 방식의 많은 단점이 극복될 수 있다. 예를 들어, PET/CT (computed tomography), MR(magnetic resonance)/광학, 및 PET/NIRF(near infrared optical fluorescence)등 다양한 이미징 기법을 조합하는 노력이 이루어지고 있다. 그 중에서도 PET/MRI 이중 이미징 기법은 비침투성 3차원 토모그래피의 강점을 가지며 PET의 장점인 ① 우수한 민감도, ② 높은 시간 해상도, ③ 생체 기능 이미징 가능성과 MRI의 장점인 ① 높은 공간 해상도, ② 해부학적 정보 제공을 동시에 가지게 되어 오진 없이(fault-free) 정확한 질병 진단을 가능하게 하므로 그 응용 가능성이 크다(S. S. Gambhir et al. Gene. Dev. 17:545(2003)). 이러한 PET/MR 이중 모드 이미징 기술은 미국 공개 특허 US20060052685. US20080045829, US20080033279 등에서 명시하고 있으며, 최근 B.J. Pichler 연구팀에서 PET-MRI 일체형 복합 기기에 대해 보고 (Nature Medicine 14:459(2008))하고 있다.

지난 수십년 동안, 다양한 이미징 프로브들이 개발되었고, 의학적 응용을 위해 시험되었다. 예를 들어, 산화철(Fe₂O₃), 양자점(quantum dot) 및 금 나노입자 같은 나노 결정들은 그들의 고유한 이미징 조영 효과(imaging contrast effect)를 가지기 때문에, 가장 많이 선호되어 왔다. 그러나, 대부분의 나노 결정들은 세망내피계 시스템(reticuloendothelial system, RES)에 의해 흡수되고, 체내로부터 천천히 소멸한다. 따라서, 핵의학 영상(nuclear imaging)을 위해 방사선 동위 원소를 나노 결정에 공유 결합할 경우, 배경 잡음(background noise)을 증가시킬 뿐 아니라, 환자들을 방사선에 노출시키므로 의학적 응용에 제한을 가지는 문제점이 있다.

이에 비해, 리포좀 및 엑소좀은 무독성이며 생체 적합한 물질들로, 특히 많은 리포좀들은 FDA 승인을 받아 약물 전달체로서 사용되고 있다. 그러나, 리포좀 및 엑소좀은 그들 고유의 이미징 조영 효과를 가지지 않으며, 또한 다수의 이미지 조영제를 포함할 경우, 제조 과정이 복잡해지고, 재현성에 문제가 생기므로, 리포좀 및 엑소좀 기반의 다중 이미징 프로브는 거의 보고되어 있지 않다. 만일 2개의 이미징 조영제만을 포함하고도, 리포좀 또는 엑소좀 기반의 삼중 이미징 기법이 개발된다면 상기 기재된 이중 이미징보다 더 우수한 효과를 나타낼 수 있을 것으로 생각된다.

따라서 단지, 2개의 이미지 조영제만을 포함하는, 리포좀 또는 엑소좀 기반의 삼중 이미징 기법에 대한 연구의 필요성이 절실히 요구되고 있다.

본 발명자들은 다중 이미징이 가능한 조영제에 대해 탐색하던 중, MRI용 조영제 및 PET/광학용 조영제를 리포좀 또는 엑소좀에 삽입하는 경우, 다중 조영이 가능하게 되는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 PET/MR/광학 이미지 삼중 조영제를 제공하고자 한다.

본 발명은 PET/MR/광학 이미지 삼중 조영제를 제공한다.

본 발명에 따른 PET/MR/광학 이미지 삼중 조영제는 PET/MR/광학 이미지를 동시에 촬영할 수 있으며, 이미징 정보를 높은 정확도로 제공하며 수용액 내 안정도가 높아 세포 이동, 각종 질병 진단 (예컨대, 암 진단) 및 약물 운반과 같은 다양한 생물학적 사건들의 비침투 고민감성 실시간 이미징에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 실시예 1-1에서 제조한 헥사데실-4-요오도벤조에이트 (hexadecyl-4-iodobenzoate)의 ¹H NMR 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 실시예 1-1에서 제조한 헥사데실-4-요오도벤조에이트 (hexadecyl-4-iodobenzoate)의 ¹³C NMR 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 실시예 1-1에서 제조한 헥사데실-4-요오도벤조에이트 (hexadecyl-4-iodobenzoate)의 질량 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 실시예 1-2에서 제조한 헥사데실-4-트리부틸스태닐벤조에이트 (Hexadecyl-4-tributyl stannyl benzoate)의 ¹H NMR 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 실시예 1-2에서 제조한 헥사데실-4-트리부틸스태닐벤조에이트 (Hexadecyl-4-tributyl stannyl benzoate)의 ¹³C NMR 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 실시예 1-2에서 제조한 헥사데실-4-트리부틸스태닐벤조에이트 (Hexadecyl-4-tributyl stannyl benzoate)의 질량 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 실시예 1-3에서 제조한 [¹²⁴I]HIB의 Radio TLC 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 방사선 표지 화합물의 제조 방법 및 크로마토그램(chromatogram)를 나타낸 도이다.
도 9는 리포좀 기반 삼중 조영제의 개략도를 나타낸 도이다.
도 10은 [¹²⁴I]HIB (A) 및 [¹²⁴I]HIB 삽입된 리포좀 (B)의 혈액내 반감기을 나타내는 도이다.
도 11은 실시예 2-1에서 제조한 리포좀 및 실시예 3-1에서 제조한 엑소좀의 크기를 동적광산란법을 이용하여 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 12은 실시예 2-1에서 제조한 리포좀 및 실시예 3-1에서 제조한 엑소좀의 표면을 투과 전자 현미경을 이용하여 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 13는 실시예 2-2에서 제조한 [¹²⁴I]HIB이 삽입된 Gd-리포좀에 대한 크기 배제 크로마토그래피의 결과를 나타낸 도이다.
도 14은 실시예 2-2에서 제조한 [¹²⁴I]HIB이 삽입된 Gd-리포좀에 대하여 PET, MR imaging 및 광학적 이미지를 생체외(in vitro)에서 촬영한 결과를 나타낸 도이다.
도 15는 실시예 2-2에서 제조한 [¹²⁴I]HIB이 삽입된 Gd-리포좀에 대하여 PET, MR imaging 및 광학적 이미지를 생체내(in vivo)에서 촬영한 결과를 나타낸 도이다.
도 16은 실시예 2-2에서 제조한 [¹²⁴I]HIB이 삽입된 Gd-리포좀 주입 후, 시간에 따른 간 및 종양의 CNR을 나타내는 도이다.

본 발명은

(a) PET 및 광학적 이미지의 조영제로서, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물;

(b) MRI 조영제로서, 금속, 금속 나노입자, 금속 칼코겐, 금속 니코겐, 합금 또는 이들을 함유하는 다성분 혼성 구조체 중에서 선택된 자성 신호발생코어(signal generating core); 및

(c) 이미징 프로브로서, 리포좀 및 엑소좀 중에서 선택된 1종 이상; 을 포함하며,

상기 금속 나노입자는 전이금속, 란탄족 및 악티늄족 금속으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는, PET/MR/광학 이미지 삼중 조영제를 제공한다.

[화학식 1]

상기 화학식 1에서, X는 요오드의 방사선 동위원소이고, 5 = k = 30 이다.

상기 화학식 1에서 X는 ¹²²I,¹²³I,¹²⁴I,¹²⁵I,¹³¹I 및 ¹³²I로 이루어진 요오드의 방사성 동위원소 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기 화학식 2로 표시되는 [¹²⁴I]HIB(헥사데실-4-[¹²⁴I]아이오도벤조에이트)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

[화학식 2]

상기 자성 신호발생코어는 상자성 혹은 초상자성일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 자성 신호발생코어는 하기 화학식 3으로 표시되는 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-디에틸렌트리아민펜타아세트산(Gd-DTPA-DPPE)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

[화학식 3]

상기 리포좀은 페길화(PEGylation)된 것이 바람직하며, 50 내지 200 nm의 직경, 바람직하게는 120nm의 직경을 갖는 것이 더욱 바람직하다.

또한, 상기 엑소좀은 소변으로부터 추출하는 것이 바람직하고, 엑소좀의 직경은 40 내지 160 nm인 것이 바람직하다.

상기 리포좀 및 엑소좀은 상기 범위의 직경을 가질 경우에 혈류 보존 시간을 상승시키고, RES의 섭취를 최소화 시킴으로써 우수한 종양 섭취량(tumor uptake)을 나타낼 수 있기 때문이다.

상기의 이중-방식 PET/MRI 조영제는 인체의 내부 부위(internal region)에 대한 이미징에 매우 유용하다. 이미징 과정은 사람에게 조영제의 진단학적 유효량을 투여한 다음 인체의 내부 부위(조직)의 가시적 이미지를 얻기 위하여 PET 이미징 및 MR 이미징을 이용하여 인체를 스캐닝함으로써 이루어진다.

특히, 본 발명의 이중-방식 PET/MRI 조영제는 암 이미징에 유용하다.

본 발명의 PET/MR/광학 이미지 삼중 조영제는 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 투여될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 조영제는 비경구 방식으로 투여되는 것이 바람직하다. 비경구 투여를 하는 경우, 정맥내 주입, 근육내 주입, 관절내(intra-articular) 주입, 활액내(intra-synovial) 주입, 수막강내 주입, 간내(intrahepatic) 주입, 병변내(intralesional) 주입 또는 두 개강내(intracranial) 주입 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 조영제의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 상기 용어 "진단학적 유효량"은 인체의 PET, MR 및 광학 이미지를 얻는데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 조영제를 이용하여 PET, MR 및 광학 이미지를 얻는 방법은 종래의 방법에 따라 실시할 수 있다. 예를 들어, PET 이미징 방법 및 장치는, 미국 특허 제6,151,377호, 제6,072,177호, 제5,900,636호, 제5,608,221호, 제5,532,489호, 제5,272,343호 및 제5,103,098호에 기재되어 있다. MR 이미징 방법 및 장치는, D. M. Kean and M. A. Smith, Magnetic Resonance Imaging: Principles and Applications(William and Wilkins, Baltimore 1986), 미국 특허 제6,151,377호, 제6,144,202호, 제6,128,522호, 제6,127,825호, 제6,121,775호, 제6,119,032호, 제 6,115,446호, 제6,111,410호 및 제602,891호에 개시되어 있다.

본 발명에 따른 PET/MR/광학 이미지 삼중 조영제는 PET/MR/광학 이미지를 동시에 촬영할 수 있으며, 이미징 정보를 높은 정확도로 제공하며 수용액내 안정도가 높아 세포 이동, 각종 질병 진단 (예컨대, 암 진단) 및 약물 운반과 같은 다양한 생물학적 이벤트들의 비침투 고민감성 실시간 이미징에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 방사성 표지(radioactive tracer) 화합물의 제조

1-1. 헥사데실-4-요오도벤조에이트 (hexadecyl-4-iodobenzoate)의 제조

1-헥사데카놀(1-hexadecanol)(1.0g, 4.12mmol), 4-요오도벤조일 클로라이드(4-iodobenzoyl chloride)(1.32g, 4.94mmol), 트리에틸아민(triethyl-amine)(1.22ml, 8.74mmol) 및 메틸렌 클로라이드(30ml)의 혼합물을 상온에서 3시간동안 반응시켰다. 용매는 감압 하에서 제거하였으며, 잔여물로부터는 헥산을 사용하여 흰색의 결정을 얻었다(1.42g, 80%). 생성된 화합물의 ¹H NMR, ¹³C NMR 및 질량 스펙트럼을 각각 도 1, 도 2 및 도 3에 나타내었다.

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃): σ 0.87-0.89 (t, 3H, J = 7 Hz), 1.26 -1.44 (m, 26H), 1.72-1.78 (m, 2H), 4.29-4.31 (t, 2H, J = 7 Hz), 7.73-7.75 (dd, 2H, J = 8 Hz), 7.78-7.80 (dd, 2H, J = 8 Hz);

¹³C NMR (125 MHz, CDCl₃): σ 14.11, 22.68, 25.99, 28.64, 29.25, 29.35, 29.50, 29.56, 29.62, 29.64, 29.66, 29.68, 31.91, 65.39, 100.50, 129.99, 130.98, 137.64, 166.12;

HRMS (FAB) calculated for C₂₃H₃₈O₄I, 473.1917 [(M+H)⁺], found: 473.1917 [(M+H)⁺]].

1-2. 헥사데실-4-트리부틸스태닐벤조에이트 (Hexadecyl-4-tributyl stannyl benzoate) 의 제조

헥사부틸디틴 (Hexabutylditin) (0.78ml, 0.9g, 1.55mmol) 및 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 (tetrakis(triphenylphosphine)palladium) (22.42mg, 19.4μmol)을 20ml의 톨루엔(toluene)에 있는 헥사데실-4-요오도벤조에이트 (hexadecyl-4-iodobenzoate) (0.46g, 0.9mmol)에 첨가하였다. 혼합물을 용액이 검은색이 될 때까지(6~8시간) 환류시켰다. 용매는 감압 하에서 제거하였으며, 잔여물은 헥산/에칠아세테이트(hexane/ethyl acetate=20/1)로 용리하고, 컬럼 크로마토그래피를 통하여 무색의 생성물을 얻었다(0.43g, 70%). 생성된 화합물의 ¹H NMR, ¹³C NMR 및 질량 스펙트럼을 각각 도 4, 도 5 및 도 6에 나타내었다.

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃): σ 0.88-0.91 (m, 12H), 1.02 -1.16 (m, 6H), 1.21-1.39 (m, 30H), 1.42-1.62 (m, 8H), 1.74-1.79 (m, 2H), 4.30-4.33 (t, 2H, J = 6.5 Hz), 7.55-7.57 (dd, 2H, J = 8 Hz), 7.96-7.98 (dd, 2H, J = 8 Hz);

¹³C NMR (125 MHz, CDCl₃): σ 9.63, 13.63, 14.10, 22.69, 26.06, 27.31, 28.75, 28.94, 29.02, 29.11, 29.29, 29.36, 29.54, 29.59, 29.64, 29.66, 29.67, 29.69, 31.92, 64.97, 128.34, 129.96, 136.35, 149.39, 167.08;

HRMS (FAB) calculated for C₃₅H₆₅O₂Sn, 637.4007 [(M+H)⁺], found: 637.4003 [(M+H)⁺].

1-3. HIB 의 방사선 표지화(radiolabeling)

HIB 전구체(Hexadecyl-4-tributylstannylbenzoate, 100μg)에 1N HCl(100μl), 3% H₂O₂(100μl), 및 Na¹²⁴I(2.75 mCi)를 넣은 후 70℃에서 30분 동안 반응시켰다. 반응물에 NaHSO₃(100 ㎕)을 넣어서 반응을 종결시켰다. 50℃에서 진공 하에 용매를 제거한 후에, 제조된 [¹²⁴I]HIB를 아세토니트릴(acetonitrile)로 다시 녹이고, 5분 동안 8000rpm으로 원심 분리하였다. 50℃에서 진공 하에 용매를 제거한 후에, [¹²⁴I]HIB를 메틸렌 클로라이드로 녹였다. 방사화학적 수율은 AR-2000 Radio-TLC 영상 스캐너로 분석하였다. 상기 제조된 [¹²⁴I]HIB의 Radio TLC 결과를 도 7에 나타내었고, 방사선 표지 화합물([¹²⁴I]HIB)의 제조 방법 및 크로마토그램 (chromatogram)을 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타난 바와 같이, HIB 전구체를 Na¹²⁴I 및 3% 과산화수소와 반응시켜 [¹²⁴I]HIB가 제조되었음을 알 수 있고, 여기서 ¹²⁴I는 긴 반감기(4.2d) 및 양전자(positron)의 높은 운동 에너지로 인해 방사선 동위 원소로서 이용되었다.

실시예 2. [ ¹²⁴ I]HIB가 삽입된 Gd-DTPA-DPPE 포함 리포좀의 제조

2-1. Gd-DTPA-DPPE 포함 리포좀의 제조

클로로포름 내의 8:8:3:1:7의 몰비로 이루어진 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DPPC), 1,2-디헥사데카노일-sn-글리세로-3-포스포-3-(1'-rac-글리세롤)(1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol). DPPG), 콜레스테롤, 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-2000](1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N [methoxy(polyethyleneglycol)-2000], DSPE-PEG2000) 및 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-디에틸렌트리아민펜타아세트산(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-diethylenetriaminepentaacetic acid, Gd-DTPA-DPPE)의 혼합물을 건조하여 얇은 지질막(lipid film)으로 만들었다. 상기 지질막을 식염수(saline)에서 50℃에서 25분간 수화시켰다. 수화시킨 결과로 나온 불투명한 리포좀 용액을 1000, 400, 200 및 100 nm의 멤브레인 필터를 이용하여 압출성형하였다. 상기 압출성형된 리포좀을 크기 배제 컬럼(size exclusion column) (PD-10, GE Healthcare)을 이용하여 더 정제하였다. Gd-DTPA-DPPE 포함 리포좀을 동적광산란법(dynamic light scattering, DLS)을 이용하여 크기를 측정하고, 투과 전자 현미경(transmission electron microscopy, TEM)을 이용하여 표면을 관찰하였다.

2-2. Gd-DTPA-DPPE 포함 리포좀에 대한 [ ¹²⁴ I]HIB(헥사데실-4-[ ¹²⁴ I]아이오도벤조에이트)의 삽입

상기 실시예 1-3에서 제조된 [¹²⁴I]HIB를 상기 실시예 2-1에서 제조한 Gd-DTPA-DPPE 포함 리포좀에 삽입하기 위하여, Gd-DTPA-DPPE 포함 리포좀 및 [¹²⁴I]HIB의 혼합물을 20%의 DMSO/식염수 용액에 가하고 37℃에서 1시간 동안 진탕하였다. 이후 상기 혼합액을 크기 배제 컬럼에 로딩하고 식염수로 용리하였다.

상기 제조된 리포좀 기반의 삼중 조영제의 개략도를 도 9에 나타내었다.

도 9에 나타난 바와 같이, 리포좀 기반의 삼중 조영제는 원-포트(one-pot) 반응에 의해서 제조되는 것을 알 수 있다.

실시예 3. [ ¹²⁴ I]HIB가 삽입된 Gd-DTPA-DPPE 포함 엑소좀의 제조

3-1. 소변으로부터 엑소좀의 추출

초원심분리기를 이용하여 소변으로부터 엑소좀을 추출하였다. 보다 구체적으로는, 소변을 받아서 프로테아제 억제제(protease inhibitor)로 처리한 후, 튜브에 분주하여 1,000g, 3,000g 및 17,000g의 원심 가속도에서 각각 10분, 15분, 15분 동안 원심분리하여 상층액을 얻었다. 원심분리 후 생성된 펠렛(pellet)을 DTT(dithiothreitol)로 처리 후, 95℃로 2분간 열을 가해 탐호스팔 단백질(Tamm-Horsfall protein, THP)로 부터 엑소좀을 분리하였다. 그 다음, 다시 17,000g의 원심 가속도로 원심분리하여 엑소좀이 포함된 상층액을 얻었다. 이렇게 얻어진 상층액들을 최종적으로 200,000g의 원심 가속도에서 1시간 동안 원심분리하여, 엑소좀을 추출하였다. 이러한 과정을 통해서 얻어진 엑소좀을 동적광산란법(dynamic light scattering, DLS)을 이용하여 크기를 측정하고, 투과 전자 현미경(transmission electron microscopy, TEM)을 이용하여 표면을 관찰하였다.

3-2. Gd-DTPA-DPPE 및 [ ¹²⁴ I]HIB(헥사데실-4-[ ¹²⁴ I]아이오도벤조에이트)포함 엑소좀의 제조

상기 실시예 1-3에서 제조된 [¹²⁴I]HIB 및 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-디에틸렌트리아민펜타아세트산(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N iethylenetriaminepentaacetic acid, Gd-DTPA-DPPE)를 상기 실시예 3-1에서 제조한 엑소좀과 함께 혼합한 후, 서모믹스(thermomix)을 사용해 4℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후, 반응 혼합물을 4℃에서 13,200 RPM으로 원심 분리하였고, HEPES 완충 용액을 가한 후, 다시 4℃에서 13,200 RPM으로 원심 분리하여 결합이 끊어진 요오드(Free iodine)을 제거하였다.

실험예 1. [ ¹²⁴ I]HIB 및 [ ¹²⁴ I]HIB 삽입된 리포좀의 혈액내 반감기(blood half-life) 측정.

[¹²⁴I]HIB 및 [¹²⁴I]HIB 삽입된 리포좀의 혈액내 반감기를 구하기 위해, 암컷 BALB/C 마우스(BALB/c mice)의 꼬리 정맥에 [¹²⁴I]HIB 및 [¹²⁴I]HIB이 삽입된 리포좀(~17 μCi)을 주입한 후, 눈구멍 뒤의 부비강(retro-orbital sinus)으로부터 혈액 샘플을 채취하였다. 원하는 시간마다, 50μl의 혈액을 계량된 헤파린 모세관(heparinized capillary tube)에 채운 후 무게를 측정하였고, 위자드 자동 감마 카운터(WIZARD automatic gamma counter)를 이용하여 카운트하였다. [¹²⁴I]HIB (A) 및 [¹²⁴I]HIB 삽입된 리포좀 (B)의 혈액내 반감기를 도 10에 나타내었다.

도 10에 나타난 바와 같이, [¹²⁴I]HIB 삽입된 리포좀의 혈액내 유지율은 주입 후 15분에서 그램당 주입 용량(%ID/g)의 28.7%이였고, 주입 후 6시간에서는 3.4%ID/g로 천천히 감소하였다. 그러나, [¹²⁴I]HIB는 혈액내에서 빠르게 감소하여, 주입 후 15분에서 오직 2.9%ID/g 만이 남았다.

실험예 2. 동적광산란법(dynamic light scattering, DLS)을 이용한 크기 측정

2-1. Gd-DTPA-DPPE 포함 리포좀의 크기 측정

상기 실시예 2-1에서 제조한 Gd-DTPA-DPPE를 포함한 리포좀의 크기를 동적광산란법을 이용하여 측정하였다. Gd-DTPA-DPPE를 포함한 리포좀의 크기를 동적광산란법을 이용하여 측정한 결과를 도 11(a)에 나타내었다.

도 11(a)에 나타난 바와 같이, Gd-DTPA-DPPE를 포함한 리포좀의 크기는 127.8±8.4 nm로 나타나는 평균 크기로부터 넓은 분포를 가지는 것을 확인하였다.

2-2. 소변에서 추출한 엑소좀의 크기 측정

상기 실시예 3-1에서 제조한 엑소좀의 크기를 동적광산란법을 이용하여 측정하였다. 엑소좀의 크기를 동적광산란법을 이용하여 측정한 결과를 도 11(b)에 나타내었다.

도 11(b)에 나타난 바와 같이, 엑소좀의 크기는 80 nm로 나타나는 평균 크기로부터 넓은 분포를 가지는 것을 확인하였다.

실험예 3. 투과 전자 현미경(transmission electron microscopy, TEM)을 이용한 표면 관찰

3-1. Gd-DTPA-DPPE 포함 리포좀의 표면 관찰

상기 실시예 2-1에서 제조한 리포좀의 표면을 투과 전자 현미경을 이용하여 관찰하였다. 리포좀의 표면을 투과 전자 현미경을 이용하여 관찰한 결과를 도 12(a)에 나타내었다.

도 12(a)에 나타난 바와 같이, 음성 염색법(negative staining)에 의해 염색된 TEM 이미지에는 성공적으로 제조된 구형의 리포좀이 나타나 있으며, 지름은 약 120 nm로 확인되었다. 또한, 리포좀의 지질 이중층(lipid bilayer)이 분명하게 나타나는 것을 확인하였다.

3-2. 소변에서 추출한 엑소좀의 표면 관찰

상기 실시예 3-1에서 제조한 엑소좀의 표면을 투과 전자 현미경을 이용하여 관찰하였다. 엑소좀의 표면을 투과 전자 현미경을 이용하여 관찰한 결과를 도 12(b)에 나타내었다.

도 12(b)에 나타난 바와 같이, 음성 염색법(negative staining)에 의해 염색된 TEM 이미지에는 성공적으로 제조된 구형의 엑소좀이 나타나 있으며, 지름은 약 80 nm으로 확인되었다.

실험예 4. 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)

상기 실시예 2-2에서 제조한 [¹²⁴I]HIB이 삽입된 Gd-DTPA-DPPE 포함 리포좀에 대하여 각각 200 uL씩 크기 배제 컬럼으로부터 수집하고, 감마 카운터(gamma counter)를 이용하여 카운트하였다. 이에 대한 크기 배제 크로마토그래피의 결과를 도 13에 나타내었다.

도 13에 나타난 바와 같이, 약 4 mL의 용리 부피 주변에서 대부분의 방사성 표지된 리포좀이 용리되었음을 확인하였다.

실험예 5. PET, MR 이미지 및 광학적 이미지의 촬영(생체외(in vitro))

상기 실시예 2-2에서 제조한 [¹²⁴I]HIB이 삽입된 Gd-DTPA-DPPE 포함 리포좀에 대하여 PET, MR imaging 및 광학적 이미지를 생체외(in vitro)에서 촬영하였다. 결과를 도 14에 나타내었다.

도 14에 나타난 바와 같이, 광학적 그리고 핵의학 영상은 [¹²⁴I]HIB의 요오드로부터 유래되었기 때문에, 광학적 이미지 패턴은 PET 영상과 유사하였다. 하지만 더 상세하게 살펴보면 광학적 이미지 영상이 핵의학 영상에 비해 공간 분해능(spatial resolution) 및 민감도(sensitivity)가 더 좋은 것을 알 수 있다. 핵의학 영상의 제한된 공간 분해능때문에 웰 활성도가 높을 때, PET 이미지에서 각각의 웰(well)의 외곽선은 선명하지 않다. 광학적 이미지의 스캔 시간(1분) 및 핵의학 영상의 스캔 시간(20분)의 차이를 고려해 볼 때, ex vivo에 대하여 광학적 이미지가 좋은 선택일 수 있다. 또한, 같은 샘플에 대한 MR 이미지는 높은 공간 분해능에 의하여 선명한 웰의 외곽선을 나타냈다.

실험예 6. PET, MR 이미지 및 광학적 이미지의 촬영(생체내(in vivo))

상기 실시예 2-2에서 제조한 [¹²⁴I]HIB이 삽입된 Gd-DTPA-DPPE를 포함한 리포좀에 대하여 PET, MR 이미지 및 광학적 이미지를 생체내(in vivo)에서 촬영하였다. 마우스 모델에 대한 각각의 이미지를 촬영하기 위하여, CT26 암-BALB/C 마우스(CT26 tumor-bearing BALB/c mice)의 꼬리 정맥에 상기 [¹²⁴I]HIB이 삽입된 Gd-DTPA-DPPE 포함 리포좀(150 μCi)을 주입한 후, PET, MR 이미지 및 광학적 이미지를 촬영하였고, 이의 결과를 도 15에 나타내었다.

도 15(a)에 나타난 바와 같이,¹²⁴I의 체렌코프 방사(Cerenkov radiation)에 기반한 광학적 이미지는 주입 후, 4시간이 되는 때에 가장 좋은 종양-배경 비율을 나타내었다. 피부 바로 밑에 있는 종양은 복부 내의 핫스팟(hot spots)을 따라 선명하게 나타나는 것을 확인하였다.

도 15(b)에 나타난 바와 같이, PET 이미지는 종양이 선명하게 관찰될 뿐만 아니라, 간 및 지라 또한 높은 활성 지속도(activity retention)를 보였으며, 상기 광학적 이미지 내의 복부 핫스팟을 나타내는 것을 확인하였다.

도 15(c)에 나타난 바와 같이, MRI 이미지는 상기 광학적 이미지 또는 PET 이미지가 제공하지 못하는 토모그래픽 해부학적 정보(tomographic anatomical information)를 우수하게 제공하였고, 간 및 종양은 리포좀 내의 Gd(Ⅲ) 복합체에 의해서 더욱 대비되었음을 확인하였다.

도 15(d)에 나타난 바와 같이, PET-CT 이미지는 종양의 위치를 정확히 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

도 15(e)에 나타난 바와 같이, 간(liver), 지라(spleen), 종양(tumor) 및 근육(muscle)에서의 방사성(radioactivity)이 PET 영상(도 15(f))에 기반해 주입 후 2시간, 4시간 및 24시간에서 각각 정량화되었다. 주입 후 2시간에서, 간이 가장 높은 흡수를 나타내었고, 종양 및 지라가 뒤를 이었다(각각 7.5±3.1, 4.6±1.6, 4.7±0.7 %ID/g). 간 및 지라에서의 활성도는 주입 후 24시간까지 지속적으로 감소하여 24시간에서는 2시간 활성도의 약 10% 이하만이 존재하였다(0.45±0.04, 0.47±0.3 %ID/g). 그러나, 종양에서의 활성도는 훨씬 느리게 감소하였고, 주입 후 24시간에서 2시간 활성도의 약 40% 이상이 여전히 존재하였다(1.9±0.29 %ID/g). 주입 후 24시간에서, 종양-근육, 종양-간 및 종양-지라의 비율은 각각 16.1, 4.1 및 4.0이였다. 따라서, 종양을 제외한 모든 장기의 방사성은 암 조직만 명확하게 가시화시키며, 몸에서 24시간 내에 점차 사라짐을 확인하였고, 종양-배경(background) 비율이 높아지게 된다. 이는 종래 이미징 방법에 비하여 획기적인 효과를 가져오는데, 종래의 이미징 방법에서는 상기 RES 기관 또는 배경에도 장시간 시그널이 남아있었기 때문에, 암 조직의 확인이 보다 명확하지 않았기 때문이다.

실험예 7. MR 이미지 분석

향상된 대비(contrast)를 갖는 해부학상 위치가 조영 후 MR 이미지에서 간 및 종양에 대해 확인되었고, 정량적 측정을 위해, 관심 있는 특정 영역에서의 신호 강도를 영상 J(Image J, 미국 국립보건원)을 이용하여 측정하였다. 대조 대 잡음 비(Contrast to Noise Ratio, CNR)를 식 CNR = (SNRpost - SNRpre)을 이용해 측정하였고, 여기에서 SNR은 신호 대 잡음 비이다. 실시예 2-2에서 제조한 [¹²⁴I]HIB이 삽입된 Gd-리포좀의 주입 후, 시간에 따른 간 및 종양의 CNR을 도 16에 나타내었다.

도 16에 나타난 바와 같이, 간 및 종양 모두 주입 후 30분까지 CNR이 급속히 증가하여, 주입 후 3시간에서 최대치에 도달하는 것을 알 수 있다. 그러나, 그 후로 간 및 종양의 CNR 값은 천천히 감소하였다.

Claims

(a) PET 및 광학적 이미지의 조영제로서, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물;
(b) MRI 조영제로서, 하기 화학식 3으로 표시되는 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-디에틸렌트리아민펜타아세트산(Gd-DTPA-DPPE)의 자성 신호발생코어; 및
(c) 이미징 프로브로서, 리포좀 및 엑소좀 중에서 선택된 1종 이상; 을 포함하는, PET/MR/광학 이미지 삼중 조영제:
[화학식 1]

상기 화학식 1에서, X는 요오드의 방사선 동위원소이고, 5 ≤ k ≤ 30 이다.
[화학식 3]
제1항에 있어서, 상기 화학식 1에서 X는 ¹²²I,¹²³I,¹²⁴I,¹²⁵I,¹³¹I 및 ¹³²I로 이루어진 요오드의 방사성 동위원소 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, PET/MR/광학 이미지 삼중 조영제.
제1항에 있어서 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기 화학식 2로 표시되는 [¹²⁴I]HIB(헥사데실-4-[¹²⁴I]아이오도벤조에이트)인 것을 특징으로 하는, PET/MR/광학 이미지 삼중 조영제.
[화학식 2]
제1항에 있어서, 상기 자성 신호발생코어는 상자성 혹은 초상자성인 것을 특징으로 하는, PET/MR/광학 이미지 삼중 조영제.
삭제
제1항에 있어서, 상기 리포좀은 페길화(PEGylation)된 것을 특징으로 하는, PET/MR/광학 이미지 삼중 조영제.
제1항에 있어서, 상기 리포좀은 50 내지 200 nm의 직경을 갖는 것을 특징으로 하는, PET/MR/광학 이미지 삼중 조영제.
제1항에 있어서, 상기 엑소좀은 소변으로부터 추출하여 얻은 것임을 특징으로 하는, PET/MR/광학 이미지 삼중 조영제.
제1항에 있어서, 상기 엑소좀은 40 내지 160 nm의 직경을 갖는 것을 특징으로 하는, PET/MR/광학 이미지 삼중 조영제.