KR101942196B1 - 금속이온이 포함된 멜라닌 나노입자를 유효성분으로 함유하는 다중 영상 조영제용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 다양한 금속 이온이 배위결합된 멜라닌 나노입자를 이용한 다중 영상 조영제에 관한 것으로, 보다 상세하게는 철(Fe), 비스무스(Bi) 및 요오드(I) 이온이 표면에 결합된 멜라닌 나노입자는 MRI, CT 및 SPECT 이미지를 동시에 촬영하여 질병 부위에 대한 정보를 제공할 수 있어, 각 이미지의 한계를 보완함으로써, 진단 정확도를 매우 향상시킬 수 있으며, 특히 암세포 선택성을 증가시킴으로써 암 분포 정보와 종양의 정확한 위치에 대한 정보를 제공할 수 있다.

Description

금속이온이 포함된 멜라닌 나노입자를 유효성분으로 함유하는 다중 영상 조영제용 조성물{Composition for multiple imaging agent comprising metal ions contained melanin nanoparticle}

본 발명은 다양한 금속 이온이 배위결합된 멜라닌 나노입자를 이용한 다중 영상 조영제에 관한 것이다.

나노 물질은 직경 1 내지 100nm 사이의 크기를 갖으며, 분자 및 벌크물질과 구별되는 독특한 성질을 가지므로, 지난 10년간 매우 많은 양의 새로운 나노입자 기반의 조영제가 생의학에 적용되어 왔으며, 자석, 금, 동위원소가 내장되거나 형광을 나타내는 나노입자들이 비침습적 자기공명영상(magnetic resonance imaging; MRI), X-선 전산화단층 촬영(X-ray computed tomography; CT), 양전자방출단층활영(positron emission tomography; PET), 단일광자 단층촬영 CT(single-photon emission CT; SPECT) 및 광학 촬영을 위한 암 영상 조영제로 개발되었다.

그러나 많은 조영제들은 단일 이미징 방식(single imaging modality)으로 정확도가 떨어지거나 공간 해상도에 제한이 있으며, 이로 하여금 질환 위치에 대한 정확하고 신뢰할 수 있는 정보 획득이 어렵다.

이러한 문제점을 해결하기 위한 다중 방식 이미징 물질은 관심 부위에 대한 자세한 정보를 제공함으로써, 오직 단일 이미징 방식에 사용되는 물질의 한계점을 보완할 수 있다.

예를 들어, MRI와 PET으로부터 얻은 이중 이미징 데이터는 근육, 혈관 및 신경조직의 병리학적인 상태에 대한 정보를 제공하여 몸 안의 비정상적인 조직 또는 세포의 위치를 정확하게 확인함으로써, 정확한 질병 진단을 가능하게 됨에 따라, 다중 방식 이미징을 위한 다양한 조영제가 개발되었고, 의학적 응용을 위한 연구가 진행되었다.

그러나 몇몇의 무기 입자를 이용한 다중 방식 이미징은 복합한 적용 단계 및 급성 독성 문제 때문에 임상 적용에 제한되었다.

또한, 고유한 이미징 조영 효과를 나타내어 가장 많이 선호되어 왔던 산화철, 양자점 및 금 나노입자와 같은 나노결정들은 세망내피계 시스템에 의해 흡수되고, 체내로부터 천천히 소멸함에 따라, 체내에 머무르는 시간이 길어 체내 독성을 유발할 수 있는 가능성이 매우 높으며, 핵의학 영상을 위해서는 방사선 동위 원소를 나노 결정에 공유결합해야 하며, 이런 경우 배경 잡음을 증가시킬 뿐 아니라, 환자들을 방사선에 노출시키므로 의학적 응용에 제한이 있다.

따라서, 인체에 안전하면서 정확한 질환 부위에 대한 정보를 제공할 수 있는 다중 이미징 조영제의 개발이 필요한 실정이다.

대한민국등록특허 제10-1469156호(2014.12.04 공고)

본 발명은 생체적합성이 우수한 멜라닌 나노입자 표면에 다양한 종류의 양이온과 항체를 결합시킨 나노입자를 인체에 안전하면서 정확한 질환 부위 영상을 제공할 수 있는 다중 이미징 조영제 조성물로 제공하고자 한다.

본 발명은 철(Fe), 비스무스(Bi) 및 요오드(I) 양이온이 표면에 배위결합된 멜라닌 나노입자; 상기 나노입자 표면에 항체가 결합된 멜라닌 나노입자를 유효성분으로 함유하는 다중 영상 조영제용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 멜라닌 나노입자가 분산된 수용액에 철(Fe), 비스무스(Bi) 및 요오드(I) 양이온을 첨가하여 멜라닌 나노입자 표면에 결합시키는 단계; 및 상기 양이온이 결합된 멜라닌 나노입자 표면에 항체를 결합시키는 단계를 포함하는 다중 영상 조영제 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 철(Fe), 비스무스(Bi) 및 요오드(I) 양이온이 표면에 결합된 멜라닌 나노입자는 MRI, CT 및 SPECT 이미지를 동시에 촬영하여 질병 부위에 대한 정보를 제공할 수 있어, 각 이미지의 한계를 보완함으로써, 진단 정확도를 매우 향상시킬 수 있으며, 특히 암세포 선택성을 증가시킴으로써 암 분포 정보와 종양의 정확한 위치에 대한 정보를 제공할 수 있다.

도 1A는 표면 위에 다양한 이온이 배위 결합된 멜라닌 나노입자(iMNP)를 나타낸 모식도이며, 도 1B는 상기 이온이 결합된 멜라닌 나노입자 표면에 항체 및 페길화된 구조를 나타낸 모식도이며, 도 1C는 배위결합된 Fe^{3 +}, Bi^{3 +} 및 I⁺ 이온이 존재하는 멜라닌 나노입자(iMNP)의 표면을 확인한 STEM 이미지이다.
도 2A는 어떠한 이온도 배위 결합되지 않은 순수한 멜라닌 나노입자의 표면을 확인한 STEM 이미지로, 이온 특이적 신호 강도가 확인되지 않으며, 도 2B는 Fe, Bi 및 I와 같은 다양한 이온 배위결합 후 iMNP에서 나타나는 정확한 이온 피크를 EDS로 분석한 결과이다.
도 3A는 이온 적가 후 MNP 표면에서 화학적 작용기의 변화를 확인한 FT-IR 분석결과로, 이온 처리 후 O-H 피크는 감소하였으며, 금속 산화 피크의 상대적 강도가증가한 것을 확인한 결과이며, 도 3B는 iMNP의 안정성 확인을 위한 DLS 분석 결과로, 분산 용액(Sigma-Aldrich)에서 자기응집 없이 장시간 안정성을 유지하는 것을 확인한 결과이다.
도 4A는 멜라닌 나노입자 표면 위에서 다양한 이온의 배위결합 능력을 확인한 ICP-AES 분석결과이며, 도 4B는 다양한 농도의 이온이 결합된 멜라닌 나노입자의 감도를 확인하기 위해, T_1-w MR (3.0-T, Philips) 및 CT (InveonTM, Siemens)의 대조 신호를 확인한 결과이며, 도 4C는 이온이 결합된 멜라닌 나노입자(iMNP) 표면 위에 결합된 항체를 정량한 BCA 분석결과이며, 도 4D는 iMNP의 세포독성을 확인하기 위해, iMNP 처리 후 세포의 소기관 기능 또는 증식과 관련된 다양한 바이오바커 단백질 수준을 확인한 웨스턴 블롯 분석 결과로, i) 세포만 존재하는 대조군; ii) iMNP 처리군 및 iii) iMNP-EGFR 처리군이다.
도 5는 모형 연구를 통하여 iMNP의 감도를 확인한 T_1-w MRI 및 CT 결과로, 도 5A는 0.47T magnetic relaxometer (mq20, Bruker)를 이용하여 의학적으로 사용되는 T1 MRI 조영제(Gadovist^®, GDV)와 iMNP-EGFR 입자의 종측이완(longitudinal relaxivity; r1) 값을 확인한 결과로, 다양한 농도의 금속이온을 이완 시간(T1) 마다 측정한 후 ICP-AES 분석을 수행하여 정확한 값을 계산한 결과, Fe 이온이 배위결합된 iMNP 용액에서 Gadovist^® (3.2 s^-1·mM[Gd]) 보다 2배 높은 r1 값(6.2 s^-1·mM[Fe]^-1)이 확인되었으며, iMNP 및 Gadovist^® 의 r2 값은 각각 7.5 mM[Fe]^-1 및 3.5 s-1·mM[Gd]^-1을 나타내었으며, T2 MRI 조영제보다도 매우 향상된 능력을 나타내는 것을 확인한 결과이다. 도 5B는 Bi 이온을 함유하는 iMNP의 민감성을 확인한 CT 조영제 모형 이미지로, 임상적으로 사용되는 Telebrix® 30 (TB) CT 조영제와 각각 CT 강도(Hounsfield unit, HU)를 측정하고 ICP-AES로 계산하여 비교한 결과, 동일한 농도의 Bi 및 I에서 iMNP는 매우 높은 HU 값을 나타내었으며, 이온의 동일한 농도(mM) 당 HU 값이 4.5배 이상 높은 것을 확인한 결과이다.
도 6A는 다양한 pH 또는 사람 혈청 조건에서 iMNPs의 이온 누출을 확인한 결과로, 다양한 용액에서 인큐베이트된 iMNP를 13,000 rpm에서 15분간 원심분리한 후 상층액 내 이온의 농도를 ICP-AES로 확인한 결과, 모든 시료는 입자로부터 3% 이하로 방출되는 것을 확인한 결과이며, 도 6B는 iMNP-EGFR 입자 처리 후 HepG2 세포 생존도를 확인한 세포 증식 분석(MTT) 결과로, 다양한 농도에서 90% 이상의 생존도를 확인하였으며, 도 6C는 iMNP의 생체 적합성을 확인하기 위해 세포 내 소기관 기능을 확인한 결과로, 세포 내 신호 및 미토콘드리아 기능과 관련 있는 바이오마커로 알려진 VDAC1 (voltage-dependent anion channel-1), ATG5 (autophagy protein 5), SOD2 (superoxide dismutase 2 mitochondrial), 및 Cyto.c (cytochrome complex)의 발현 수준을 확인한 웨스턴 블롯 분석결과이며, 모든 처리군(i: 세포만 존재, ii: iMNP, 및 iii: iMNP-EGFR)은 유사한 단백질 발현 수준을 나타내었으며, 어떤 유의한 강도 변화도 나타나지 않았다.
도 7A는 EGFR 항체 결합 후 적색 형광을 나타내는 iMNP의 특이적인 표적화를 확인한 결과로(파란색: DAPI 핵 염색, 적색: iMNP-EGFR, scale bar: 20 μm), iMNP-EGFR 처리 후 EGFR 양성 HepG2 간암 세포 형태를 확인한 Bio-TEM 이미지이며(right, scale bar: 1 μm, N indicates the nucleus), 도 7B는 선택성 확인을 위해, iMNP 또는 iMNP-EGFR를 3T3, MCF7 및 HepG2 세포에 처리한 후 원심분리하여 축적된 세포의 T_1-w MR 및 CT 이미징 데이터를 분석한 세포 모형 연구 결과이다.
도 8은 in vivo 암 마우스 모델에 입자를 정맥 주사 후 다양한 영상 장비를 사용하여 iMNP-EGFR이 매개하는 특이적인 다중 방식 이미지를 확인한 결과로(A: MRI, B: 마이크로-CT, 및 C: 마이크로-SPECT), A 및 B의 왼쪽 이미지는 각각 입자 용액의 주입 전 이미지이며, A 및 B의 오른쪽 이미지는 입자 주입 24시간 후의 이미지이며, 도 8C는 관상 동맥 투시도로 흰색 화살표는 간에 이식된 간암세포를 나타내며 빨간색 화살표는 정상적인 폐를 나타낸다.
도 9는 대조군으로 항체 변형 없는 iMNP의 다양한 이미지 데이터로, 암이 형성된 마우스에 iMNP 입자를 정맥주사한 후 다양한 장비로 얻은 영상 결과로 (A: T_1-w MRI axial view, B: coronal view, 및 C: micro-SPECT coronal projection view), 흰색 원은 간에 이식된 HCC 종양을 나타낸다.
도 10은 기본적인 독성 실험 결과로, 도 10A는 MNP 및 iMNP-EGFR를 정상 생쥐에 주입한 후 15일간 몸무게를 확인한 결과이며, 도 10B는 주입 24시간 후 PBS를 주입한 대조군과 실험군에서 어떠한 몸무게 변화 차이가 나타나지 않았음을 확인한 결과이며, 도 10C는 MNP 주입 후 비정상적인 색이 나타난 생쥐의 장기(폐(Lu), 간(L), 및 비장(S))의 무게를 대조군과 비교한 결과, 장기 무게가 대조군과 유사한 것을 확인한 결과이다.
도 11은 iMNP-EGFR 나노입자를 처리한 마우스 모델 장기의 현미경 이미지로, iMNP-EGFR 나노입자 처리에 의해 간, 비장, 및 폐가 검은색을 나타내었나, 헤마톡실린&에오신(H&E) 염색을 통한 조직병리학 분석결과, 기관은 정상 형태를 나타내는 것을 확인한 결과이며, HepG2가 이식된 간암 조직에서 EGFR 양성 세포를 면역조직화학 염색하여 암 부분(어두운 갈색부분)을 확인한 결과이다.
도 12는 IODO-GEN® 튜브를 이용하여 생산된 요오드 양이온(I⁺) 생산 과정 및 이를 이용한 멜라닌 나노입자 요오드화 과정을 나타낸 모식도이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명은 인체에 안전하면서 정확한 질환 부위를 확인하기 위해 다중 방식 이미징이 가능한 조영제용 조성물에 관한 것으로, 생체적합성이 우수한 멜라닌 나노입자 표면에 다양한 종류의 이온과 항체를 결합시킨 나노입자가 다중 영상 조영제로 사용되어 매우 정확한 질환 부위에 대한 정보를 제공하는 것을 확인함에 따라 본 발명을 완성한 것이다.

본 발명은 철(Fe), 비스무스(Bi) 및 요오드(I) 양이온이 표면에 배위결합된 멜라닌 나노입자; 상기 나노입자 표면에 항체가 결합된 멜라닌 나노입자를 유효성분으로 함유하는 다중 영상 조영제용 조성물을 제공할 수 있다.

보다 상세하게 상기 철(Fe), 비스무스(Bi) 및 요오드(I) 양이온은 멜라닌 나노입자 표면의 카테콜의 O-디하이드록실기와 상호작용하여 멜라닌 나노입자 표면에 배위결합되는 것일 수 있다.

상기 항체는 암세포 표적용 항체일 수 있으며, 보다 상세하게는 표피 성장인자 수용체 EGFR, HER2, EpCAM 및 EN 항체로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

상기 멜라닌 나노입자는 표면에 폴리에틸렌글리콜(PEG)를 추가로 더 포함할 수 있으며, 상기 멜라닌 나노입자의 평균 직경은 50 내지 150 nm일 수 있다.

상기 조성물은 자기공명영상(magnetic resonance imaging; MRI), X-선 전산화단층 촬영(X-ray computed tomography; CT), 단일광자 단층촬영 CT(single-photon emission CT; SPECT) 또는 이들의 혼합 방식의 조영제로 사용될 수 있다.

상기 다중 영상 조영제는 인체의 내부 부위(internal region)에 대한 이미징에 매우 유용하며, 이미징 과정은 사람에게 조영제의 진단학적 유효량을 투여한 다음 인체의 내부 부위의 가시적 이미지를 얻기 위하여 MRI 이미징, CT 이미징, SPECT 이미징을 이용하여 인체를 스캐닝함으로써 이루어진다.

또한, 본 발명은 멜라닌 나노입자가 분산된 수용액에 철(Fe), 비스무스(Bi) 및 요오드(I) 양이온을 첨가하여 멜라닌 나노입자 표면에 결합시키는 단계; 및 상기 이온이 결합된 멜라닌 나노입자 표면에 항체를 결합시키는 단계를 포함하는 다중 영상 조영제 제조방법을 제공할 수 있다.

상기 요오드(I) 양이온은 요오드화 시약과 NaI 수용액을 반응시켜 얻은 I-Cl로부터 생성될 수 있다.

보다 상세하게 일반적으로 ¹²⁵I 또는 ¹³¹I와 같은 요오드(iodine) 방사성 동위원소(I*)의 활성은 음이온 형태이며, 이러한 음이온은 전하 반발로 인하여 제조된 멜라닌 나노입자의 카테콜기와 비효율적으로 킬레이트화 되는 문제가 있다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 본 발명은 IODO-GEN^® 요오드화 튜브에 NaI 수용액을 첨가하여 반응시킴으로써 요오드 양이온(I⁺)을 생산하고 이를 이용하여 요오드 멜라닌 나노입자 생산을 최적화할 수 있다.

상기 다중 영상 조영제 제조방법은 항체가 결합된 멜라닌 나노입자 표면을 PEG로 개질하는 단계를 추가로 더 포함할 수 있다.

상기 항체는 암세포 표적용 항체로서, 표피 성장인자 수용체 EGFR, HER2, EpCAM 및 EN 항체로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

본 발명의 다중 방식 영상 조영제는 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 투여될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조영제는 비경구 방식으로 투여되는 것이 바람직하다. 비경구 투여를 하는 경우, 정맥내 주입, 근육 내 주입, 관절내(intra-articular) 주입, 활액내(intra-synovial) 주입, 수막강내 주입, 간내(intrahepatic) 주입, 병변내(intralesional) 주입 또는 두개내(intracranial) 주입 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 조영제의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 상기 용어 "진단학적 유효량"은 인체의 PET, MR 및 광학 이미지를 얻는데 충분한 양을 의미한다.

본 발명에 따른 다중 방식 영상 조영제는 MRI, CT, SPECT 이미지를 동시에 촬영할 수 있으며, 이미징 정보를 높은 정확도로 제공하며 수용액 내 안정도가 높아 세포 이동, 각종 질병 진단 (예컨대, 암 진단) 및 약물 운반과 같은 다양한 생물학적 이벤트들의 비침투 고민감성 실시간 이미징에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실험예 1> IODO -GEN® 튜브(Pierce)를 이용한 멜라닌 나노입자( MNP )의 요오드화

멜라닌 나노입자 표면에 이온을 배위 결합시키기 위해서, 이온은 멜라닌 나노입자 카테콜의 O-디하이드록실기와 상호작용해야 하기 때문에 양전하를 가져야 하므로, 다음과 같은 과정을 통하여 양전하 요오드 이온을 생산하여 멜라닌 나노입자를 요오드화 시켰다.

먼저, PBS 90μL에 포함된 무색 NaI 수용액(50 μL, 8 mM)을 IODO-GEN^® 튜브에 첨가하고 격렬하게 교반시켰다. 3분 후 용액 내 I-Cl이 생성됨에 따라, 용액 색이 옅은 노란색으로 변화하였다. 다음으로, 표면에 Fe 및 Bi 이온이 포함된 멜라닌 나노입자를 튜브에 첨가하여 용액에 분산시키고 30분간 인큐베이션하였다.

그 후, 이온이 적가된 멜라닌 나노입자를 원심분리한 후 PBS에 재분산시키고 I-Cl 흡광도 UV-Vis 스펙트럼을 통하여 iMNP의 요오드화를 확인하였다.

< 실험예 2> In vitro 모형 MRI/CT 연구

T ₁-w MR 모형 연구를 위해, 0 ~ 9.6 mM와 같은 다양한 농도의 [Fe], [Bi], [Gd], 또는 [I]의 iMNP-EGFR 입자 또는 Gadovist^® 를 0.5 % 아가로스 겔 (1:1 volume ratio)에 주입하여 준비하였다.

in vitro 모형 MRI/CT 이미지 분석을 위해, 3 mM 농도의 입자를 다양한 세포와 5% CO₂ 배양기에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.

세포 배양액으로 세척하여 남은 입자를 제거하고, 트립신 처리법을 수행하여 처 세포를 떼어낸 후 신속하게 3,000 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 모든 T ₁-w in vitro MR 이미지는 3.0-T clinical MR scanner (Philips medical system, Netherlands, archieva Release 3.2.1.0 version)에서 얻었다.

축 방향 T ₁-w 이미지를 400 ms 위치의 TR, 10 ms 위치의 TE, 240 × 240 매트릭스, 90°플립각, 3mm 조각 두께, 4의 평균 수, 115 Hz/pixel 대역폭 및 120 × 120 mm의 FOV에서 얻었다.

CT 모형을 위해, 사용된 MR 모형을 CT 이미징 스캐너에 옮겼다.

다른 농도의 iMNPs에 대한 CT 값(called Houndsfield units, Hus)을 Inveon^TM CT system (Siemens Healthcare, Germany)으로 측정하였다.

In vitro 세포 CT 이미징 분석은 상기 시스템뿐만 아니라 80 kV 및 400 μA의 장비 파라미터를 사용하여 수행되었다.

< 실험예 3> 세포 독성 확인

MTT 분석 키트(Invitrogen)을 사용하여 MNP 기반의 입자 처리 후 세포 생존도를 확인하였다.

먼저, 다양한 농도의 입자를 다양한 세포에 다양한 배양 시간으로 처리하고 37℃의 5% CO₂ 배양기에서 유지시킨 후, 세포를 세척하고 트립신 처리하여 배양 배지로 재 부유시키고 96-웰 조직 배양 플레이트에 5,000 cells/well 농도로 분주한 후 CO₂ 배양기에서 하룻밤 동안 성장시켰다.

세포 생존도를 확인하기 위해, 배양 배지를 MTT 용액으로 교체하고 3시간 동안 CO₂ 배양기에서 인큐베이트한 후, 특이적인 MTT 용액을 첨가하여 포르마잔 크리스탈을 용해시켰다.

세포 생존도는 분광광도계를 이용하여 570 nm에서 확인되었으며, 690 nm의 백그라운드 값은 감하였다.

< 실험예 4> 동물 준비

6주령 BALB/c 수컷 누드 생쥐를 Orient Bio (Seoul, Korea)에서 구입하였다.

모든 동물 연구는 삼성 바이오메디컬 연구 기관(Seoul, Korea)의 동물 관리 및 사용 위원회에서 승인을 받아 수행하였다.

사람 간세포 선종(HCC)에 발생한 간 종양 세포 주인 HepG2 (Korean Cell Line Bank)를 이용하여 위성 간 종양 모델를 제조하였다.

얼굴 마스크를 이용하여 2% 이소플루란이 포함된 O₂/N₂ (3:7 비율) 혼합가스를 흡입시켜 생쥐를 마취시킨 후 간을 노출시키고 1×10⁶ HepG2 세포를 HBSS와 마트리겔 (1:1) 10 μL에 부유시킨 후 천천히 간에 주입하였다.

4주 후, MRI를 이용하여 종양 크기를 확인하고 상기와 동일한 방법으로 마취시킨 후 MR 이미지를 얻었다.

< 실험예 5> In vivo MRI 이미징

MRI, CT 및 SPECT 전체 실험 동안 2% 이소플루란을 이용하여 모든 생쥐를 마취시켰으며, MR 이미지는 7-T MRI 시스템 (Bruker Biospin, Fallanden, Switzerland)과 하기와 같은 호흡동조(respiratory gating) 파라미터를 이용하여 빠른 회전-에코 T_1-w MRI 시퀀스를 얻었다.

반복시간(repetition time; TR) / 반사 시간(TE)= 370/7.6 ms, ETL (echo train length) = 2, 1mm의 절편 두께로 100 × 100 μm² 평면 해상도 및 14 절편을 사용하였으며, 여기(excitation) 및 신호 수용을 위해 구적 부피 코일(35mm i.d.)을 사용하였다.

< 실험예 6> In vivo 마이크로( Mircro )-CT/ SPECT 이미징

작은 동물의 통합 CT/SPECT 이미징과 분석 시스템 (InveonTM Micro-CT/SPECT multimodality system, Siemens Healthcare, Germany)을 사용하였으며, 상기 시스템은 in vivo 시스템으로 디자인되었다.

HCC 간 이식된 생쥐에게 iMNP-EGFR 분산액 (148 KBq ¹³¹I, 0.3 μmol Fe, 및 0.27 μmol Bi per 0.1 mg MNP/mL) 200 μL 정맥 주사하였다.

모든 시료는 360°전체 회전 및 360 회전 스텝, 1°스텝 크기, 70 kV 및 400 μA 광원 세팅 및 스텝당 700ms 노출 시간 조건으로 세팅된 후 1.5 mm 알루미늄 필터로 스캔되었다.

픽셀은 4에서 저장됨에 따라, 효과적인 픽셀 크기와 대략 74.93 μm의 해상도를 나타내었다.

각각의 스캔을 위해, Inveon Acquisition Workplace software package (IAW, Siemens Medical Solutions, Knoxville, TN, USA)를 이용하여 2개의 다운 시료 인자로 재구성되었으며, 변형된 Feldkamp filtered back projection algorithm(Shepp-Logan filter)을 수행하였다.

그 후, 시각화 및 분석을 위하여, 2차원 (two-dimensional; 2D) 및 3차원 (three-dimensional; 3D) 바이오메디컬 이미지 분석 소프트웨어 패키지(IRW, CT Bone Visualization and Analysis, Siemens Medical Solutions, Knoxville, TN, USA)가 수행되는 Inveon^TM Research Workplace(IRW)를 이용하여 재구성된 이미지를 얻었다.

SPECT 이미징을 위해, InveonTM micro-SPECT 이미징 시스템을 이용하여 SPECT 스캔하였다. SPECT 이미지는 고해상도 평행 홀 분광기와 요오드-131의 30 keV 광전 피크(photo peak)로 설정된 높은 펄스 분석기 창에서 얻었다.

In vivo CT 이미징 연구는 in vitro CT 분석 파라미터 (80 kV 및 400 μA)와 동일한 조건에서 수행되었다.

< 실험예 7> In vivo 독성 확인

수컷 생쥐를 통풍기가 달려있고 살균된 벼 껍질이 깔려있는 스테인리스 스틸 케이지에서 사육하였다.

조절된 환경(온도: 22 ± 1℃, 습도: 60 ± 10% 및 빛: 12 h 낮/밤 주기)에서 생쥐들을 적응시켰으며, 물과 상업적으로 판매되는 실험 사료를 자유롭게 섭취 하도록하였다.

적응 후 100μL PBS(대조군), MNP 및 iMNP-EGFR 용액을 각각 5 마리씩 매일 복강내 주사하였으며, 이때 입자의 농도는 0.5 mg이 되도록 하였다.

처리된 생쥐의 몸무게 변화를 15일간 확인하였다. 2주간 매일 처리한 후, 생쥐를 수집하고 다양한 장기를 헤마톡실린&에오신 염색하여 체중 변화 및 조직 형태를 분석하였다.

< 실시예 1> 이온 적가된 멜라닌 나노입자( iMNP ) 합성 및 기능화 확인

1. 이온 적가된 멜라닌 나노입자( iMNP ) 합성

도파민 하이드로클로라이드(Dopamine hydrochloride; 180 mg)를 90 mL 탈이온수에 용해시키고 50℃로 격렬하게 교반하는 동안 1 N NaOH (780 μL)를 첨가하였다. 상기 용액은 빠르게 어두운 갈색으로 변하였으며, 5시간 후 검정색으로 변한 멜라닌 나노입자(MNP) 용액을 18,000 rpm에서 20분간 원심분리하고 증류수로 여러 번 세척하여 남은 화학물질을 제거하였다.

다음으로, MNP 용액에 이온 적가 과정 수행하였다. Fe^{3 +} 이온을 조절하기 위해, 4 mL Fe(NO₃)₃·6H₂O (5.7 mM) 용액을 MNP 분산 용액 10 mL과 혼합하여 10분간 교반하였다. 그 후, 혼합물을 20,000 rpm에서 10분간 원심분리하고, 전체 로딩 능력을 확인하기 위해, 상층액 내 결합되지 않은 Fe³⁺ 이온을 정량적으로 측정하였다.

순차적으로, 실험예 1과 같이 IODO-GEN^®로부터 얻은 I-Cl 용액 (50 μL, 8 mM)을 Bi(NO₃)₃·6H₂O (4 mL, 5.7 mM) 및 Fe^{3 +} 적가된 MNP 용액 (5 mg/mL)과 혼합하고, 상기 방법으로 얻은 입자를 정제하기 위해, 원심분리한 후 탈 이온수로 세척하였다.

상기 과정으로 이온 적가된 멜라닌 나노입자(iMNPs)의 로딩 능력 및 이온 방출 능력을 확인하기 위해, 20,000 rpm에서 5분간 원심분리 후 ICP-AES를 통하여 상층액 내 이온농도를 확인하였다.

수용액 안정성 및 선택성을 확인하기 위해, iMNP 용액에 Traut’s 시약에 의해 변형된 술프하이드릴(-SH) EGFR 항체 (Abcam, Anti-EGFR antibody [2E9], ab8465)를 4℃에서 하룻밤 동안 처리하였다.

그 후, 상기 용액을 18,000 rpm에서 5분간 원심분리하여, 반응하지 않은 항체를 제거하고, 폴리에틸렌글리콜(PEG)-SH (2 kDa, 0.5 mM) 용액 2mL를 첨가하여 2시간 동안 실온에서 반응시켰다.

반응이 완료된 후, 18,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 남은 PEG-SH를 제거하였으며, iMNP-EGFR 제제의 항체를 이용하여 단백질 농도를 BCA 단백질 분석을 통하여 정량적으로 확인하였다.

SPECT 이미지 분석은 산화를 위해, 50 μg 요오드화 시약(IODO-GEN^®, Thermo Scientific)으로 코팅된 붕규산(borosilicate) 테스트 튜브를 사용하였으며, 운반체가 없는 Na¹³¹I (Korea Atomic Energy Research Institute)와 실온에서 노란색으로 색변화가 나타날 때까지(10분간) 인큐베이션하였다.

10 mM HEPES에 Fe- 및 Bi-가 적가된 MNP (2.5 mg)의 분산체를 첨가한 후 빠르게 교반시켰으며, 상기 과정에서 알루미늄 포일을 이용하여 빛으로부터 시료를 보호하였다.

18,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 결합되지 않은 요오드화물-131을 제거하고, 침전된 생성물을 1 mL PBS 버퍼로 분산시켰다.

2. 이온 적가된 멜라닌 나노입자( iMNP )의 기능화 확인

상기와 같은 과정으로 iMNP를 합성하기 위해, 먼저, 도파민 하이드로클로라이드의 자연발생적인 공기 산화와 중립화를 통하여 멜라닌 나노입자를 성공적으로 합성하였다.

간략하게, 자연발생적인 산화와 중합 과정이 가능하도록 격렬한 교반하에서 1N NaOH 용액에 도파민 클로라이드 용액을 첨가하였으며, 상기 과정을 통하여 구형 멜라닌 나노입자(MNP)가 형성되었다.

상기 입자를 수차례 증류수로 세척하고 원심분리하여 정제하고, 전자현미경(TEM) 분석을 통하여 제조된 MNP는 100nm의 평균 직경과 규칙적인 크기 분산을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 멜라닌 나노입자들은 도 1A와 같이 5,6-디하이드록시인돌 (5,6-dihydroxyindole; 카테콜 타입)로 구성되었으며, 상기 5,6-디하이드록시인돌은 양이온과 배위화합물을 형성시켰다.

그 후, 도 1B와 같이 Schiff’s 염기를 이용한 링커 또는 미카엘 첨가 반응을 통하여 입자 표면에 술프하이드릴 EGFR 항체 및 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜) (PEG-SH)를 도입하였다.

MNP의 카테콜기 사용으로, Fe^{3 +} 및 Bi^{3 +} 이온이 동시에 배위되었고, MNP 표면에 I⁺ 이온 결합에 대한 방향족 치환 반응이 촉진되었다.

한편, 주사 투과전자 현미경(scanning transmission electron microscopy; STEM)를 수행하여 멜라닌 나노입자의 형태적 특징과 질적 분석을 수행하였다.

일반적으로 ¹²⁵I 또는 ¹³¹I와 같은 요오드(iodine) 방사성 동위원소(I*)를 이들의 방사성 활성 요오드화물인 NaI*로 구매하였다.

그러나 방사성 활성 음이온 형태는 전하 반발로 인하여, 제조된 멜라닌 나노입자의 카테콜기와 비효율적으로 배위결합되기 때문에 요오드 멜라닌 나노입자를 최적화하기 위해, 실험예 1과 같이 요오드화 튜브를 이용하여 요오드 양이온(I⁺)을 생산하고 이를 멜라닌 나노입자와 배위결합시켰으며, 상기 과정은 5분 이내에 무색의 NaI* 용액이 옅은 노란색(I*-Cl)으로 변하는 것이 확인됨에 따라, 요오드 양이온이 쉽게 멜라닌 나노입자 표면에 치환되는 것을 쉽게 확인할 수 있었다.

도 1C를 참고하면, iMNP의 표면에 다양한 양이온이 존재하는 것이 확인되었으며, 도 2와 같은 에너지 분산 X-선 분광계(EDS)를 갖춘 STEM 분석 결과, 비적가된 MNP와 매우 다르게 나타나는 것을 확인할 수 있었다.

한편, 다양한 양이온의 로딩 능력을 확인하기 위해, 도 3a와 같이 1 mL MNP 용액에 2.5-2.7 μmol 농도와 유사하게 모든 이온을 포화시키고, 푸리에 변환 적외분광법 (Fourier transform infrared spectroscopy; FT-IR)을 이용하여 이온 복합체가 형성되는 동안 화합물 작용기의 변화를 확인하여 처리된 iMNPs의 특징을 분석하였다.

그 결과, 도 3B와 같이 카테콜의 ν_{O -H} 기 피크는 감소한 반면, ν_{M -O}는 증가된 진동 피크 강도를 나타내었다.

또한, iMNPs는 한 달 동안 H₂O, PBS 버퍼, 배양 배지 및 사람 혈청 수용액에서 매우 탁월한 분산능을 나타내는 것이 확인됨에 따라, 상기 입자들은 용액 내에서 장기적으로 안정성을 유지하고 생물학적 적용에 적합한 것이 확인되었다.

< 실시예 2> MRI 및 CT를 위한, In vitro 모형 연구

이미지 양상을 위한 모형 연구에서, iMNP를 상업적으로 임상에서 사용되는 T_1-w MR (Gadovist^®, Bayer Schering Pharma) 및 CT (Telebrix^®, Guerbet Asia Pacific) 이미징 시약과 동일한 농도의 이온으로 비교하였다.

그 결과, 도 4B 및 도 5와 같이 T1-w MRI 시약으로서 iMNP 용액은 0.47 T magnetic relaxometer (mq-20, Bruker)에서 Gadovist^®보다 2배 높은 이완성을 나타내었으며, X-선 기반 CT 스캔 결과에서도 동일한 농도의 이온에 대하여, Telebrix® 용액보다 4.5배 높은 HU(Hounsfield) 강도를 나타내었다.

상기 결과로부터 iMNP은 기존의 용량의 절반보다 2배 적은 용량으로도 동일한 신호 강도를 나타낼 수 있는 것이 확인됨에 따라, 상기 iMNP은 매우 우수한 조영제로 사용될 수 있다.

MRI 대조 시약의 효율성을 예측하는 Solomon-Bloembergen-Morgan (SBM) 이론에 따르면 종축이완 (longitudinal relaxivity; r1)이 두 부분으로 나누어졌는 데 내부 이완은 물 분자의 직접적인 영향에 의한 것이고, 외부 이완은 제2 및 외부 물 분자와의 상호작용으로부터 발생한다.

내부 이완의 주요 효과가 r1 이완성이나, 실질적인 연구결과, iMNPs의 카테콜-Fe³⁺ 복합체는 두번 째 구형 물 분자와 산소 원자 사이의 상호작용이 비정상적으로 높게 증가되는 능력에서 기여하는 것으로 확인되었다.

특이적인 표적화 능력을 발생시키기 위해, 표피 성장 인자 수용체 (epidermal growth factor receptor; EGFR) 암세포 특이적인 항체를 항체 결합 전구체를 이용하여 iMNP 표면 위에 고정시키고, 결합된 iMNP 및 EGFR 항체 (iMNP-EGFR) 제제를 도 4C와 같이 BCA 단백질 분석으로 정량하였다.

또한, 도 6A와 같이 다양한 pH 수용성 조건하에서 72시간 노출시킨 iMNP로부터 적가된 이온이 유출되지 않은 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 iMNP는 이미징 시약으로써 안정성 및 재현성이 확인되었다.

EGFR 양성 간 암세포(HepG2)에 처리한 후 iMNP의 세포 독성을 확인하기 위해, 세포 대사활성을 평가하는 비색분석법인 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)를 수행하였다.

그 결과, 도 6B(S5b)와 같이 다양한 농도 및 인큐베이션 시간 조건에서 90% 이상의 세포가 생존하는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 웨스턴 블롯을 수행하여 MNPs, iMNPs 및 iMNP-EGFR 입자 처리 후 세포 내 기능에 대한 다양한 바이오마커의 발현 수준 변화를 확인한 결과, 도 4D와 같이 iMNPs에 의한 유의적인 단백질 발현 감소는 나타나지 않았다.

한편, iMNP-EGFR 입자의 EGFR 양성 간암 세포에 대한 선택성을 확인한 결과, 도 7A와 같이 결합 반응에 의해 적색 형광이 나타나는 iMNP-EGFR는 HepG2 세포에서 매우 높게 나타난 반면, EGFR 음성 세포 주인 NIH-3T3 및 MCF7에서는 상기 결과와 반대로 낮은 형광 발현이 확인되었다.

상기 결과로부터 iMNP-EGFR 입자는 EGFR 양성 간암 세포에 대하여 매우 높은 선택성을 나타낼 수 있음이 확인되었다.

또한, Bio-TEM 분석 결과를 통하여 iMNP-EGFR 입자가 에너지 의존적 수용체에 의해 유도되는 세포내 섭취 작용(endocytosis)을 통하여 HepG2 세포 세포질로 분산되는 것을 확인할 수 있었으며, 다양한 MNPs가 처리된 세포를 T_1-w MR (3.0-T, Philips) 및 CT로 이미지화한 결과, 도 7B와 같이 EGFR 음성 세포와 비-항체 iMNP가 처리된 세포에서는 유사한 수준의 낮은 조영 강도가 나타난 반면, iMNP-EGFR이 처리된 HepG2 간암 세포에서는 매우 높은 조영 신호가 확인되었다.

< 실시예 3> 생체 내( In vivo ) 이미지화

다음으로, iMNP-EGFR 입자를 in vivo 생쥐 종양 모델에 적용시켰다.

상기 종양 모델은 EGFR 양성 HepG2 간암 세포를 간에 이식하여 제작한 정소성 종양 모델로, 이종이식 종양 모델인 피하에 이식된 모델보다 의학적으로 매우 적합한 모델이다.

MRI/CT/SPECT 데이터를 얻는 동안 모든 생쥐는 2% 이소플루란으로 마취시키고, iMNP-EGFR 입자를 꼬리 정맥에 정맥주사하였다.

그 결과 도 8 및 도 9와 같이 모든 MRI/CT/SPECT 이미지에서 높은 수준의 조영 강도가 나타났으며, iMNP-EGFR와 iMNP 단독 처리군의 특이적 표적화 능력 차이는 간 종양 내 농축된 입자에 의해 나타났다.

iMNP-EGFR 입자의 특이적인 종양 축적은 활성 표적화로서 고정된 항체와 종양 수용체의 상호작용과 입자 순환기간 동안 향상된 투과성 및 유지(EPR) 효과에 의한 것이다.

개별적인 이미지는 각각 진단적 의미를 가지며, 각 방법의 한계를 보완할 경우, 진단 정확도를 매우 향상시킬 수 있으므로 다중 방식의 이용은 SPECT 이미지를 이용한 상세한 암 분포 정보와 해부학적 CT 또는 MRI 이미지를 이용한 종양의 정확한 위치 정보를 제공할 수 있다.

한편, 기본적인 독성 평가로, MNP, iMNP-EGFR 입자 및 인산완충용액(phosphate-buffered saline; PBS)를 정상 생쥐에게 정맥 주사한 후 생쥐 몸무게 변화 및 다양한 조직 기능 변화를 확인하였다.

그 결과, 도 10과 같이 MNP가 처리된 생쥐의 몸무게에서는 비정상적인 변화가 나타나지 않았으나, 투여된 입자의 축적에 의해 간, 폐 및 비장과 같은 몇몇 기관의 색이 검정에 가까운 색으로 변화된 것을 확인할 수 있었다.

그러나 기관 조직의 면역조직화학적(IHC) 염색 결과, 도 11과 같이 축적된 MNPs는 조직형태에 어떠한 영향도 미치지 않는 것이 확인됨에 따라, iMNPs는 주로 간, 비장 및 폐에 축적되지만 노출된 기관 조직에서는 어떠한 이상도 나타나지 않는 것이 확인되었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (9)

1. 철(Fe), 비스무스(Bi) 및 요오드(I) 양이온이 표면에 배위결합된 멜라닌 나노입자;
   상기 나노입자 표면에 항체가 결합된 멜라닌 나노입자를 유효성분으로 함유하는 다중 영상 조영제용 조성물.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 항체는 암세포 표적용 항체인 것을 특징으로 하는 다중 영상 조영제용 조성물.
3. 청구항 1에 있어서, 상기 멜라닌 나노입자는 표면에 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 다중 영상 조영제용 조성물.
4. 청구항 1에 있어서, 상기 멜라닌 나노입자의 평균 직경은 50 내지 150 nm인 것을 특징으로 하는 다중 영상 조영제용 조성물.
5. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 자기공명영상(magnetic resonance imaging; MRI), X-선 전산화단층 촬영(X-ray computed tomography; CT), 단일광자 단층촬영 CT(single-photon emission CT; SPECT) 또는 이들의 혼합 방식의 조영제로 사용되는 것을 특징으로 하는 다중 영상 조영제용 조성물.
6. 멜라닌 나노입자가 분산된 수용액에 철(Fe), 비스무스(Bi) 및 요오드(I) 양이온을 첨가하여 멜라닌 나노입자 표면에 결합시키는 단계; 및
   상기 양이온이 결합된 멜라닌 나노입자 표면에 항체를 결합시키는 단계를 포함하는 다중 영상 조영제 제조방법.
7. 청구항 6에 있어서, 상기 요오드(I) 양이온은 요오드화 시약과 NaI 수용액을 반응시켜 얻은 I-Cl로부터 생성되는 것을 특징으로 하는 다중 영상 조영제 제조방법.
8. 청구항 6에 있어서, 상기 다중 영상 조영제 제조방법은 항체가 결합된 멜라닌 나노입자 표면을 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 개질하는 단계를 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 다중 영상 조영제 제조방법.
9. 청구항 6에 있어서, 상기 항체는 암세포 표적용 항체로서, 표피 성장인자 수용체 EGFR, HER2, EpCAM 및 EN 항체로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 다중 영상 조영제 제조방법.

Images