KR101468585B1 - 하나의 핵산상에서 서로 떨어져 있는 복수의 염기서열 요소들의 pcr 증폭 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 하나의 핵산상에서 서로 떨어져 있는 복수의 염기서열 요소들의 PCR 증폭 방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 하나의 핵산상에서 서로 떨어진 DNA상의 복수의 염기서열 요소들을 DNA origami를 이용해 연접(bringing them in close proximity)시킨 후 해당 연접 서열들을 하나의 amplicon으로 PCR 증폭하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 한 염색체상에서 서로 떨어져 위치한 복수의 염기서열 요소들을 DNA origami를 매개로 한 PCR 방법을 통해 하나의 amplicon으로 손쉽게 증폭할 수 있으며, 상기 증폭된 PCR amplicon의 분석을 통해 서로 물리적 연관되어 있는 염기서열 요소들의 관계를 신속하고 효과적으로 밝힐 수 있다. 예컨대, 복수의 SNP와 같은 염기서열 다형성 부위들 또는 대립유전자들의 Haplotype phasing이 가능하며, 유전자 재조합(recombination) 기술에 의해 원하는 유전자가 원하는 부위에 삽입되었는지를 확인하는데 유용하다.

Description

하나의 핵산상에서 서로 떨어져 있는 복수의 염기서열 요소들의 PCR 증폭 방법{A method to PCR amplify multiple sequence elements that are distantly located on a single nucleic acid together into a single amplicon}
본 발명은 하나의 핵산상에서 서로 떨어져 있는 복수의 염기서열 요소들의 PCR 증폭 방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 하나의 핵산상에서 서로 떨어진 DNA상의 복수의 염기서열 요소들을 DNA origami를 이용해 연접(bringing them in close proximity)시킨 후 해당 연접 서열들을 하나의 amplicon으로 PCR 증폭하는 방법에 관한 것으로, 증폭된 PCR amplicon의 분석을 통해 서로 물리적 연관되어 있는 염기서열 요소들의 관계를 효과적으로 밝힐 수 있다.
인간을 포함한 많은 생명체의 유전체는 모계와 부계에서 각각 유래된 2개의 set으로 구성되어있다. 종내 그리고 종간 다양성의 원천은 유전체상 염기서열 다양성에 기인한다. 이러한 염기서열의 다양성은 암호화하고 있는 단백질의 구조적 차이를 유발하거나 세포내해당 유전자의 양적 발현 수준의 차이를 유발시키는 방식으로 작동한다. 동일 염색체상에서 염기서열의 변이의 배열 양상을 밝히는 것은typing하고자 하는 변이가 포함된 염기조각을 따로 분리하여 해당 변이 부분을 sequencing 하거나 genotyping하는 방법을 통해 이루어 진다. 이때 염기조각의 분리는 변이들 사이의 길이가 짧은 경우 PCR 등을 통해서 쉽게 수행할 수 있으나 phasing 하려는 두 개 이상의 변이 사이의 거리가 PCR을 통해 증폭할 수 있는 거리를 벗어 날 경우 library를 구축하는 방식으로 분리해내어야 하므로 그 절차의 수행이 매우 어렵고 많은 시간이 필요하게 된다.
본 발명에서, 발명자들은 SNP등과 같은 복수개의 염기서열 요소가 2배체에서 heterozygous하여 서로의 연관상이 불분명한 경우에서와 같은 상황에서 한 염색체상의 복수개의 염기서열 요소 사이의 관계를 밝혀낼 수 있는 방법을 고안하였고 이를 증명하였다. 분석하고자 하는 변이 또는 염기서열 요소의 주변 염기서열에 각각 상보적인 서열을 갖는 한 분자의 oligonucleotide를 만들어 표적 핵산에 결합시키는 방식으로 이들 염기서열 요소들을 연접시켰다. 한 개 이상의 화학적 반응을 통해 분석 대상 염기서열을 포함하면서 이들 사이의 염기서열은 제거된 짧은 단일가닥 DNA 조각을 생성시켰고, 이를 PCR 반응의 주형으로 삼아서 한 염색체상에 놓인 두 개 이상 변이 또는 염기서열 요소들을 하나의 amplicon으로 증폭해냄으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
[선행기술문헌]
한국특허번호 1011632790000
다수의 대립 유전자의 하플로타입의 결정방법(METHOD OF DETERMINING THE HAPLOTYPE OF MULTIPLE ALLELIC GENES)
2개의 대립 유전자를 포함하는 부위를 증폭하는 데 있어서, 상기 대립 유전자 중 1개의 대립 유전자의 다형을 하나의 증폭 프라이머의 3' 말단에 혹은 그 근방에 위치결정하므로, 변이형 뉴클레오타이드(들)와 정합하는 프라이머와 야생형 뉴클레오타이드(들)와 정합하는 프라이머의 2개의 프라이머 중 하나의 프라이머로부터만 사슬이 신장하게 된다. 다른 쪽의 프라이머는 대립 유전자에 의해 영향받지 않지만, 다른 쪽의 대립 유전자를 증폭산물에 포함하시키도록 위치결정되어 있다. 제1대립 유전자의 하나의 특정 대립형질을 지닌 대상 게놈 DNA만을 PCR 증폭한다. 이 기술은, 그 증폭산물 내의 제2대립 유전자의 대립형질이 식별될 수 있다면, 제1 및 제2대립 유전자의 하플로타입이 결정될 수 있다는 사실을 이용한다. 제2대립 유전자의 2개의 대립형질(메이저/마이너)을 식별하는 상보 서열을 지닌 프로브를 설계하고, 상기 프로브 세트를 고상 지지체 상에 고정하고, 이들을 증폭산물로 하이브리드화하여 하이브리드체를 형성하는 프로브를 식별하는 것을 본 발명의 특징으로 한다.
US2006078938 (A1)
다중의 멀리 떨어진 뉴클레오티드 폴리모피즘들의 하플러타이핑 방법(Haplotyping method for multiple distal nucleotide polymorphisms)
본 발명은 하나의 유전자내에 다중의 멀리 떨어진 뉴클레티오티드 폴리모피즘들의 검출 방법에 관한 것이다. 수 kilobases의 DNA만큼 서로 떨어진 두 개 이상의 뉴클레오티드 폴리모피즘들을 갖는 유전자 또는 기타 연속된 DNA 절편의 하플로타입 구조를 결정하는 방법을 제공한다. 이 방법은 유전자의 특정 대립유전자상의 뉴클레오티드 폴리모피즘들을 가깝게 연접시키는 DNA 라이게이션과 PCR 증폭을 사용하여 하플로타입 구조를 결정할 수 있다.
따라서, 본 발명의 주된 목적은 한 염색체상에서 서로 떨어져 위치한 복수의 염기서열 요소들을 DNA origami를 매개로 하여 하나의 amplicon으로 간편하게 PCR 증폭하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 한 염색체상에서 서로 떨어져 위치한 복수의 염기서열 요소들간의 관계를 DNA origami를 매개로 한 PCR 방법을 통해 신속하며 비용효율적인 분석 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계들을 포함하는 한 핵산 분자상에서 서로 떨어져 있는 염기서열 요소들을 한꺼번에 PCR 증폭시키는 방법을 제공한다: 1) 서로 떨어져 있는 염기서열 요소들을 오리가미(origami) 형태로 연접시키는 단계; 2) 연접된 염기서열 요소들이 포함된 단일 가닥 주형 DNA를 생성하는 단계; 및, 3) 상기 주형 DNA를 PCR을 통해 증폭하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 ‘염기서열 요소’란 염기서열에 의해 그 특성이나 형질이 결정되는 염기서열 부위로서 SNP와 같은 하나의 염기서열일수도 있으나 복수의 염기서열을 갖는 염기서열 영역일수도 있다. 바람직하게는 상기 염기서열 요소는 염기서열 다형성(Polymorphism) 부위, SNP, 대립유전자, 표적 유전자, 유전자 변이, 또는 유전자 마커인 것을 특징으로 한다. 상기 ‘서로 떨어져 있는’은 염기서열 요소들이 한 핵산 분자상에서 가까이 위치하지 않고 서로 멀리 떨어져 있는 것을 의미하며, 바람직하게는 일반적인 PCR로 한꺼번에 증폭하기 어려운 5000염기쌍 이상의 길이만큼 멀리 떨어져 있는 것을 의미한다.
또한, 상기 ‘오리가미 (origami) 형태로 연접’된다는 것은 한 가닥의 DNA 서열이 마치 종이접기처럼 접혀서 중간에 루프를 형성하고 두 개의 서로 떨어져 있는 염기서열 부위가 밀접하게 가까이 위치하는 것(bringing them in close proximity)을 의미한다. DNA origami란 DNA가 종이접기처럼 폴딩되어 나노스케일로 2 차 또는 3차 구조를 형성하는 것을 의미하는 것으로, 종래 DNA origami의 용도로는 enzyme immobilization, drug carry capsules, 및 nanotechnological self-assembly of materials 등이 알려져 있었다 (Lee et al., (2012). "Molecularly self-assembled nucleic acid nanoparticles for targeted in vivo siRNA delivery". Nature Nanotechnology (Nature) 7 (6): 389-393).
본 발명에 있어서, 상기 1) 단계에서 오리가미 형태로 연접되는 것은 상기 염기서열 요소들을 포함하는 핵산분자의 안티센스(anti-sense) 서열이고, 상기 2)단계에서 생성된 단일가닥 주형 DNA는 상기 염기서열 요소들을 포함하는 핵산분자의 센스(sense) 서열인 것을 특징으로 하는 PCR 증폭 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 1) 단계에서 해당 염기서열 요소들의 주변 염기서열에 각각 상보적인 서열들을 포함하는 단일가닥 Oligonucleotide인 DARI(Distance Arrangement by DNA oRIgami)를 사용하여 상기 주변 염기서열과 상보적 결합을 유도하여 해당 염기서열 요소들을 연접시키는 방법을 특징으로 PCR 증폭 방법을 제공한다. 앞으로, 상기 DARI를 이용한 본 발명의 PCR을 DARI PCR이라고 부르기로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 DARI oligonucleotide는 첫번째 염기서열 요소의 뒷부분(안티센스 서열의 5'쪽) 서열 및 두번째 염기서열 다형성 부위의 앞부분(안티센스 서열의 3'쪽) 서열과 각각 상보적인 서열들을 양끝에 가지며, 가운데 3-10 뉴클레오타이드 길이의 링커를 포함하는 것을 특징으로 하는 PCR 증폭 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 2) 단계에서 상기 주형DNA의 생성은 서로 떨어져 있는 염기서열 요소들을 연접시킨 DARI oligonucleotide의 5’쪽 상부 쪽에 연접하거나 조금 떨어진 곳에 또 다른 oligonucleotide인 MURI(MarginalUpstream todaRI)를 오리가미로 연접된 염기서열의 3’쪽에 상보결합시키고, 상기 MURI와 DARI를 DNA 중합반응과 Ligation 반응을 통하여 공유결합 시키고 DARI의 3’쪽에 오리가미로 연접된 염기서열의 5’쪽 상보적 서열을 신장시키는 것을 특징으로 하는 PCR 증폭 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 MURI oligonucleotide는 첫번째 염기서열 요소의 앞부분(안티센스 서열의 3'쪽) 서열과 상보적인 서열을 가지거나, 상기 앞부분 서열과 상보적인 서열 및 첫번째 염기서열 요소의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 PCR 증폭 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 3) 단계에서 상기 DARI와 MURI의 상보적 결합과 DNA 중합반응 및 ligation 반응에 의해 생성된 원거리 염기서열 요소들을 포함하는 단일가닥의 DNA를 주형으로 하여 PCR을 통해 이를 증폭하는 것을 특징으로 하는 PCR 증폭 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 PCR 증폭을 위해 Forward primer로서 상기 MURI oligonucleotide를 그대로 또는 첫번째 염기서열 요소의 앞부분(안티센스 서열의 3'쪽) 서열과 상보적인 서열을 사용하고, Reverse primer로서 두번째 염기서열 요소의 뒷부분(안티센스 서열의 5'쪽) 서열을 사용하는 것을 특징으로 하는 PCR 증폭 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계들을 포함하는 한 핵산 분자상에서 서로 떨어져 있는 염기서열 요소들의 관계를 분석하는 방법을 제공한다: 1) 서로 떨어져 있는 염기서열 요소들을 오리가미(origami) 형태로 연접시키는 단계; 2) 연접된 염기서열 요소들이 포함된 단일 가닥 주형 DNA를 생성하는 단계; 및, 3) 상기 주형 DNA를 PCR을 통해 증폭하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 3)단계에서 PCR 증폭된 amplicon의 시퀀싱을 통해 상기 서로 떨어져 있는 염기서열 요소들의 염기서열을 분석 하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 분석 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 염기서열 요소는 염기서열 다형성 부위, SNP, 대립유전자, 표적 유전자, 유전자 변이, 또는 유전자 마커인 것을 특징으로 하는 분석 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 서로 떨어져 있는 염기서열 요소들간의 관계 분석은 대립유전자들의 Haplotype phasing인 것을 특징으로 하는 분석 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 서로 떨어져 있는 염기서열 요소들간의 관계 분석은 유전자 재조합(recombination) 기술에 의해 원하는 유전자가 원하는 부위에 삽입되었는지를 확인하는것을 특징으로 하는 분석 방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 서로 떨어져 있는 염기서열 요소들간의 관계 분석을 단계별로 보다 구체적으로 설명한다.
1) 서로 떨어져 있는 염기서열 요소들의 연접단계
- 대상 염기서열을 포함하는 DNA 시료에 DARI와 MURI oligonucleotide를 넣어 섞은 뒤 온도를 가하여 이중가닥 DNA를 변성시킨다.
- MURI oligonucleotide의 5‘말단은 ligation을 위해 인산화된 것을 사용한다.
- 온도를 순차적으로 낮춰주면서 두 oligonucleotide가 표적 DNA와 상보적 결합을 하도록 한다.
- MURI와 DARI는 전략적 고려에 따라 서로 연접하게 하거나 (실시예 1) 또는 일정 거리를 두도록 (실시예 2) 설계할 수 있다
2) 연접된 표적 염기서열들에 상보적인 단일 가닥 주형 DNA를 생성하는 단계
- MURI와 DARI사이의 gap 또는 nick을 메우고 DARI의 3’쪽의 신장을 위해 DNA polymerase와 DNA ligase 효소와 필요한 buffer및 기질을 추가하여 반응을 진행시킨다.
- DNA Polymerase는 exonuclease 기능이 없고 ligation과 5‘->3’ polymerization 기능이 있는 것을 사용한다.
3) 상기 주형 DNA를 PCR을 통해 증폭하는 단계
- 적절한 프라이머를 사용하여 2단계에서 생성된 단일가닥의 주형 DNA에 포함된 표적 염기서열을 포함하는 amplicon을 PCR을 통해 증폭한다.
- 둘 이상의 SNP에 대해 phasing을 수행할 경우 하나 또는 두 프라이머 모두 그의 3’-말단이 특정 SNP의 특정 염기에 상보적이게 함으로서 PCR에 의한 증폭 내용에 따라 해당 SNP의 염기형을 밝힐 수 있다.
- sequencing 또는 genotyping등의 방법을 통해 증폭된 amplicon을 분석하여 표적 염기서열들의 성상과 관계를 밝힌다.
본 발명에 따르면, 한 염색체상에서 서로 떨어져 위치한 복수의 염기서열 요소들을 DNA origami를 매개로 한 PCR 방법을 통해 하나의 amplicon으로 손쉽게 증폭할 수 있으며, 상기 증폭된 PCR amplicon의 분석을 통해 서로 물리적 연관되어 있는 염기서열 요소들의 관계를 신속하고 효과적으로 밝힐 수 있다. 예컨대, 복수의 SNP와 같은 염기서열 다형성 부위들 또는 대립유전자들의 Haplotype phasing이 가능하며, Gene targeting에서 homologous recombination과 같은 유전자 재조합 기술에 의해 원하는 유전자가 원하는 부위에 삽입되었는지를 확인하는데 유용하다.
도 1은 종래의 Genotyping과 본 발명의 DARI PCR/Genotyping를 개략적으로 비교한 도면이다. 가로 두선은 두 개의 염색체 즉 이배체(diploid)를 의미하고, 세로 선은 두개의 마커(대립유전자) 사이트를 의미한다. 종래 Genotyping방법으로는 두개의 마커가 hetero라는 것만 알아낼 수 있고, 하나의 염색체상에 AC 또는 AT 등 어떤 조합(haplotype)으로 되어 있는지 알 수 없으나, 본 발명의 DARI PCR 방법으로는 하나의 염색체상에 AC의 조합, 다른 염색체 상에 GT의 조합(haplotype)으로 되어 있는 것을 알 수 있다.
도 2는 본 발명의 DARI PCR에 의한 Haplotype Phasing의 개략적인 순서를 도시한 것이다. 첫 번째 그림은 한 개의 염색체 상에 두 개의 염기서열 요소들을 표시한 것이고, 두 번째 그림에서 윗가닥은 DARI를 통해 염색체의 anti-sense 가닥이 오리가미를 형성한 것을 보여주며, 1st SNP의 앞부분 서열과 상보적으로 결합한 MURI 올리고뉴클레오티드와 1st SNP의 뒷부분 서열과 2nd SNP의 앞부분 서열과 상보적인 서열을 양끝에 가지는 DARI 올리고뉴클레오티드를 보여준다. 세번째 및 네 번째 그림은 MURI와 DARI사이의 Ligation과 DARI의 3'쪽의 Polymerization을 통해 연접된 염기서열들에 상보적인 단일 가닥 주형 DNA를 생성하는 과정을 보여주며, 다섯 번째 그림은 상기 단일가닥의 DNA를 주형으로 하여 PCR을 통해 이를 증폭하는 것을 보여준다. 이때 MURI가 forward primer역할을 하며, 2nd SNP 뒷부분(안티센스 서열의 5'쪽) 서열 (화살표)을 reverse primver로 사용한다.
도 3은 실시예 1에서 Linear plasmid상 떨어져 있는 두 염기서열 요소들을 한 amplicon으로의 증폭한 사진을 보여준다. 여기서는 MURI와 DARI를 서로 연접하게 설계하였다.
도 4는 실시예 2에서 유전체 DNA상 떨어져 있는 두 염기서열 요소들을 한 amplicon으로의 증폭한 사진을 보여준다. 여기서는 MURI와 DARI를 일정 거리를 두도록 설계하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1: Linear plasmid 상 떨어져 있는 두 염기서열 조각의 한 amplicon 으로의 증폭
pTop plasmid DNA를 HindIII로 절단한 다음 약 1kb 정도의 거리를 두고 세 개의 영역에서 두 가지의 DARI PCR을 설계하고 수행하였다 (표 1). 첫 번째의 경우,MURI (A_F1)는 A영역에 위치시키고 DARI(AB_dari)는 5’쪽 절반을 A영역에 3쪽 절반을 B영역에 위치시킴으로써 서로 1kb 정도 떨어져 있는 A와 B영역에 각각 위치한 두 개의 염기서열 조각을 한 amplicon으로 증폭하고자 하였다. Plasmid 200, 20, 2 그리고 0.2 pg을 준비한 뒤 각각에 1 pmole의 MURI와 1pmole의 DARI를 혼합한 뒤 1X PCR buffer 존재 하에서 최종 10 ul의 용액상태에서 Thermal cycler를 이용하여 Denatureation 및 Annealing 반응을 수행하였다. 이때 사용한 온도 조건은 최초 95℃에서 1분, 60℃ 10분, 55℃ 10분 그리고 37℃ 30분이다. Annealing이 끝난 시료에 T4 ligase와 반응 buffer를 넣어준 뒤 20ul 반응 부피를 20ul로 조정하였고 이를 37℃에서 30분간 방치하여 MURI와 DARI사이에 Phosphodiester 결합을 유도하였다. 이 반응산물 2ul를 취한 뒤,A_F1을 정방향프라이머로 B_R1을 역방향 프라이머로 각각 10 pmole을 사용하였고 Taq polymerase, dNTP 및 PCR 반응 buffer를 최종 1X 수준으로 첨가하여 20ul 부피에서 3’- extension 및 PCR 반응을 수행하였다. 이때 반응 조건은 최초 72℃ 10분 방치 후, 40회의 94℃ 5초, 56℃ 15초, 72℃ 25초의 thermal cycle 과 마지막으로 72℃ 10분의 extension 시기로 구성되었다. PCR 산물을 1.5% Agarose gel에서 전기영동한 결과를 도1에 나타낸 바와 같이 예측된 크기의 PCR 산물을 확인할 수 있었다. 두 번째 시도에서는, 서로 2kb 정도 떨어진 A와 C 영역의 염기서열 조각을 한 개의 염기서열로 증폭하고자 하였다. 이를 위해 A영역과 C영역의 각각에 대해 상보적 염기서열을 갖는 AC-dari를 도입하였고 MURI에는 A_F1, 정방향 및 역방향 프라이머로는 A_F1과 C_R1을 사용하였으며 기타 실험 조건은 첫 번째의 경우와 동일하였다. 최종 PCR 산물을 도 3에 나타낸 바 예측된 크기의 산물을 확인할 수 있었다. 플라스미드 0.2 pg을 사용하여 생성된 PCR 산물을 TA-cloning하여 sequencing 분석을 실시한 결과 예측된 염기서열을 확인할 수 있었으므로 플라스미드를 사용한 실시예를 통해 본 발명의 유효성을 입증하였다.
[표 1]
Figure 112012103944918-pat00001

상기 표 1에서, A,B, C 서열은 염기서열 요소를 포함하는 sense 서열이며, MURI 및 DARI 서열도 연접되는 anti-sense 서열에 상보적인 sense 서열이다. 대문자는 MURI 또는 primer 서열을 표시하고, 밑줄친 것은 연접되는 anti-sense 서열과 상보적인 DARI의 일부 서열을 표시한 것이다. 여기서는 첫 번째 염기서열 요소는 MURI (A_F1)의 3‘말단에 위치하도록 디자인하였으며, 두 번째 염기서열 요소는 DARI (AB_dari 또는 AC_dari)의 3’쪽 뒷부분에 위치하도록 디자인하였다. 만약 MURI (A_F1)의 3‘말단인 첫 번째 염기서열 요소를 g가 아닌 다른 염기로 바꾸면 MURI와 DARI의 ligation이 일어나지 않아서 PCR 증폭되지 않는다.
실시예 2: 유전체 DNA 상 떨어져 있는 두 염기서열 조각의 한 amplicon 으로의 증폭
사람의 유전체 DNA 100ng을 사용하여 IL6R 유전자 영역의 세 SNP rs4845618, rs6427658 및 rs6694817을 대상으로 서로 떨어진 두 염기서열 조각을 한 amplicon으로 증폭하는 실험을 수행하였다 (표 2). 먼저 서로 약 800bp 정도 떨어진 rs4845618 및 rs6427658를 연결하는 DARI IL119_20과 MURI IL119-F를 100ng의 유전체 DNA와 혼합한 뒤 1X ligase buffer 존재하에서 10ul의 부피에서 실시예 1에서와 같은 조건으로 Denaturation 및 annealing 반응을 수행하였다. 이 반응 산물에 1X ligase buffer, 2X Polymerase buffer 및 2.5mM의 dNTP와 함께 T4 ligase 및 Klenow 효소가 들어있는 용액 10ul를 첨가한 37℃에서 30분간 배양하여 DARI와 MURI사이의 틈을 메우고 DARI의 3’쪽을 신장시켰고, 95℃에 1분간 방치하여 효소 활성을 제거하였다. 두 번째 시도는 SNP rs6427658 및 rs6694817를 대상으로 해당 SNP가 포함된 두 염기서열 조각을 하나의 amplicon으로 증폭하는 것이다. 이를 위해 DARI 및 MURI로 IL120_21과 IL129-F를 사용하였으며 상기한 조건과 동일하게 Denaturation/Annealing 반응과 Ligation/polymerization 반응을 수행하였다. 위 반응 산물 2ul씩을 주형으로 취하여 DARI IL119_20에 대해선 프라이머 쌍 IL119-T2/IL120R 또는 IL119-G2/IL120R을 이용하여 DARI IL120_21에 대해선 프라이머 쌍 IL120-C/IL121-R 및 IL120-T/IL120-R을 이용하여 PCR 반응을 수행하였으며 그 결과를 도 4에 나타내었으며 모든 경우에서 예측된 크기의 amplicon을 얻을 수 있었다. 이를 통해 유전체 DNA를 사용한 예에서도 본 발명이 유효함을 입증하였다.
[표 2]
Figure 112012103944918-pat00002

상기 표 2에서, rs4845618, rs6427658, rs6694817 서열은 염기서열 요소를 포함하는 sense 서열이며, MURI 및 DARI 서열도 연접되는 anti-sense 서열에 상보적인 sense 서열이다. 대문자는 MURI 또는 reverse primer에 해당되는 서열을 표시하고, 밑줄친 것은 연접되는 anti-sense 서열과 상보적인 DARI의 일부 서열을 표시한 것이다. 여기서는 첫 번째 염기서열 요소는 MURI의 3‘ 쪽 뒷부분에 위치하도록 디자인하였으며, 두 번째 염기서열 요소는 DARI의 3’쪽 뒷부분에 위치하도록 디자인하였다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 하나의 긴 DNA 이중나선상에서 서로 떨어져 있는 염기서열 조각을 DARI PCR을 통해 하나의 amplicon으로 증폭해 낼 수 있으며 증폭된 amplicon의 추가분석을 통해서 서로 떨어진 염기서열 조각사이의 관계를 밝힐 수 있다. 이러한 특성은 본 발명을 SNP들의 haplotype phasing을 통한 진단 및 Sequence-specific mutagenesis의 확인 등에 활용할 수 있으며 본 발명의 실행과정에 포함된 반응체계 또한 상업적으로 활용할 수 있을 것이다.

Claims (13)

  1. 다음 단계들을 포함하는 한 핵산 분자상에서 서로 떨어져 있는 염기서열 요소들을 한꺼번에 PCR 증폭시키는 방법:
    1) 서로 떨어져 있는 염기서열 요소들을 오리가미(oRIgami) 형태로 연접시키기 위하여, 첫번째 염기서열 요소의 뒷부분(안티센스 서열의 5'쪽) 서열 및 두번째 염기서열 다형성 부위의 앞부분(안티센스 서열의 3'쪽) 서열과 각각 상보적인 서열들을 양끝에 가지며 가운데 3-10 뉴클레오타이드 길이의 링커를 포함하는 단일가닥 올리고뉴클레오티드인 DARI(Distance Arrangement by DNA oRIgami)를 사용하여 상기 염기서열 요소들의 주변서열과 상보적 결합을 유도하여 해당 염기서열 요소들을 연접시키는 단계;
    2) 연접된 염기서열 요소들이 포함된 단일 가닥 주형 DNA를 생성하는 단계; 및
    3) 상기 주형 DNA를 PCR을 통해 증폭하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 1) 단계에서 오리가미 형태로 연접되는 것은 상기 염기서열 요소들을 포함하는 핵산분자의 안티센스(anti-sense) 서열이고, 상기 2)단계에서 생성된 단일가닥 주형 DNA는 상기 염기서열 요소들을 포함하는 핵산분자의 센스(sense) 서열인 것을 특징으로 하는 PCR 증폭 방법.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 2) 단계에서 상기 주형 DNA의 생성은 서로 떨어져 있는 염기서열 요소들을 연접시킨 DARI 올리고뉴클레오티드의 5’쪽 상부 쪽에 연접하거나 떨어진 곳에 또 다른 올리고뉴클레오티드인 MURI(MarginalUpstream todaRI)를 오리가미로 연접된 염기서열의 3’쪽에 상보결합시키고, 상기 MURI와 DARI를 DNA 중합반응과 라이게이션(Ligation) 반응을 통하여 공유결합 시키고 DARI의 3’쪽에 오리가미로 연접된 염기서열의 5’쪽 상보적 서열을 신장시키는 것을 특징으로 하는 PCR 증폭 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 MURI 올리고뉴클레오티드는 첫번째 염기서열 요소의 앞부분(안티센스 서열의 3'쪽) 서열과 상보적인 서열을 가지거나, 상기 앞부분 서열과 상보적인 서열 및 첫번째 염기서열 요소의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 PCR 증폭 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 3) 단계에서 상기 DARI와 MURI의 상보적 결합과 DNA 중합반응 및 라이게이션(ligation) 반응에 의해 생성된 원거리 염기서열 요소들을 포함하는 단일가닥의 DNA를 주형으로 하여 PCR을 통해 이를 증폭하는 것을 특징으로 하는 PCR 증폭 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 PCR 증폭을 위해 포워드 프라이머(Forward primer)로서 상기 MURI 올리고뉴클레오티드를 그대로 또는 첫번째 염기서열 요소의 앞부분(안티센스 서열의 3'쪽) 서열과 상보적인 서열을 사용하고, 리버스 프라이머(Reverse primer)로서 두번째 염기서열 요소의 뒷부분(안티센스 서열의 5'쪽) 서열을 사용하는 것을 특징으로 하는 PCR 증폭 방법.
  9. 다음 단계들을 포함하는 한 핵산 분자상에서 서로 떨어져 있는 염기서열 요소들의 관계를 분석하는 방법으로서, 상기 서로 떨어져 있는 염기서열 요소들간의 관계 분석은 대립유전자들의 하플로타입 페이징(Haplotype phasing) 또는 유전자 재조합(recombination) 기술에 의해 원하는 유전자가 원하는 부위에 삽입되었는지를 확인하는 것을 특징으로 하는 분석 방법:
    1) 서로 떨어져 있는 염기서열 요소들을 오리가미(oRIgami) 형태로 연접시키기 위하여, 첫번째 염기서열 요소의 뒷부분(안티센스 서열의 5'쪽) 서열 및 두번째 염기서열 다형성 부위의 앞부분(안티센스 서열의 3'쪽) 서열과 각각 상보적인 서열들을 양끝에 가지며 가운데 3-10 뉴클레오타이드 길이의 링커를 포함하는 단일가닥 올리고뉴클레오티드인 DARI(Distance Arrangement by DNA oRIgami)를 사용하여 상기 염기서열 요소들의 주변서열과 상보적 결합을 유도하여 해당 염기서열 요소들을 연접시키는 단계;
    2) 연접된 염기서열 요소들이 포함된 단일 가닥 주형 DNA를 생성하는 단계; 및
    3) 상기 주형 DNA를 PCR을 통해 증폭하는 단계.
  10. 제9항에 있어서, 상기 3)단계에서 PCR 증폭된 앰플리콘(amplicon)의 시퀀싱을 통해 상기 서로 떨어져 있는 염기서열 요소들의 염기서열을 분석 하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 분석 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 염기서열 요소는 염기서열 다형성 부위, SNP, 대립유전자, 표적 유전자, 유전자 변이 또는 유전자 마커인 것을 특징으로 하는 분석 방법.
  12. 삭제
  13. 삭제
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KR20120093882A (ko) * 2009-09-16 2012-08-23 마쎄이 유니버시티 융합 폴리펩티드 및 이들의 용도

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