KR101466316B1 - 라저스트로에미아 오바리폴리아 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 또는 천식의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 라저스트로에미아 오바리폴리아 (Lagerstroemia ovalifolia) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 또는 천식의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 및 상기 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 또는 천식의 예방 또는 개선용 건강기능식품 및 사료첨가제에 관한 것이다.

Description

라저스트로에미아 오바리폴리아 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 또는 천식의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition comprising extract or fraction of Lagerstroemia ovalifolia for prevention or treatment of inflammatory diseases or asthma}

본 발명은 라저스트로에미아 오바리폴리아 (Lagerstroemia ovalifolia) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 또는 천식의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 상기 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 또는 천식의 예방 또는 개선용 건강기능식품 및 사료첨가제에 관한 것이다.

염증반응은, 조직 (세포)이 손상되거나 외부감염원 (박테리아, 곰팡이, 바이러스, 다양한 종류의 알레르기 유발물질)에 감염되었을 때 국소 혈관과 체액 중 각종 염증 매개 인자 및 면역세포가 관련되어 나타나는 효소 활성화, 염증매개 물질 분비, 체액 침윤, 세포 이동, 조직 파괴 등 일련의 복합적인 생리적 반응과 홍반, 부종, 발열, 통증 등 외적 증상이다. 구체적으로, 외부 세균이 특정 조직에 침입하여 증식을 하게 되면 생체의 백혈구가 이를 인지하여 증식된 외부 세균을 활발히 공격하게 되는데, 이 과정 중 발생되는 백혈구의 사해가 균에 의하여 침입받은 조직에 축적됨과 동시에 백혈구에 의하여 사멸된 침입균의 세포 파괴물이 침입받은 조직 내로 융해되어 농양이 형성된다.

정상인 경우 염증반응은 외부감염원을 제거하고 손상된 조직을 재생하여 생명체 기능회복작용을 하지만, 항원이 제거되지 않거나 내부물질이 원인이 되어 염증반응이 과도하거나 지속적으로 일어나면 인체의 생명을 위협하는 질환으로서 급성염증, 류마티스 관절염과 같은 관절 내에서의 질환, 건선 등의 형태로 나타나는 피부질환 및 기관지 천식 등의 알레르기성 염증질환 등이 나타나게 되며 수혈, 약물투여, 장기이식 등 치료과정에서도 장해요인이 된다.

최근 분자생물학의 발달과 더불어 염증성 질환이 사이토카인 (cytokine)이라는 분자 수준에서의 이해가 시도되고 있으며, 이러한 질환에 영향을 주는 인자들도 하나씩 규명되고 있다. 이러한 인자 중에서, 나이트릭 옥사이드 (NO; nitric oxide)는 염증과정의 매개체로서 병원성 DNA를 손상시키는 방어작용을 함으로써 항상성을 유지하는 역할을 한다 (Kou and Schroder, Annuals of Surgery 221, 220-235, 1995).

NO는 세 가지 주요한 나이트릭 옥사이드 합성효소 (NOS) 이성질체인 nNOS (neuronal NOS), eNOS (endothelial NOS), iNOS (inducible NOS)에 의해 L-아르기닌 (L-arginine)으로부터 생성된다. nNOS와 eNOS는 Ca^{2 +}/칼모듈린 (calmodulin)에 의해 조절되지만, iNOS는 인터루킨 (interleukin), 인터페론 (interferon), LPS와 같은 염증성 자극에 의해 전사 수준에서 조절된다. nNOS나 eNOS에 의해 소량 생성된 NO는 혈관확장, 신경전달, 병원체에 대한 세포파괴 등과 같은 정상적인 생리기능을 담당하지만, 대식세포에서 iNOS에 의해 과다 생성된 NO는 염증과 암을 포함한 다양한 병리생리학적 과정에 관여하며, 수퍼옥사이드 (superoxide)와 반응하여 퍼옥시니트라이트 (peroxynitrite)를 형성하고, 이는 강력한 산화제로 작용하여 세포에 손상을 입히고, 염증성 자극에 의해 활성화된 대식세포에서 NF-B를 활성화시켜 염증반응, 암, 동맥경화 등 만성질환에 관련하는 것으로 알려져 있다 (Lawrence et al., Nat Med., 7:1291-1297, 2001).

포스타글란딘 E₂ (PGE₂)와 류코트리엔 또한 아라키도닉산으로부터 생성되는 염증 매개체로서, 특히 PGE₂는 사이클로 옥사이드 합성효소 (COX-2; cyclooxygenase-2 enzyme)에 의해 생성되며, 주로 대식세포와 단핵구세포에서 많이 생성된다.

천식은 기도 혹은 폐에 발병하는 만성 염증성 질환으로 복잡한 면역반응에 의해 일어난다. 여러 가지 자극에 의해 기도의 광범위한 협착이 발생하여 쌕쌕거리는 천명이나, 호흡곤란, 기침 등의 임상 증세들을 나타내며 자연히 혹은 치료에 의해 호전될 수 있다. 대부분의 천식은 현대사회에 흔히 일어나는 알레르기 질환으로 만성 기도염증 외에도 알레르겐에 특이적인 면역글로불린 (Immunoglobulin E, IgE) 항체를 형성하거나, 기도점액의 과다분비 및 기도과민성으로 인한 기도폐쇄 증상이 나타난다.

천식은 그 원인에 따라 외인성 천식과 내인성 천식으로 나누어질 수 있다. 외인성 천식의 경우 원인 항원에 노출되었을 때 증상이 나타나는 천식을 말한다. 원인 항원에 대한 피부시험이나 기관지 유발시험이 양성반응을 보이며 발병 연령이 젊은 것이 보통이다. 집 먼지, 진드기가 가장 많은 원인 항원이며, 그밖에 꽃가루, 동물의 상피, 곰팡이 등이 원인 항원으로 작용한다. 내인성 천식의 경우에는 상기도 감염, 운동, 정서불안, 한랭 기후 및 습도의 변화 등이 천식을 유발하거나 악화시키는 경우인데, 성인형 천식에서 흔히 볼 수 있다. 그 외에도 약물에 의해 유발되는 천식, 운동 유발성 천식 및 직업성 천식 등이 있다.

과거 30년간의 알레르기 질환의 급격한 증가를 고려할 때, 유전에 의존하는 내적 요인보다는 외적요인이 주요원인이라는 주장이 강하게 제기되고 있다. 이 중에서 가장 큰 비중을 차지하는 부분은 외부환경에 따른 체내 면역체계의 변화이다. 특히, 알레르겐에 의한 TH2 (T helper 2) 타입 면역세포가 생성하는 인터루킨-4, 인터루킨-5 또는 인터루킨-13에 의해 염증세포가 증식, 분화 및 활성화되어 기도 및 기도 주변 조직으로 이동, 침윤하여 나타나는 만성 염증질환으로 인식되고 있다 (Elias JA, et al., J. Clin. Invest., 111, pp291-297, 2003). 이 경우 활성화된 호산구, 비만세포, 폐포 대식세포 등의 염증세포가 다양한 염증매개인자들 (시스테인 류코트리엔, 프로스타글란딘 등)을 분비하면서 강력한 기관지 수축작용이 과정에서 중요한 역할을 한다 (Maggi E., Immunotechnology, 3, pp233-244, 1998; Pawankar R., Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol., 1, pp3-6, 2001; Barnes PJ, et al., Pharmacol Rev., 50, pp515-596, 1998).

지금까지 다양한 치료제가 상용되고 있으나 상당수의 치료제들은 많은 부작용으로 사용시 주의를 요하고 있다. 현재 흡입형 코르티코스테로이드 제제가 가장 많이 사용되는 치료제이며 뛰어난 효과를 나타내지만 장기적으로 사용할 경우 용량과 사용시간에 비례하여 부신 억제, 골밀도 감소, 성장 장애, 눈과 피부의 합병증 등을 유발하는 것으로 알려져 있다. 또한 코르티코스테로이드 제제는 오히려 콜라겐의 합성을 증가시킬 수 있다는 보고도 있다 (Warshmana GS, et al. Dexamethasone activates expression of the PDGF-alpha receptor and induces lung fibroblast proliferation. Am J Physiol 274, 499-507, 1998). 이러한 이유로 만성 지속성 천식환자에서 수년간의 코르티코스테로이드를 이용한 치료에도 불구하고 기도과민성이 정상화되는 천식환자는 드물다. 또한, Beta-2 agonist 의 장기간 투여도 기도재구성을 억제하지 못하는 것으로 알려져 있으며 (Jeffery PK, et al. Effects of treatment on airway inflammation and thickening of basement membrane reticular collagen in asthma. A quantitative light and electron microscopic study. Am Rev Respir Dis 145: 890-0, 1992), salmeterol과 formeterol 과 같은 지속성 beta-2 agonist 는 천식발작을 예방해주면서 오히려 천식환자를 사망케 할 수 있다는 사실도 경고된 바 있는 부작용이다. 이와 같은 다양한 부작용들이 보고되고 있으나 천식 증상을 완화하는 효과가 부작용 위험보다 크다는 판단 아래 계속 처방되고 있다. 그러나 부작용에 민감한 어린이 천식 환자에서 성장율을 측정한 결과 경구용 leukotriene anatagonist (montelukast) 를 복용한 환아들의 성장율이 흡입용 corticosteroid 제를 사용한 경우보다 1년에 최고 1 cm 까지 우수한 것으로 나타났다 (Garcia Garcia ML, et al. Montelukast, compared with fluticasone, for control of asthma among 6- to 14-year old patients with mild asthma: the MOSAIC study. Pediatrics 116 (2): 360-9, 2005). 성장기에 천식이 조절되지 않으면 폐는 물론 신체 전반의 성장이 저해될 수 있으므로 꾸준한 치료로 정상적인 폐기능을 유지하는 것이 성장에 필수적이다. 하지만 지속적인 치료에 안전한 약물을 이용, 기도의 염증을 잘 관리하는 것이 무엇보다 중요하다는 것이 밝혀짐으로서 치료제 선택에 있어 천식완화 효과와 더불어 부작용에 대한 신중한 고려가 필요하다.

따라서, 면역학적 치료 및 항염증 효능에 탁월하고 부작용이 거의 없어 장기간 사용하는데 무리가 없는 약제의 개발이 널리 요구되고 있으며, 이는 최근 천연 자원으로부터의 효능 검증을 통한 소재 개발 연구가 활성화되고 있는 이유이기도 하다.

한편, 라저스트로에미아 속은 약 50여 종을 포함하고 있는 식물로서, 이 중에서 라저스트로에미아 인디카 (Lagerstroemia indica L.)는 지혈, 소종 (消腫)의 효능이 있어 혈붕 (血崩), 적백대하 (赤白帶下), 외상출혈, 장염, 설사 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 상기 라저스트로에미아 인디카 추출물 및 이의 유효성분에 대한 항알러지 효과 (한국공개특허 제10-2011-0050938호)가 알려져 있다. 또한, 라저스트로에미아 스페키오사 (Lagerstroemia speciosa)는 당뇨병, 비만에 효과가 있는 것으로 알려져 있으며, 바나바 (Lagerstroemmia speciosa) 잎 추출물의 항산화 효과 (일본공개특허 제1998-291935호)가 알려져 있다. 그러나, 라저스트로에미아 속 식물 중, 라저스트로에미아 오바리폴리아 (Lagerstroemia ovalifolia)의 항염증 활성 또는 항천식 활성에 대해서는 알려진 바가 없다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 독성 및 부작용이 없는 천연물 유래의 염증성 질환의 예방 및 치료제를 개발하기 위하여 연구한 결과, 라저스트로에미아 오바리폴리아 추출물 및 이의 분획물이 독성을 나타내지 않으며, 염증 매개 인자인 NO, iNOS, PEG2, COX-2, IL-6 및 IL-1β의 생성을 현저히 억제할 수 있음을 확인하였다. 또한, 상기 라저스트로에미아 오바리폴리아 추출물 및 이의 분획물이 난백알부민-유도 천식 마우스 모델에서 기도과민성 경감, 기관지내 염증세포 침윤 억제, 기관지 폐포세척액의 사이토카인 양 감소, 혈액의 면역글로불린 분비 억제 및 배상세포의 mucous 분비 억제 효과를 가지는 것을 확인함으로써 염증성 질환 또는 천식에 유용하게 사용될 수 있는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 라저스트로에미아 오바리폴리아 (Lagerstroemia ovalifolia) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 또는 천식의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 염증성 질환 또는 천식을 예방 또는 치료하기 위한 라저스트로에미아 오바리폴리아 (Lagerstroemia ovalifolia) 추출물 또는 이의 분획물의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 라저스트로에미아 오바리폴리아 (Lagerstroemia ovalifolia) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 염증성 질환 또는 천식의 치료방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 라저스트로에미아 오바리폴리아 (Lagerstroemia ovalifolia) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 또는 천식의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 라저스트로에미아 오바리폴리아 (Lagerstroemia ovalifolia) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 또는 천식의 예방 또는 개선용 사료첨가제를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 라저스트로에미아 오바리폴리아 (Lagerstroemia ovalifolia) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 또는 천식의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

염증은 통상 외부 감염원 (박테리아, 곰팡이, 바이러스, 다양한 종류의 알레르기 유발 물질)의 침입에 의하여 형성되는 농양의 병리적 상태를 의미하며, 염증성 질환이란 상기와 같은 염증을 동반하는 질병을 의미한다.

상기 염증성 질환은 전신성 홍반성 루푸스, 경피증, 궤양성 대장염, 크론씨 병, 아토피성 피부염, 건선, 아나필락시스, 피부염, 당뇨병성 망막증, 망막염, 황반 변성, 포도막염, 결막염, 관절염, 류마티스성 관절염, 강직성 척추염, 골관절염, 골다공증, 알레르기, 당뇨, 당뇨성 신장병, 신염, 신장염, 쇼그렌 증후군, 자가 면역 췌장염, 치주질환, 천식, 이식편 대 숙주 질환, 만성 골반 염증 질환, 자궁내막염, 비염, 편도염, 중이염, 인후염, 방광염 및 만성 전립선염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 질환일 수 있으나, 본 발명이 적용가능한 염증성 질환이 이에 의하여 제한되는 것은 아니다.

천식은 통상 폐 속의 기관지가 예민해진 상태로 기관지의 알레르기 염증 반응 때문에 발생하는 알레르기 질환의 일종이며, 알레르기는 어떤 외래성 물질과 접한 생체가 그 물질에 대하여 정상과는 다른 반응을 나타내는 현상이다.

본 발명의 목적상, 본 발명에 따른 라저스트로에미아 오바리폴리아 추출물 또는 이의 분획물은 염증성 질환 또는 천식을 예방 또는 치료하기 위하여 사용된다.

본 발명에서 사용된 용어, "예방"이란 조성물의 투여에 의해 염증성 질환 또는 천식에 의한 증상을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"란 조성물의 투여에 의해 염증성 질환 또는 천식에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 라저스트로에미아 오바리폴리아 추출물은 당업계에 공지된 임의의 용매를 사용하여 제조할 수 있으며, 바람직하게는 물, C₁ 내지 C₄의 알코올 또는 이들의 혼합용매를 사용하여 추출할 수 있으며, 보다 바람직하게는 메탄올을 사용하여 추출할 수 있다.

본 발명의 라저스트로에미아 오바리폴리아 추출물은 추출처리에 의해 얻어지는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 및 이들 조정제물 또는 정제물 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.

본 발명의 라저스트로에미아 오바리폴리아 추출물을 제조하는 방법은 초음파 추출법, 여과법 및 환류추출법 등 당업계의 통상적은 추출방법을 사용할 수 있으며, 라저스트로에미아 오바리폴리아는 상업적으로 판매되는 것을 구입하여 사용하거나, 자연에서 채취 또는 재배된 것을 사용할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "분획물"은 다양한 구성성분을 포함하는 혼합물로부터 특정성분 또는 특정 그룹을 분리하는 분획방법에 의하여 얻어진 결과물을 의미한다.

라저스트로에미아 오바리폴리아 분획물을 얻기 위하여 사용되는 용매는 당업계에서 공지된 통상적인 분획 용매, 예를 들어 물, 에탄올, 메탄올과 같은 C₁ 내지 C₄의 알코올 (예: 메탄올, 에탄올, 부탄올 등) 등의 극성용매 및 헥산, 에틸아세테이트, 클로로포름, 디클로로메탄 등의 비극성용매 또는 이들의 혼합용매를 사용할 수 있으며 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 라저스트로에미아 오바리폴리아 분획물은 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함될 수 있다. 예컨대, 본 발명의 제조방법에 따른 라저스트로에미아 오바리폴리아 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등으로 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 라저스트로에미아 오바리폴리아 분획물에 포함된다.

또한, 본 발명의 라저스트로에미아 오바리폴리아 추출물 또는 이의 분획물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 열풍 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말상태로 제조될 수 있다.

본 발명의 조성물은 라저스트로에미아 오바리폴리아 추출물 또는 이의 분획물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스 (sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다. 상기 약제학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 사용된 용어, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 조성물은 염증성 질환 또는 천식의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 염증성 질환 또는 천식의 예방 또는 치료하기 위한 라저스트로에미아 오바리폴리아 (Largerstroimia ovalifolia) 추출물 또는 이의 분획물의 용도를 제공한다. 상기 라저스트로에미아 오바리폴리아 추출물 (Largerstroimia ovalifolia), 이의 분획물, 염증성 질환, 천식, 예방 및 치료는 상기에서 설명한 바와 같다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 라저스트로에미아 오바리폴리아 (Largerstroimia ovalifolia) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 약제학적으로 유효한 양으로 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함한는 염증성 질환 또는 천식의 치료방법을 제공한다.

본 발명에서 사용된 용어, "개체"란 염증성 질환 또는 천식이 이미 발병되었거나 발병될 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미한다. 상기 라저스트로에미아 오바리폴리아 추출물 (Largerstroimia ovalifolia), 이의 분획물, 염증성 질환, 천식, 예방 및 치료는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 목적하는 바에 따라 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피 내 투여, 경구 투여, 비 내 투여, 폐 내 투여, 직장 내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, 라저스트로에미아 오바리폴리아 추출물을 대식세포에 농도별로 처리하여 MTT 검사를 수행한 결과, 라저스트로에미아 오바리폴리아 추출물이 30 ㎍/㎖의 농도에서도 세포독성이 없음을 확인함으로써, 염증성 질환의 예방 및 치료제로서 라저스트로에미아 오바리폴리아 추출물의 안전성을 확인하였다 (표 1 및 2).

또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서는, 염증 유발 인자에 대한 라저스트로에미아 오바리폴리아 추출물의 억제 활성을 확인한 결과, 라저스트로에미아 오바리폴리아 추출물의 (a) 대식세포에서 NO (nitric oxide)의 생성 억제 활성, (b) 대식세포에서 iNOS (inducible nitric oxide synthase)의 발현 억제 활성, (c) 대식세포에서 PGE₂ (Prostaglandin E₂)의 생성 억제 활성, (d) COX-2 (cyclooxygenase-2)의 발현 억제 활성, (e) IL-6 생성 억제 활성, 및 (f) IL-1β 생성 억제 활성을 확인함으로써, 염증성 질환의 예방 및 치료제로서 라저스트로에미아 오바리폴리아 추출물의 우수한 효능을 확인하였다 (도 3 내지 5).

또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서는 난백알부민 유도 천식 마우스 모델에서 라저스트로에미아 오바리폴리아 추출물 또는 이의 분획물의 처리 효과를 확인한 결과, 1) 기도과민성 경감 및 기관지 내 염증세포 침윤 억제효과, 2) 기관지 폐포세척액의 사이토카인 양의 감소, 3) 혈액 면역글로불린 분비 억제 및 4) 배상세포의 점액분비 억제효과를 확인함으로써 염증성 질환 뿐만 아니라, 천식 질환에서 라저스트로에미아 오바리폴리아 추출물 또는 이의 분획물이 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다 (도 6 내지 11).

본 발명의 조성물은 염증성 질환, 천식, 및 상기 언급된 다른 질병 또는 상태의 치료, 예방, 억제 또는 개선에 유용한 기존의 다른 제제와 함께 사용될 수 있다.

다른 제제 또는 약물들은 본 발명의 조성물과 동시에 또는 순차적으로 이것들이 보통 사용되는 경로 및 양으로 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물이 다른 하나 이상의 약물과 동시에 사용될 때, 다른 약물을 함유하는 약학적 조성물이 본 발명의 조성물에 추가되는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 약학적 조성물은 하나 이상의 다른 활성 성분 또는 치료제를 포함한다.

본 발명의 조성물과 부분적으로 함께 투여되거나 동시에 조합하여 투여될 수 있는 다른 치료제의 실시예들은 다음을 포함하며 이에 한정되는 것은 아니다; (a) VLA-4 대항제, (b) 베클로메타손(beclomethasone), 메틸프레드니솔론(methylprednisolone), 베타메타손(betamethasone), 프레드니손(prednisone), 프레니솔론(prenisolone), 트리암시놀론(triamcinolone), 덱사메타손(dexamethasone), 플루티카손(fluticasone), 플루솔리드(flunisolide) 및 하이드로코르티손(hydrocortisone) 및 부데소니드(budesonide)같은 코르티코스테로이드 아날로그(corticosteroid analogs)와 같은 스테로이드; (c) 시클로스포린 류(시클로포린 A, Sandimmune^®, Neorals^®, 타클로무스(tacrolimus) (FK-506, Prograf^®, 라파미신(rapamycin), 시롤리무스(sirolimus, Rapamune^® 같은 면역억제제 및 다른 FK-506 형태의 면역억제제, 및 미코페놀레이트(mycophenolate), 예를 들어, 미코페놀레이트 모페틸(mycophenolate mofetil)(CellCept^®; (d) 브롬페니라민(bromopheniramine), 클로로페니라민(chlorpheniramine), 덱클로페니라민(dexchlorpheniramine), 트리프로리딘(triprolidine), 클레마스틴(clemastine), 디펜하이드라민(diphenhydramine), 디페닐피랄린(diphenylpyraline), 트리펠레나민(tripelennamine), 하이드록진(hydroxyzine), 메트딜라진(methdilazine), 프로메타진(promethazine), 트리메프라진(trimeprazine), 아자타딘(azatadine), 시프로헵타딘(cyproheptadine), 안타졸린(antazoline), 페닐가민(pheniramine), 피릴라민(pyrilamine), 아스테미졸(astemizole), 테르페나딘(terfenadine), 로라타딘(loratadine), 세티리진(cetirizine), 펙소페나딘(fexofenadine), 데스카보에톡실로라타딘(descarboethoxyloratadine) 및 이와 유사한 것과 같은 항히스타민제 (Hl-히스타민 대항제); (e) β-작용제 (예를 들어, 테르부달린(terbutaline), 메타프로테레놀(metaproterenol), 페노테롤(fenoterol), 이소에타린(isoetharine), 알부테롤(albuterol), 살메테롤(salmeterol), 비톨테롤(bitolterol) 및 피르부테롤(pirbuterol)) 같은 비스테로이드 항천식제 및 β-작용제-스테로이드 조합 (예를 들어, 살메테롤-플루티카손(salmeterol-fluticasone)(Advairo^®, 포르모테롤-부데소니드(formoterol-budesonid)(Symbicort^®), 테오필린(theophylline), 크로몰린(cromolyn), 크로몰린 나트륨(cromolyn sodium), 네도크로밀(nedocromil), 아트로핀(atropine), 이프라트로피엄(ipratropium), 이프라트로피엄 브롬(ipratropium bromide), 류코트리엔 대항제 (예를 들어 자퍼루카스트(zafirlukast), 몬테루카스느(montelukast), 몬테루카스트 나트륨(montelukast sodium)(Singulair^®, 프란루카스트(pranlukast), 이라루카스트(iralukast), 포빌루카스트(pobilukast) 및 SKB-106, 203), 류코트리엔 생합성 억제제 (질루톤(zileuton), BAY- 1005);(f) 프로피온산 유도체들 (예를 들어, 알미노프로펜(alminoprofen), 베녹사프로펜(benoxaprofen), 부클록식산(bucloxic acid), 카르프로펜(carprofen), 펜부펜(fenbufen), 페노프로펜(fenoprofen), 플루프로펜(fluprofen), 플루비프로펜(flurbiprofen), 이부프로펜(ibuprofen), 인도프로펜(indoprofen), 케토프로펜(ketoprofen), 미로프로펜(miroprofen), 나프록센(naproxen), 옥사프로진(oxaprozin), 피르프로펜(pirprofen), 프라노프로펜(pranoprofen), 수프로펜(suprofen), 티아프로페닉산(tiaprofenic acid) 및 티옥사프로펜(tioxaprofen)), 아세트산 유도체들 (예를 들어 , 인도메타신(indomethacin), 아세메타신(acemetacin), 알클로페낙(alclofenac), 클리다낙(clidanac), 디클로페낙(diclofenac), 펜클로페낙(fenclofenac), 페클로직산(fenclozic acid), 펜티아작(fentiazac), 퓨로페낙(furofenac), 이부페낙(ibufenac), 이소세팍(isoxepac), 옥피낙(oxpinac), 술린닥(sulindac), 티오피낙(tiopinac), 톨메틴(tolmetin), 지도메타신(zidometacin) 및 조메피락(zomepirac)), 페나믹산(fenamic acid) 유도체들 (예를 들어, 플루페나믹산(flufenamic acid), 메클로페나믹산(meclofenamic acid), 메페나믹산(mefenamic acid), 니플루믹산(niflumic acid) 및 톨페나믹산(tolfenamic acid)), 비페닐카복실산(biphenylcarboxylic acid) 유도체들 (예를 들어, 디플루니살(diflunisal) 및 플루페니살(flufenisal)), 옥시캄스(oxicams) (예를 들어, 이소시캄(isoxicam), 피록시캄(piroxicam), 수독시캄(sudoxicam) 및 테녹시칸(tenoxican)), 살리실레이트(salicylates) (예를 들어, 아세틸살리실산 및 설파살라진) 및 피라졸론(pyrazolones) (예를 들어, 아파존(apazone), 베즈피페릴론(bezpiperylon), 페프라존(feprazone), 모페부타존(mofebutazone), 옥시펜부타존(oxyphenbutazone) 및 페닐부타존(phenylbutazone))와 같은 비스테로이드 항염증제(NSAIDs); (g) 셀레콕시브(celecoxib)(Celebrex^® 및 로페콕시브(rofecoxib)(Vioxx^®와 같은 사이클로옥시게나제-2 (COX-2) 억제제들; (h) 포스포디에스터 타입 IV (PDE-IV)의 억제제들; (i) 다른 PGD2 수용체 대항제, 특히 DP 대항제; (j) 코데인(codeine), 펜타닐(fentanyl), 하이드로모르폰(hydromorphone), 레보르파놀(levorphanol), 메페리딘(meperidine), 메타돈(methadone), 모르핀(morphine), 옥시코돈(oxycodone), 옥시모르폰(oxymorphone), 프로폭시펜(propoxyphene), 부프레노르핀(buprenorphine), 부토르파놀(butorphanol), 데조신(dezocine), 날부핀(nalbuphine) 및 펜타조신(pentazocine)과 같은 아편유사진통제; (k) HMG-CoA 환원효소 억제제와 같은 콜레스테롤 저하제 (예를 들어, 로바스타틴(lovastatin), 심바스타틴(simvastatin), 프라바스타틴(pravastatin), 플루바스타틴(fluvastatin), 아토르바스타틴(atorvastatin) 및 다른 스타틴), 담즙산 결합제 (예를 들어, 콜레스티라민(cholestyramine) 및 콜레스티폴(colestipol)), 비타민 B3 (또한 니코틴산 또는 니아신으로 알려짐), 비타민 B6 (피리독신), 비타민 B12 (시아노코발아민), 피브릭산 유도체 (예를 들어, 젬피브로질(gemfibrozil), 클로피브레이트(clofibrate), 페노피브레이트(fenofibrate) 및 벤자피브레이트(benzafibrate), 프로부콜(probucol), 니트로글리세린, 및 콜레스테롤 흡수 억제제 (예를 들어, 멜리나미드 같은 베타-시토스테롤(beta-sitosterol) 및 아실CoA-콜레스테롤 아실트랜스퍼레이스(ACAT) 억제제), HMG-CoA 신타아제 억제제, 스쿠알렌 에폭시데이즈 억제제 및 스쿠알렌 신테타아제 억제제; (1) 혈전용해제 (예를 들면, 스트렙토키나아제, 알테플라제, 아니스트레플라제(anistreplase) 및 레테플라제(reteplase)), 헤파린, 히루딘 및 와파린 유도체, p- 차단제 (예를 들어, 아테놀롤(atenolol)), p-아드레날린 작용제 (예를 들어, 이소프로테레놀), ACE 억제제 및 혈관확장제 (예를 들어, 니트로푸루시드나트륨, 염산니카르디핀, 니트로글리세린 및 에날로프리랫(enaloprilat)) 같은 항혈전제; (m) 인슐린 및 인슐린 유사체, 설폰요소제 (예를 들어, 글리부리드(glyburide), 메글리나티드(meglinatide)), 비구아니드(biguanides), 예를 들어, 메트포민(metformin)(Glucophage^®, a-글루코시다아제 억제제 (아카르보스(acarbose)), 티아졸리디논 화합물(thiazolidinone compounds), 예를 들어, 로시글리타존(rosiglitazone)(Avandia^®, 트로글리타존(troglitazone)(Rezulin^®, 시글리타존(ciglitazone), 피오글리타존(pioglitazone)(Actors^® 및 엔글리타존(englitazone)과 같은 항당뇨제; (n) 인터페론 베타의 제제(인터페론 β-1 a, 인터페론 β-l β); (o) 아우라노핀(auranofin) 및 아우로티오글루코스(aurothioglucose)와 같은 금 화합물, (p) TNF 억제제, 예를 들어, 에타네르셉트(etanercept)(Enbrel^®, 오르토클론(orthoclone) (OKT3), 다클리주맙(daclizumab)(Zenapax^®, 바실릭시맙(basiliximab)(Simulect^®, 인플리시맙(infliximab)(Remicade^® 및 D2E6 TNF 항체와 같은 항체 요법들 (q) 바셀린 및 라놀린, 각질용해제, 비타민 D3 유도체들 (예를 들어, 칼시포트라이엔 및 칼시포트리올(Dovonex^®), PUVA, 안트랄린(anthralin)(Drithrocreme^®, 에트레티네이트(etretinate)(Tegisono^® 및 이소트레티노인(isotretinoin)과 같은 윤활제 또는 피부연화제 (r) 인터페론(Betaseron, 인터페론 β-1a (Avonex^®, 아자티오프린(azathioprine)(Imurek^® Imuran^®, 글라티라머 아세테이트(glatiramer acetate)(Capoxone^®, 글루코코르티코이드(예를 들어, 프레드니솔론) 및 시클로포스파미드와 같은 다발성 경화증 치료제; (s) 5-아미노살리실산 및 그의 프러드럭과 같은 다른 화합물들; (t) DNA-알킬화제(예를 들어, 시클로포스파미드, 이소스파미드), 항대사물들(예를 들어, 아자티오프린(azathioprine), 6-머캅토퓨린(6-mercaptopurine), 메토트렉세이트, 폴산염 대항제 및 5-플루오로우라실, 피리미딘 대항제), 미세관 교란물질(예를 들어, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 파클리탁셀(paclitaxel), 콜히친, 노코다졸 및 비노렐빈(vinorelbine)), DNA 삽입제(예를 들어, 독소루비신, 다우노미신(daunomycin) 및 시스플라틴(cisplatin)), 수산화요소와 같은 DNA 합성 억제제, DNA 교차연결제, 예를 들어, 미토미신 C, 호르몬 치료(예를 들어, 타모시펜(tamoxifen) 및 플루타미드(flutamide)) 및 세포 증식억제제, 예를 들어, 이마티닙(STI571, Gleevec^® 및 리튜시맙(rituximab)(Rituxan^®. 본 발명의 조성물에 대한 2차 활성 성분의 질량비는 다양하며 각 성분의 유효량에 따라 사용자가 적절히 조절하여 사용할 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 라저스트로에미아 오바리폴리아 (Lagerstroemia ovalifolia) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 또는 천식의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

라저스트로에미아 오바리폴리아 추출물 또는 이의 분획물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 추출물 또는 이의 분획물은 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 라저스트로에미아 오바리폴리아 추출물 또는 이의 분획물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

상기 외에 본 발명의 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 건강기능식품은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 라저스트로에미아 오바리폴리아 (Lagerstroemia ovalifolia) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 또는 천식의 예방 또는 개선용 사료첨가제를 제공한다.

상기 사료첨가제는 가금류, 가축 등에게 꾸준히 섭취하게 함으로써 염증 또는 천식을 예방할 수 있고, 이미 발생한 염증 또는 천식을 치료할 수 있다.

바람직한 일 구현예에 따르면, 본 발명의 사료첨가제는 라저스트로에미아 오바리폴리아 추출물, 분획물 또는 활성분획 0.1 ~ 20% 중량부, 지방분해효소 (Lipase) 0.001 ~ 0.01% 중량부, 제3인산칼슘 1 ~ 20% 중량부, 비타민 E 0.01 ~ 0.1% 중량부, 효소분말 1 ~ 10% 중량부, 유산균 0.1 ~ 10% 중량부, 바실러스 (Bacillus) 배양액 0.01 ~ 10% 중량부 및 포도당 20 ~ 90% 중량부로 구성될 수 있으나, 특별히 이에 한정되는 것은 아니며, 라저스트로에미아 오바리폴리아 추출물, 분획물 또는 활성분획이 유효량으로 첨가되어 있다면, 본 발명의 사료첨가제로서 가능하다.

상기 유효량이란, 가금류, 가축 등이 꾸준히 섭취하게 함으로써 염증 또는 천식을 예방하거나, 이미 발생한 염증 또는 천식을 치료할 수 있는 양을 의미한다. 또한, 첨가에 의한 이익을 넘는 악영향이 생기지 않는 양이 바람직하다.

본 발명의 사료첨가제는 공지의 담체, 안정제 등을 포함할 수 있으며, 필요에 따라 비타민, 아미노산류, 미네랄 등의 각종 양분, 항산화제, 항생물질, 항균제 및 기타의 첨가제 등을 포함할 수도 있으며, 그 형상으로서는 분체, 과립, 펠릿, 현탁액 등의 적당한 상태일 수 있다. 본 발명의 사료첨가제는 가금류 및 가축 등에 대하여 단독으로 또는 사료에 혼합하여 공급할 수 있다.

본 발명의 라저스트로에미아 오바리폴리아 추출물 및 이의 분획물은 독성을 나타내지 않으며, 염증 매개 인자인 NO, iNOS, PEG₂, COX-2, IL-6 및 IL-1β 생성 억제 활성이 우수하다. 또한, 본 발명의 상기 추출물 및 이의 분획물은 난백알부민-유도 천식 마우스 모델에서 기도과민성 경감 및 기관지내 염증세포 침윤 억제, 기관지 폐포세척액의 사이토카인 양 감소, 혈액의 면역글로불린 분비 억제 및 배상세포의 점액분비 억제 효과가 우수하였으므로, 염증성 질환 또는 천식의 예방 및 치료를 위한 안전한 제제로서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 라저스트로에미아 오바리폴리아 추출물과 분획물의 TLC (Thin Layer Chromatography)를 나타낸 그림이다.
T: 라저스트로에미아 오바리폴리아 메탄올 추출물
H: 라저스트로에미아 오바리폴리아 n-헥산 분획물
C: 라저스트로에미아 오바리폴리아 클로로포름 분획물
E: 라저스트로에미아 오바리폴리아 에틸아세테이트 분획물
B: 라저스트로에미아 오바리폴리아 부탄올 분획물
W: 라저스트로에미아 오바리폴리아 물 분획물
도 2는 라저스트로에미아 오바리폴리아 추출물과 분획물의 CAD (Charge Aerosol Detector)를 나타낸 그림이다.
도 3은 라저스트로에미아 오바리폴리아 추출물의 RAW264.7 세포에서 LPS로 유도된 NO 생성 및 iNOS의 발현 억제 효과를 나타낸 것이다:
a) 는 NO생성량을 나타낸 그래프이며, ($)는 음성대조군에 대한 P값이 0.05 이하, (*)은 양성대조군에 대한 P값이 0.005 이하, (#)은 양성대조군에 대한 P값이 0.0005 이하를 나타내며;
왼쪽 첫 번째 막대 : 음성대조군, 0.15% DMSO만 투여한 군;
왼쪽 두 번째 막대 : 양성대조군, 0.5 ㎍/㎖의 LPS를 처리하여 염증을 유도한 군
나머지 막대 : 라저스트로에미아 오바리폴리아 추출물을 농도별로 처리한 후, LPS로 염증을 유도한 군.
b) 및 c)는 각각 음성, 양성 대조군과 함께 라저스트로에미아 오바리폴리아 추출물을 농도별로 처리한 후, 핵산증폭분석 결과, 및 웨스턴 블랏팅 결과를 확인한 것으로,
음성대조군 : 0.15% DMSO만 투여한 군 (왼쪽 첫 번째);
양성대조군 : 0.5 ㎍/㎖의 LPS를 처리하여 염증을 유도한 군 (왼쪽 두 번째).
도 4는 라저스트로에미아 오바리폴리아 추출물의 RAW264.7 세포에서 LPS로 유도된 PGE₂의 생성과 COX-2 발현 억제 효과를 나타낸 도이다:
a)는 PGE₂생성량을 나타낸 그래프이며, ($)는 음성대조군에 대한 P값이 0.05 이하, (*)은 양성대조군에 대한 P값이 0.005 이하를 나타내며;
왼쪽 첫 번째 막대 : 음성대조군, 0.15% DMSO만 투여한 군;
왼쪽 두 번째 막대 : 양성대조군, 0.5 ㎍/㎖의 LPS를 처리하여 염증을 유도한 군;
나머지 막대 : 실험군, 라저스트로에미아 오바리폴리아 추출물을 농도별로 처리한 후, LPS로 염증을 유도한 군.
b) 및 c)는 각각 음성, 양성 대조군과 함께 라저스트로에미아 오바리폴리아 추출물을 농도별로 처리한 후, 핵산증폭분석 결과, 및 웨스턴 블랏팅 결과를 확인한 것으로,
음성대조군 : 0.15% DMSO만 투여한 군 (왼쪽 첫 번째);
양성대조군 : 0.5 ㎍/㎖의 LPS를 처리하여 염증을 유도한 군 (왼쪽 두 번째).
도 5는 라저스트로에미아 오바리폴리아 추출물의 RAW264.7 세포에서 LPS로 유도된 사이토카인 IL-6 및 IL-1베타 발현에 대한 억제 효과를 나타낸 것이다:
(*)은 양성대조군에 대한 P값이 0.005 이하, (#)은 양성대조군에 대한 P값이 0.0005 이하를 나타내며;
왼쪽 첫 번째 막대 : 음성대조군, 0.15% DMSO만 투여한 군;
왼쪽 두 번째 막대 : 양성대조군, 0.5 ㎍/㎖의 LPS를 처리하여 염증을 유도한 군;
나머지 막대 : 실험군, 라저스트로에미아 오바리폴리아 추출물을 농도별로 처리한 후, LPS로 염증을 유도한 군.
도 6은 기도 감작한 후 호흡률에 미치는 영향을 나타낸 도이다:
NC; 기도 감작하지 않은 음성대조군;
OVA; 난백알부민으로 기도 감작한 양성대조군;
M; 몬테루카스트를 30 mg/kg 투여한 비교대조군;
LO-T; 라저스트로에미아 오바리폴리아 메탄올 추출물을 30 mg/kg 투여한 군; 및
LO-EA; 라저스트로에미아 오바리폴리아 에틸아세테이트 분획물을 30 mg/kg 투여한 군.
도 7은 기도 감작한 후 기관지 폐포 세척액의 총세포수와 호산구수에 대한 라저스트로에미아 오바리폴리아 메탄올 추출물 및 에틸아세테이트 분획물이 미치는 영향을 나타낸 도이다:
NC; 기도 감작하지 않은 음성대조군;
OVA; 난백알부민으로 기도 감작한 양성대조군;
M; 몬테루카스트를 30 mg/kg 투여한 비교대조군;
LO-T; 라저스트로에미아 오바리폴리아 메탄올 추출물을 30 mg/kg 투여한 군; 및
LO-EA; 라저스트로에미아 오바리폴리아 에틸아세테이트 분획물을 30 mg/kg 투여한 군.
도 8은 기도 감작한 후 기도세척액의 사이토카인 함량을 측정한 도이다:
NC; 기도 감작하지 않은 음성대조군;
OVA; 난백알부민으로 기도 감작한 양성대조군;
M; 몬테루카스트를 30 mg/kg 투여한 비교대조군;
LO-T; 라저스트로에미아 오바리폴리아 메탄올 추출물을 30 mg/kg 투여한 군; 및
LO-EA; 라저스트로에미아 오바리폴리아 에틸아세테이트 분획물을 30 mg/kg 투여한 군.
도 9는 기도 감작한 후 혈액의 면역글로불린의 함량을 측정한 도이다:
NC; 기도 감작하지 않은 음성대조군;
OVA; 난백알부민으로 기도 감작한 양성대조군;
M; 몬테루카스트를 30 mg/kg 투여한 비교대조군;
LO-T; 라저스트로에미아 오바리폴리아 메탄올 추출물을 30 mg/kg 투여한 군; 및
LO-EA; 라저스트로에미아 오바리폴리아 에틸아세테이트 분획물을 30 mg/kg 투여한 군.
도 10은 H&E염색으로 기도 감작한 후 기도점막내 염증세포의 침윤정도를 확인한 도이다:
NC; 기도 감작하지 않은 음성대조군;
OVA; 난백알부민으로 기도 감작한 양성대조군;
M; 몬테루카스트를 30 mg/kg 투여한 비교대조군;
LO-T; 라저스트로에미아 오바리폴리아 메탄올 추출물을 30 mg/kg 투여한 군; 및
LO-EA; 라저스트로에미아 오바리폴리아 에틸아세테이트 분획물을 30 mg/kg 투여한 군.
도 11은 PAS염색으로 기도 감작한 후 마우스의 기관지 상피세포에서 배윤세포가 차지하는 정도를 확인한 도이다:
NC; 기도 감작하지 않은 음성대조군;
OVA; 난백알부민으로 기도 감작한 양성대조군;
M; 몬테루카스트를 30 mg/kg 투여한 비교대조군;
LO-T; 라저스트로에미아 오바리폴리아 메탄올 추출물을 30 mg/kg 투여한 군; 및
LO-EA; 라저스트로에미아 오바리폴리아 에틸아세테이트 분획물을 30 mg/kg 투여한 군.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

제조예 1 : 라저스트로에미아 속 식물의 추출물 제조

라저스트로에미아 오바리폴리아 (Lagerstroemia ovalifolia Teijsm. & Binn.) 메탄올 추출물은 한국생명공학연구원 해외생물소재허브센터의 해외식물추출물은행에서 구입하였다. 증거표본(KRIB 0038535)은 한국생명공학연구원 식물표본관(KRIB, Herbarium of the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology)에 보관되어 있다. 추출과정을 살펴보면, 라저스트로에미아 오바리폴리아 (Lagerstroemia ovalifolia Teijsm. & Binn.)를 10 kg 을 채집하여 분쇄가 용이하도록 건조기(50-55℃)를 사용하여 수분을 제거하였다. 분쇄된 분말시료 10.8 kg을 메탄올 200 ℓ를 가한 후 상온에서 추출하였다. 그런 다음 여과하여 감압농축한 후, 라저스트로에미아 오바리폴리아 메탄올 추출물 1,030 g 을 수득하였다. 이하 실험에서는 라저스트로에미아 오바리폴리아 추출물을 DMSO (dimethyl sulfoxide)에 20 mg/ml의 농도가 되도록 용해시킨 후, 농도별로 희석하여 사용하였다.

또한, 라저스트로에미아 속의 식물로서 라저스트로에미아 칼리쿨라타( Lagerstroemia calyculata Kurz), 라저스트로에미아 체키안젠시스 (Lagerstroemia chekiangensis Cheng), 라저스트로에미아 플로리분다 (Lagerstroemia floribunda Jack sec . Griff.), 라저스트로에미아 플로스-레지나에 (Lagerstroemia flos - reginae Retz .), 라저스트로에미아 인디카 (Lagerstroemia indica L.), 라저스트로에미아 인디카 포 라티폴리아 ( Lagestroemia indica for . latifolia Koehne), 라저스트로에미아 레콤테이(Lagerstroemia lecomtei Gagnep .), 라저스트로에미아 라우도니 (Lagerstroemia loudonii Teysm . & Binn .), 라저스트로에미아 마크로카르파 (Lagerstroemia macrocarpa Wall . ex Kurz), 라저스트로에미아 오바리폴리아 (Lagerstroemia ovalifolia Teijsm . & Binn.), 라저스트로에미아 스페시오사 (Lagerstroemia speciosa (L.) Pers .), 라저스트로에미아 토멘토사 (Lagerstroemia tomentosa C. Presl), 라저스트로에미아 베너스타 (Lagerstroemia venusta Wall . ex C.B. Clarke) 및 라저스트로에미아 빌로사 (Lagerstroemia villosa Wall . ex Kurz)의 메탄올 추출물은 모두 한국생명공학연구원에 소재한 해외생물소재허브센터에서 구입하였다. 건조된 추출물을 DMSO 용매에 20 mg/㎖ 농도로 녹여, 각 실험에 사용하였다.

제조예 2: 라저스트로에미아 속 식물의 분획물 제조

상기 제조예 1에서 얻어진 라저스트로에미아 오바리폴리아 메탄올 추출물 1.0 g 에 증류수 50 ㎖을 가하여 현탁시켰다. 동량의 n-헥산을 가하여 혼합한 후 n-헥산가용성 분획부와 물가용성 분획부를 분리하였고, 이를 3회 실시하여 여과, 감압농축하여 n-헥산 분획물 100.5 ㎎을 수득하였다. 그런 다음, 상기 n-헥산 분획물을 제거하고 남은 물층에 클로로포름을 동량 가하여 같은 방법으로 클로로포름 분획물 73.6 ㎎ 수득하였고, 다시 남은 물층에 에틸아세테이트를 동량 가하여 같은 방법으로 에틸아세테이트 분획물 91.9 ㎎을 수득하였으며, 또 다시 남은 물층에 부탄올을 동량 가하여 동일한 방법으로 부탄올 분획물 138.2 ㎎을 수득하였으며, 남은 물층을 농축하여 물 분획물 395.6 ㎎을 수득하였다.

실시예 1: 라저스트로에미아 오바리폴리아 추출물 및 분획물의 TLC 시험

제조예 1 및 2에서 얻어진 라저스트로에미아 오바리폴리아 메탄올 추출물과 분획물을 10 ㎎/㎖ 농도로 메탄올에 녹인 후 실리카겔 박층 크로마토그래피 (TLC Silica gel 60 F₂₅₄, Merck)를 시행하였다. 박층 크로마토그래피는 혼합물 조성의 1차적인 분석방법으로서, 전개용매의 극성차이에 따른 초기분리 및 분석에 이용된다. 전개용매로는 클로로포름 : 메탄올의 비율이 10 : 1 인 혼합용매를 사용하였다. 또한 실리카겔 역상 크로마토그래피 (TLC Silica gel 60 RP-18 F₂₅₄S, Merck)를 실시하였고, 전개용매는 메탄올 50%를 사용하였고 그 결과를 도 1에 나타내었다.

실시예 2: 라저스트로에미아 오바리폴리아의 추출물 및 분획물의 UPLC 분석

제조예 1 및 2에서 얻어진 라저스트로에미아 오바리폴리아 메탄올 추출물과 분획물을 10 mg/ml로 메탄올에 녹인 후 0.2 ㎛ membrane filter로 여과하였다. UPLC는 Waters Acquity UPLC 시스템을 이용하였으며, 컬럼은 ACQUITY UPLC^TMBEHC₁₈ (10 mm×2.1 mm, i.d., 1.7 ㎛, waters, 미국)을 35℃에서 사용하였으며, 이동상 A는 물과 포름산(100:0.1, v/v)로 이동상 B는 아세토니트릴과 포름산(100:0.1,v/v)로 하여 초기에 이동상 B를 10%로 1분동안 유지시킨 후, 7분까지 50%로 증가, 12분까지 100%로 이동상 B를 증가시켜 분석 한 후, 이동상 B를 100%로 13분까지 유지시키고, 13.1분까지 이동상 B를 10%로 낮추고 15분까지 10%로 안정화시켜 분석에 사용하였다. 이동상의 유속량은 0.4 ㎖/min 그리고 시료 주입량은 10 ㎕로 하였다. 검출기로는 CAD (Charge Aerosol Detector)를 사용하여 UPLC로부터 분리되어진 물질들을 크로마토그래피 형식으로 물질의 상대적 함량과 분리도를 확인하였다 (도 2).

실험예 1 : 라저스트로에미아 속 식물 추출물의 세포독성 평가

생쥐의 대식세포인 Raw264.7 세포를 소태아혈청 (Fetal Bovine Serum)을 5% 첨가한 DMEM 배지 (Dulbecco's Modified Eagle Medium, Gibco)에 1x10⁵개/㎖의 농도로 현탁하여 100 ㎕씩 96 웰 플레이트에 접종하여 부착하였다. 4시간 후, 라저스트로에미아 오바리폴리아 메탄올 추출물을 0, 5, 10, 20, 30 ㎍/㎖로 처리하였고, 그 외의 라저스트로에미아 속 식물 추출물들은 각각 20 ㎍/㎖ 농도로 처리하였다. 24시간 동안 배양한 후, 5 ㎎/㎖의 MTT 용액을 웰당 10 ㎕씩 첨가한 후 4시간 더 배양을 하고, 배양이 완료된 후, 상등액을 제거한 다음, DMSO를 100 ㎕씩 첨가한 후 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포생존율은 DMSO를 0.15% 처리한 음성대조군을 100%로 하여 하기 수학식 1에 따라 계산하였다.

[ 수학식 1]

세포생존율(%) = [(추출물 처리한 OD₅₇₀nm 값)/(음성대조군 OD₅₇₀nm 값)]×100

그 결과, 하기 표 1에 나타난 바와 같이 라저스트로에미아 속 식물 중 특히 라저스트로에미아 오바리폴리아 (Lagerstroemia ovalifolia Teijsm . & Binn .)와 바나바 (Lagerstroemia speciosa (L.) Pers .) 추출물은 전혀 독성이 나타나지 않는 것을 확인하였다. 또한, 하기 표 2에 나타난 바와 같이, 라저스트로에미아 오바리폴리아 메탄올 추출물의 경우, 30 ㎍/㎖의 농도로 처리했을 때에도 세포독성이 전혀 없음을 확인하였다.

시료 (20㎍/㎖)	생존율 (%, Ave±SD)
Lagerstroemia calyculata Kurz	88.39±8.45
Lagerstroemia chekiangensis Cheng	68.82±4.27
Lagerstroemia floribunda Jack sec. Griff.	81.74±5.07
Lagerstroemia flos-reginae Retz.	70.21±5.38
Lagerstroemia indica L.	92.13±5.41
Lagerstroemia indica for. latifolia Koehne	50.72±7.18
Lagerstroemia lecomtei Gagnep.	63.82±7.11
Lagerstroemia loudonii Teysm. & Binn.	99.82±5.32
Lagerstroemia macrocarpa Wall. ex Kurz	58.30±11.67
Lagerstroemia ovalifolia Teijsm. & Binn.	102.54±11.69
Lagerstroemia speciosa (L.) Pers.	102.54±4.65
Lagerstroemia tomentosa C. Presl	42.71±6.05
Lagerstroemia venusta Wall. ex C.B. Clarke	53.73±5.99
Lagerstroemia villosa Wall. ex Kurz	98.69±1.17

시료 (20㎍/㎖)	생존율 (%, Ave±SD)
음성대조군	100.00±5.85
Lagerstroemia ovalifolia Teijsm. & Binn. 5 ㎍/㎖	110.30±10.50
Lagerstroemia ovalifolia Teijsm. & Binn. 10 ㎍/㎖	106.38±6.00
Lagerstroemia ovalifolia Teijsm. & Binn. 20 ㎍/㎖	118.02±6.25
Lagerstroemia ovalifolia Teijsm. & Binn. 30 ㎍/㎖	123.24±2.68

실험예 2 : 라저스트로에미아 속 식물 추출물의 나이트릭 옥사이드 생성에 대한 억제 효과

Raw264.7 세포에 LPS를 처리하여 인위적으로 유발시킨 염증에 대한 억제 효과를 알아보기 위하여, 하기의 방법에 따라 유도성 나이트릭 옥사이드 (NO)의 생성량을 측정하였다. 페놀레드 (phenol-Red)가 들어있지 않은 DMEM 배지에 소태아혈청을 5% 첨가하고, 1x10⁵ 개의 세포를 현탁하여 96 웰 플레이트에 접종하였다. 4시간 동안 부착시킨 후, 라저스트로에미아 오바리폴리아 메탄올 추출물을 0, 5, 10, 20, 및 30 ㎍/㎖의 농도로 처리하였고, 그 외의 라저스트로에미아 속 식물 추출물들은 20 ㎍/㎖의 농도로 처리하여 1시간 동안 배양한 후에 0.5 ㎍/㎖의 LPS (lipopolysaccharide, Sigma)를 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 이후, 상층액 100 ㎕를 회수하여 새로운 96 웰 플레이트에 넣고, 그리스 시약 (Griess reagent, Sigma사)을 동량 첨가하여 상온에서 10분간 반응시킨 후, 마이크로플레이트 측정기 (microplate reader, Bio-Rad)로 540 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 아질산나트륨(sodium nitrite)을 이용하여 검량선을 작성하고, 이를 기준으로 배양액 내의 나이트릭 옥사이드 생성량을 구하였으며, LPS를 처리한 군의 나이트릭 옥사이드 생성량을 100%로 하여 각 시료의 NO생성 저해율을 퍼센트로 나타내었고(하기 수학식 2 참고), 그 결과를 표 3 및 도 3에 나타내었다.

[ 수학식 2]

NO 생성저해율(%) = [1-(시료처리군의 OD₅₄₀nm 값/LPS 처리군의 OD₅₄₀nm 값)] × 100

그 결과, 하기 표 3에 나타난 바와 같이 나이트릭 옥사이드 생성 저해율이 라저스트로에미아 인디카 (Lagerstroemia indica L.)는 31.89±3.47%이었고, 바나바(Lagerstroemia speciosa (L.) Pers .)는 14.17±1.49%로 나타났다. 반면, 라저스트로에미아 오바리폴리아 (Lagerstroemia ovalifolia Teijsm . & Binn .)는 71.15±0.66%로 다른 라저스트로에미아 속 식물들의 저해율과 비교하여 현저하게 우수한 NO 생성저해활성을 가지는 것을 확인할 수 있었다.

시료 (20 ㎍/㎖)	생존율 (%, Ave±SD)
Lagerstroemia calyculata Kurz	29.96 ±0.73
Lagerstroemia chekiangensis Cheng	11.34 ±1.23
Lagerstroemia floribunda Jack sec. Griff.	10.42 ±7.59
Lagerstroemia flos-reginae Retz.	-0.68 ±13.04
Lagerstroemia indica L.	31.89 ±3.47
Lagerstroemia indica for. latifolia Koehne	10.90 ±4.32
Lagerstroemia lecomtei Gagnep.	18.86 ±2.07
Lagerstroemia loudonii Teysm. & Binn.	17.26 ±2.25
Lagerstroemia macrocarpa Wall. ex Kurz	3.28 ±8.11
Lagerstroemia ovalifolia Teijsm. & Binn.	71.15 ±0.66
Lagerstroemia speciosa (L.) Pers.	14.17 ±1.49
Lagerstroemia tomentosa C. Presl	15.30 ±5.10
Lagerstroemia venusta Wall. ex C.B. Clarke	10.29 ±1.23
Lagerstroemia villosa Wall. ex Kurz	16.13 ±2.66

또한, 도 3의 a)에 나타난 바와 같이, LPS 처리에 따라 나이트릭 옥사이드의 생성이 현저히 증가였으나, 라저스트로에미아 오바리폴리아 메탄올 추출물을 처리한 군에서는 농도 의존적으로 나이트릭 옥사이드 생성량이 감소하였음을 확인하였다.

실험예 3 : 라저스트로에미아 오바리폴리아 추출물의 iNOS 유전자 및 단백질 발현 억제 효과

3-1. iNOS 유전자의 발현 억제 실험 ( RT - PCR )

100 mm 페트리디쉬에 1×10⁶ 개의 Raw264.7 세포를 분주하고, 라저스트로에미아 오바리폴리아 메탄올 추출물을 농도별로 처리한 다음, LPS로 염증을 유도시켜 24시간 배양한 후, 배지를 제거한 다음 세포를 배양용기로부터 떼어내어 리보핵산 추출 용액(Invitrogen, CA, USA)을 사용하여 세포를 균질화하였다. 5분 후에 세포를 모아서 원심분리관에 옮기고, 200 ㎕의 클로로포름을 넣고 15초간 완전히 섞어준 후, 3분간 방치한 다음 14000 rpm에서 15분간 원심분리하였다. 리보핵산을 포함하는 상등액을 새로운 관에 옮겨 담고 아이소프로필알코올 500 ㎕와 혼합하였다. 10분 후 다시 원심분리를 하여 상등액은 버리고, 침천물에 75% 에탄올 1 ㎖을 넣고 10000 rpm에서 5분간 원심분리한 후, 상등액을 버리고 침전된 리보핵산을 20분간 상온에서 건조시켰다. 건조된 리보핵산은 DEPC (Diethylpyrocarbonate, Sigma)가 처리된 증류수로 현탁하였다. 리보핵산은 정량 후, RT-PreMix (AccuPower RT PreMix, 바이오니아)를 이용하여 상보적 핵산 (cDNA)을 합성하였다. 합성된 cDNA를 주형 (template)으로 iNOS 프라이머를 혼합한 후, PCR Premix (AccuPower PCR PreMix, 바이오니아)를 사용하여 리보핵산의 발현 정도를 확인하였다.

그 결과, 도 3의 b)에 나타난 바와 같이, LPS 처리에 따라 iNOS 발현이 증가하였으나, 라저스트로에미아 오바리폴리아 메탄올 추출물을 처리한 군에서는 농도 의존적으로 iNOS 유전자 발현량이 감소하는 것을 확인하였다.

3-2. iNOS 단백질의 발현 억제 실험 ( Western blotting )

100 mm 페트리디쉬에 1×10⁶ 개의 Raw264.7 세포를 분주하고, 라저스트로에미아 오바리폴리아 메탄올 추출물을 농도별로 처리한 다음, LPS로 염증을 유도시켜 24시간 배양한 후, 배지를 제거한 다음에 세포를 배양용기로부터 떼어내어 단백질 분해효소 저해제(Protease inhibitor cocktail, Roche)를 함유한 단백질 용출용액 (CelLytic^TM-MT Tissue Lysis Reagent, Sigma)을 사용하여 균질화 하였다. 추출액은 20분 동안 14000 rpm에서 원심분리한 뒤 상등액과 불용성 응집체를 분리하였다. 분리된 상등액의 단백질 농도는 바이오-라드 단백질 분석 키트 (Bio-Rad protein assay kit, Bio-Rad)를 이용하여 측정하였다. 또한, 상등액을 5×SDS (0.156M Tris-HCl, pH 6.8, 2.5% SDS, 37.5% 글리세롤, 37.5 mM DTT)와 1:4로 섞어 100℃에서 10분간 끓였다. 끓인 시료에서 40 ㎍ 단백질을 SDS 4-12% SDS-PAGE 겔에 로딩하고 125 V에서 2시간 동안 전기영동 하여 분자량에 따라 분리하였고, 상기 단백질을 겔 한 장당 50 mA의 조건으로 1시간 동안 전기영동 하여 PVDF 막으로 옮겼다. 단백질이 옮겨진 막에서 단백질이 없는 부분을 탈지 분유로 차단 (blocking)시킨 다음, 1차 항체[항-iNOS 항체 (1:1000, Santa Cruz Biotechnology)] 및 2차 항체 (항토끼-IgG-HRP, Amersham Biosciences)를 순차적으로 결합시킨 후, ECL 검출 키트 (Amersham Biosciences, UK)로 발광반응을 유발하였고 X-ray 필름에 노출시켜 감광하였다.

그 결과, 도 3의 c)에서 나타난 바와 같이, 대식세포에 라저스트로에미아 오바리폴리아 메탄올 추출물을 처리한 경우, 농도 의존적으로 LPS에 의한 iNOS 단백질 발현정도를 감소시키는 것을 확인하였다.

실험예 4 : 라저스트로에미아 오바리폴리아 추출물의 프로스타글란딘 생성 억제 효과

라저스트로에미아 오바리폴리아 추출물의 프로스타글란딘 E₂ (Prostaglandin E₂) 생성 억제 효과를 확인하기 위하여 하기의 실험을 수행하였다. 구체적으로 실험예 3-1의 방법에 따라 라저스트로에미아 오바리폴리아 메탄올 추출물 및 LPS를 처리한 Raw264.7 세포의 배양 상층액을 취하여 프로스타글란딘 측정 키트 (PGE2 assay kit; R&D systems, Minneapolis)로 프로스타글란딘 E₂의 생성 억제 효과를 측정하였다.

그 결과, 도 4의 a)에 나타난 바와 같이, 라저스트로에미아 오바리폴리아 메탄올 추출물의 처리에 따라 농도의존적으로 프로스타글란딘 E₂의 생성이 감소하였음을 확인하였다.

실험예 5 : 라저스트로에미아 오바리폴리아 추출물의 COX -2 유전자 및 단백질 발현 억제 효과

5-1. COX -2 유전자의 발현 억제 실험 ( RT - PCR )

실험예 3-1의 방법으로 세포에 라저스트로에미아 오바리폴리아 추출물을 농도별로 처리하고, LPS로 염증을 유도시켜 24시간 배양한 후, 리보핵산을 추출하였고, 정량 후, RT-PreMix (AccuPower RT PreMix, 바이오니아)를 이용하여 상보적 핵산을 합성하였다. 합성된 cDNA를 주형으로 COX-2 프라이머를 혼합하고, PCR Premix (AccuPower PCR PreMix, 바이오니아)를 사용하여 리보핵산의 발현 정도를 확인하였다.

그 결과, 도 4의 b)에 나타난 바와 같이, LPS 처리에 따라 iNOS 발현이 증가하였으나, 라저스트로에미아 오바리폴리아 추출물을 처리한 군에서는 처리농도에 따라 COX-2의 핵산 발현량이 현저히 감소하였음을 확인하였다.

5-2. COX -2 단백질의 발현 억제 실험 ( Western blotting )

실험예 3-2의 방법과 동일한 방법으로 단백질을 분리한 후, 40 ㎍의 단백질을 SDS 4-12% SDS-PAGE 겔에서 전기영동을 하고, PVDF 막으로 옮겼다. 단백질이 옮겨진 막에서 단백질이 없는 부분을 탈지 분유로 차단시킨 다음, 1차 항체[항-COX-2 항체(1:1000, Santa Cruz Biotechnology)] 및 2차 항체 (anti-goat-IgG-HRP; Amersham Biosciences)를 순차적으로 결합시킨 후, ECL 검출 키트 (Amersham Biosciences, UK)로 발광반응을 유발하였고 X-ray 필름에 노출시켜 감광하였다.

그 결과, 도 4의 c)에 나타난 바와 같이, 대식세포에 라저스트로에미아 오바리폴리아 메탄올 추출물을 처리한 경우, 농도 의존적으로 LPS에 의한 COX-2 단백질의 발현이 감소하였음을 확인하였다.

실험예 6 : 라저스트로에미아 오바리폴리아 추출물의 사이토카인 생성 저해 효과

LPS를 처리한 Raw264.7 세포에서 라저스트로에미아 오바리폴리아 추출물의 사이토카인 생성 저해 효과를 확인하기 위하여, LPS로 유도된 IL-6 및 IL-1 베타의 생성량을 효소면역학적 분석키트 (mouse IL-6 Enzyme Immunometric Assay Kit, mouse IL-1beta Enzyme Immunometric Assay Kit, BD bioscience)를 이용하여 측정하였다. 실험예 2와 동일한 방법으로 처리된 세포배양액 100 ㎕를 회수하여 마우스 면역글로불린이 코팅된 96 웰 플레이트에 분주하고 2시간 동안 교반하여 반응시켰다. 이후, 세척용액으로 4회 세척한 다음, 제1차 항체를 100 ㎕ 씩 분주한 후 2시간 반응시켰다. 반응 후에 세척을 하고 제2차 항체를 분주한 다음 30분간 반응시켰다. 재세척한 후 기질을 넣어 30분간 반응시킨 다음, 발색 정도를 마이크로플레이트 측정기로 450 nm에서 측정하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, LPS를 처리한 군에서 IL-6 및 IL-1 베타 의 양이 증가하였으나, 처리된 라저스트로에미아 오바리폴리아 메탄올 추출물의 농도에 따라 감소하였음을 확인하였다.

실시예 7: 실험동물 및 난백 알부민으로 기관지 천식 유도

본 실험에서는 평균 체중 20 g 내외의 6주령 Balb/c 암컷 생쥐를 실험동물로 사용하였고, 1 주 간의 적응기간을 가진 후에 기본적인 신체검사 상에서 이상이 관찰되지 않는 동물을 대상으로 하였다. 구체적으로 선별된 실험동물들을 2 주 간격으로 2 ㎎ 의 수산화알루미늄 (A8222, Sigma, St. Louis, MO) 과 난백알부민 20 ㎍ (A5503, Sigma, St. Louis, MO)을 현탁한 인산완충용액 (pH 7.4) 200 ㎕을 복강에 주입하여 감작시켰다. 첫 번째 난백알부민 복강투여 후 28 일부터 30 일까지 1% 난백알부민을 초음파분무기를 이용하여 30분간 흡입시켰다. 마지막 항원 투여 후 24 시간 뒤에 기도과민성을 측정하였고 48 시간 뒤에 치사량의 펜토바비탈 (엔토발^® 한림제약주식회사) 을 투여한 뒤 체중을 측정하고 기관지 절개를 실시하여 총 1.2 ㎖ 의 생리식염수로 기관지폐포 세척을 실시한 뒤 검체를 수거하였다. 정상 대조군 (NC) 으로 난백알부민을 투여, 흡입하지 않은 군, 천식 유도군 (OVA) 으로 난백알부민을 투여, 흡입하여 기관지 천식을 유도한 군, 비교군 (M) 으로 난백알부민 흡입 1시간 전에 montelukast (30 ㎖/㎏, PO) 을 경구투여한 군, 실험군 (LO-T or LO-EA) 으로 난백알부민 흡입 1시간 전에 각각 라저스트로에미아 오바리폴리아 메탄올 추출물 혹은 에틸아세테이트 분획물 (30 ㎖/㎏, PO) 을 경구투여한 군으로 실험을 진행하였으며 각 군당 7두의 흰쥐를 사용하였다.

실험예 8: 기도과민성의 측정

천식 발생에 의한 기도과민성 여부는 단일 챔버 체적변동 측정기 (one chamber plethysmography ;All Medicus, Seoul)를 이용한 기도 저항을 측정하고, 기도 저항의 정도는 수학적으로 계산된 기도의 폐색을 반영하는 수치인 enhanced pause (Penh) 을 측정하여 평가하였다. Penh 의 측정은 정상 호흡 상태에서 기저값을 측정한 후 PBS 를 초음파분무기를 이용하여 3분간 흡입시킨 후 3분간 측정하였다. 이후 히스타민제인 메타콜린 (A2251, Sigma, St. Louis, MO) 을 12, 25, 50 ㎖/㎏의 농도로 점차 증가시키면서 흡입시킨 후 Penh을 측정하였다. 그 결과수치는 하기 수학식 1에 나타난 바와 같이 계산하였고, 기저 Penh값 (PBS challenge)을 100%로 하여, 각 농도의 메타콜린 흡입 후 Penh의 증가율을 백분율로 표현하였다.

[ 수학식 3]

Penh = [Te/(RT-1)] × (PEF/PIF)

Te : expiratory time(sec) (흡기에서 다음 흡기까지 걸리는 시간)

RT : relaxation time(호기동안 호기양이 일회호흡양의 30%가 남을 때까지 걸리는 시간)

PEF : Peak expiration flow

PIF : Peak inspiration flow

그 결과 도 6에 나타낸 바와 같이, 정상 대조군(NC)에서는 메타콜린 농도 증가에 따른 완만한 penh 수치 증가를 확인하였으나, 난백알부민에 의한 천식 유도군(OVA)에서는 급격한 penh 수치의 증가를 확인할 수 있었다.

반면, 상기 비교군(M) 및 라저스트로에미아 오바리폴리아 추출물 및 이의 분획물 투여군(LO-T, LO-EA)에서는 메타콜린 농도에 상관없이 천식군(OVA)보다 유의하게 감소하였으며, 농도의존적으로 더욱 감소하는 양상을 확인할 수 있었다. 또한 이러한 차이는 저농도의 메타콜린 보다는 고농도의 메타콜린을 흡입시켰을 때 더욱 뚜렷한 차이를 나타내었다.

실험예 9: 기관지폐포 세척액내 염증세포 분석

각 개체의 기관지폐포 세척액은 회수된 즉시 Trypan blue 로 염색하여 죽은 세포를 제외한 총 세포수를 hematocytometer 를 이용하여 계산한 다음 Cytospin 으로 표본 도말후 Diff-Quick 염색 (Sysmex, Switzerland) 을 실시하여 호산구와 그 외의 염증세포를 감별계산하였다.

그 결과, 도 7에서 나타낸 바와 같이 총 염증세포수는 정상 대조군(NC)에 비해 천식유도군(OVA)에서 급격히 증가하였으며, 비교군(M)에서 급격히 감소하였고, 라저스트로에미아 오바리폴리아 추출물 및 이의 분획물 투여군(LO-T, LO-EA)에서도 모두 유의성 있게 감소하였다.

실험예 10: 기관지폐포 세척액의 사이토카인 측정

각 개체의 기관지폐포 세척액에서 천식유발시 증가하는 사이토카인의 양을 측정하기 위하여 효소면역학적인 방법(sandwich-type enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)을 사용하였다. Th2 type-cytokine을 측정하기 위하여 IL-4, IL-5, IL-13 ELISA kit를 염증관련 사이토카인을 측정하기 위하여 IL-6, IL-1beta, TNF-alpha ELISA kit를 사용하였다.

기관지 폐포액을 사이토카인 항체가 붙어있는 96웰 플레이트에 넣어 2시간 동안 실온에서 항원-항체 반응을 유도하였다. 자세한 실험방법은 kit의 실험방법에 따라 실시하였다.

그 결과, 도 8에서 나타낸 바와 같이, 정상대조군(NC)에 비해 난백알부민에 의한 천식 유도군(OVA)에서는 사이토카인 양이 급격히 증가한 반면, 비교군(M)과 라저스트로에미아 오바리폴리아 추출물 및 이의 분획물 투여군(LO-T, LO-EA) 모두 사이토카인 생성량이 유의성 있게 감소하였다.

실험예 11: 혈청의 IgE 측정

혈청내 전체 IgE의 양과 난백알부민에 특이적인 IgE 의 측정을 위하여 면역효소법을 이용하였다. 96-well flat bottom ELISA plate 에 IgE를 20 ㎍/㎖ 혹은 OVA 를 20 ㎍/㎖의 농도로 pH 8.3 의 0.1 M NaHCO₃ 완충액에 녹여 4℃ 에서 overnight coating 시킨 후 1% bovine serum albumin 이 함유된 PBS 로 비특이반응을 억제시켰다. 혈청 검체를 1:400으로 희석하여 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 잘 세척한 후 항-마우스 IgE 단일클론성 항체(anti-mouse IgE monoclonal antibody) 를 300배 희석하여 2시간 반응시킨 후 peroxidase 가 결합된 항-래트 IgG 다중클론성 항체 (HRP-conjugated goat anti-rat IgG polyclonal Antibody)를 4000배 희석하여 실온에서 1시간 반응시킨 후 세척하였다. 발색은 3.3'.5.5'-tetramethylbezidine substrate 로 반응시킨 후 450 nm 에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 9에서 나타난 바와 같이, 혈청 내의 IgE 항체의 농도를 측정한 결과, 혈청 내 IgE 항체 농도는 정상대조군(NC)에 비해 난백알부민에 의한 천식 유도군(OVA)에서 급격히 증가하였다. 또한, IgE가 증가한 천식유도군(OVA)에 비해 본 발명의 라저스트로에미아 오바리폴리아 추출물 및 이의 분획물 투여군(LO-T, LO-EA)은 IgE의 농도가 유의성 있게 감소하는 것으로 나타났다. 또한, 혈청 내의 난백알부민-특이 IgE 항체의 농도도 천식유도군(OVA)에 비해 오바리폴리아 추출물 및 이의 분획물 투여군(LO-T, LO-EA)에서 유의성 있게 감소하는 것으로 나타났다.

실험예 12: 조직병리학적 검사

폐조직의 염증정도를 평가하기 위하여, 적출된 폐조직은 통상적인 포르말린 고정과 파라핀 포매를 거쳐 4 ㎛ 두께로 영구조직 절편을 제작하여 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신 와이(Eosin Y; ThermoShandon, Pittsburgh, PA)로 H & E 염색을 하였고, 그런 다음 Dako-봉입액 (Dakocytomation, 덴마크)으로 봉입하였다. 염색과 봉입이 끝난 슬라이드는 광학현미경으로 검경하였다. H & E 염색 후 각 개체의 조직 절편당 무작위로 5개 부위의 염증지수를 측정하여 평균을 내었다. 염증지수 0 은 기관지 주변에 염증세포가 발견되지 않은 경우, 염증지수 1 은 간헐적으로 염증 세포가 관찰되는 경우, 염증지수 2 는 대부분의 기관지 주변에 한 층에서 두세층사이의 얇은 염증세포층이 관찰되는 경우, 염증지수 3 은 대부분의 기관지 주변에 두세층에서 다섯층 이하의 염증세포층이 관찰되는 경우, 염증지수 4 는 대부분의 기관지 주변에 다섯층 이상의 두꺼운 염증세포층이 관찰되는 경우로 평가하였다. PAS (Periodic acid Schiff) 염색을 통해 감별된 goblet cell 이 기관지 상피세포에서 차지하는 비율을 측정하여 배윤세포 (goblet cell)의 증식 정도를 평가하였다. 모든 측정은 computerized image analyzer 프로그램을 이용하였다.

H & E 염색결과, 도 10에서 나타낸바와 같이, 기도 감작되지 않은 정상대조군(NC)보다 난백알부민에 의한 천식 유도군(OVA)에서 상피세포가 손상되어 있었으며, 세기관지 주변에 호산구를 비롯한 많은 염증세포가 침윤되어 있었다. 반면, 비교군(M)과 라저스트로에미아 오바리폴리아 추출물 및 이의 분획물 투여군(LO-T LO-EA)에서는 호산구를 비롯한 염증세포가 현저하게 감소되었고, 상피세포의 손상도 거의 보이지 않았다. 이는 도 7에서 페포세척액의 총 염증세포수와 호산구 수가 감소한 현상과 일치하는 것이었다.

한편 PAS 염색결과, 도 11에서 나타낸 바와 같이, 기도 감작되지 않은 정상대조군에서 세기관지의 상피세포에서 배윤세포가 차지하는 비율은 아주 적지만, 난백알부민에 의한 천식 유도군(OVA)에서는 많이 증가되었으며, 라저스트로에미아 오바리폴리아 추출물 및 이의 분획물 투여군(LO-T LO-EA)에서 배윤세포의 수가 큰 폭으로 감소함을 확인하였으며, 따라서 점액분비도 억제됨을 확인하였다.

실험예 13: 통계분석

여러 변수에 따른 평균값과 표준오차(mean?.E.)를 계산하였고 각 집단간의 비교는 SPSS 10.0 을 이용하여 Mann-whitney U 검정을 수행하여 분석하였다. 통계적으로 p 값이 0.05 미만인 경우에 유의적 차이가 있다고 판정하였다.

Claims (8)

1. 라저스트로에미아 오바리폴리아 (Lagerstroemia ovalifolia)의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하며,
   상기 에틸아세테이트 분획물은 라저스트로에미아 오바리폴리아의 메탄올 추출물에 물 및 n-헥산을 가하여 얻은 물가용성 분획부에, 에틸아세테이트를 가하여 얻은 것인, 염증성 질환 또는 천식의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 제1항에 있어서, 상기 염증성 질환은 전신성 홍반성 루푸스, 경피증, 궤양성 대장염, 크론병, 아토피성 피부염, 건선, 아나필락시스, 피부염, 망막염, 포도막염, 결막염, 관절염, 류마티스성 관절염, 강직성 척추염, 골관절염, 알레르기, 신염, 신장염, 쇼그렌 증후군, 자가 면역 췌장염, 천식, 이식편 대 숙주 질환, 만성 골반 염증 질환, 자궁내막염, 비염, 편도염, 중이염, 인후염, 방광염 및 만성 전립선염로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인 약학적 조성물.
6. 제1항에 있어서, 상기 추출물은 하기의 활성을 나타내는 것인 약학적 조성물:
   (a) 대식세포에서 NO (nitric oxide)의 생성 억제 활성;
   (b) 대식세포에서 iNOS (inducible nitric oxide synthase)의 발현 억제 활성;
   (c) 대식세포에서 PGE₂ (Prostaglandin E₂)의 생성 억제 활성;
   (d) COX-2 (cyclooxygenase-2)의 발현 억제 활성;
   (e) IL-6 생성 억제 활성; 또는
   (f) IL-1β생성 억제 활성.
7. 라저스트로에미아 오바리폴리아 (Lagerstroemia ovalifolia)의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하며,
   상기 에틸아세테이트 분획물은 라저스트로에미아 오바리폴리아의 메탄올 추출물에 물 및 n-헥산을 가하여 얻은 물가용성 분획부에, 에틸아세테이트를 가하여 얻은 것인, 염증성 질환 또는 천식의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
8. 라저스트로에미아 오바리폴리아 (Lagerstroemia ovalifolia)의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하며,
   상기 에틸아세테이트 분획물은 라저스트로에미아 오바리폴리아의 메탄올 추출물에 물 및 n-헥산을 가하여 얻은 물가용성 분획부에, 에틸아세테이트를 가하여 얻은 것인, 염증성 질환 또는 천식의 예방 또는 개선용 사료첨가제.

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